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使编码植物免疫刺激蛋白质的抗病基因(PR基因簇)表达的、使用该水预防植物病害的方法、及该水的生成装置

申请号 CN200980136175.2 申请日 2009-09-16 公开(公告)号 CN102159082A 公开(公告)日 2011-08-17
申请人 财团法人北九州产业学术推进机构; 发明人 田中健一郎; 田中里香; 河野智谦;
摘要 本 发明 公开了一种 预防 植物 病害的方法,其能够在植物 体细胞 内引起 氧 化还原反应,诱导病原抗性基因的表达,并且,不会在 土壤 中遗留残留成分,且能够培育抗病性强的植物。通过使含有 活性氧 种且具有能够长时间保持功能的 水 接触 植物,诱导上述植物所具有的病原抗性基因,含有活性氧的水被植物吸收,从而预防上述植物的病害。
权利要求

1.一种活性,其特征在于,
含有选自超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基种的、经时变化不同的第一活性氧种与第二活性氧种,
所述第一活性氧种和所述第二活性氧种中,一方比另一方反应性低,且能长时间保持功能,
所述活性氧水通过使所述活性氧种所具有的氧化还原植物体的细胞外到达植物细胞内,在所述植物细胞内引起氧化还原反应,使病原抗性基因表达。
2.一种预防植物病害的方法,其特征在于,
使含有活性氧种并能长时间保持功能的活性氧水与植物接触,诱导所述植物具有的抗病基因表达,预防所述植物的病害。
3.如权利要求2所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
所述活性氧水含有超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基中的至少一种活性氧,通过与植物接触,使活性氧种所具有的氧化还原力由植物体细胞外到达植体物细胞内,利用由被吸收的水在植物体细胞内引起的氧化还原反应诱导抗病基因表达,预防所述植物的病害。
4.如权利要求2所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
所述活性氧水含有选自超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基种的、经时变化不同的第一活性氧种和第二活性氧种,
所述第一活性氧种和所述第二活性氧种中,一方比另一方反应性低,且能长时间保持功能,
在诱导所述抗病基因时,使能够直接对病原生物起作用的所述第一活性氧种迅速起效,使能够诱导植物的抗病基因表达的所述第二活性氧种缓慢起效,预防所述植物的病害。
5.如权利要求2-4中任一项所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
向浸渍在水中的催化剂体施加紫外线、声波振动、可见光、微波中的至少任意一种,而生成所述活性氧种。
6.如权利要求5所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
所述水中溶解有作为所述活性氧种的前驱物的氧气、臭氧气、氯气、一氧化氮气、气中的至少任意一种。
7.如权利要求5或6所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
所述催化剂体含有二氧化(TiO2)、氧化(Al2O3)、耐酸铝、氧化镁、氢氧化镁、磁矿(Fe3O4)、氧化锌、氧化钨、钛酸钡、钛酸锶、钛酸钠、二氧化锆、氧化钨、氢氧化钨化合物、α-Fe2O3、硫化镉、硫化锌、或由铂、、钯的金属氧化离子及金属氢氧化离子构成的金属中的至少一种。
8.如权利要求5-7中任一项所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
所述催化剂体的形状为,粉末状、粒状或纤维状。
9.如权利要求2-7中任一项所述的预防植物病害的方法,其特征在于,
所述活性氧水由活性氧水生成装置生成,
在所述活性氧水生成装置中,在水中设置紫外线光源,并在该紫外线光源周围保持一定间隙环绕由纤维体形成的光催化剂体,使水流形成为,流过紫外线光源与光催化剂体的间隙并上升或下降的第一水流;以螺旋状流过光催化剂体的外周并上升或下降的第二水流;和流入流出光催化剂体组织内的第三水流。
10.一种用于如权利要求2-9中任一项所述的预防植物病害的方法的活性氧水生成装置,其特征在于,包括:
设置在具有供水口和活性氧水取出口的容器内的紫外线光源;和
保持一定间隙环绕在所述紫外线光源周围的、由纤维体形成的光催化剂体,
供给到容器内的水流形成为,流过紫外线光源与光催化剂体的间隙并上升或下降的第一水流;以螺旋状流过光催化剂体的外周并上升或下降的第二水流;和流入流出光催化剂体组织内的第三水流。
11.一种用于如权利要求2-9中任一项所述的预防植物病害的方法的活性氧水生成装置,其特征在于,包括:
由透过紫外线的材质形成、具有供水口和出水口、内部容纳催化剂体的容器;
向从所述供水口流入的水在所述容器内流动的方向照射超声波的超声波照射部;和设置于所述容器周围、从所述容器外部对所述催化剂体照射紫外线的紫外线照射部,所述催化剂体的至少一部分设置在所述超声波照射部的照射区和所述紫外线照射部的照射区的重叠区域。
12.如权利要求11所述的活性氧水生成装置,其特征在于,
具有微波照射部,其在垂直于水从所述供水口流入并流向所述出水口时在所述容器内流动的方向照射微波,
所述催化剂体的至少一部分设置在所述微波照射部的照射区、所述超声波照射部的照射区和所述紫外线照射部的照射区的重叠区域。

