众所周知，食品中含有的硝酸盐，可能会给人类的健康带来损害、使 得血液中的血红蛋白含量下降等，引起很多代谢障碍。该硝酸态的氮被认 为是促进生物体内形成致突变性和致癌性亚硝基胺的起因物质。
为此，对于栽培植物产品，特别是不加热即供食用的蔬菜、和可能会 在牛奶及其他畜产制品中混入硝酸盐的畜产饲料用栽培植物，人们一直在 寻找降低其硝酸盐含量的手段、方法。
另一方面，硝酸盐也是大多数农业用栽培植物中最重要的氮源。其能 够促进植物生长，同时也发挥营养素和信号的作用。作为营养素的硝酸盐， 被还原成铵盐，接下来成为氨基酸的成分，然后转化为蛋白质、叶绿素、 激素及其他植物的含氮化合物成分。另外，作为信号的硝酸盐，通过加强 大批基因的表达，来调整氮和碳的新陈代谢。
硝酸盐经过两个阶段被还原成铵盐。在第1阶段中，通过硝酸还原酶 来促进反应，硝酸盐被还原成亚硝酸盐，在第2阶段的反应中，通过亚硝 酸盐还原酶将亚硝酸盐还原成铵盐。铵盐在氨基酸中的结合，主要是通过 谷氨酸合成促进酶和谷氨酸盐合成促进酶来催化的。
作为使植物中的硝酸态氮含量降低的组合物，已知以5-氨基乙酰丙酸 及其盐的水溶液作为基料的物质(Yoshida等、1996、美国专利第5,489,572 号)。
该组合物的缺点是需要大量的(每1ha为80g～3kg)昂贵的(每1kg 为5万～7.5万美金)5-氨基乙酰丙酸，提高了组合物自身的价格，在经济 上不合适。这种组合物还有另外一个缺点。5-氨基乙酰丙酸是除草剂，在 一定的条件下，即使少量使用，也有阻碍所施用的栽培植物的生长的危险。 根据该专利，5-氨基乙酰丙酸是为了对土壤和/或植物进行处理而使用的。 无论哪种情况下，如果以低浓度(不是作为除草剂的浓度)使用，则不仅 对目的植物，而且对杂草也会起到促进生长的作用。
本发明者们采用的原型(prototype)是以壳聚糖为基料、以增强植物 对疾病的抵抗力为目的而提出的组成(Novodzilov等，2000，俄罗斯共和 国专利第2158510号)。
根据该公报可知，这种组成对于栽培植物中的硝酸态氮含量实质上没 有影响。

本发明的目的在于提供一种可以解决上述现有技术的缺点的药剂。
更详细地说，本发明的目的在于开发不需要转基因植物或昂贵的化合 物，就可以降低栽培植物中含有的硝酸盐量的药剂。
本发明的另一目的是提供利用该药剂来降低栽培植物中的硝酸盐含量 的方法。
本发明者进行了深入研究，结果发现使用含有壳聚糖的组合物作为降 低硝酸盐含量的药剂，对于解决上述课题是非常有效的，从而完成了本发 明。更详细地说，通过使含有壳聚糖的组合物与有机酸、硝酸盐还原酶活 性物质和叶绿素合成促进剂进行组合，能够有效地降低栽培植物中的硝酸 盐含量。
本发明包含例如下述的内容。
[1]一种用于降低栽培植物中的硝酸盐含量的组合物，其特征在于， 以下述质量比率(％)含有壳聚糖、有机酸、硝酸盐还原酶活性物质和叶 绿素合成促进物质，
壳聚糖…………………………15-25
硝酸盐还原酶活性物质………25-30
叶绿素合成促进物质…………29-35
有机酸…………………………15-25。
[2]如[1]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在于，壳聚糖 的质量平均分子量在20～180kDa的范围内。
[3]如[1]或[2]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其中壳聚 糖的脱乙酰度大于等于70％。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在 于，有机酸为选自琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸中的至少一种或一种以上。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在 于，有机酸为琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸的组合。
