[0001] （一）技术领域本发明涉及作物育种技术领域，特别涉及一种萝卜细胞核雄性不育系及其选育方法。

[0002] （二）背景技术雄性不育在高等动植物中普遍存在，据统计，人们至少在617个种和种间杂交种中发现了雄性不育现象，它分布在43个科的162个属的植物中，几乎涵盖了所有的栽培作物。

[0003] 十字花科植物大多为异花受粉作物，存在着明显的杂种优势，但由于它们的花器较小，人工去雄操作费时费力，且一次授粉获得的杂交种子很少，为解决这一问题，育种工作者选用自交不亲和系育种，但自交不亲和系易受环境等因素的影响，亲和性不稳定，经常出现制种纯度不高的现象。利用植物雄性不育系进行杂交制种，较好地解决了自交不亲和系制种的问题，并可提高杂交种子的纯度，增加农作物的产量，己成为国际种业的主要发展方向。萝卜雄性不育系育种是开展研究较早，并且进行商业化应用较为成熟的一项技术。

[0004] 目前在生产上使用的萝卜雄性不育系，通常是由细胞质基因和细胞核基因共同互作，形成的一种雄性不育现象，萝卜的不育细胞质一般有Ogura-CMS(orf138)、Kos-CMS(orf125)、DCGMS-CMS和NWB-CMS等类型，但最常见的还是Ogura不育类型；由线粒体基因orf138和细胞核中的两对隐性基因控制，不育系基因型为Sms1ms1ms2ms2，保持系基因型为Nms1ms1ms2ms2 ，（S为不育型细胞质，N为正常细胞质)。萝卜雄性不育表现为花药退化，或不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊发育正常。保持系则具有正常的雄性和雌性器官，自交能正常结实，当与不育系杂交时，能够保持不育系的不育性。

[0005] 萝卜细胞质雄性不育基因存在于线粒体DNA上，主要是由于线粒体基因组分子内或分子间频繁重组所形成的异常嵌合基因造成的，目前研究认为，Ogura不育类型雄性不育的主控基因为orf138, orf138与线粒体基因组中具有正常功能的基因共转录，产生异常转录本和翻译产物，从而在花药发育的某个时期干扰线粒体的正常功能发挥，最终导致雄性不育现象的发生。线粒体基因组的转录和翻译产物尽管只占整个细胞基因组产物的很少部分，但其转录和翻译情况比较复杂。当用恢复系与不育系进行杂交时，恢复系中的恢复基因能够产生一种PPR蛋白，该蛋白抑制orf138的表达，从而达到育性恢复的目的。

[0006] 到目前为止所知的萝卜雄性不育类型中，Ogura雄性不育是导入率和稳定性方面最优秀的不育材料，同时Ogura雄性不育也是目前研究最为深入的一种雄性不育材料，日本学者Yamagishi通过对野生种、栽培种等不育材料进行测序，将Ogura雄性不育基因orf138分为九个类型（如下表）。据有关资料研究，A型与F型具有相同的恢复和保持关系，尽管有的碱基变异导致了氨基酸发生了变化，但目前通过试验验证，能够明确导致雄性不育的有A、B、D、F、H型，其它类型还有待验证。

[0007] 注：表中Δa栏的“+”为基因中缺失39个碱基对；Orf138类型中A为最早发现的测序的序列；其它栏中“””为与A型没有变化。

[0008] 在日本发现Ogura后，我国从上世纪70年代初先后发现萝卜雄性不育株，开始了萝卜雄性不育系的育种工作，到80年代中期已先后育出了多个品种在生产上推广，如山东的鲁萝卜三号、辽宁的红丰一号、山西的国光、丰光、河南的郑研等品种。

[0009] 随着生物技术的不断发展，科技工作者将萝卜Ogura雄性不育基因先后引入到油菜、甘蓝、大白菜、花椰菜等多种十字花科作物上。我国目前发现和使用的萝卜雄性不育系同样为Ogura细胞质雄性不育，目前全世界范围内使用的萝卜雄性不育系几乎全部为Ogura细胞质类型，随着雄性不育材料使用的越来越普及，萝卜及其它十字花科作物的细胞质类型将严重单一化。