说明书全文

使编码植物免疫刺激蛋白质的抗病基因(PR基因簇)表达

、使用该水预防植物病害的方法、及该水的生成装置

技术领域

[0001] 本发明涉及一种使编码植物免疫刺激蛋白质的抗病基因(PR基因簇)表达的水、使用该水预防植物病害的方法、以及该水的生成装置。

背景技术

[0002] 在现有技术中,为预防植物的病害,已知利用植物自身具有的免疫(immune-like)防御机制的方法。
[0003] 即,对于病原菌等的入侵,植物具有提高自身抵抗性的免疫防御机制,通过使激发该防御机制的免疫刺激物质表达,提高植物的耐病害性。
[0004] 在使该免疫刺激物质表达时,使用了例如美国Dupont公司的苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)或明治制果公司出品的噻菌灵(probenazole,商品名:Oryzemate)(例如,参见专利文献1)。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:日本专利公开第2006-327995号公报
[0008] 本发明要解决的问题
[0009] 但是,在上述现有技术的预防植物病害的方法中,由于使用了药剂,因此在使用量大的农忙期存在药液溶入排水渠及河流,超过规定标准的险。而且,产生对环境负荷的堪忧,例如市售噻菌灵可湿性粉剂(商品名:ホクホ一側条オリゼメ一ト顆粒水和剂)的数据表中提示注意其对鱼类的毒性(对鲤鱼的LC50值(48小时)为8ppm)。
[0010] 本发明的发明人经过潜心研究,发现了活性种(reactive oxygen species)诱导植物抗病害基因表达的现象。因此,可认为若将这些活性氧种与植物接触,能够提高植物的耐病害性。
[0011] 然而,在接触方式中采用的使气体状或雾状的活性氧种与植物体接触的方法中,由于活性氧种与空气接触,因而与大气中的有机物或浮游细菌作用而被消耗,因此到达作用对象的植物体的活性氧种的浓度值变低。为了使基因表达,需要初始浓度极高的活性氧种,因而具有与上述药物相同的对环境影响的风险。
[0012] 因此,可认为理想的是形成水中含有活性氧种的状态,且在水中尽可能长时间地维持活性氧种,并使该水与植物接触。
[0013] 但是,至今还没有稳定生成这样的含有活性氧种的水(以下称为“活性氧水”)的普遍方法,也没有研究过将该水应用于提高植物耐病害性上的问题。

