[0001] 本发明涉及一种稻瘟病抗性基因，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用。

[0002] 水稻是最重要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米为主食，而稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病对水稻的安全生产造成严重的危害，每年都造成严重的粮食损失。从农业可持续发展的观点来看，选育和利用抗病品种是防治稻瘟病的最有效、最安全环保的方法，然而稻瘟病菌群体的多样性及易变性，以及人们缺乏对抗性基因的充分了解和有效利用，导致单一抗病品种抗性的短命化(通常仅2-4年)，而成为育种学家最为棘手的问题(郑钊等2009)。因此合理挖掘、克隆和利用广谱抗病基因，是获得持久、广谱抗病品种的重要途径，已成为农业科研中优先解决的重要问题。

[0003] 迄今，人们已经鉴定出80多个水稻稻瘟病抗性基因(Ballini et al.,2008；鄂志国等2009；Jiang et al.,2012)，至少22个抗瘟基因已被克隆(Wang et al.,1999；Qu et al.,2006；Hayashi et al.,2010；Jiang et al.,2012；Hua et al.,2012；Das et al.,2012)。研究表明，这些抗瘟基因多数是具有核苷酸结合位点-富亮氨酸重复结构(NBS-LRR)的蛋白质，即N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)，C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)。NBS结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack&Jones 1997)，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶的活性，可以激活激酶或G蛋白(Traut et al.,1994)；LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质的相互作用(Jones&Jones,1996；Dangl&Jones,2001；Takken&Tameling,2009；Bernoux,2011)，推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent,1996；
Baker et al.,1997)。Jia et al.(2000))。通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的激发子与Pita受体LRD区域的结合，能激活细胞内Pita介导的防卫反应，直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域。

[0004] NBS-LRR基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途径的基因也维持着共遗传的规律(Michelmore&Meyers,1998；Leister,2004)。水稻第6染色体长臂的Pi2/9基因簇是科学家的研究热点，从该位点区域已报道并深入研究的抗瘟基因有：Pi2、Pi9、Pigm(t)、Pi-z及Piz-t，他们分布在2-9个NBS-LRR成员组成的基因簇内。人们证明了Pi2、Pi9和Pi-z中单个NBS-LRR基因具有广谱抗瘟作用(Zhou，2006，2007；Dai，2010)，其中，Pi2和Piz-t的LRR区域仅8个氨基酸残基的差异就产生了不同的产物及抗性(Qu et al.,2006；Zhou et al.,2006)。而其中更多的NBS-LRR抗病基因正在被进一步的挖掘和利用，该基因簇的应用前景可观。

[0005] 对于该区域抗病基因的克隆以及充分的认识，可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害，也是了解水稻抗稻瘟病基因成簇机制的前提。同时，可能通过对基因关键位点的修饰和改造，拓宽植物的抗谱，或者进行更精确地靶向育种。

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种稻瘟病抗性基因Pi50。

[0007] 本发明的另一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法与应用。

[0008] 本发明的再一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的编码蛋白。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因Pi50，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

[0010] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的长度为3099个核苷酸，能编码1032个氨基酸的蛋白质；

[0011] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法，可通过化学合成方法得到，或是设计引物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到；

[0012] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50的应用，可将其用于选育对稻瘟病具有抗病性的水稻；具体步骤如下：将稻瘟病抗性基因Pi50转入易感病的水稻中，得到具有抗病性的水稻；

[0013] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

[0014] 所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列共计1032个氨基酸，包含2个主要的结构域：NBS和LRR区域，其中包括含有保守的AAA kinase结构域的NBS区域(170-462aa)，以及C-末端的富亮氨酸的LRR重复区域(578-1032aa)，其亮氨酸含量(67of454)为14.8％。

[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的稻瘟病抗性基因Pi50转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中难以在植物种间转移抗病基因的问题的前提。本发明能够进一步提供或应用基于上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以通过有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株中。附图说明

[0016] 图1是Pi2/9等位基因对稻瘟病菌群体抗谱的比较图。

[0017] 图2是水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略图。

[0018] 图3是通过PCR鉴定转化体的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1和12为分子量标记1kb ladder、泳道2为pCambia-Pi50-N4质粒为模板得到的PCR产物、泳道3为转化受体品种日本晴基因组DNA为模板得到的PCR产物、泳道4为EBZ基因组DNA为模板得到的PCR产物、泳道5-11为不同的T0转化体基因组DNA为模板得到的PCR产物。

