一种与植物雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用

申请号 CN201610321598.3 申请日 2016-05-16 公开(公告)号 CN105884874A 公开(公告)日 2016-08-24
申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究所; 发明人 陈化榜; 赵丽; 张华;
摘要 本 发明 公开了一种与 植物 雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b):(a)由 序列表 中序列1所示的 氨 基酸序列组成的 蛋白质 ;(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加,且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的ZmIAP1基因在玉米中能够控制雄性育性,即该基因的纯合突变或缺失能够使玉米雄性不育,在该基因突变或缺失的材料中正常表达ZmIAP1基因能够恢复雄性育性。本发明为植物特别是玉米的雄性育性研究提供了新的基因资源,其在玉米制种领域利用细胞核雄性育性基因创制不育系和保持系的应用中将发挥重要作用。
权利要求

1.蛋白质,是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加,且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子,其特征在于:所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因,所述基因为如下1)-6)中任一的DNA分子:
1)序列表中序列2所示的DNA分子;
2)序列表中序列3所示的DNA分子;
3)序列表中序列3的第249-1997位所示的DNA分子;
4)序列表中序列4所示的DNA分子;
5)在严格条件下与1)-4)中任一限定的DNA分子杂交且编码与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子;
6)与1)-5)中任一限定的DNA序列具有90%以上同一性,且编码与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组生物
5.根据权利要求4所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用:
(a)植物育种和/或制种;
(b)调控植物雄性育性。
7.培育转基因植物的方法,为如下(A)或(B):
(A)培育雄性可育转基因植物的方法,包括如下步骤:
(a1)向雄性不育的受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因,得到表达所述编码基因的转基因植物;所述受体植物的雄性不育性状是由于所述受体植物表达有功能的权利要求1所述蛋白质的能丧失或降低引起的;
(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到雄性可育的转基因植物;
(B)培育雄性不育转基因植物的方法,包括如下步骤:
(b1)抑制雄性可育的受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达,得到转基因植物;
(b2)从步骤(b1)所得转基因植物中得到雄性不育的转基因植物。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:步骤(a1)中,所述编码基因是通过权利要求5中的所述重组表达载体导入所述受体植物的;
步骤(b1)中,是通过如下实现抑制所述受体植物中所述编码基因的表达的:采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码权利要求1所述蛋白质的基因组DNA序列进行特异性剪切,使所述受体植物丧失或降低表达有功能的权利要求1所述蛋白质的能力。
9.根据权利要求7或8所述的应用或方法,其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法,其特征在于:所述单子叶植物为禾本科植物;
所述禾本科植物具体为玉米。

说明书全文

一种与植物雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程领域,涉及一种与植物雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 玉米是一种杂种优势十分明显的作物,生产上普遍使用杂交种,因此每年都需要制种。在制种过程中,由于玉米是异花授粉作物,为了保证种子纯度,制种所用的母本需要去雄。如果母本自身雄性不育,则无需去雄,既节省人成本又避免了由于去雄不彻底所带来的制种纯度降低。玉米的雄性不育,包括质核互作的雄性不育和细胞核基因雄性不育。在玉米雄性组织的生长发育直至产生有活性花粉的过程中,任何一个细胞核雄性育性基因发生突变,都有可能导致雄性不育。这些细胞核雄性育性基因突变导致的雄性不育可分为显性核不育和隐性核不育,且以隐性核不育居多。