发明内容

[0014] 本发明有鉴于这种情况,提供了一种不使用药物作为有效成分,并能引起植物体细胞内的氧化还原反应,诱导病原抗性基因(抗病基因)表达的含有活性氧种的水;使用该水的预防植物病害的方法;以及该水的生成装置。
[0015] 为解决上述现有技术中的问题,本发明的第1方面提供了一种活性氧水,其含有选自超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基种的、经时变化不同的第一活性氧种与第二活性氧种,
[0016] 所述第一活性氧种和所述第二活性氧种中,一方比另一方反应性低,且能长时间保持功能,
[0017] 所述活性氧水通过使所述活性氧种所具有的氧化还原由植物体的细胞外到达植物细胞内,在所述植物细胞内引起氧化还原反应,使病原抗性基因表达。
[0018] 本发明的第2方面提供了一种预防植物病害的方法:使含有活性氧种并能长时间保持功能的活性氧水与植物接触,诱导所述植物具有的抗病基因表达,预防所述植物的病害。
[0019] 本发明的第3方面为基于第2方面的预防植物病害的方法中,所述活性氧水含有超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基中的至少一种活性氧,通过与植物接触,使活性氧种所具有的氧化还原力由植物体细胞外到达植体物细胞内,利用由被吸收的水在植物体细胞内引起的氧化还原反应诱导抗病基因表达,预防所述植物的病害。
[0020] 本发明的第4方面为基于第2方面的预防植物病害的方法中,
[0021] 所述活性氧水含有选自超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基种的、经时变化不同的第一活性氧种和第二活性氧种,
[0022] 所述第一活性氧种和所述第二活性氧种中,一方比另一方反应性低,且能长时间保持功能,
[0023] 在诱导所述抗病基因时,使能够直接对病原生物起作用的所述第一活性氧种迅速起效,使能够诱导植物的抗病基因表达的所述第二活性氧种缓慢起效,预防所述植物的病害。
[0024] 本发明的第5方面为基于第2-4方面的预防植物病害的方法中,向浸渍在水中的催化剂体施加紫外线、声波振动、可见光、微波中的至少任意一种,而生成所述活性氧种。
[0025] 本发明的第6方面为基于第5方面的预防植物病害的方法中,所述水中溶解有作为所述活性氧种的前驱物的氧气、臭氧气、氯气、一氧化氮气、气中的至少任意一种。
[0026] 本发明的第7方面为基于第5或第6方面的预防植物病害的方法中,所述催化剂体含有二氧化(TiO2)、氧化(Al2O3)、耐酸铝(alumite)、氧化镁、氢氧化镁、磁矿(Fe3O4)、氧化锌、氧化钨、钛酸钡、钛酸锶、钛酸钠、二氧化锆、氧化钨、氢氧化钨化合物、α-Fe2O3、硫化镉、硫化锌、或由铂、、钯的金属氧化离子及金属氢氧化离子构成的金属中的至少一种。
[0027] 本发明的第8方面为基于第5-7方面的预防植物病害的方法中,其特征在于,所述催化剂体的形状为,粉末状、粒状或纤维状。
[0028] 本发明的第9方面为基于第2-7方面的预防植物病害的方法中,
[0029] 所述活性氧水由活性氧水生成装置生成,
[0030] 在所述活性氧水生成装置中,在水中设置紫外线光源,并在该紫外线光源周围保持一定间隙环绕由纤维体形成的光催化剂体,使水流形成为,流过紫外线光源与光催化剂体的间隙并上升或下降的第一水流;以螺旋状流过光催化剂体的外周并上升或下降的第二水流;和流入流出光催化剂体组织内的第三水流。
[0031] 本发明的第10方面为基于第2-9方面的预防植物病害的方法中使用的活性氧水生成装置,其特征在于,包括:
[0032] 设置在具有供水口和活性氧水取出口的容器内的紫外线光源;和
[0033] 保持一定间隙环绕在所述紫外线光源周围的、由纤维体形成的光催化剂体,[0034] 供给到容器内的水流形成为,流过紫外线光源与光催化剂体的间隙并上升或下降的第一水流;以螺旋状流过光催化剂体的外周并上升或下降的第二水流;和流入流出光催化剂体组织内的第三水流。