[0019] 图4是水稻对照品种和pCambia-Pi50阳性转化体接种稻瘟病病原菌TY19七天后的结果图；其中，自左向右，第1条叶片是感病品种日本晴、第2条叶片是水稻抗病品种EBZ，第3～6条叶片是pCambia-Pi50阳性转化个体，第7条叶片是抗性品种IRBLzt-T，第8条叶片是抗性品种IRBLz5-CA。

[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，阐述了Pi50基因的抗性特征、分离克隆、功能特征以及分子鉴定，分离的Pi50基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。

[0021] 本实验室的前期工作如下(参见Zhu,et al.The identification of Pi50(t),a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9multigene family.Theor Appl Genet,2012(124):1295-1304)：

[0022] (1)抗性基因Pi50的抗性特征

[0023] 为了比较和明确Pi50与Pi2/9位点4个等位基因(Pi2,Pi9,Piz,Piz-t)的抗谱，利用从广东(85个菌株)，福建(40个)，湖南(41个)，贵州(60个)，四川(66个)，辽宁(108个)，吉林(60个)和黑龙江(63个)收集的总计523个稻瘟病菌株对上述5个等位基因的所持品种(分别是EBZ、IRBLz5-CA、C101A51、IRBL9-w、IRBLz-Fu、IRBLz-T和Toride)进行了抗谱比较分析。结果表明，Pi50对绝大多数的广东、广西、四川、福建、黑龙江、吉林稻瘟病菌群体表现较高的抗性(抗谱达到97.7％)，由此说明该基因可在上述地区使用(图1)。

[0024] (2)水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略

[0025] 本实验室先前的定位研究表明Pi50基因定位于与Pi2/9簇基因相同的基因组区域；Pi50基因中NBS-LRR的成簇排列特性也与Pi2/9簇基因高度相似；进一步抗谱分析显示Pi50基因与Pi2/9簇4个等位基因相似，对大部分测试菌株表现出相同的抗性反应(Zhu et al.,2012)；综合上述三方面的结果推断，Pi50也是Pi2/9的等位基因。值得注意的是，同样位于Pi2/9基因簇的Pi50，其对应的专化性小种却与Pi2、Pi9和Piz-t的明显不同，Pi50可以抵御Pi2/9簇其他抗病基因的致病菌的侵害，而表现更宽的抗谱(图1)。图中方框表示，各基因型对应的菌株为其致病型菌株，数字表示感病级别，1～3为高抗，4～6为中感，7～9为高感。因此，本发明完成了Pi50目标区域电子物理图谱的构建。亦即，以水稻参考品种日本晴(Nipponbare)的序列信息为基础，通过生物信息学手段，把与Pi50连锁的、以及共分离的标记与物理位置整合，由此构建了目的基因区域的重叠群图及电子物理整合图(图2)。

[0026] 然后，申请人通过长片段PCR扩增(Long Rangement PCR Amplification)、染色体步移(Chromosome Working)以及同源基因品种参考序列监控等方法，获得了优异抗源品种28占(EBZ，华南稻区，已在文献“Zhu,et al.The identification of Pi50(t),a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9multigene family.Theor Appl Genet,2012(124):1295-1304”公开)包含Pi50位点区域的超过100kb基因组序列，通过FGenesh预测，该区域包括了9个以上编码NBS-LRR类蛋白的基因(申请人未发表数据)。依据该数据，本发明进行如下工作。