[6]如[5]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在于，有机酸为 琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸的组合，且以相对于所含有的全体有机酸的质 量比率计，上述成分的比例为琥珀酸2、抗坏血酸0.8～1.2、山梨酸0.8～ 1.2。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在 于，硝酸盐还原酶活性物质为选自硝酸铁、钼酸铵、吲哚乙酸、萘基乙酸、 乙二胺四乙酸及N，N-二羧甲基谷氨酸中的至少一种或一种以上。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在 于，硝酸盐还原酶活性物质为硝酸铁、钼酸铵、吲哚乙酸、乙二胺四乙酸 的组合。
[9]如[8]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在于，硝酸盐还 原酶活性物质为硝酸铁、钼酸铵、吲哚乙酸和乙二胺四乙酸的组合，且以 相对于所含有的全部硝酸盐还原酶活性物质的质量比率计，各成分比例为 硝酸铁20、钼酸铵4～6、吲哚乙酸0.5～1.5、乙二胺四乙酸0.5～1.5。
[10]如[1]～[7]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征 在于，硝酸盐还原酶活性物质为硝酸铁、钼酸铵、萘基乙酸和N，N-二羧甲 基谷氨酸的组合。
[11]如[10]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在于，硝酸盐 还原酶活性物质为硝酸铁、钼酸铵、萘基乙酸和N，N-二羧甲谷氨酸的组合， 且以相对于所含有的全部硝酸盐还原酶活性物质的质量比率计，上述成分 的比例为硝酸铁20、钼酸铵4～6、萘基乙酸0.5～1.5、N，N-二羧甲基谷氨 酸0.5～1.5。
[12]如[1]～[11]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征 在于，叶绿素合成促进物质为选自2-氧代戊二酸和L-谷氨酸中的至少一种 或一种以上。
[13]如[1]～[12]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征 在于，叶绿素合成促进物质为2-氧代戊二酸和L-谷氨酸的组合。
[14]如[13]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在于，叶绿素 合成促进物质为2-氧代戊二酸和L-谷氨酸的组合，且以相对于所含有的全 部叶绿素合成促进物质的质量比率计，以上成分比例为2-氧代戊二酸为30、 L-谷氨酸为0.5～1.5。
[15]如[1]～[14]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征 在于，相对于100质量份的用于降低硝酸盐含量的组合物，进一步含有1 质量份～3质量份的表面活性剂。
[16]如[15]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物，其特征在于，表面活 性剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯。
[17]一种用于降低硝酸盐含量的组合物水溶液，其特征在于，将[1]～ [16]中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物溶解在水中。
[18]如[17]所述的用于降低硝酸盐含量的组合物水溶液，其特征在于， pH在4.5～5.5的范围内。