[0003] 目前克隆的玉米细胞核雄性育性基因包括MS8(Wang et al.,2013,Plant Reprod.26:329-338)、MS9(专利号:US20150191743)、MS22/MSCA1(Chaubal et al.,2003,Planta 216:778-788,专利号:US20090038028、EP2631243A2)、MS26(专利号:US7098388)、MS32(Moon et al.,2013,Plant Journal 76:592-602)、MS45(Albertsen et al.,1993,Proc Annu Corn Sorghum Ind Res Conf 48:224-233)、AM1(Pawlowski et al.,2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:3603-3608)、MAC1(Wang et al.,2012,Development 139:2594-2603)、OCL4(Vanessa et al.,2009,Plant Journal 59:883-894)。其中有些基因由于其突变导致雄性不育严格彻底且对玉米其他性状没有明显的负面影响,可以在玉米制种过程中得以利用。例如MS22、MS26、MS45已获得美国或欧洲专利保护。在我国,以MS1、MS7、MS30为基础的不育系保持和繁殖方法专利也已公开(专利号:CN104823840A、CN105039316A、CN105018475A)。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种与植物雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0005] 本发明所提供的蛋白质,名称为ZmIAP1,来源于玉米属的玉米(Zea mays L.),是如下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的基酸序列组成的蛋白质;
[0007] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加,且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0008] 序列表序列1为ZmIAP1的氨基酸序列,包括582个氨基酸,在该蛋白质序列中,疏氨基酸占263个,亲水氨基酸占266个,性氨基酸占70个,酸性氨基酸占52个,该蛋白质的分子量为63.43KD,等电点为8.73。
[0009] 为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化,可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0010] 表:标签的序列
[0011]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0012] 上述(b)中的蛋白质可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0013] 编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0014] 所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0015] 在本发明的一个实施例中,所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名为ZmIAP1),所述基因具体可为如下1)-6)中任一的DNA分子:
[0016] 所述基因为如下1)-6)中任一的DNA分子:
[0017] 1)序列表中序列2所示的DNA分子;
[0018] 2)序列表中序列3所示的DNA分子;
[0019] 3)序列表中序列3的第249-1997位所示的DNA分子;
[0020] 4)序列表中序列4所示的DNA分子;
[0021] 5)在严格条件下与1)-4)中任一限定的DNA分子杂交且编码与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子;
[0022] 6)与1)-5)中任一限定的DNA序列具有90%以上同一性,且编码与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。
[0023] 其中,序列2为ZmIAP1基因在玉米基因组中的序列;序列3为ZmIAP1基因的cDNA序列,第249-1997位为CDS。
[0024] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。