[0010] 在十字花科中，细胞核雄性不育现象相对于细胞质雄性不育要少，目前仅在大白菜、甘蓝、油菜、小白菜等作物的自然群体中发现了显性或隐性核雄性不育材料。如南京农业大学上世纪80年代在小白菜中发现细胞核雄性不育材料，并利用“两用系”进行杂交制种；福建省农科院在当地菜心品种“七叶心”中发现核雄性不育材料，并获得了雄性不育两用系；沈阳农业大学在小青口、二青帮大白菜品种中获得了隐性核基因雄性不育材料；沈阳市农科所在“万泉青帮”地方大白菜品种中发现了显性核基因雄性不育材料，并提出了“显性核基因雄性不育与显性上位基因互作”雄性不育遗传模式，最终获得了具有100%不育率的大白菜雄性不育系；中国农科院在甘蓝的自然群体中发现了显性核基因控制的雄性不育材料。在萝卜的研究中，国内还没有在自然群体中发现由核基因控制的雄性不育材料的报道。

[0011] （三）发明内容本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种拓宽利用范围、避免细胞质单一问题的萝卜细胞核雄性不育系及其选育方法。

[0012] 本发明是通过如下技术方案实现的：一种萝卜细胞核雄性不育系，其特征在于：所述不育系是由一对隐性核基因控制的雄性不育系，其育性遗传稳定，不受环境等因素的影响，雌蕊发育正常，雄蕊完全退化，无有效花粉，其保藏号为CCTCC No:P201411，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年10月26日，分类命名为萝卜雄性不育系136S Raphanus sativus L.。

[0013] 本发明所述的萝卜细胞核雄性不育系的选育方法，包括如下步骤：（1）以雄性不育株为母本，以同一自然群体中的可育株为父本进行测交，同时该父本自交；
（2）对测交和自交所得的种子进行春化处理，通过春化后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对杂交后代的雄性不育情况进行观察统计；
（3）以测交后代的不育株为母本，可育株为父本进行杂交；同时以具有正常细胞质的可育株为母本，以测交后代中的可育株为父本进行杂交；
（4）将杂交收获的种子经过春化处理后播种于隔离网室中，开花后进行育性调查，确定种子中的不育株为细胞核控制的雄性不育系；
（5）通过转录组测序，找到了雄性不育系所独有基因转录组，并设计引物用cDNA进行PCR验证，获得了雄性不育系独有的4个mRNA。

[0014] 本发明的更优技术方案为：步骤（1）中，在地方品种自然群体中发现雄性不育株，用Ogura特异引物：ORF-F 5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'，和ORF-R 5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3'，对不育材料叶片DNA进行PCR分子标记，没有出现特异条带的，说明该不育材料不含有Ogura雄性不育基因，不属于通常使用的Ogura细胞质雄性不育类型。

[0015] 步骤（2）中，对测交和自交所得的种子每份取50粒，用35℃的温水浸泡3小时，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后，放入2-4℃的冰箱中进行春化处理25天，通过春化后的种子播种于隔离网室中。

[0016] 在进行萝卜细胞质雄性不育的研究中，我们在山东的一个地方品种中发现了一株雄性不育单株，以雄性不育株为母本，以本品种的其它可育株为父本进行杂交，在20个杂交组合的后代中，有一个组合的后代中出现了50%可育与50%不育株的表现型，继续以该组合的父本自交后代与不育株杂交，在杂交后代中，有的组合育性完全恢复，有的组合仍然出现可育株与不育株各50%的现象，并且在父本的自交后代中出现了育性的分离现象，可育株与不育的比例为3：1；同时在不育株与保持材料的杂交后代中，可育株的自交后代同样出现了育性的分离，可育株与不育株的比例同样为3：1，我初步确定该不育材料为细胞核控制的雄性不育。