[19]一种降低栽培植物中的硝酸盐含量的方法，其中通过将[1]～[16] 中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物散布到栽培植物的种子上来 降低栽培植物中的硝酸盐含量。
[20]一种降低栽培植物中的硝酸盐含量的方法，其中通过将[17]或[18] 中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物水溶液散布到栽培植物的种 子上来降低栽培植物中的硝酸盐含量。
[21]一种降低栽培植物中的硝酸盐含量的方法，其中通过将[1]～[16] 中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物散布到栽培植物的叶面上来 降低栽培植物中的硝酸盐含量。
[22]一种降低栽培植物中的硝酸盐含量的方法，其中通过将[17]或[18] 中任一项所述的用于降低硝酸盐含量的组合物水溶液散布到栽培植物的叶 面上来降低栽培植物中的硝酸盐含量。
[23]如[19]～[22]中任一项所述的降低栽培植物中的硝酸盐含量的方 法，其特征在于，栽培植物选自菠菜、莴苣、甘蓝、莳萝、欧芹、萝卜、 洋葱、甜菜、胡萝卜和马铃薯中的至少一种。
附图说明
图1是使用具有通过“粘度测测定法”求得的已知分子量的壳聚糖的 硝酸盐减少用组合物的GPC色谱图。
实施发明的最佳方式
下面，对本发明进行更具体的说明。
对本发明中的壳聚糖没有特别的限制，一般来说，只要是被称作壳聚 糖的物质，就可以使用任何形态、性状的物质。
作为壳聚糖的定义，具体来说可以列举例如下式(2)所示的β-聚-D- 葡糖胺，该物质是作为天然多糖类的下式(1)所示的甲壳质，即别名为β -聚-N-乙酰基-D-葡糖胺的乙酰胺基通过水解而脱乙酰化为胺基后而得到 的生成物。

关于甲壳质、壳聚糖的详细信息，必要时，可参考例如技报堂出版的 “-最後のバィオマス一キチン、キトサン”1995年6月20日发行(第1 版第5次印刷)的内容(特别是第1～20页的内容)。
甲壳质脱乙酰化后生成壳聚糖时，不需要严格地将全部的乙酰胺基水 解成胺基。只要对用作本发明的壳聚糖没有不利影响，就可以残留一部分 乙酰胺基。当然，也可以是没有检测出、实质上并不存在乙酰胺基的壳聚 糖。在本发明中，包括残留一部分乙酰胺基的壳聚糖在内，定义为“壳聚 糖”。
壳聚糖分子中存在的胺基与乙酰胺基的比率，一般被称作“脱乙酰度”， 用下式定义。另外，关于测定方法，在后面的内容中进行叙述。
脱乙酰度＝(胺基的数目/(乙酰胺基的数目+胺基的数目))×100(％)
本发明中的组合物，虽然并不取决于脱乙酰度，但通常优选使用具有 大于等于70％的脱乙酰度的壳聚糖。
如果脱乙酰度过低，则壳聚糖在水中的溶解度降低，因此使用困难， 也有效力下降的可能。另外，在脱乙酰度过高的情况下，也有难以得到稳 定效力的倾向。
作为脱乙酰度，更优选在75％～95％的范围内，最优选在75％～90 ％的范围内。
另外，据说在甲壳质脱乙酰化的过程中，一部分聚合物会发生解聚， 因而生成的壳聚糖的分子量具有从低分子到高分子的分布。
本发明中所述的壳聚糖的分子量，是指质量平均分子量，关于其测定 方法在后面内容中进行叙述。
在本发明中提出了，在该组合物的调整中使用上述定义的分子量为 20～180kDa的壳聚糖的方案。这相当于聚合度为120～1020，如果可能的 话，优选使用具有20～120kDa的分子量的壳聚糖。含有这样的分子量的 壳聚糖的组合物，从容易溶解在水中、能快速向植物中浸透的观点出发， 是优选的。
壳聚糖的分子量更优选在20～100kDa的范围内，最优选在20～70kDa 的范围内。
对本发明中可以使用的壳聚糖的来源，没有特别的限制。即，不仅可 使用化学或者生化方法将天然来源的甲壳质进行脱乙酰化所得到的物质， 也可以使用从菌类的细胞壁提取出来的物质。
另外，也可以购买使用大日精化工业株式会社(商品名：ダイキトサ ン)和烧津水产化学工业株式会社等销售的产品。