[0025] 所述重组载体可为重组表达载体,也可为重组克隆载体。
[0026] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等,如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子,例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等,它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建重组表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用重组表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。
[0027] 在本发明中,所述重组表达载体为将ZmIAP1基因插入到pCAMBIA3300载体的多克隆位点(如KpnⅠ和HindⅢ)处后得到的重组质粒。更加具体的,为将pCAMBIA3300载体的酶切位点KpnⅠ和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列4的第1406-6601位所示DNA片段后得到的重组质粒(命名为p3300-ZmIAP1)。
[0028] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子,所述基因,以及转录终止序列组成。
[0029] 所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。
[0030] 所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0031] (a)植物育种和/或制种;
[0032] (b)调控植物雄性育性。
[0033] 所述(a)中的应用可以是转基因的,也可以是非转基因的。其中“非转基因”的应用,可为:利用所述ZmIAP1基因培育不育系。不育系的雄性不育性状是由于植物体内表达有功能的所述ZmIAP1蛋白的能力丧失或降低引起的,所述ZmIAP1基因为纯合态aa。“转基因”的应用可为:将保持系和不育系合二为一成为两用系,需要以不育系为基础导入所述正常有功能的ZmIAP1基因,在后代中可分离出不育系和两用系。所述应用可以是对所述ZmIAP1基因(正常有功能)的利用,也可以是所述ZmIAP1基因(降低或丧失功能)的利用。
[0034] 所述(b)中,所述调控植物雄性育性可为提高植物雄性育性或降低植物雄性育性。
[0035] 本发明还提供了培育转基因植物的方法。
[0036] 本发明所提供培育转基因植物的方法,可为如下(A)或(B):
[0037] (A)培育雄性可育转基因植物的方法,包括如下步骤:
[0038] (a1)向雄性不育的受体植物中导入ZmIAP1蛋白的编码基因,得到表达所述编码基因的转基因植物;所述受体植物的雄性不育性状是由于所述受体植物表达有功能的所述ZmIAP1蛋白的能力丧失或降低引起的;
[0039] (a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到雄性可育的转基因植物;
[0040] (B)培育雄性不育转基因植物的方法,包括如下步骤:
[0041] (b1)抑制雄性可育的受体植物中ZmIAP1蛋白的表达,得到转基因植物;
[0042] (b2)从步骤(b1)所得转基因植物中得到雄性不育的转基因植物。
[0043] 在所述方法(A)的步骤(a1)中,所述编码基因可通过以上重组表达载体p3300-ZmIAP1导入所述受体植物;
[0044] 在所述方法(B)步骤(b1)中,是通过如下实现抑制所述受体植物中所述编码基因的表达的:采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmIAP1蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切,使所述受体植物丧失或降低表达有功能的ZmIAP1蛋白的能力。
[0045] 其中,所述CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmIAP1蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切时的靶标片段为所述受体植物中编码ZmIAP1蛋白的基因组DNA序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段;N表示A、G、C和T中的任一种,14≤X≤30,且X为整数(如X为20),NX表示X个连续的脱核糖核苷酸。更加具体的,所述靶标片段为所述受体植物中编码ZmIAP1蛋白的基因组DNA序列中的“5’-GAACGCGCGGGCCCGGGTGCTGG-3’(即序列2的第701-723位)”。