[0035] 本发明的第11方面为基于第2-9方面的预防植物病害的方法中使用的活性氧水生成装置,其特征在于,包括:
[0036] 由透过紫外线的材质形成、具有供水口和出水口、内部容纳催化剂体的容器;
[0037] 向从所述供水口流入的水在所述容器内流动的方向照射超声波的超声波照射部;和
[0038] 设置于所述容器周围、从所述容器外部对所述催化剂体照射紫外线的紫外线照射部,
[0039] 所述催化剂体的至少一部分设置在所述超声波照射部的照射区和所述紫外线照射部的照射区的重叠区域。
[0040] 本发明的第12方面为基于第11方面的活性氧水生成装置,具有微波照射部,其在垂直于水从所述供水口流入并流向所述出水口时在所述容器内流动的方向照射微波,[0041] 所述催化剂体的至少一部分设置在所述微波照射部的照射区、所述超声波照射部的照射区和所述紫外线照射部的照射区的重叠区域。
[0042] 发明效果
[0043] 根据本发明的第1方面,由于形成的活性氧水含有选自超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基种(radical species)的根据时间性质不同的第一活性氧种和第二活性氧种,上述第一活性氧种和第二活性氧种相互之间反应性低,而且能长时间保持功能,通过使上述活性氧种的氧化还原力由植物体的细胞外到达植物细胞内,引起上述植物细胞内的氧化还原反应,使病原抗性基因表达,能够提供不使用药物作为有效成分,能够引起植物体细胞内的氧化还原反应、诱导病原抗性基因表达的含活性氧种的水。
[0044] 根据本发明的第2方面,由于使含有活性氧种并能长时间保持功能的水与植物接触,诱导上述植物所具有的病原抗性基因的表达,通过表达系统获得抗性,预防上述植物的病害,通过含有活性氧种的水被植物吸收,能够在植物体细胞内引起氧化还原反应,诱导病原抗性基因表达,并且在土壤中不会留下残留成分,能够培育抗病性强植物。即,能够提供不使用药物作为有效成分,引起植物体细胞内的氧化还原反应、并能够诱导病原抗性基因表达的含活性氧种的水。
[0045] 根据本发明的第3方面,由于上述活性氧水含有超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基中的至少一种活性氧,通过与植物接触的方法,使活性氧种的氧化还原力由植物体的细胞外到达植物细胞内,并通过被吸收的水在植物细胞内引起的氧化还原反应诱导病原抗性基因的表达,因此在各种栽培方式下都能够培育抗病性强的植物。
[0046] 根据本发明的第4方面,由于上述含有活性氧,并具有能长时间保持功能的活性氧水含有选自超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基种(radical species)的第一活性氧种和第二活性氧种,上述第一活性氧种和第二活性氧种相互之间反应性低,而且具有能长时间保持功能,在诱导上述病害耐性基因时,使第一活性氧种在短时间内迅速起效,接着,由于使第二活性氧种缓慢起效的同时预防上述植物的病害,因此在诱导病害抗性基因时,对于活性氧种敏感度高的植物,使第一活性氧种迅速起效,防止由第二活性氧种产生的毒性;同时对于活性氧种敏感度低的植物,利用第二活性氧种能持续地诱导病原抗性基因,因而对各种植物都能准确地使病原抗性基因表达,在不需要对病原微生物直接作用的植物病原抗性诱导过程中(预防阶段),能够预期具有迟效性/缓效性的第二活性氧种的效果;对于已经过了预防阶段,被病原微生物感染了的植物体,可以选择性地利用以直接排除病原微生物为目标的第一活性氧种。
[0047] 根据本发明的第5方面,由于上述活性氧种是通过将紫外线、超声波振动、可见光、微波中的至少一种施加到浸在水中的催化剂体上而生成的,因此能够由催化剂体高效地生成活性氧种。
[0048] 根据本发明的第6方面,由于上述水溶解有成为前述活性氧种的前驱物的氧气、臭氧气、氯气、一氧化氮气、氨气中的至少一种,因此能够进一步提高活性氧种的生成效率。