作为用于降低硝酸盐含量的组合物中的壳聚糖的比例，以质量比率计， 在15％～25％的范围内。该壳聚糖的比例，优选在15％～20％的范围内， 更优选18％～20％的范围内。另外，在本说明书中，以壳聚糖为代表的各 成分的比例(质量比率)的基准，是包含该成分自身在内的用于降低硝酸 盐含量的组合物的总质量。即，在设壳聚糖的质量为A克、壳聚糖以外的 成分的质量共计为B克的情况下，用于降低硝酸盐含量的组合物的总质量 可用(A+B)克表示，壳聚糖的质量比率可用{A/(A+B)}×100(％) 表示。
本发明的用于降低硝酸盐含量的组合物的特征在于，除壳聚糖外，还 含有有机酸、硝酸盐还原酶活性物质和叶绿素合成促进物质。下面，对各 成分进行说明。
(硝酸盐还原酶活性物质)
对本发明中可以使用的硝酸盐还原酶活性物质没有特别的限制，只要 可以用于农业乃至栽培植物用途即可。这里，所谓“硝酸盐还原酶活性物 质”，是指具有提高植物中的硝酸盐还原酶活性的作用的物质。作为结果， 只要可以实现提高硝酸盐还原酶的活性的作用，则对其作用机制没有特别 的限制(关于这样的硝酸盐还原酶活性物质的详细信息，必要时，可以参 考论文“野菜類の硝酸塩還元酵素の生化学”、中川弘毅著、日本食品科学工 学会志、第45卷、第1号、1998年1月发行；或技报堂出版的“安全·持 続型農業を目指して～キトサンの農業利用の理論と際”2000年11月6日 发行(第1版第1次印刷)的内容(特别是第39页的内容))。
从有效降低栽培植物中的硝酸盐含量的效果的观点出发，该硝酸盐还 原酶活性物质优选使用选自硝酸铁、钼酸铵、吲哚乙酸、萘基乙酸、乙二 胺四乙酸和N，N-二羧甲基谷氨酸中的至少一种或一种以上。
从本组合物溶解在水中、作用于栽培植物时向植物所施加的活性的观 点出发，优选多种硝酸盐还原酶活性物质的组合。特别优选硝酸铁、钼酸 铵、吲哚乙酸(或萘基乙酸)和乙二胺四乙酸(或N，N-二羧甲基谷氨酸) 的组合。
作为用于降低硝酸盐含量的组合物中的硝酸盐还原酶活性物质的比 例，以质量比率计，在25％～30％的范围内。优选在27％～30％的范围内， 更优选在27％～28％的范围内。
在使用硝酸铁、钼酸铵、吲哚乙酸(或萘基乙酸)和乙二胺四乙酸(或 N，N-二羧甲基谷氨酸)的组合时，对各成分的比例没有特别的限制。从更 有效地提高硝酸盐还原酶的活化的观点出发，硝酸铁、钼酸铵、吲哚乙酸 (或萘基乙酸)和乙二胺四乙酸(或N，N-二羧甲基谷氨酸)的质量比率优 选在20∶4～6∶0.5～1.5∶0.5～1.5的范围内，更优选为20∶5∶1∶1。
这里所说的硝酸盐还原酶活性物质，同时还具有使植物中的亚硝酸盐 还原酶活化的作用。
(叶绿素合成促进物质)
对本发明中可以使用的叶绿素合成促进物质没有特别的限制，只要可 以用于农业乃至栽培植物用途即可。作为结果，只要可以实现促进叶绿素 合成的作用，就对其作用机制没有特别的限制(关于这样的叶绿素合成促 进物质的详细信息，必要时，可以参考技报堂出版的“安全·持続型農業を 目指して～キトサンの農業利用の理論と実際”2000年11月6日发行(第1 版第1次印刷)的内容(特别是第39页的内容))。
从有效地降低栽培植物中的硝酸盐含量的效果的观点出发，该叶绿素 合成促进物质优选使用选自2-氧代戊二酸和L-谷氨酸中的至少一种或一种 以上。
从本组合物溶解在水中、作用于栽培植物时向植物所施加的活性的观 点出发，优选多种叶绿素合成促进物质的组合。特别优选2-氧代戊二酸和 L-谷氨酸的组合。
作为用于降低硝酸盐含量的组合物中的叶绿素合成促进物质的比例， 以质量比率计，在29％～35％的范围内。优选在31％～34％的范围内，更 优选在31％～32％的范围内。
当使用2-氧代戊二酸和L-谷氨酸的组合时，对各比例没有特别的限制。 从更有效地促进叶绿素合成的观点出发，2-氧代戊二酸和L-谷氨酸的质量 比率优选在30∶0.5～1.5的范围内，更优选在30∶1的范围内。
(有机酸)