[0017] 雄性不育基因的确定与定位方法包括如下步骤：（1）线粒体与叶绿体全测序
为了寻找该不育材料的不育基因，我们对该不育材料和一个Ogura细胞质雄性不育类型的保持系进行了线粒体与叶绿体全测序。为保证样品纯度，防止出混杂现象，在提取线粒体和叶绿体DNA过程中，我们分别从一个单株提取样品，根据线粒体和叶绿体DNA的提取方法，提取了含有线粒体和叶绿体的混合DNA样品，进行高通量DNA测序，测序深度在1000倍以上，经过De novo程序组装及PCR查补间隙，完成了线粒体和叶绿体的测序组装工作（两个DNA序列还未发表），通过本地Blast，两者的线粒体DNA完全一致，叶绿体DNA新型不育系仅比对照品种在其镜像重复区内多出了31个碱基的重复，其它完全一致，对发生变异的区域进行基因和开放阅读框（ORF）比对、寻找，该区域不在已明确的叶绿体基因内，也未发现有大于150bp的ORF存在。

[0018] （2）生物遗传学试验验证。

[0019] 试验一：以对照品种为母本，以不育系和保持系的杂交后代中可育株为父本进行杂交，获得F1；取20料F1代的种子进行萌动、春化处理，开花后，每个F1代单株进行自交，获得F2代种子；每株F1代取50粒自交的F2代种子，同样进行萌动、春化处理，观察其育性分离情况。

[0020] 表1 F2代育性分离情况在20株F2代中，有11株为全部可育，9株出现育性分离，合计可育株330株，不育株108株，基本符合核隐性基因的遗传规律。

[0021] 试验二：在该不育材料保持系的选育中，凡是能够给不育系保持的单株，其保持能力都是50%。对具有保持能力的单株自交，在其85株自交后代中，有64株为可育株，21株不育株，约为3：1，符合孟德尔单基因隐性基因控制性状的遗传规律；我们又以23个可育株中的15株分别与不育株杂交，种子成熟后，经春化处理，15个组合中，有5个组合的后代育性完全恢复，有10个组合的后代仍然出现各50%的不育株和可育株。

[0022] 我们以“M”代表育性基因的显性性状，以“m”代表育性基因的隐性性状，通过以上的试验可以断定，该雄性不育为隐性基因性状，其基因型为“mm”，雄性可育的基因型为“MM”或“Mm”，其中“Mm”型为保持系。当“MM”型可育株与不育系（mm）杂交时，后代基因型为“Mm”，全部可育；当“Mm”型可育株与不育系（mm）杂交时，后代基因型为“Mm”和“mm”，有50%的可育株，50%的不育株。

[0023] 3）取该材料的雄性不育系与保持系的花蕾进行转录组测序，获得了多条雄性不育系所独有的转录，并根据测序组装得到的基因转录组设计PCR引物，将RNA转化cDNA进行PCR验证，最终获得了4个雄性不育系所独有的基因转录组Unigene1、Unigene2、 Unigene3、Unigene4。

[0024] 本发明具有以下优点：（1）萝卜细胞核雄性不育系的发现，拓宽了萝卜雄性不育系的利用范围，原有的Ogura细胞质类型不育系，是由细胞质基因和两对核基因共同作用的结果，在保持系的选育上难度很大，有的材料根本就选不出保持系。萝卜核雄性不育系是由一对隐性基因控制，在进行保持系的转育和选育上相对容易很多，对一些不能利用细胞质不育系的材料提供了新的育种途径；
（2）本发明涉及的核隐性雄性不育，避免了Ogura细胞质雄性不育造成的十字花科作物细胞质单一问题；
（3）本发明涉及的核雄性不育系是萝卜中的首次发现，具有雄性不育株花药退化彻底，雌蕊发育正常的特点，能够进行杂交种的配制与选育。

[0025] 本发明打破了传统萝卜雄性不育仅有细胞质不育类型的局限，为萝卜利用雄性不育育种开辟了新的途径，同时该不育材料的发现对于解决萝卜雄性不育材料基因单一具有十分重要的意义。