[0046] 在本发明中,所述雄性不育为“盛花期花药不外挂”和/或“花药内没有经1%I2-KI染色鉴定为有活力的花粉”。
[0047] 在本发明中,所述植物既可为单子叶植物,也可为双子叶植物。其中,所述单子叶植物如禾本科植物,具体如玉米。
[0048] 在培育雄性可育转基因植物时,可将玉米突变体ms*-6044作为所述受体植物,获得相应的雄性可育转基因玉米;当然也可以像本发明的一个实施例一样,将含有所述ZmIAP1基因的载体转化到玉米品种HiII中,然后再将转基因阳性植株与玉米突变体ms*-6044杂交两次,选择定位区间内基因组背景为ms*-6044且转基因为阳性的植株,即为相应的雄性可育转基因玉米。
[0049] 在本发明的另一个实施例中,培育雄性不育转基因植物时采用的所述受体植物具体为玉米品种HiⅡ。
[0050] 本发明利用图位克隆的策略,用玉米雄性不育突变体ms*-6044与玉米自交系B73和/或自交系郑58组配BC1F1群体,将控制这一突变性状的基因定位到玉米一号染色体80.96cM到81.1cM之间,以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为140kb,共包括四个基因。其中基因号为GRMZM2G434500的序列在突变体与玉米自交系B73/郑58之间存在差异,突变体有一个1.3kb的插入,B73和郑58没有这一插入,基因编码蛋白可以正确翻译,将此基因命名为ZmIAP1。用转基因技术将ZmIAP1基因在上述玉米雄性不育突变体中互补表达,可以恢复其雄性育性。用CRISPR-Cas9基因编辑技术将玉米雄性育性正常的材料HiⅡ的ZmIAP1基因敲除,可以使HiⅡ的雄性育性丧失,不能产生有活性的花粉。
[0051] 本发明的ZmIAP1基因在玉米中能够控制雄性育性,即该基因的纯合突变或缺失能够使玉米雄性不育,在该基因突变或缺失的材料中正常表达ZmIAP1基因能够恢复雄性育性。
[0052] 本发明为玉米雄性育性研究提供了新的基因资源,其在玉米制种领域利用细胞核雄性育性基因创制不育系和保持系的应用中将发挥重要作用。附图说明
[0053] 图1为玉米突变体ms*-6044与野生型的表型对比图。其中,A、C、E、G为野生型,B、D、F、H为ms*-6044突变体。A和B,植株形态;C和D,雄穗花药外挂情况;E和F,花药形态;G和H,花粉1%I2-KI染色。
[0054] 图2为ZmIAP1基因图位克隆图。
[0055] 图3为ZmIAP1基因结构及其在玉米突变体ms*-6044中插入位点示意图。
[0056] 图4为构建互补载体PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0057] 图5为PCR产物经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后的电泳图。
[0058] 图6为ZmIAP1基因遗传互补验证图。其中,A:转基因后代群体配制示意图;B:基因型为aaBb植株的雄性可育表型;C:转基因检测(3、4、5是基因型为aaBb的植株,经鉴定为转基因阳性,1是对照,即转化玉米受体HiII时用的p3300-ZmIAP1质粒作为模板扩增所得的阳性对照);D:基因型为aaBb植株的花粉1%I2-KI染色。
[0059] 图7为ZmIAP1基因敲除验证图。其中,A:基因敲除靶点序列;B:转基因植株的PCR酶切验证,1-4为转基因植株,CK为野生型,PCR产物大小为805bp,被SmaⅠ酶切后产生大小为574bp和231bp的两个片段;C:野生型与转基因植株PCR产物测序和编码氨基酸序列比较;D:
转基因阳性植株盛花期雄穗;E:转基因阳性植株花药1%I2-KI染色;F:转基因阴性植株盛花期雄穗;G:转基因阴性植株花粉1%I2-KI染色。

具体实施方式

[0060] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0061] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0062] 玉米突变体ms*-6044:由Maize Genetics Cooperation Stock Center保存,Co-op ID:104G;Description:104G ms*-6044。该玉米突变体在该保藏中心的具体网页链接如下:http://www.maizegdb.org/data_center/stock?id=130311。
[0063] pBUN411载体:在文献“Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338(2014)”中公开过,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得,仅可用于重复本发明实验。该质粒可同时用于转录向导RNA和表达Cas9蛋白。
[0064] 实施例1、玉米雄性育性基因ZmIAP1的图位克隆
[0065] 一、玉米突变体ms*-6044的表型