对本发明可以使用的有机酸没有特别的限制，只要可以用于农业乃至 栽培植物用途即可。从有效地降低栽培植物中的硝酸盐含量的观点出发， 该有机酸优选使用选自琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸中的至少一种或一种以 上。
从本组合物溶解在水中、作用于栽培植物时向植物所施加的活性的观 点出发，优选多种有机酸的组合。特别优选琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸的 组合。
作为用于降低硝酸盐含量的组合物中的有机酸的比例，以质量比率计， 在15％～25％的范围内。优选在18％～25％的范围内，更优选在20％～ 25％的范围内。
当使用琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸的组合时，对各成分的比例没有特 别的限制。从溶解在水中而形成水溶液时的最最佳pH范围的观点出发， 琥珀酸、抗坏血酸和山梨酸的质量比率，优选在2∶0.8～1.2∶0.8～1.2的范 围内，更优选为2∶1∶1。
(表面活性剂)
本发明的组合物，必要时，为了提高本组合物在植物叶子表面上的保 持率，可以含有表面活性剂。对本发明可以使用的叶绿素合成促进物质没 有特别的限制，只要可以用于农业乃至栽培植物用途即可。关于可以用于 农业乃至栽培植物用途的表面活性剂的详细信息，必要时可以参考JA全 农肥料农药部农药技术普及课编集“クミァイ農薬総覧2001(改正)”平成 13年1月31日发行的内容(特别是展开剂、第592～1601页的内容)”。
从本组合物在栽培植物的叶面上的保持能力的观点出发，该表面活性 剂优选为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯。也可以购买使用花王株式会 社(商品名：しオド一ルス一パ一TW-S120)销售的商品。
作为用于降低硝酸盐含量的组合物中的表面活性剂的比例，以质量比 率计，在1％～3％的范围内。优选在1.5％～2.5％的范围内，更优选在1 ％～2％的范围内。
(作为水溶液使用)
本发明也提供作为水溶液来使用上述组合物的方法。在该方法中，为 了降低栽培植物中的硝酸盐的含量，例如，将用于降低硝酸盐含量的组合 物溶解于pH 5～9的水中，制成pH4～5.5的水溶液。然后，将该水溶液 散布在农作物的种子上或者将种子浸渍在该水溶液中，以及向处于成长期 的植物的叶面散布该水溶液。
(与现有技术水平的比较)
根据对现有技术水平进行分析的结果，关于壳聚糖和有机酸，目前为 止已知的情况仅限于植物生长调节作用和增强对疾病的抵抗力的作用。已 知钼酸盐阴离子和硝酸盐阴离子具有提高硝酸还原酶活性的作用，但是， 将它们作为降低硝酸盐含量的手段而应用于蔬菜和其他栽培植物的方向尚 未开发。
本组合物具有的通过提高植物对无机氮的同化效率来降低栽培植物中 的硝酸盐含量的作用，是本发明者们发现的，而不是从目前报告的生长促 进作用中推导出来的结果。
(应用)
本发明中提出的组合物，可以适用于任何种类的植物。对于硝酸盐含 量水平高的植物(植物的商品化部分所含有的总氮中的硝酸态氮为0.5％或 其以上)，本发明的组合物显示了特别显著的效果。与其类似的植物有例如 一系列的蔬菜(菠菜、各种莴苣、甘蓝、莳萝、欧芹、萝卜、洋葱)和各 种根菜类(甜菜、胡萝卜、马铃薯)等。
(组合物的作用)
本发明的组合物所具有的作用是基于壳聚糖中的以前未明确的部分、 即实质上没有毒性、且对环境无害的生物活性物质。壳聚糖与本组合物中 其他成分的组合，具有下述优点，即，使硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶 活化、增加植物中的叶绿素、并进而成为提高浸透活性的物质，由此可以 提高无机氮的同化，降低农产品中的硝酸盐含量。
壳聚糖，只有通过特定的组合，即，使其含有极有限的有机酸和仅一 部分本发明者们申请的化合物，才可以表现出上述的作用。其理由被推定 是，本组合物的降低硝酸盐含量的作用是由下述的3个作用引起的。