[0026] （四）附图说明下面结合附图对本发明作进一步的说明。

[0027] 图1为本发明136S线粒体基因组图；图2为本发明136S叶绿体基因组图；
图3为本发明136S与45B叶绿体基因组DNA的差别比较图；
图4为本发明萝卜细胞核雄性不育系的选育方法步骤图；
图5为本发明136S与136F的基因差异表达图。

[0028] （五）具体实施方式一种萝卜细胞核雄性不育系的选育方法，包括如下步骤：
（1）在地方品种136自然群体中发现雄性不育株（136S），用Ogura特异引物：ORF-F 5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'，和ORF-R 5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3'，对不育材料叶片DNA进行PCR分子标记，没有出现特异条带的，说明该不育材料不含有Ogura雄性不育基因。

[0029] （2）对136S和对照品种45B进行线粒体和叶绿体测序45B是Ogura细胞质雄性不育系的保持系，一般被认为具有正常的细胞质。对136S和对照品种45B的叶片提取叶绿体和线粒体，为保证样品纯度，防止出混杂现象，在提取线粒体和叶绿体DNA过程中，分别从一个单株提取样品，根据线粒体和叶绿体DNA的提取方法，提取了含有线粒体和叶绿体的混合DNA样品，进行高通量DNA测序，叶绿体测序深度在600倍以上，线粒体测序深度在100倍以上，根据测序深度的不同，经过De novo程序组装及PCR查补间隙，先组装叶绿体；组装完成叶绿体后再用相同的方法组装线粒体，对De novo组装的Contig先与叶绿体DNA序列进行比对，剔除叶绿体DNA部分，再进行线粒体组装，组装拼接方法与叶绿体相同，最后再用PCR的方法，将叶绿体与线粒体相同的DNA序列进行甄别。完成线粒体和叶绿体的测序组装工作（两个DNA序列还未发表）后，通过本地Blast，两者的线粒体DNA完全一致，叶绿体DNA新型不育系仅比对照品种在其镜像重复区内多出了31个碱基的重复，其它完全一致，对发生变异的区域进行基因和开放阅读框（ORF）比对、寻找，该区域不在已明确的叶绿体基因内，也未发现有大于150bp的ORF存在。由此说明，136S不育材料在细胞质上与正常可育株没有明显的区别（136S线粒体基因组图见图1，叶绿体图基因组见图2，叶绿体突变区域见图3，图3中注：使用Vector NTI软件对136S雄性不育叶绿体与正常可育株
45B叶绿体进行比对，在基因组的镜像重复区，136S多出了31个碱基）。

[0030] （3）136S不育系和保持系的选育如图4。

[0031] 2012年春在纱网隔离条件下，以雄性不育材料136S作母本，以同一自然群体中的可育株作父本进行测交，做测交组合31个，同时与五不同品种进行测交，测交组合147个，每个测交组合的有效结籽粒数都在50粒以上；测交父本自交的有效结籽数也在50粒以上。

[0032] 2012年秋，7月初，对测交和自交所得的种子每份取50粒，用35℃的温水浸泡3小时，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后，放入2-4℃的冰箱中进行春化处理25天，通过春化后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对测交后代的雄性不育情况进行观察统计。雄性不育株的标准为，雌蕊发育正常，雄蕊完全退化或不能形成有效花粉。

[0033] 在测交一代中出现具有部分保持能力的单株2株，其保持能力都在50%左右；这两株都是出现在136的自然群体中的可育株，其它品种的测交后代全部为可育株，没有选出具有保持能力的单株。2株具有保持能力的单株，在自交后代中也出现了育性的分离，一株为不育株12，可育株37；另一株为不育株11，可育株36。