[0066] 与正常植株相比,玉米突变体ms*-6044在植株整体形态方面没有异常(图1中A和B),但是其雄穗的花药不外挂(图1中C和D),经解剖其花药干瘪瘦小(图1中E和F),花药内部用1%I2-KI溶液染色未观察到饱满成熟的花粉粒(图1中G和H),表现为彻底的雄性不育现象。该现象在北京和海南连续4年观察表型一致,不育特性稳定,且在大田条件下肉眼即可区分是否为雄性不育。
[0067] 二、遗传定位群体的构建
[0068] 以玉米突变体ms*-6044为母本,以玉米自交系B73或郑58为父本组配F1,F1田间表型均为雄性可育。而后以玉米突变体ms*-6044为母本,以F1为父本构建回交群体(BC1F1),BC1F1群体在田间可分为雄性可育个体和雄性不育个体两种类型,且两种类型的比例经卡方检验符合1:1(表1)。由此推测玉米突变体ms*-6044的表型由隐性单基因控制,并将BC1F1群体做为遗传定位群体。
[0069] 表1 BC1F1群体不同表型个体的比例统计
[0070]
[0071]
[0072] Χ0.052(1)=3.84
[0073] 三、ZmIAP1基因的定位
[0074] 首先,以玉米突变体ms*-6044和玉米自交系B73、郑58的基因组DNA为模板,用玉米全基因组引物筛选在突变体和自交系之间有多态性的引物。然后,从BC1F1群体中选取雄性可育单株和雄性不育单株各10株,验证多态性引物是否与雄性育性性状连。筛选出连锁引物,用于对BC1F1群体的1060个单株测定基因型,从而结合雄性育性表型筛选出表型与基因型不符的为交换单株,并根据不同引物筛选出的交换单株个数的不同,依照减少趋势确定定位区间,由此将ZmIAP1基因定位在位于一号染色体的引物标记K204(80.92Mb)和K265(81.93Mb)之间。在K204和K265之间继续开发多态性分子标记,并用于检测BC1F1群体的所有单株,最终将ZmIAP1基因定位在K168(80.96Mb)和K163(81.1Mb)之间,参考已公布的玉米自交系B73基因组测序结果,物理距离约为140kb(图2)。其中,用于基因定位的分子标记引物序列如表2所示。
[0075] 表2用于基因定位的分子标记引物序列
[0076]
[0077]
[0078] 四、ZmIAP1基因的克隆
[0079] 参考玉米基因组测序信息,定位区间的140kb范围内包含4个基因,分别是GRMZM2G434514、GRMZM2G133968、GRMZM2G434500、GRMZM2G133943。以雄性可育单株和雄性不育单株的基因组DNA为模板,扩增这4个基因并比较其序列差异,发现只有GRMZM2G434500基因在雄性可育单株和雄性不育单株之间存在DNA序列上的差异。相对于雄性可育单株,雄性不育单株在GRMZM2G434500基因的第三外显子的第691位碱基处,存在一个1331bp的插入(图3)。因此推测候选基因GRMZM2G434500即为要克隆的ZmIAP1基因。
[0080] 以玉米自交系B73的基因组DNA为模板,采用引物对F1/R1进行PCR扩增,所得PCR产物的序列为序列表中序列2,序列2即为ZmIAP1基因在玉米基因组中的序列。提取玉米自交系B73的总RNA,反转录为cDNA,采用引物对F2/R2进行PCR扩增,所得PCR产物的序列为序列表中序列3,序列3即为ZmIAP1基因的cDNA序列,其中第249-1997位为CDS。序列2和序列3均编码序列表中序列1所示的ZmIAP1蛋白。
[0081] F1:5’-CTCACAGCAAATTCGTCTCAC-3’;
[0082] R1:5’-TTAAAATTAAGGGAAAATTAAATAG-3’。
[0083] F2:5’-TCGTCATCCAGCTCCGTT-3’;
[0084] R2:5’-GCCTAGTCCCTAGACCATGCTGAA-3’。
[0085] 实施例2、玉米雄性育性基因ZmIAP1的功能验证(互补实验)
[0086] 一、互补载体的构建
[0087] 设计针对ZmIAP1基因的基因组序列的特异引物。具体序列为:
[0088] P1-F:5'-CCAAGGGTGACAGAATACA-3';
[0089] P1-R:5'-ATTGCGATGGGAGCGTAT-3'。
[0090] 其中,P1-F位于ZmIAP1基因起始密码子ATG上游3323bp,P1-R位于ZmIAP1基因终止密码子下游1404bp。
[0091] 以玉米自交系B73的基因组DNA为模板,采用引物对P1-F/P1-R进行PCR扩增,扩增获得的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带(图4)。进一步将目标条带胶回收测序,显示其序列如序列表中序列4所示。
[0092] 将此PCR产物(序列4)用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物经过1.0%的凝胶电泳检测,如图5所示,得到两条条带,长度分别为5.2kb和1.3kb左右,将5.2kb(上游1919bp+ZmIAP1基因1922bp+下游1358bp,即序列表中序列4的第1405-6602位)的目的条带回收,与经同样双酶切的pCAMBIA3300的骨架大片段相连,经酶切和测序鉴定,构建成为互补载体p3300-ZmIAP1。
