一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法

申请号 CN201710506205.0 申请日 2017-06-28 公开(公告)号 CN107409792A 公开(公告)日 2017-12-01
申请人 成都大学; 发明人 王静; 黄正文; 高丽楠; 曾永刚; 曾丽; 辛勤;
摘要 本 发明 公开了一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法,该方法包括以下步骤:开花结实的物候观察;开花动态观察;单花花粉量及花粉形态大小测定;花粉活 力 测定;柱头可受期测定。该方法通过对凹叶木兰的开花物候、开花时花被片和雌雄蕊的动态变化、花粉维持活性的时间和柱头可受期的研究,探讨凹叶木兰的开花 生物 学特性和繁育系统。
权利要求

1.一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、开花结实的物候观察
在麻咪泽自然保护区,设置19个样地,按照人为干扰程度将样地的生境划分为村庄附近,放牧地,原始森林和人工林;连续两年于样地内进行凹叶木兰花期物候观测;按照Dafni 
1992的标准记录开花进程并记录开始的时间,当个别植株开始开花时为始花期,50%以上的植株开花时为盛花期,少于10%的植株仍在开花为末花期;记录样地的海拔高度和经纬度;
于第一年9月在美姑大顶自然保护区,次年10月在雷波麻咪泽保护区和冕宁冶勒自然保护区,第三年10月在冕宁冶勒自然保护区进行凹叶木兰结实特性的调查,纪录每株凹叶木兰的结实数量,并测量结实的个体的高度和胸径;
步骤2、开花动态观察
从现蕾开始,随机标记凹叶木兰10朵花,每隔3个小时观察1次,记录花蕾的生长变化状态和开花动态,同时记录观察的时间、天气、湿度、温度
步骤3、单花花粉量及花粉形态大小测定
从3株样树上随机选取外轮花被片已张开但雄蕊还未散粉的花20朵,固定于FAA溶液中带回实验室;在室内统计每朵花的花药数目后,从每朵花上随机选取5枚花药,用1.0mL/L HCl软化花药壁,解剖花药,将全部花粉移入装有蒸馏的烧杯中,仔细清洗花药壁、镊子和刀片,清洗液也移入离心管,定容至100mL,振荡器下振荡60s,制成花粉粒悬浮液,用微量进样器取10μL花粉液于载玻片上,在显微镜下观察并统计花粉数,重复10次,取其平均值乘以
10000算出5枚花药的花粉粒总数,并算出单花花粉量和平均单花花粉量;接着将该花的子房置于载玻片上于解剖镜下解剖剥离,统计胚珠数;每一朵花的花粉胚珠比用单花中的花粉量除以单花子房中的胚珠数的方法统计;
在显微镜下观察木兰花粉的形态,用测微尺测量每朵花20粒花粉的大小;统计数据用平均值±标准误差表示,n表示样本量;
步骤4、花粉活测定
在三棵样树上共选取10朵外轮花被片已开放至平展状态的花朵,采下带回室内水插,从其自然散粉开始到衰败时定期1h、2h、3h、4h、8h、1d、2d、3d取花粉测定;将花粉样品置于载玻片上,加1-2滴0.5%TTC蔗糖溶液,在室温下放置10-15分钟后,用显微镜在同一张玻片的3个不同视野观察并统计花粉中红色花粉数所占总花粉数的比例,重复3次,取平均值;
步骤5、柱头可受期测定
人为将凹叶木兰花朵或花蕾分为I-IV个时期,取不同发育时期的花的花柱各20个,来源于不同的5朵花,每朵花取4个柱头,在凹形载玻片内,用MTT溶液对柱头进行检测。
2.根据权利要求1所述的凹叶木兰的有性繁殖研究方法,其特征在于,步骤5中,花朵人为分期如下:
I:具有1层苞片的花蕾,苞片未开裂,褐色;
II:佛焰苞开裂至外轮花被片展开,中、内轮花被片略裂开,雄蕊未散粉;
III:中内轮花被片开放、雄蕊开始散粉;
IV:花被片、雄蕊开始脱落。

说明书全文

一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体地说,涉及一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法。

背景技术