-由使基因和无机氮同化的重要的酶，即硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还 原酶、谷氨酸盐合成促进酶、谷氨酸合成促进酶的活化所产生的作用，该 作用的实现原理如下：壳聚糖、2-氧代戊二酸、琥珀酸、吲哚乙酸、硝酸 盐、钼等吸附于壳聚糖的基质中，持续附着在植物的叶上，作为辅助因子、 基质的前体物质和上述酶活性物质，比这些物质分别单独使用具有更长的 持续作用。在提高硝酸盐还原酶活性的同时，亚硝酸盐还原酶的活性也有 提高，由此，特别是在光不充足或存在其他胁迫的条件下，能够增强防止 植物组织中亚硝酸盐蓄积的作用。
-通过利用叶绿素的前体物质，即2-氧代戊二酸和L-谷氨酸来增强叶 绿素的合成，使得植物叶子中含有的叶绿素增加，其结果使产生的光合作 用和糖的形成强化的作用。此时，糖也导致植物中的氮的同化。
-壳聚糖和本组合物的其他成分具有的浸透活性所产生的作用，其结 果是防止硝酸盐还原至作为氮元素的还原态的最终产物，同时协调了炭水 化合物和氮的代谢。
根据上述论据，确认了迄今为止尚未知晓的“成分·性状”在机能方 面的依存关系。由此可以认为，本发明的方法对于上述课题的解决也是有 效的。
本发明的组合物是水溶性的，在膜形成能力和附着能力方面优异，对 植物有很高的粘附性。该组合物，例如在pH4.5～5.5的接近中性的水溶液 状态下，具有活性、稳定性。本发明的组合物，在使用范围的浓度下，对 植物无毒性。
本发明中可以使用的壳聚糖、2-氧代戊二酸、L-谷氨酸、琥珀酸、山 梨酸、抗坏血酸、吲哚乙酸，在本申请中作为活性物质使用，作为自然界 中存在的已知化合物，是可以利用化学合成、以及微生物方法或酶合成、 使用自然资源的提取方法等任一方法所获得的物质。
在为了降低非同化硝酸盐含量而使用以壳聚糖为基料的本组合物的情 况下，其使用量和使用频率，有时随着环境条件的不同而不同。通常，可 以采用本组合物对种子进行处理和对处于生长期的植物进行水溶液散布的 方法。对处于生成期的植物进行的水溶液散布，例如可以1周进行一次直 至收获前的3周。在光不足或存在其他胁迫的条件下，也可以适当增加散 布的次数。
对蔬菜进行的种子阶段的处理，例如可以浸渍在使用了干燥状态的本 组合物的0.5％的水溶液中。这种情况下的溶液的使用量，优选例如每1kg 种子为1升左右。在用于散布时，例如可以每1ha使用200～300升的使用 了干燥粉末的0.5％的水溶液。
为了显示本发明的工业可利用性，并进一步加深对本发明内容的理解， 这里列出具体的实施例，但是并非由此来全部概括所申请发明的特性。
实施例
使用例1
对室内栽培的莴苣，显示组合物提高莴苣叶中含有的硝酸盐还原酶活 性的作用。
组合物(之1)的成分(wt％)为：分子量50kDa的壳聚糖-20、硝 酸盐还原酶活性物质-27、叶绿素合成促进物质-31、有机酸-20、表面 活性剂-2。
组合物(之2)的成分(wt％)为：分子量170kDa的壳聚糖-15、硝 酸盐还原酶活性物质-25、叶绿素合成促进物质-34、有机酸-25、表面 活性剂-1。
表1中显示了使用例1相关的数据。如该数据所示，在对莴苣散布组 合物后的7天时间内，硝酸盐还原酶活性持续高于对照。
表1
以活化莴苣(品种名：“ァザルト”)的叶子中的硝酸盐还原酶为目标、在生长阶段散布 本组合物水溶液的影响   组合物类别          莴苣叶中含有的硝酸盐还原酶活性、               NO2 -/g组织湿重量/hr   处理   前   1天后   3天后   7天后   10天后   对照、水   64±2   61±2   65±2   60±2   63±2   组合物(之1)   93±3   79±3   69±1   65±1   组合物(之2)   85±2   80±3   70±2   67±2
使用例2