[0027] 实施例1稻瘟病抗性基因Pi50的分析和确定

[0028] 一、水稻稻瘟病抗性基因Pi50候选基因的注释及序列分析

[0029] 为了确定Pi50的候选基因，本发明发明人利用日本晴的参考序列，通过2种 基 因 预 测 软 件 RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)和 Softberry 的FGENESH(http://www.softberry.com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析确定。在日本晴中，Pi50区域的候选抗性基因为7个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(nucleotide binding site-leucine-rich repeat,NBS-LRR)的候选基因(Pi501-NP，Pi502-NP，Pi503-NP，Pi504-NP，Pi505-NP，Pi506-NP和 Pi507-NP)，其 中 Pi501-NP 和Pi507-NP在已报道的Pi2/9家族所持各品种中高度保守，几乎没有差异。而基于基因的完整性以及特异性标记的存在/缺失(presence/absence,P/A)分析结果表明，其余5个在品种间存在差异的候选基因(Pi502-NP，Pi503-NP，Pi504-NP，Pi505-NP以及Pi506-NP)的结构不完整。通过进一步比照Pi2/9簇基因的结构，本发明发明人发现日本晴在该区域存在一个大约20kb的缺失(在Pi502-NP和Pi503-NP之间)，而此缺失恰对应于Pi2/z-t的功能成员。这可能可以解释相对于Pi2/9抗源品种，日本晴表现为感病的原因。类似地，Pi50基因位点在EBZ基因组上存在的8-9个具有NBS-LRR保守结构的候选基因，对应于日本晴的5个预测候选基因的结构也不完整。因此推断，Pi50的候选抗性基因可能就存在于感病品种日本晴所缺失的那部分片段之中。

[0030] 进一步分析，在EBZ中存在，且在日本晴中缺失，具有完整的NBS-LRR保守结构及并能够表达的基因，并依据其在基因簇中所处的位置，将其命名为Pi50-N4。其中Pi50-N4在基因组上的序列长达7063bp，如SEQ ID NO.3所示。

[0031] 二、获得Pi50-N4的cDNA

[0032] 利用RT-PCR技术，用SuperScript III Reverse Transcriptase反转录酶III(美国invitrogen公司原装进口)和Oligo(dT)18进行逆转录，逆转录的体系和反应条件按SuperScript III Reverse Transcriptase反转录酶III说明书操作。

[0033] 再用如下引物进行PCR扩增：

[0034] 上游引物F1：5’-ATGGCGGAGACGGTGCTGAGC-3’；

[0035] 下游引物R1：5’-TCAGCCAGCTTGAGCTGTGC-3’。

[0036] 得到的Pi50-N4的cDNA序列为3099bp。

[0037] 三、序列的分析

[0038] 通过比较Pi50-N4基因组序列(SEQ ID NO.3)和cDNA序列(SEQ ID NO.1)，可知，Pi50-N4基因组序列含有两个内含子，其第一外显子为第1～116位，第二外显子为第3953～6904位，第三外显子为第7033～7063位。该基因的cDNA序列与Pi2/9簇中已克隆的等位基因Pi2(序列见GenBank:DQ352453.1中的产物为“NBS-LRR type R protein,Nbs4-Pi”部分)和Pi-zt的cDNA序列(序列见GenBank:DQ352040.1)高度保守，相似度达到98％以上，通过多重序列的比对可见，各基因间的差异主要集中在近3’端的第一个LRR结构域中，Pi2和Pi-zt之间只有8个氨基酸的差异，这8个氨基酸的差异即造成了两个基因抗性的差异(Zhou et al.,2006.The Eight Amino-Acid Differences Within Three Leucine-Rich Repeats Between Pi2and Piz-t Resistance Proteins Determine the Resistance Specificity to Magnaporthe grisea.MPMI,19:1216–1228)，而在此区域Pi50-N4(编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)与前述两个基因又有10个氨基酸的差异。

[0039] 实施例2：水稻稻瘟病抗性基因Pi50的遗传互补实验及转化子的鉴定[0040] 一、获得Pi50-N4基因

[0041] 以EBZ的基因组为模板，通过如下引物扩增得到Pi50-N4基因组基因：

[0042] 上游引物F2：5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACC CTTGACATCCAAACCGCACC-3’；

[0043] 下游引物R2：5’-AGTGCCAAGCTTCGGCGCGCC TCAGCCAGCTTGAGCTGTGC-3’。

[0044] PCR反 应 体 系 为：高 保 真 酶KOD plus neo 0.4μl、EBZ基 因 组 模 板1.2μl(100pg～50ng)、DMSO 0.5μl、引物F2(10μM)0.6μl、引物R2(10μM)0.6μl、dNTP(2mM)4μl、2倍浓度的缓冲液(2×buffer)10μl、双蒸水补足20μl。

[0045] PCR温度循环条件为：94℃2分钟；98℃10秒、56℃30秒、68℃9分钟，68℃的延伸时间以每循环的延长10秒的梯度运行5个循环；98℃10秒、68℃10分钟，并以每循环68℃延伸时间延长10秒的梯度运行32个循环；68℃延伸15分钟；12℃保存。