[0002] 被子植物的花朵在大小、形态和颜色上千差万别。就形态而论,一朵花就是一个复合器官,其所有结构都与有性生殖过程相适应,所以植物的开花和结实特性是植物在一定生境条件下经过长期自然选择后的一种适应性表现,也是植物的花与其传粉者之间在生物界长期进化中,相互适应、相互协调的结果。了解植物的开花结实特性对研究物种濒危原因和以此制订合理的保护措施有重要的指导意义。
[0003] 植物的繁育系统,作为物种性别表达中影响个体对下一代相对遗传贡献的首要因子,被认为不仅包含雌、雄配子等载体,是种群基因流动的途径,而且是受精成功的先决条件,是调节种群遗传结构的有效手段,它更深远的意义在于通过影响生殖成功来影响种群的动态和进化。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法,该方法通过对凹叶木兰的开花物候、开花时花被片和雌雄蕊的动态变化、花粉维持活性的时间和柱头可受期的研究,探讨凹叶木兰的开花生物学特性和繁育系统。
[0005] 为实现上述技术目的,达到上述技术效果,其技术方案具体为:
[0006] 一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法,包括以下步骤:
[0007] 步骤1、开花结实的物候观察
[0008] 在麻咪泽自然保护区,设置19个样地,按照人为干扰程度将样地的生境划分为村庄附近,放牧地,原始森林和人工林。连续两年于样地内进行凹叶木兰花期物候观测。按照Dafni(1992)的标准[353]记录开花进程并记录开始的时间,当个别植株开始开花时为始花期,50%以上的植株开花时为盛花期,少于10%的植株仍在开花为末花期。记录样地的海拔高度和经纬度。
[0009] 于第一年年9月在美姑大顶自然保护区,次年10月在雷波麻咪泽保护区和冕宁冶勒自然保护区,第三年10月在冕宁冶勒自然保护区进行凹叶木兰结实特性的调查,纪录每株凹叶木兰的结实数量,并测量结实的个体的高度和胸径。
[0010] 步骤2、开花动态观察
[0011] 从现蕾开始,随机标记凹叶木兰10朵花,每隔3个小时观察1次,记录花蕾的生长变化状态和开花动态,同时记录观察的时间、天气、湿度、温度
[0012] 步骤3、单花花粉量及花粉形态大小测定
[0013] 从3株样树上随机选取外轮花被片已张开但雄蕊还未散粉的花20朵,固定于FAA溶液中带回实验室。在室内统计每朵花的花药数目后,从每朵花上随机选取5枚花药,用1.0mL/L HCl软化花药壁,解剖花药,将全部花粉移入装有蒸馏的烧杯中,仔细清洗花药壁、镊子和刀片,清洗液也移入离心管,定容至100mL,振荡器下振荡60s,制成花粉粒悬浮液,用微量进样器取10μL花粉液于载玻片上,在显微镜下观察并统计花粉数,重复10次,取其平均值乘以10000算出5枚花药的花粉粒总数,并算出单花花粉量和平均单花花粉量。接着将该花的子房置于载玻片上于解剖镜下解剖剥离,统计胚珠数。每一朵花的花粉胚珠比(pollen ovule ratio,P/O)用单花中的花粉量除以单花子房中的胚珠数的方法统计。
[0014] 在显微镜下观察木兰花粉的形态,用测微尺测量每朵花20粒花粉的大小。统计数据用平均值±标准误差表示,n表示样本量。
[0015] 步骤4、花粉活测定
[0016] 在三棵样树上共选取10朵外轮花被片已开放至平展状态的花朵,采下带回室内水插,从其自然散粉开始到衰败时定期(1h、2h、3h、4h、8h、1d、2d、3d)取花粉测定。将花粉样品置于载玻片上,加1-2滴0.5%TTC(2.3.5-Triphenyl tetrazolium chloride)蔗糖溶液,在室温下放置10-15分钟后,用显微镜在同一张玻片的3个不同视野观察并统计花粉中红色花粉数所占总花粉数的比例,重复3次,取平均值。
[0017] 步骤5、柱头可受期测定
[0018] 人为将凹叶木兰花朵(或花蕾)分为I-IV个时期,取不同发育时期的花的花柱各20个(来源于不同的5朵花,每朵花取4个柱头),在凹形载玻片内,用MTT(噻唑蓝)溶液对柱头进行检测。
[0019] 进一步,步骤5中,花朵人为分期如下:
[0020] I:具有1层苞片的花蕾,苞片未开裂,褐色。