显示本组合物提高莴苣的叶绿素含量的作用。组合物的种类构成如使 用例1所示。例2的数据(表2)所示表明，在用本申请的组合物对莴苣 处理后的3天内、提高了叶绿素含量。
表2
本组合物水溶液散布对莴苣(品种名：“ァザルト”)的叶绿素含量的影响   组合物类别          莴苣的叶绿素含量(mg/100g湿重量)   处理前   1天后   2天后   3天后   对照、水   98±4   99±4   97±4   99±3   组合物(之1)   143±5   138±5   115±4   组合物(之2)   140±6   120±4   110±5
使用例3～5
显示了本组合物降低各种莴苣(品种名“ァザルト”、“ロ一ラ·ロッサ”、 “オデッサの縮れ葉”)和菠菜(品种名“マタド一ル”)叶中硝酸盐含量 的作用。组合物(之1)的成分与使用例1、2相同，组合物(之3)的成 分(wt％)为：分子量100kDa的壳聚糖-18、硝酸盐还原酶活性物质- 30、叶绿素合成促进物质-31、有机酸-18、表面活性剂-3。
使用例3～5(表3～5)的相关数据所示表明，本发明提出的组合物显 著降低了生长到商品水平的莴苣和菠菜所含有的硝酸盐含量。
表3
利用本组合物进行的2次处理对收获时的莴苣(“ァザルト”)中含有的硝酸盐含量的影 响   组合物类别*   每湿重量mg/kg的硝   酸盐含量   被追加还原的硝酸   盐，％   对照、水   3200±145   -   组合物(之1)   1620±74   49   组合物(之3)   1700±80   47
*向莴苣(品种名“ァザルト”)进行散布时，对照组用水，试验组使用组合物的2倍稀 释液。
表4
利用本组合物的0.5％水溶液(间隔10天)进行2次散布，对散布2周后莴苣(品种名 “ロ一ラ·ロッサ”)和菠菜(品种“マタド一ル”)中所含的硝酸盐含量的影响   散布的类别   植物名   每组织湿重量mg/kg的   叶中含有的硝酸盐含量   相对于对照*的   硝酸盐含量，％   对照-水散布   莴苣   4280±114   100.0   菠菜   3840±97   100.0   组合物(之1)的   0.5％溶液的散布   莴苣   2115±93   49.4   菠菜   1967±69   51.2
*生长到商品水平的产品
表5
对莴苣(品种名“オデッサの縮れ葉”)实施种子处理和在生长期进行水溶液散布的情况 下的硝酸盐含量   处理类别  播种后65天(达到商品水  平)时的每湿组织重量  mg/kg的硝酸盐含量   对照-对种子阶段进行水处理(在水中   浸泡)。对处于生长期的植物以10天的   间隔进行3次水散布。第一次散布在播   5种后经过35天的时点进行。  5200±134   利用本组合物*对种子进行处理(在   0.5％水溶液中浸泡24小时)。对处于生   长期的植物以10天的间隔进行3次水散   布。第一次散布在播种后经过35天的时   点进行。  2300±115
*之1
如上所述，通过在壳聚糖中加入少量的生物活性物质，本发明的组合 物可以降低蔬菜、根菜中的硝酸盐含量。另外，如果使用本组合物，则可 以提高氮肥的使用效率，结果可以降低对动物体具有高毒性的硝酸盐造成 的环境污染(特别是水污染)，并且，对环境没有实质的破坏，可以获得硝 酸盐含量少的农作物。
(脱乙酰度的测定方法)
使用下述方法，其基于财团法人日本健康·营养食品协会“健康食品 规格基準の公示”(平成7年6月1日发行)的方法。使用聚乙烯硫酸钾 (PVSK)进行胶体滴定，测定游离氨基，求得壳聚糖的脱乙酰度。在按 照干燥减重试验法在200ml量瓶中进行干燥后，精确称取1.0g壳聚糖样品， 加入0.5％的醋酸水溶液进行溶解，准确定容至200ml。准确量取1.0g壳 聚糖样品溶液至滴定容器，加入50ml水和0.2ml甲苯胺蓝(指示剂)试剂 溶液，充分混和后，用聚乙烯硫酸钾溶液进行滴定。将由蓝色变为红紫色 的点定为终点。设滴定量为Vml。