[0049] 根据本发明的第7方面,由于上述催化剂体含有钛氧化物、氧化铝(Al2O3)、耐酸铝(alumite)、氧化镁、氢氧化镁、磁铁矿(Fe3O4)、氧化锌、氧化钨、钛酸钡、钛酸锶、钛酸钠、二氧化锆、氧化钨、氢氧化钨化合物、α-Fe2O3、硫化镉、硫化锌、或由铂、铜、钯的金属氧化离子及金属氢氧化离子构成的金属中的至少一种,因此能够在水中准确地生成活性氧种。
[0050] 根据本发明的第8方面,由于上述催化剂体具有粉状、粒状或纤维状的形状,因此能够增加水与催化剂体的接触面积,提高反应效率。
[0051] 根据本发明的第9方面,由于上述活性氧水由活性氧水生成装置生成,该活性氧水生成装置通过在水中设置紫外线光源,并且在该紫外线光源周围保持一定间隙,由纤维体形成的光催化剂体环绕,从而形成由流过紫外线光源和光催化剂体的间隙并上升或下降的第一水流、流过光催化剂体的外周呈螺旋状上升或下降的第二水流和流入流出光催化剂体结构的第三水流构成的水流,因此能够使水中高效地含有活性氧种,并能够向大量的植物提供活性氧水。
[0052] 根据本发明的第10方面,由于预防植物病害的方法中使用的活性氧水生成装置包括:在具有供水口和活性氧水排出口的容器中设置的紫外线光源;保持一定间隙的环绕在上述紫外线光源周围的,由纤维体形成的光催化剂体;以及供给到容器的水流,其由流过紫外线光源与光催化剂体的间隙并上升或下降的第一水流、流过光催化剂体的外周并呈螺旋状上升或下降的第二水流和流入流出光催化剂体组织的第三水流构成,因此能够提供可高效产生不使用药物作为有效成分,引起植物体细胞内的氧化还原反应、并能够诱导病原抗性基因表达的含活性氧种的水的装置。
[0053] 根据本发明的第11方面,由于预防植物病害的方法中使用的活性氧水生成装置包括:由对紫外线透明的材质形成、具有供水口和出水口、且内部收容有催化剂体的容器;向从上述供水口流入的水在上述容器内的流动方向上照射超声波的超声波照射部;设置于上述容器周围、从上述容器外部对上述催化剂体照射紫外线的紫外线照射部,上述催化剂体的至少一部分设置于上述超声波照射部照射的超声波的照射区与上述紫外线照射部照射的紫外线的照射区的重叠区域,因此能够提供可高效产生不使用药物作为有效成分,引起植物体细胞内的氧化还原反应、并能够诱导病原抗性基因表达的含活性氧种的水的装置。
[0054] 根据本发明的第12方面,由于从上述供水口流入的水流向上述出水口时,进一步地设置有向上述容器内的流动方向的垂直方向照射微波的微波波照射部,上述催化剂体的至少一部分设置在上述微波照射部照射的微波的照射区、上述超声波照射部照射的超声波的照射区和上述紫外线照射部照射的紫外线的照射区的重叠区内,因此能够提供可高效产生不使用药物作为有效成分,引起植物体细胞内的氧化还原反应、并能够诱导病原抗性基因表达的含活性氧种的水的装置。附图说明
[0055] 图1为表示本实施方式的活性氧水生成装置的侧面剖面图。
[0056] 图2为表示本实施方式的活性氧水生成装置的平面剖面图。
[0057] 图3为表示另一实施方式涉及的活性氧水生成装置的示意图。
[0058] 图4为表示超氧化物阴离子自由基的标尺图、KO2的尖峰信号和由本实施方式生成的超氧化物阴离子自由基的浓度变化的曲线图。
[0059] 图5为表示单线态氧随时间变化的曲线图。
[0060] 图6为表示臭氧浓度测定结果的曲线图。
[0061] 图7为表示在初始浓度2.5ppm的臭氧水中的实验结果的曲线图。
[0062] 图8为表示使用Tiron和/或DABCO的抑制试验结果的曲线图。
[0063] 图9为表示烟草PR1a基因表达结果的琼脂电泳照片。
[0064] 图10为表示番茄PR-1基因表达结果的琼脂电泳照片。
[0065] 图11为表示单线态氧和超氧化物阴离子自由基的脉冲状刺激给药的示意图。
[0066] 符号说明
[0067] A活性氧水的生成装置
[0068] B活性氧水的生成装置
[0069]
[0070]