[0021] II:佛焰苞开裂至外轮花被片展开,中、内轮花被片略裂开,雄蕊未散粉。
[0022] III:中内轮花被片开放、雄蕊开始散粉。
[0023] IV:花被片、雄蕊开始脱落。
[0024] 本发明具有以下有益效果:
[0025] 本发明通过对凹叶木兰的开花物候、开花时花被片和雌雄蕊的动态变化、花粉维持活性的时间和柱头可受期的研究,探讨凹叶木兰的开花生物学特性和繁育系统。附图说明
[0026] 图1是凹叶木兰花粉寿命。

具体实施方式

[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图和实施例,对本发明进行进一步详细说明。
[0028] 1研究方法
[0029] 1.1开花结实的物候观察
[0030] 在麻咪泽自然保护区,设置19个样地,按照人为干扰程度将样地的生境划分为村庄附近,放牧地,原始森林和人工林。2007-2008年连续两年于样地内进行凹叶木兰花期物[353]候观测。按照Dafni(1992)的标准 记录开花进程并记录开始的时间,当个别植株开始开花时为始花期,50%以上的植株开花时为盛花期,少于10%的植株仍在开花为末花期。记录样地的海拔高度和经纬度。
[0031] 于2007年9月在美姑大风顶自然保护区,2008年10月在雷波麻咪泽保护区和冕宁冶勒自然保护区,2009年10月在冕宁冶勒自然保护区进行凹叶木兰结实特性的调查,纪录每株凹叶木兰的结实数量,并测量结实的个体的高度和胸径。
[0032] 1.2开花动态观察
[0033] 从现蕾开始,随机标记凹叶木兰10朵花,每隔3个小时观察1次,记录花蕾的生长变化状态和开花动态,同时记录观察的时间、天气、湿度、温度。
[0034] 1.3单花花粉量及花粉形态大小测定
[0035] 从3株样树上随机选取外轮花被片已张开但雄蕊还未散粉的花20朵,固定于FAA溶液中带回实验室。在室内统计每朵花的花药数目后,从每朵花上随机选取5枚花药,用1.0mL/L HCl软化花药壁,解剖花药,将全部花粉移入装有蒸馏水的烧杯中,仔细清洗花药壁、镊子和刀片,清洗液也移入离心管,定容至100mL,振荡器下振荡60s,制成花粉粒悬浮液,用微量进样器取10μL花粉液于载玻片上,在显微镜下观察并统计花粉数,重复10次,取其平均值乘以10000算出5枚花药的花粉粒总数,并算出单花花粉量和平均单花花粉量。接着将该花的子房置于载玻片上于解剖镜下解剖剥离,统计胚珠数。每一朵花的花粉胚珠比(pollen ovule ratio,P/O)用单花中的花粉量除以单花子房中的胚珠数的方法统计。
[0036] 在显微镜下观察木兰花粉的形态,用测微尺测量每朵花20粒花粉的大小。统计数据用平均值±标准误差表示,n表示样本量。
[0037] 1.4花粉活力测定
[0038] 在三棵样树上共选取10朵外轮花被片已开放至平展状态的花朵,采下带回室内水插,从其自然散粉开始到衰败时定期(1h、2h、3h、4h、8h、1d、2d、3d)取花粉测定。将花粉样品置于载玻片上,加1-2滴0.5%TTC(2.3.5-Triphenyl tetrazolium chloride)蔗糖溶液,在室温下放置10-15分钟后,用显微镜在同一张玻片的3个不同视野观察并统计花粉中红色花粉数所占总花粉数的比例,重复3次,取平均值。
[0039] 1.5柱头可受期测定
[0040] 人为将凹叶木兰花朵(或花蕾)分为I-IV个时期,取不同发育时期的花的花柱各20个(来源于不同的5朵花,每朵花取4个柱头),在凹形载玻片内,用MTT(噻唑蓝)溶液对柱头进行检测。
[0041] 花朵人为分期如下:
[0042] I:具有1层苞片的花蕾,苞片未开裂,褐色。
[0043] II:佛焰苞开裂至外轮花被片展开,中、内轮花被片略裂开,雄蕊未散粉。
[0044] III:中内轮花被片开放、雄蕊开始散粉。
[0045] IV:花被片、雄蕊开始脱落。
[0046] 2观察和实验的结果
[0047] 2.1凹叶木兰花期物候
[0048] 野外调查发现凹叶木兰花期一般在4月初至4月下旬,花先叶开放。冬芽于3月中下旬萌动,4月初至4月下旬展叶,到7月中旬开始形成越冬花蕾;果实于9月下旬至10月初成熟,9月中下旬开始落叶,至11月上中旬全部脱落。
