一种文心兰的组织培养方法专利检索- 新植物或获得新植物的方法;通过组织培养技术的植物再生专利检索查询-专利查询网

一种文心兰的组织培养方法
申请号	CN201710764265.2	申请日	2017-08-30	公开(公告)号	CN107484658A	公开(公告)日	2017-12-19
申请人	贵州安龙金蕙花卉发展有限公司;			发明人	刘湘凤;
摘要	本发明属于兰花培育领域，尤其涉及一种文心兰组织培养方法，包括以下步骤：引种、灭菌、分化培养、增殖培养、生根培养；通过使用特制的灭菌液，对培养基的组分进行调整，并在培养基中增加特制的提取物，此外，分化培养时向培养基中通入微电流刺激组织分化，从而使得文心兰的组织培养过程中受污染率降低、组织分化较快，存活率高达92％。由于培养基所含的培养成分较适合文心兰生长，所以苗分化增殖、生根速度较快，进行生根培养20天左右既有根长出，且生根率高达100％。
权利要求	1.一种文心兰的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5-1cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； 2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1-1.5min、75％乙醇浸泡60-70s、浸泡于灭菌液中、15-20r/min摇晃灭菌18-22min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24-26℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500Lx、光照8-10h/天的条件下培养85-90天； 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26-28℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500Lx、光照8-10h/天条件下培养55-60天；随后在 23-25℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500Lx、光照10-12h/天的条件下培养20-25天； 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24- 26℃、相对湿度50-55％、光照强度为2000-3000Lx、光照10-12h/天的条件下培养6-8周。 2.如权利要求1所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的灭菌液，包括以下质量份的原料：芹菜22-25份、稻生黄单胞菌发酵粗提物17-10份、野马追17-20份、刺五加10- 12份、香加皮7-8份、苦地丁4-5份。 3.如权利要求2所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8-10天，7000-8000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4-5倍的磷酸缓冲液，20-23KHz超声提取30-35min，13000-13500rpm离心20-22min，取上清，既得。 4.如权利要求1所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的分化培养基，是将1/ 3MS、提取物7.5ml/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，其中pH＝5.4。 5.如权利要求1所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的MS，包括以下组分： 1)大量元素：硝酸钾1.5份、二水氯化钙0.3份、硝酸镁0.22份、磷酸二氢钾0.17份、硝酸铵0.15份、硫酸铵0.2份、磷酸二氢钠0.04份； 2)铁盐：乙二胺四乙酸二钠盐0.0373份、硫酸亚铁0.0086份； 3)微量元素：碘化钾0.00083份、七水硫酸锌0.000025份、硼酸0.0062份、二水钼酸钠 0.00025份、无水硫酸铜0.000025份、氯化钴0.000025份； 4)有机成分：甘氨酸0.00025份、烟酸0.000025份、盐酸硫胺0.0004份、肌醇0.05份； 5)激素：6-苄氨基腺嘌呤1份、吲哚丁酸1份、α-萘乙酸1份。 6.如权利要求4所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的提取物，包括以下质量份原料：雪莲花25-27份、毕澄茄20-22份、高良姜17-19份、藜芦12-14份、海藻10-12份、五味子7-9份、七叶莲6-8份、大叶桉叶5-7份、丙烯酰胺4-5份、透明质酸3-4份、角鲨烷2-3份。 7.如权利要求1所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5-7min，停留10-12min，所述的微电流为0.5- 0.8毫安。 8.如权利要求1所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的增殖培养基，是将1/ 2MS、提取物5.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC 1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖 20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 9.如权利要求1所述的文心兰组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基，是将1/ 2MS、提取物8.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。
说明书全文	一种文心兰的组织培养方法技术领域 [0001] 本发明属于兰花培育领域，尤其涉及一种文心兰组织培养方法。背景技术 [0002] 文心兰，又名跳舞兰、舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，叶片1-3枚，植株轻巧、滞洒，花茎轻盈下垂，花朵奇异可爱，形似飞翔的金蝶，极富动感，系兰科文心兰属植物的总称，属于热带复茎性着生兰，原产于西印度群岛、墨西哥、巴西等地。 [0003] 文心兰花小而繁多，形态多变，花期因品种而异，花朵可持续1～3个月，是上等的切花材料，也可以作为盆栽植物供人们观赏。按照传统的繁殖方式进行分株，一株文心兰1年仅繁殖2-3个芽，繁殖系数很低，不能满足消费者的需要。组织培养技术的应用，可以加快繁殖速度。对文心兰的组织培养已有很多报道，但文心兰工厂化育苗过程中存在的组培成苗率不高、幼苗长势弱等问题，从而阻碍了新品种进行大规模繁殖与推广。发明内容 [0004] 本发明为解决上述技术问题，提供了一种文心兰组织培养方法，具体是通过以下技术方案来实现。 [0005] 一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤： [0006] 1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5-1cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； [0007] 2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1-1.5min、75％乙醇浸泡60-70s、浸泡于灭菌液中、15-20r/min摇晃灭菌18-22min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； [0008] 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24-26℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500Lx、光照8-10h/天的条件下培养85-90天； [0009] 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26-28℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500Lx、光照8-10h/天条件下培养55-60天；随后在23-25℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500Lx、光照10-12h/天的条件下培养 20-25天； [0010] 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24-26℃、相对湿度50-55％、光照强度为2000-3000Lx、光照10-12h/天条件下培养6-8周。 [0011] 进一步，所述的灭菌液，是将芹菜22-25份、稻生黄单胞菌发酵粗提物17-10份、野马追17-20份、刺五加10-12份、香加皮7-8份、苦地丁4-5份混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0012] 进一步，所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8-10天，7000-8000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4-5倍的磷酸缓冲液，20-23KHz超声提取30-35min， 13000-13500rpm离心20-22min，取上清，既得。 [0013] 进一步，所述的分化培养基，是将1/3MS、提取物7.5ml/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.4。 [0014] 进一步，所述的MS培养基，包括以下制备步骤： [0015] 1)大量元素：硝酸钾1.5份、二水氯化钙0.3份、硝酸镁0.22份、磷酸二氢钾0.17份、硝酸铵0.15份、硫酸铵0.2份、磷酸二氢钠0.04份； [0016] 2)铁盐：乙二胺四乙酸二钠盐0.0373份、硫酸亚铁0.0086份； [0017] 3)微量元素：碘化钾0.00083份、七水硫酸锌0.000025份、硼酸0.0062份、二水钼酸钠0.00025份、无水硫酸铜0.000025份、氯化钴0.000025份； [0018] 4)有机成分：甘氨酸0.00025份、烟酸0.000025份、盐酸硫胺0.0004份、肌醇0.05份； [0019] 5)激素容液：6-苄氨基腺嘌呤1份、吲哚丁酸1份、α-萘乙酸1份。 [0020] 进一步，所述的提取物，是将雪莲花25-27份、毕澄茄20-22份、高良姜17-19份、藜芦12-14份、海藻10-12份、五味子7-9份、七叶莲6-8份、大叶桉叶5-7份、丙烯酰胺4-5份、透明质酸3-4份、角鲨烷2-3份混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0021] 进一步，步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5-7min，停留10-12min，所述的微电流为0.5-0.8毫安。 [0022] 进一步，所述的增殖培养基，是将1/2MS、提取物5.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC(活性炭)1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 [0023] 进一步，所述的生根培养基，是将1/2MS、提取物8.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。 [0024] 本发明的有益效果：按照本发明的方法进行文心兰的组织培养，通过使用特制的灭菌液，对培养基的组分进行调整并在培养基中增加特制的提取物，分化培养时向培养基中通入微电流刺激组织分化，从而使得文心兰的组织培养过程中受污染率降低、组织分化叫较快，存活率高达92％，由于所含的培养成分较适合文心兰生长，所以苗分化增殖、生根速度较快，进行生根培养20天左右既有根长出，且生根率高达100％。具体实施方式 [0025] 下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。 [0026] 实施例1 [0027] 一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤： [0028] 1)引种和灭菌：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； [0029] 2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于灭菌液中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； [0030] 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天的条件下培养85天； [0031] 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照10h/天的条件下培养20天； [0032] 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000Lx、光照10h/天条件下培养6-8周。 [0033] 所述的灭菌液，是将芹菜22kg、稻生黄单胞菌发酵粗提物17kg、野马追17kg、刺五加10kg、香加皮7kg、苦地丁4kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0034] 所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8天，7000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4倍的磷酸缓冲液，20KHz超声提取30min，13000rpm离心20min，取上清，既得。 [0035] 所述的分化培养基，是将1/3MS、提取物7.5ml/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.4。 [0036] 所述的MS培养基，包括以下制备步骤： [0037] 1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g； [0038] 2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g； [0039] 3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g； [0040] 4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g； [0041] 5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g； [0042] 6)按以上配比称取各成分溶解于1L去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得MS培养基。 [0043] 所述的提取物，是将雪莲花25kg、毕澄茄20kg、高良姜17kg、藜芦12kg、海藻10kg、五味子7kg、七叶莲6kg、大叶桉叶5kg、丙烯酰胺4kg、透明质酸3kg、角鲨烷2kg加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0044] 步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5min，停留10min，所述的微电流为0.5毫安。 [0045] 所述的增殖培养基，是将1/2MS、提取物5.