[0046] 得到的PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过DNA凝胶回收试剂盒纯化得到Pi50-N4基因组基因。电泳大致定量。

[0047] 二、表达载体的构建和转化

[0048] (1)载体线性化：用限制性内切酶KpnⅠ和AscⅠ双酶切pCAMBIA1300AscI载体(按“刘新琼,等.稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因双元载体的构建.湖北农业科学,2007年02期”中提供的方法制备得到)：酶切缓冲液(Cutsmart)2μl、KpnⅠ和AscⅠ各0.5μl、Pi50-N4基因组基因3μl、双蒸水补足20μl；37℃酶切过夜；0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收，电泳大致定量。

[0049] (2)In-Fusion反应：步骤(1)得到的Pi50-N4基因组基因350ng、线性化的pCambia1300AscI载体200ng、5×In-Fusion HD 2μl，双蒸水补足10μl。按In-Fusion HD克隆试剂盒的说明书操作，得到转化有重组载体pCambia-Pi50的大肠杆菌JM109菌株。

[0050] (3)扩大培养转化有重组载体pCambia-Pi50的大肠杆菌JM109菌株，抽提pCambia-Pi50质粒，测序，可知往5’延伸的Pi50-N4基因组基因如SEQ ID NO.4所示。

[0051] (4)按文献“Hiei,et al.1994Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.6:271–282.”方法，将pCambia-Pi50质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，再转化感病的水稻品种日Nipponbare(日本晴，通过国际水稻研究所(http://www.irri.org)的国际共享种质资源库可免费获得)。用潮霉素B筛选，得到转化体。

[0052] 对得到的转化体进行鉴定：通过植物DNA提取试剂盒提取转化体(叶片)的基因组DNA。利用基因内部近3'端的特异引物F3与载体克隆位点处的引物R3对转化体进行了PCR检测。结果证明得到28个阳性转基因植株，另外有19个植株是转基因阴性植株，部分转化体的鉴定电泳图如图3所示。

[0053] 上游引物F3：5’-GGTATATGGATAGCAGAAGG-3’；

[0054] 下游引物R3：5’-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3’。

[0055] 用对Pi50无毒性的菌株TY19(朱小源等，引致“天优998”抗性丧失的稻瘟病菌小种鉴定及其致病性测定,广东农业科学，2008,12:84-86)。对Pi50转基因株系及对照品种进行苗瘟人工接种实验(按照“张磊,等.4套水稻稻瘟病鉴别品种对江苏地区主要稻瘟病菌株的抗性分析.《江苏农业学报》，2010年05期”中提供的方法)。结果如表1和图4所示。

[0056] 表1遗传互补实验分析结果

[0057]

[0058] a自各个构建体的T0植株接种对Pi50无毒性的菌株TY19的抗病或感病反应类型。

[0059] R，抗病；S，感病。

[0060] b功能互补成功率(％)：抗性植株数R所占转基因阳性植株数的百分比。

[0061] 从表1的结果，可见28株阳性转化植株中的25株表现抗性反应。对照组及接种后部分转化植株的叶片图如图4所示。图4中，自左向右，第1条叶片是感病品种日本晴(Nip)、第2条叶片是水稻抗病品种EBZ，第3～6条叶片是pCambia-Pi50阳性转化个体，第7条叶片是抗性品种IRBLzt-T(为Piz-t供体品种，在文献“Zhou et al.,2006.The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea.MPMI,19:1216–1228”中公开)，第8条叶片是抗性品种IRBLz5-CA(为Pi2供体品种，已在文献“汪文娟等.源于粤晶丝苗2号穗瘟的稻瘟病菌致病性分析.广东农业科学，2012(23)：59-61”公开)。从图4中可见，日本晴、IRBLzt-T和IRBLz5-CA均出现病斑，对菌株TY19表现为感病；EBZ以及pCambia-Pi50阳性转化个体未出现病斑，表现为抗病。

[0062] 进一步选择部分的转化后代T1株系，进行了抗性表现型/抗性基因型的共分离分析。结果表明，抗性表现型与抗性基因型完全共分离。亦即，转基因构建体在转化后代中能够稳定遗传、表达。这说明可以用Pi50基因转化水稻感病品种，经过自交、纯化选择等一系列育种程序之后，即可产生抗病品种而应用于生产中。

[0063] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。