[0049] 不同年份凹叶木兰的花期物候有所不同,2007年始花期和盛花期分别比2008年早3d和2d(表1)。此外,生长在不同生境中的凹叶木兰其花期也不同。2008年,位于村庄附近的凹叶木兰开花最早,始花期在4月5日,到4月7日已进入盛花期,而此时放牧林和原始森林中的凹叶木兰尚未开花,当放牧区的凹叶木兰进入盛花期时,原始森林中的凹叶木兰才开始开花。
[0050] 表1凹叶木兰花期物候
[0051]
[0052] 2008年3月31日,冕宁冶勒自然保护区的凹叶木兰已进入盛花期,而雷波麻咪泽自然保护区的凹叶木兰尚未开花。
[0053] 2010年早春干旱,麻咪泽自然保护区凹叶木兰花期提前,3月8日就有少数个体开花,3月16日进入盛花期,3月23日进入末花期。
[0054] 凹叶木兰单株花期为5-7d,花期长短与气候有很大关系,若遇阴雨天气,花期延长,若遇晴朗大风天气,花期缩短。同时,通过观察发现凹叶木兰不同树冠部位的开花期也有不同,一般趋势为上层树冠先开花,中、下层后开花。
[0055] 凹叶木兰果实于10月成熟。
[0056] 2.2不同生境,不同年份凹叶木兰开花个体数及盛花期开花数量差异
[0057] 调查发现,2007年开花的个体比2008年少,2007年开花的个体数占被调查个体总数的27.4%,2008年开花的个体数占被调查个体总数的34.2%,2008年原始森林中凹叶木兰开花个体比例大于2007年。村庄附近每年只有2株木兰开花;放牧区开花的木兰很少,仅占调查总数的12%-13%;连续两年调查都没有发现人工林中的凹叶木兰开花,据保护区工作人员介绍,历年来都不曾见人工林中的凹叶木兰开花。
[0058] 2008年4月对在2007年开过花的个体进行观察发现,凹叶木兰存在大小年的现象,有的个体在2007年开花,但是2008年没有花蕾,不开花;有的个体2007年开数百朵花,但在2008年仅开不到10朵花;有的个体2007年仅开不到十朵花,但在2008年开一百多朵花。
[0059] 不同生境中开花的木兰个体在盛花期开花数量也有显著差别。原始森林中有的个体开花达数百朵甚至上千朵,村庄附近个体开花为几十朵,放牧区个体开几朵花,最多达十几朵,人工林中个体未见开花。
[0060] 表2麻咪泽自然保护区凹叶木兰个体开花情况
[0061]
[0062] 2.3凹叶木兰单花开花过程
[0063] 凹叶木兰单花从苞片开裂,最外轮花被片开始展开到花被片和雄蕊全部脱落需5-6d。凹叶木兰的花在下午15:00-18:00开放,单花期依形态特征可人为划分4个时期:1)下午
15-18点到次日清晨6-8点,从苞片开裂,最外轮花被片开始展开到最内轮花被片完全展开;
2)次日清晨6-8点到第三日清晨7-9点,雄蕊开始散粉;3)第三日清晨7-9点到下午19:00左右,雄蕊全部散粉;4)第四日中午12:00左右,花被片和雄蕊开始脱落。
[0064] 凹叶木兰花蕾卵圆形,外面包被一层褐色的苞片,花蕾长大到长达10cm左右时,苞片从一侧开裂,苞片从开裂到变黑脱落视天气情况,若遇晴朗大风天气,很快脱落,有时待花被片脱落后才脱落;苞片开裂后,最外轮花被片开始展开,中、内轮花被片仍紧闭,随着最外轮花被片张开,中、内轮花被片松动,微张,花被片开始散发香味,花被片之间出现缝隙,通过缝隙可见雌蕊群上柱头白色,向下弯曲,表面湿润,雄蕊群紧贴雌蕊群,未散粉,雌蕊上部突出雄蕊群0.57±0.37cm(n=12),最外轮花被片全部展开后,中、内轮花被片才依次展开,三轮花被片全部展开需13-16h,此时花冠直径为17-21cm;最外轮花被片开始反卷,中、内轮花被片完全展开,雄蕊尚未开始散粉,单个雄蕊紧密相挨,柱头仍然弯曲,可受面白色,背面紫红色,可受面有明显乳头状突起,表面湿润,这个状态将持续21-24h左右后,雄蕊群开始散粉,一般是位于雄蕊群一侧或位于雄蕊群最内轮的几枚雄蕊开始散粉,然后其余雄蕊依次开始散粉;有的雄蕊花粉囊单侧先开裂然后另一侧再开裂,有的雄蕊两侧花粉囊同时开裂,花粉囊有的从上往下开裂,有的从中间向两端开裂,有的从下向上开裂;从第一枚雄蕊散粉开始到全部雄蕊散粉完毕需要8-10h,雄蕊散粉时,雄蕊群张开,单个雄蕊之间距离增大,雌蕊柱头呈淡黄色或淡褐色,由向下弯曲状变为直立,可受面紧贴雌蕊柱;全部雄蕊散粉后经过15-18h,花被片和雄蕊开始脱落,此时花被片基部变为褐色,雄蕊脱水呈螺旋状,柱头干枯萎缩,变为褐色。花被片和雄蕊全部脱落的时间要视天气情况,若遇大风天气,花被片和雄蕊会很快脱落。花被片和雄蕊脱落后,只留绿色幼果,没有受精的幼果数日后果柄逐渐萎缩,15d左右脱落。