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC 1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 [0046] 所述的生根培养基，是将1/2MS、提取物8.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。 [0047] 实施例2 [0048] 一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤： [0049] 1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； [0050] 2)灭菌：将外植体用清水清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于0.1％升汞中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； [0051] 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天的条件下培养85天； [0052] 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照10h/天的条件下培养20天； [0053] 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000Lx、光照10h/天条件下培养6-8周。 [0054] 所述的分化培养基，是将1/3MS、提取物7.5ml/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.4。 [0055] 所述的MS培养基，包括以下制备步骤： [0056] 1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g； [0057] 2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g； [0058] 3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g； [0059] 4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g； [0060] 5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g； [0061] 6)按以上配比称取各成分溶解于1L去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得MS培养基。 [0062] 所述的提取物，是将雪莲花25kg、毕澄茄20kg、高良姜17kg、藜芦12kg、海藻10kg、五味子7kg、七叶莲6kg、大叶桉叶5kg、丙烯酰胺4kg、透明质酸3kg、角鲨烷2kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0063] 步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5min，停留10min，所述的微电流为0.5毫安。 [0064] 所述的增殖培养基，是将1/2MS、提取物5.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC 1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 [0065] 所述的生根培养基，是将1/2MS、提取物8.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。 [0066] 实施例3 [0067] 一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤： [0068] 1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； [0069] 2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于灭菌液中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； [0070] 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天的条件下培养85天； [0071] 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照10h/天的条件下培养20天； [0072] 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000Lx、光照10h/天条件下培养6-8周。 [0073] 所述的灭菌液，是将芹菜22kg、稻生黄单胞菌发酵粗提物17kg、野马追17kg、刺五加10kg、香加皮7kg、苦地丁4kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0074] 所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8天，7000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4倍的磷酸缓冲液，20KHz超声提取30min，13000rpm离心20min，取上清，既得。 [0075] 所述的分化培养基，是将1/3MS、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝ 5.4。 [0076] 所述的MS培养基，包括以下制备步骤： [0077] 1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g； [0078] 2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g； [0079] 3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g； [0080] 4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g； [0081] 5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g； [0082] 6)按以上配比称取各成分溶解于1L去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得MS培养基。 [0083] 步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5min，停留10min，所述的微电流为0.5毫安。 [0084] 所述的增殖培养基，是将1/2MS、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC 1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 [0085] 所述的生根培养基，是将1/2MS、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。 [0086] 实施例4 [0087] 一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤： [0088] 1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； [0089] 2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于灭菌液中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； [0090] 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天的条件下培养85天； [0091] 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照10h/天的条件下培养20天； [0092] 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000Lx、光照10h/天条件下培养6-8周。 [0093] 所述的灭菌液，是将芹菜22kg、稻生黄单胞菌发酵粗提物17kg、野马追17kg、刺五加10kg、香加皮7kg、苦地丁4kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0094] 所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8天，7000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4倍的磷酸缓冲液，20KHz超声提取30min，13000rpm离心20min，取上清，既得。 [0095] 所述的分化培养基，是将1/3MS、提取物7.5ml/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.4。 [0096] 所述的MS培养基，包括以下制备步骤： [0097] 1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g； [0098] 2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g； [0099] 3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g； [0100] 4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g； [0101] 5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g； [0102] 6)按以上配比称取各成分溶解于1L去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得MS培养基。 [0103] 所述的提取物，是将雪莲花25kg、毕澄茄20kg、高良姜17kg、藜芦12kg、海藻10kg、五味子7kg、七叶莲6kg、大叶桉叶5kg、丙烯酰胺4kg、透明质酸3kg、角鲨烷2kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。 [0104] 所述的增殖培养基，是将1/2MS、提取物5.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC 1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 [0105] 所述的生根培养基，是将1/2MS、提取物8.0ml/L、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。 [0106] 实施例5 [0107] 一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤： [0108] 1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体； [0109] 2)将外植体用清水清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于0.1％升汞中灭菌8min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次； [0110] 3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天的条件下培养85天； [0111] 4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500Lx、光照10h/天的条件下培养20天； [0112] 5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000Lx、光照10h/天条件下培养6-8周。 [0113] 所述的分化培养基，是将1/3MS、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L，椰子水40ml/L，混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝ 5.4。 [0114] 所述的MS培养基，按照传统的配方进行，各成分配比如下： [0115] 1)大量元素，NH4NO3 1 650mg/L、KNO3 1 900mg/L/CaCl 2·2H2O 440mg/L mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4 700mg/L； [0116] 2)铁盐，FeSO4·7H2O 27.8mg/L+Na2-乙二胺四乙酸二钠盐·2H2O 37.3mg/L； [0117] 3)微量元素，KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MnO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L； [0118] 4)有机成分，肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.5mg/L、甘氨酸2mg/L [0119] 5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g/L、吲哚丁酸1g/L、α-萘乙酸1g/L； [0120] 6)按以上配比混合各成分，121℃灭菌20-25min，既得MS培养基。 [0121] 所述的增殖培养基，是将1/2MS、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、AC 1.0g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L、蔗糖20ml/L、琼脂4.5ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.5。 [0122] 所述的生根培养基，是将1/2MS、土豆20ml/L、香蕉20ml/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20ml/L混合，121℃灭菌20-25min，其中pH＝5.6。 [0123] 实验例 [0124] 1、文心兰组织培养生长情况 [0125] 按照实施例1-5的方法对文心兰进行培养，采用长宽为12cm×15cm、厚0.05mm的聚丙烯塑料袋代替传统的玻璃容器进行培养，分别统计每个培养组存活率、生根情况，结果如表1和表2所示。 [0126] 表1文心兰组织培养存活率 [0127] 接种数存活数污染数枯死数成活率实施例1 200 172 11 5 92％实施例2 200 130 24 46 65％实施例3 200 147 43 10 73.5％实施例4 200 128 47 25 64％实施例5 200 98 42 60 49％ [0128] 从表1可知，实施例1按照本发明的方法进行文心兰的组织培养，通过使用特制的灭菌液，对培养基的组分进行调整并在培养基中增加特制的提取物，分化培养时向培养基中通入微电流刺激组织分化，从而使得文心兰的组织培养过程中受污染率降低、组织分化叫较快，存活率高达92％，由于所含的培养成分较适合文心兰生长，所以苗分化增殖、生根速度较快，进行生根培养20天左右既有根长出，且生根率高达100％。与实施例1相比，由于实施例2-5的培养方法不同，从而导致培养苗的存活率较低，生根速度较慢。 [0129] 表2文心兰组织壮苗生根情况 [0130]

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