[0093] 重组表达载体p3300-ZmIAP1的结构描述:将pCAMBIA3300载体的酶切位点KpnⅠ和HindⅢ之间的小片段替换为序列表中序列4的第1406-6601位所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0094] 二、玉米遗传转化实验
[0095] 由天津吉诺沃生物科技有限公司完成重组表达载体p3300-ZmIAP1向玉米杂交种HiⅡ的遗传转化,具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化。
[0096] 三、转基因后代群体配制
[0097] 为鉴定ZmIAP1基因的功能,将转p3300-ZmIAP1载体的T0代转基因植株配制成群体。
[0098] 在此,将玉米基因组上正常的ZmIAP1基因以基因型AA表示,突变的zmiap1基因以基因型aa表示。玉米受体HiⅡ是雄性育性正常的材料,因此ZmIAP1基因在HiⅡ中的基因型是AA,而在玉米突变体ms*-6044中的基因型是aa。同时,将转基因阴性植株或非转基因植株的基因型以bb表示,将转基因阳性植株(即含有ZmIAP1基因的互补载体片段已整合到玉米基因组上)以B表示,那么转基因杂合植株的基因型是Bb,转基因纯合植株的基因型是BB。
[0099] 转基因后代群体的配制(图6中A),首先以T0代转基因阳性植株(AABb)为父本,玉米突变体ms*-6044(aabb)为母本,组配F1。F1群体包含两种基因型,即AaBb和Aabb。提取F1各个单株的基因组DNA鉴定其是否为转基因阳性(B)。选择转基因阳性植株即AaBb基因型单株为父本,以玉米突变体ms*-6044(aabb)为母本,再次杂交,其后代共产生四种基因型:AaBb、Aabb、aaBb、aabb。其中aaBb基因型的单株,在玉米基因组上一号染色体定位区间内的基因型为aa(确定方法是通过在定位区间两侧的连锁的多态性分子标记,即定位区间右端K10和定位区间左端K57,来扩增单株的基因组DNA,得到的条带带型与HiII一样,就认为这一段来自HiII,得到的条带带型与ms*-6044一样,就认为这一段来自ms*-6044。我们将ZmIAP1基因两侧的分子标记都用来做这个检测,两侧的分子标记都同时是ms*-6044材料的带型,就确定这一段基因组DNA来自突变体ms*-6044,如果基因组DNA双链都是来自ms*-6044,那么在这一区间内的目的基因的基因型就是aa),由此对应的表型应为雄性不育,然而由于转基因阳性(Bb)使得玉米基因组上整合了ZmIAP1基因,aaBb基因型的单株的表型实则应为雄性可育。
[0100] 其中,确定是否为转基因阳性的方法具体如下:将转基因后代群体中的单株提取基因组DNA,以此为模板,以P2-F和P2-R为引物,扩增获得大小1396bp的目的条带为转基因阳性,无此条带为转基因阴性。同时以转化前的p3300-ZmIAP1质粒为模板进行扩增,做为阳性对照。
[0101] P2-F:5’-CTCCACCATGTTATCACATCAATCC-3’(位于pCAMBIA3300载体上启动标记基因的CaMV35S启动子上)
[0102] P2-R:5’-CGTCTTTGTCTTTCGCGTAGC-3’(位于p3300-ZmIAP1的酶切位点KpnⅠ和HindⅢ之间的插入片段上,即序列4的第2185-2205位的反向互补序列)。
[0103] 图6中C的泳道3、4、5为鉴定为转基因阳性的基因型为aaBb的植株,泳道1是以转化前的p3300-ZmIAP1质粒为模板的结果,是阳性对照。
[0104] 其中,植株表型是否为雄性可育,具体通过如下两种方法鉴定:1、观察盛花期雄穗的花药是否外挂,不外挂为雄性不育,外挂为雄性可育。2、花药内部用1%I2-KI溶液染色,未观察到黑色圆形饱满成熟的花粉粒为雄性不育,观察到黑色圆形饱满成熟的花粉粒为雄性可育。
[0105] 最终,本发明检测的4个转化事件共63个aaBb基因型单株其表型均为雄性可育(图6中B和D,图中显示盛花期花药饱满且外挂,花药内经1%I2-KI染色全部花粉均呈现黑色圆形饱满状,鉴定为有活力的花粉),同时分离出的33个aabb基因型单株的表型均为雄性不育(盛花期花药干瘪且不外挂,花药内没有经1%I2-KI染色鉴定为有活力的花粉)。由此得出,转化的ZmIAP1基因可以互补ms*-6044纯合突变的雄性育性表型。
[0106] 实施例3、玉米雄性育性基因ZmIAP1的功能验证(敲除实验)
[0107] 除了上述互补实验,本发明的发明人还设计实验将玉米雄性育性正常的植株中的ZmIAP1基因进行编辑。具体是采用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated 9)基因编辑系统,对玉米受体植株中ZmIAP1基因的基因组序列进行定点编辑。CRISPR-Cas9技术可针对基因组上特定位点DNA进行切割,利用生物体对DNA链的修复无法每次都保证100%正确的特点,重新连接的DNA链在序列上与未被切割前会产生差异,从而使得基因序列发生变化,其编码的蛋白质也随之变化。