[0034] 以测交后代的不育株为母本，可育株为父本进行杂交（FA2）。以具有正常细胞质的可育株45B为母本，以测交后代中的可育株为父本进行杂交（FB1）。

[0035] 2013年春将2012年秋收获的种子经过春化处理后播种于网室中，开花后进行育性调查，以测交后代的不育株为母本与可育株杂交后代FA2中，出可育株和不育株各50%；以具有正常细胞质的可育株45B与测交后代中的可育株进行杂交，其后代FB1中全部为可育。

[0036] 以FA2后代中的不育株为母本，可育株为父本杂交（FA3）；FB1进行自交（FB2）。

[0037] 2013年秋对春季收获的FA3和FB2代种子进行春化处理，通过春化后种植于网室中，开花后调查育性，FA3后代中可育株和不育株各占50%；对于新型不育材料连续选育了5代，形成了稳定的不育系（136S）和保持系（136F）。

[0038] 在FB2代中有11个FB1的后代为全部可育，9个FB1的后代出现了育性的分离，出现育性分离的FB2代，共有330个可育株，108个不育株，约为3：1。

[0039] 此试验结束后，已基本明确该不育材料为核基因控制的隐性单基因雄性不育，以其测交后代中的不育株为不育系（136S），可育株为保持系，选育出了稳定的具有50%保持能力的保持系。136S不育系的育性退化彻底，经过多代观察，其育性不受环境等因素的影响，花药完全退化，不能形成具有功能的花粉，雌蕊发育正常。不育株的花器略小于可育株。

[0040] （4）136S特异cDNA引物的筛选取136S与其保持系两个材料的花蕾进行RNA测序。取样时取整枝花序未开放的全部花蕾，每个重复取一个单株，每个材料3个重复。测序工作由测序公司完成。提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后再合成第二条cDNA链，经过纯化、洗脱后，做末端修复、加poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库（200bp）用Illumina HiSeq 2000进行测序，以组装完成的Unigene进行基因的差异表达分析。