[0065] 2.4单花花粉量测定
[0066] 凹叶木兰平均单花花粉量为553800±392104(n=20)粒,平均P/O值为3955.71±2893.95∶1(n=20)。
[0067] 花粉粒极面观为船型,具一远沟,长为62.03±2.23um(n=30);宽为25.17±2.81um(n=30)。
[0068] 2.5花粉活性
[0069] TTC(2.3.5-Triphenyl tetrazolium chloride)染色结果表明花粉活力(有活性花粉所占百分比)在散粉后随时间的推移逐渐降低(图1),在散粉后的第1小时活性最高,达90.4%±8.9%(n=30),第2、3个小时花粉活性相差不大但比散粉后的第1小时稍有下降,分别为79.8%±14.4%(n=30)和77.9%±15.4%,第4小时花粉活性比散粉后的第2、3小时也稍有下降,为68.6%±20.2%,第8小时后花粉活性迅速下降,为47.6%±21.8%,到第
2天仅有极少数花粉有活性,为4.4%±5.1%,第3天花粉活性全失。
[0070] 从形态学上可以观察到,自然状态下初散粉时,花粉呈粉状,淡黄色。到散粉后第3天,花粉囊中很少有花粉,仅在花粉囊两侧壁上残留少数条状花粉团。
[0071] 2.6柱头可受期
[0072] 用MTT溶液测定各花期柱头可受性,同时观察凹叶木兰各花部的变化特征,结果如表3。
[0073] 表3凹叶木兰不同单花花期柱头可受期测定观察
[0074]
[0075]
[0076] 花朵处于I期时,仍是花蕾,外面包被一层褐色的佛焰苞,此时柱头黄绿色或白色,直立,可受面紧贴雌蕊柱,可受面上有微弱的突起,没有分泌物,经MTT溶液检测不变色,说明此时柱头处于不可受状态。
[0077] 在花期II时,佛焰苞一侧开裂,最外轮花被片开始展开,中、内轮花被片略松开,此时通过中、内轮花被片张开的缝隙可以看到,雌蕊群的柱头向外张开并向下弯曲,可受面乳头状突起明显,表面湿润,在显微镜下观察,乳头状突起呈啫哩状物质。经MTT溶液检测全部变为蓝色,说明此时柱头处于可受状态。
[0078] 花朵处于III期时,中、内轮花被片完全展开,雄蕊开始散粉,此时柱头由白色逐渐变为淡黄色或淡褐色,并由弯曲状态变为直立,可受面紧贴雌蕊柱。经MTT溶液检测,仅刚开始散粉的花的柱头还未完全紧贴雌蕊柱,颜色变为浅蓝,其余紧贴雌蕊柱的柱头颜色均不发生变化,推测刚开始散粉的花的柱头仍具有可受性,但活性较低,若柱头紧贴雌蕊柱则表明柱头不再具有可受性。
[0079] 在花期IV中,雄蕊全部散粉完毕,花被片和雄蕊开始脱落,此时柱头干枯萎缩,变为褐色,并紧贴雌蕊柱,经MTT溶液检测不变色,说明此时柱头完全失活,完全不能接受花粉。
[0080] 可见凹叶木兰的雌蕊可受期和雄蕊可授期没有重叠,其雌雄异熟的时间约为1天。严格的雌雄异熟机制,有昆虫访花,初步表明凹叶木兰是异花虫媒授粉植物。
[0081] 2.7凹叶木兰的自然结实率
[0082] 凹叶木兰的自然结实率很低,2007年9月,在美姑大风顶自然保护区仅发现一株个体结实,果实仅为5个,结实率为0.98%。2008年10月未见雷波麻咪泽自然保护区的凹叶木兰结实;在冕宁冶勒自然保护区发现2株个体结实,1株结实约30个,胸径较小的一株结实5个。2009年10月在冕宁冶勒自然保护区发现1株个体结实,果实仅有8个。
[0083] 以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
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