进行同样操作来对不加入壳聚糖样品的溶液进行滴定。滴定量以Bml 表示。精确测得聚乙烯硫酸钾溶液约为1/400N。其浓度用[PVSK]表示。
壳聚糖中的游离氨基质量(X)(相当于葡糖胺残基的质量)和键合氨 基质量(Y)(相当于N-乙酰基葡糖胺残基的质量)为：
X＝壳聚糖中的游离氨基的质量＝[PVSK]×161/1000×(V-B)
Y＝壳聚糖中的键合氨基的质量＝0.5×1/100-X，
脱乙酰度利用下面的公式计算，
脱乙酰度(％)＝(X/161)/(X/161+Y/203)×100。其中，161是 指葡糖胺残基的当量分子量，203是指N-乙酰基葡糖胺残基的当量分子量。
(壳聚糖的分子量的测定方法：奥斯特瓦尔德粘度测定法)
使用奥斯特瓦尔德粘度计，测定比粘度，使用下表6的换算表求得。 在50mg的壳聚糖样品中加入50ml的4％的醋酸水溶液及50ml的0.6M 的食盐水进行溶解，来配制粘度的测定溶液。使用シバタ制奥斯特瓦尔德 粘度计的内径为0.5mm的毛细管，测定从刻度a到刻度b的通过时间，设 该时间为t。
配制没有溶解壳聚糖的溶液，进行同样操作来测定从刻度a到刻度b 的通过时间，设该时间为to。
对t和to测定三次，使用平均值。
比粘度按照下式计算。
比粘度＝t/to-1
表6
表6：由比粘度向壳聚糖分子量的换算表   比粘度   分子量(Da)   0.005   1,000   0.01   4,000   0.02   8,000   0.03   13,000   0.04   17,000   0.05   21,000   0.06   26,000   0.07   30,000   0.08   34,000   0.09   39,000   0.10   43,000   0.11   47,000   0.12   51,000   0.13   55,000   0.14   59,000   0.15   63,000   0.16   67,000   0.17   71,000   0.18   75,000   0.19   79,000   0.20   83,000   0.39   150,000
在比粘度位于上述数值之间的情况下，按照具有比例关系来求算。
(壳聚糖分子量的测定方法：GPC测定法)
壳聚糖的分子量，也可以利用凝胶渗透色谱(GPC)法来求得。
作为GPC测定法中使用的分析仪器，包括差示折射率检测器(Shodex RI-71)、泵(Shodex DS-4)、数据处理装置GPC软件(ウオ一タ一ズ Maxima 820J)，然后将2根分离柱(Shodex OHpak SB-806M HQ)串联 连接，设置在温度设定为60℃的柱加热炉(Shodex OVEN AO-50)中。
作为洗脱液，使用0.1M的醋酸缓冲液(在750ml的0.1M醋酸中加入 100ml的0.1M的醋酸钠，进而用0.1M醋酸钠将pH调节成4，将所获得 的溶液用孔径为0.45μm的过滤器过滤而得到的溶液)，以1.0ml/min的流 速流通液体。
为了使样品为0.1质量％，在GPC测定48小时前，预先溶解于洗脱 液中。在溶解时，不可以激烈震荡溶液或使用超声波。注入200μl这样配 制后的样品溶液。
洗脱液：0.1M的醋酸缓冲液(pH4.0)
色谱柱：Shodex SB-806M HQ×2根60℃
流量：1.0ml/min
检测器：差示折射率检测器(Shodex RI-71)
进样量：200μl(0.1％/洗脱液)
利用以上条件测得的GPC色谱图如图1所示。
工业可利用性
如上所述，根据本发明，可以提供一种用于降低栽培植物中的硝酸盐 含量的组合物，其以规定的质量比率含有壳聚糖、有机酸、硝酸盐还原酶 活性物质和叶绿素合成促进物质。根据本发明，不需要转基因植物、昂贵 的化合物就可以降低栽培植物中含有的硝酸盐量。
(专利文献1)俄罗斯共和国专利第2,158,510号
(专利文献2)美国专利第5,489,572号