[0041] 在11万个Unigene中，差异表达的基因3391个（见图5）136S与136F（保持系）比较，调高表达的基因745，调低表达的2645个。在745个调高表达的基因中，136S所独有的有11个基因，以这11个基因的mRNA序列设计引物，将136S与136F的RNA转化为cDNA，用设计的特异引物进行PCR扩增验证，最后筛选得到4个136S所独有的mRNA。分别是：Unigene1
CAATGGTCACTATCTGCTAGTTCCAGCAGCTTCCTCTTGATGGCATCAGAGCAAAGACGAGCCATCATACGGTGGAAGGAAAGAAGATCAGACAAACGCTCTGCGGACAGCTTGTCCATTGCCCTCTCATGCTCCTCTTTCCTCTTCATCCTCTTCATATACACACACGAGTTCCTCACCGTCGCTCCCATCTGCTTCAGCCTGTTCTCTTCTTGCTTGCTTAGAACCGTTTTTGCCTCCAAAAGCTCATCTCCTGAGAAGCTTTTGACTAGCGTCTTCTTCACCACAATCTTTGTTGCATCTAGTTGCTTCTTCTGAAACACAGTCACAGCTTTCACAAACTCCCGGTAAACAGAAACACATCCTGGATAATCAAACTCATCGTCAGAGAGCCTCATCCTCTCGGGATGAAACTGCAGACCCATCAGAAACCGACCTTCCTCTGGATCATACCGGTTCGGATCATAGAACCCTTCTACCAAGCCATCAGGAGCGTAAGCCATAGGCACAAAACGCTCCGCGAGCCTCTTCACACCTTGATGATGATACGAATTCACCATGATCTGATCCATCTCATCGAACCATTCGTGCAGCGGCGTCTCCTCCACGAGCCTAGCCTCGTGCCTGTGCTCATCGTAGTTCTCGTAGTCTATATGCTTCGTACTAGTTCCAACTTCTTTGTCGATGTCTTGGTACAGAGTTCCTCCGGCTGCGACGTTGAGGATCTGAGAGCCACGACAGATGCCTAAAAAGGGAATGTTTCTTTCGAGACAGAGCTTGGCTAGACTCAGCTCGATGCTGTCTTTCTCTCTGTCTATCGTCGTGTCGCTTGCGTGCAACGTCCTGATCTCATCCATGTCCTCCTGAGAAAGTCCAGGTAGCTCTTCGTCTGCGTAGAGAGAAGGGTCGACGTCTTCTCCTTCGCAGAGGAGGACGCCGTGGATAGGCTCGAAGCTCCGGAGCATAGAGTGGATCCCGCTTACACGTGGGACGATGACAGGGACGGCGCCGTGTGAGACGATGAGGTCGAGATGGTACTCTCCTACGAAGTCAACGAACTTGTTCTTGCGTAGAGTCCGACGAGAGACGACGAGAACTCTCGGGAGAGTCTTGGACGAGAGATCATCATTGTTAGCGACAACCACCACCATCCTTGATTAAAGTTTTGTTTATGTCTTAAC；
Unigene 2
AACTAGATTTACAAAGGACTATAAATGTCCGTACAATTAGAAGATTTCAAATAGTGTTTTACTACGTAGAAGAGGTACATACACACTCGTAACAGCGCAAACGTAAATATTACAAACATAACCAGATTTTTTTGTATTACGGAAAGTAAACAACCAAATAAGCATACAACATATTGATTATCTAAAAGGGAAATTAAATAGTACAAATCATACAGAAATATATATGCGTAATCAACTAAACCAAAACACACCACACTGATACATTTCACTATAGTATAAGAGACAACAAACCCCATGAAGTATATAATTATTCAAGGACTCGATTTAGATGTAGTAGGCGGAGGAGAGAACATCGGAATGGATGGGAAATTAGTCGGGAGAGAAGGAATCGTTGTGGGGAATGAAGGTAAAGTTGGCATTGGAATAGGAGGGATTGAAGTGGGAATTGTGGGAAGAGTTGTTTGTGGCAATGTTGATGGCAGTGGAGGGATTGAAGTGGGCATGGTGGGAAGAGTTGGTTGTGGCAATGTAATTGAAGTGGGCATTGTGGGAAGACTTGGTTGTGGCAAGGTTGATGGTAACGGAGGTAGTCCCACTGTTGGGATAGACATATTTGGAATTTGAGGAAGAGGTTGTTGCTGGAGAAGATGGCGTGAGGCCGAGCAAGTGTTGATCGTAATAGAGGAAGAAAGGCTCACTAAGACAGCAATGAGAAAAAGCTTGAATGATGCCATTTTGGATGTGTTGATGAATTCTCTTTTATTATGGTTAAGCCACTCTTTAATTGCTTCTTTAGTTATTG；
Unigene 3