[0108] 具体到本实验中,根据CRISPR-Cas9系统的特点,选取ZmIAP1基因的第二外显子上含有SmaⅠ酶切位点的特定序列做为sgRNA(single guide RNA)靶点序列(图7中A),并将其连入到pBUN411载体(除草剂抗性),构建成为ZmIAP1基因敲除载体,并采用农杆菌介导的方法转化玉米受体HiⅡ。该部分的载体构建和玉米遗传转化工作是委托天津吉诺沃生物科技有限公司完成的。具体操作如下:
[0109] (1)设计靶位点
[0110] 5’-GAACGCGCGGGCCCGGGTGCTGG-3’(即序列2的第701-723位)。
[0111] 由于该靶位点序列中含有SmaⅠ酶切识别序列(斜体下划线的序列),可以被SmaⅠ限制性内切酶切割。靶序列区域被CRISPR-Cas9核酸酶识别切割,自身修复后,如果发生了突变,则SmaⅠ酶切识别序列被破坏,将不能被限制性内切酶SmaⅠ切割;如果没有发生突变,将可以被限制性内切酶SmaⅠ切割。
[0112] (2)用限制性内切酶BsaI酶切pBUN411载体,回收约12.4kb的载体骨架,命名为BUN411。
[0113] (3)根据步骤(1)设计的靶位点序列,合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物:
[0114] ZmIAP1F:5’-ggcgGAACGCGCGGGCCCGGGTGC-3’;
[0115] ZmIAP1R:5’-aaacGCACCCGGGCCCGCGCGTTC-3’。
[0116] (4)将ZmIAP1F和ZmIAP1R进行退火,形成有粘性末端的双链DNA,将其和步骤(2)中的胶回收产物BUN411连接,得到重组质粒pBUN411-ZmIAP1。重组质粒pBUN411-ZmIAP1的结构描述为:将pBUN411质粒的两个限制性内切酶BsaI的识别序列之间的片段(约1.1kb)替换为DNA片段“5’-GAACGCGCGGGCCCGGGTGC-3’”后所得的重组质粒。
[0117] (5)将构建好的重组质粒pBUN411-ZmIAP1通过农杆菌转化的方法导入玉米品种HiII。以HiII未成熟胚及愈伤组织为转化受体,转化后经过组织培养获得完整再生植株。
[0118] 经过转化pBUN411-ZmIAP1获得完整的转基因植株后,提取转基因植株基因组DNA,用能够扩增含有靶位点序列的特异引物对T3-F/T3-R进行PCR扩增,PCR产物用SmaⅠ单酶切。
[0119] T3-F:5'-CGCCCCTGGTGTCGCAGTACA-3'(序列2的第484-504位);
[0120] T3-R:5'-CGCCGACAGGATCACCTCGTTC-3'(序列2的第1267-1288位的反向互补序列)。
[0121] 其中,T3-F位于SmaⅠ酶切位点上游231bp,T3-R位于SmaⅠ酶切位点下游574bp。
[0122] 以转基因植株的基因组DNA为模板,扩增获得的PCR产物用SmaⅠ酶切后经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。如果PCR产物可以被SmaⅠ酶切,则说明该位点没有发生变异,称之为转基因阴性;如果PCR产物不能被SmaⅠ酶切,则说明该序列已经发生变化,ZmIAP1基因被定点编辑成功,称之为转基因阳性(图7中B)。将无法被SmaⅠ切开的PCR产物测序,以其中一株为例,发现其与野生型相比,转基因植株在ZmIAP1基因的第二个外显子上缺失7bp,导致氨基酸移码和翻译的提前终止(图7中C)。
[0123] 参照实施例2中的方法观察检测转基因阳性植株的雄性是否可育。实验同时设置了转基因阴性的对照,向玉米品种HiII导入了pBUN411空载体的对照,以及未转基因的玉米品种HiII野生型对照。每种实验材料的供试植株数不少于80株。
[0124] 结果显示:在表型上,转基因阳性植株花药干瘪不外露,无可被1%I2-KI溶液染色的花粉,表现为彻底的雄性不育;而转基因阴性植株花药饱满且外挂,散出的花粉可以被1%I2-KI溶液染色,表现为雄性可育(图7中D、E、F和G)。而空载对照和野生型对照的花药表型及1%I2-KI溶液染色结果均与转基因阴性植株结果相似,无显著差异。由此得出,ZmIAP1基因被敲除会导致玉米雄性不育的表型。另外,转基因阳性植株除了雄性不育外,其他表型和性状与未转基因的对照玉米植株相比基本上没有差异。
[0125] 综合以上各实施例的研究结果,可见:通过图位克隆、基因的互补实验和敲除实验,本发明克隆的ZmIAP1基因是控制玉米雄性育性的基因,其突变可导致彻底的雄性不育,且对其他性状没有明显的负面影响,可以在玉米制种过程中得以利用。
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