TACGAGATGCTCGGAACCTTCAAAGTTCAAACCATGGGAGCCTCATTACAATCACATTTCTGAGCATACGTGGGTGCTAAATGAAAGATTTTAAAACAAGTGTTGATTTTTTTTCCATCTGAGCGTCAGATATCCATATCTTCAAACCATTGGAGCCTTATTACTTCGGGCTTTTTTATTTCAAATATTCGTCATTTACATTGGTACTTTAGATCTTTTCCACATATATTATTACACCAAACCAATGATGTGACACATGCAGGATTCAAATACCACCACTTAGAATCTTGTCATTAGGAATGTCGCTGCAGTAGTCGCATAAGCATTTAACATCAACGGTACCGTAATCTCCCCAAATGCATGTTCCACCTTGTGCGCCCTTGTCCTTACGGCAATTTGTATAACAAAACGAGGGAAATATCTCAGGCGCACAGAAGCTGAAACCCACATCGCCGCCGTATTCTACCAGGCACTCGTCATCATGCGCTTCTATCTCCGGCACTTCAAAGATAACCAAAACGAGGATGAAAATGATGGCGAAAGAAGAAACTGATTTCGTTGCGAATGCCATCTTCTCTGCTCTATATCTCTCTGTCTACTCTTTACTTCTC；
Unigene 4
GCGTAGACACAAATACATATTAGTTAAAGAAATACATGTCGAGGTTTTGATCACATTGATCACAATATAACAGAACATATTACAATACATAAGTCTCTTGTTTAGTTGCATACAATACACCATAATACAGTTCATGTCTATTATCACAAAGACATAGCAACAGCCTGTTACTTAAACCCGACAATCATGCCTATTATCACAAAGACAACTACCATAACACCTATAATGAGTTCAAAGCCATTGGAAACCCTAGATTTTGTTTTAGCTAAGTCACACACAATTCTCTCAAGCCTAACCAACTTGTCCTCTGTCTCGCTTTGCAGTTCCTTTACCTGGTTAAGATGAGTGTCATAGTCACTCATACAGGAGAGATAATCAACCTTATCAGAGAGCTGCTGACAGTGACTCGATATGGCTCTGATCTCCTCCGTTGCCGCGACATCCCACCACTTCCAGACATGGCAGTCTCCATCGTCTCTGTTCTCGCAGGTATAGAACCTTCTCCCAGGATCATTCCTTGTGTACGATGTGGCTGTCAGCGGTTCGGCACCACAGTAGCATTCCTTTGGGAAGCCGAACTCAACCTCGGGCTGGGGAGGATAGTAAATCCGTGCAGCATCAATTTCAGCTTGGTCCAAAAGTATATCAATTTCAGCTTCTGTCTGGCTGAACCCACTCTCTGCTGAGTCCCCTAAACCATAGTCCTCCGACTGAGACGGCTGCGTGTAACTATAATCCTGCCCCATATCTTGTGTAACCTGAAAAACAACCTTCACTTAACATAATTCAAATAAGAACATATTACCATGAGCGGCGTAGATGTCATGAGCCACCTTTAGCACGTCATTGTCATTCTGACCGCTGCTTATTTGTCTCTCTGCAGCAGCGAATGCAGCGCAGAACTTGTTGGTCTGATCATTGATTTTGTGCCATCTCTGCTTGCAATGGAGTAGCTCTCTCTTCTCACCTAAGGCACGTCCAACATAATCTCCTACGCGGTCCCAGAAGGTCCCAGACGTCTGGTCATTTCCGACAATTGCATCCTTTGATGTGTTCAGCCACGCACTGATTAGTATCTCATCATCAGCTGGCGTCCATTTTCTTCTCACCTGACGAACCGGGCGTCTGGCTTCAGGTTGGGATGGAGCCTCAGATTGCTGGGAACTGAAGGGAGGGATTTCAGAGGCTCCCATGTTTAGACTAGAAGGAAAACTTTCATAAGGAAAGTTTTCCTGAACAACATTTTCTTCTACGTTGTGAAGAAGGTTTACATAGCCAGTATACTGGCTATATGTATTCCTTGAGTTCATAGGAACAAGGACAGAGAAGAGATATTTAGAAAATAACTATTACTGTAAGC；
其中，
Unigene 1-primer:
F: TCATCCTCTCGGGATGAAAC
R: CGTCGACCCTTCTCTCTACG
PRODUCT SIZE: 518, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 1.00；
Unigene 2-primer：
F: CGTAACAGCGCAAACGTAAA
R:TCCAAAATGGCATCATTCAA
PRODUCT SIZE: 653, PAIR ANY COMPL: 2.00, PAIR 3' COMPL: 1.00；
Unigene 3-primer：
F: CTGAGCATACGTGGGTGCTA
R: TAGAAGCGCATGATGACGAG
PRODUCT SIZE: 433, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 3.00；
Unigene 4-primer：
F:TCTGGCTGAACCCACTCTCT
R:CCTCTGAAATCCCTCCCTTC
PRODUCT SIZE: 525, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 0.00。

[0042] 用所筛选的4个特异引物Unigene 1-primer，Unigene 2-primer，Unigene 3-primer，Unigene 4-primer对雄性不育系136S的cDNA进行PCR扩增，有特异条带出现的即为不育系，否则为保持系或其它材料。