具体实施方式

[0071] 本发明为在生成含有活性氧种的水时,对其进行效果验证的过程中发现的发明,其通过特异性地生成并适当供给活性氧种,在植物体内诱导病原抗性基因的表达,能够得到系统获得抗性(以下称为SAR)。已知,SAR为对病毒、细菌、真菌等各种病原微生物的防御反应,能够由全身性的PR基因簇表达获得。特别地,本实施方式涉及的活性氧水,含有长寿型的超氧化物阴离子自由基,有效地诱导植物的病原抗性基因表达。
[0072] 本来,对于潜在的病原菌侵入,植物具有提高对病原菌的抵抗性的免疫防御机制。通过使能够诱导该潜在抵抗性的免疫刺激物质表达,抑制疾病的发生,进而达到限制杀菌剂农药的使用量的目的,不直接作用于病原微生物,而是尝试利用病原抗性诱导型药物提高对象植物对病原微生物的抗性的基因表达,进一步地进行利用基因重组的病原抗性基因过表达的植物体培育等利用分子遗传学的赋予抵抗性型的品种改良。
[0073] 其中,已知,以水杨酸(Salicylic Acid)为起点使植物获得免疫力的途径(Salicylic Acid as a Defense-Related Plant Hormone T.Kawano and T.Furuichi,SALICYLIC ACID A Plant Hormone S.Hayat and A.Ahmad 2007 Springer),并已知通过-超氧化物阴离子自由基(O2·)自初期反应到使病原抗性基因表达的途径,和进行其病原抗性基因的表达并发生后期反应,而在植物全株获得免疫力的系统获得抗性(Systemic Acquired Resistance,一般简写为SAR)。水杨酸诱导的系统获得抗性的指标是由以酸性PR-1基因(PR-la)为代表的PR基因簇的表达。通过利用上述水杨酸依存性的抵抗性诱导途径,不但能够防治植物病原细菌及植物病原真菌,还能预防杀菌剂等以前的农药不能防治的植物病原性病毒引起的感染。
[0074] 为此,开发出在植物体内诱导水杨酸的药剂及模拟水杨酸作用的药剂,作为现在使用的药剂,主要为美国Dupont公司的苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)或明治制果公司出品噻菌灵(商品名:Oryzemate),其是稻瘟病、白叶枯病、水稻细菌性谷枯病、枯穗病预防药,并对黄瓜、莴苣、卷心菜、西兰花、白菜、葱等的细菌性病害有效,故正被广泛利用。
[0075] 然而,由于使用了药剂,在大量使用药剂的农忙期存在药液溶入排水渠及河流,超过规定标准的风险。而且,产生对环境负荷的堪忧,例如市售噻菌灵可湿性粉剂(商品名:ホクホ一側条オリゼメ一ト顆粒水和剂)的数据表中提示了其对鱼类的毒性(对鲤鱼的LC50值(48小时)为8ppm)的注意。
[0076] 已知活性氧种广泛分布在自然界和生体内,其強氧化性具有引起细胞膜毒性的杀菌能力,在空气净化器等中对其的利用颇受瞩目。本来所谓活性氧种,一般是指超氧化物阴- 1离子自由基(O2·)、双氧水(H2O2)、羟基自由基(·OH)及单线态氧(O2)等氧种,广义上是-
指,脂质过氧化物(LOOH,LOO·)或卤化氧(ClO),被认定为生物体内血管内皮衍生弛缓因子的一氧化氮自由基(NO·)等。其被发现能够引起血管内皮细胞毒性,并被用于生体内毒性转移物质。在研究该毒性原因的过程得知其如下特性,即在生物体内,通过消除超氧化物-
歧化酶(SOD)和NO·的O2,而恒定地维持。
[0077] 并且近年来,得知在植物发芽的时候产生微量的活性氧种等,活性氧种在自然界中的作用至今还在研究过程中,并且开发了在生物体外的测定方法及定量技术,由于其具有不稳定性,寿命为只能保持几毫秒或是更短的极短时间,因此除了过氧化氢以外,其他活性氧种不能在水中恒定量地生成。
[0078] 广义地,过氧化氢虽然归入活性氧种的范围内,但因其是非常稳定的化合物,在常温下能够长期保存,在高浓度下也能生成等,与其他活性氧种具有明显区别。通过鲁米诺反应能够从极微量中测量浓度等,在了解生态系及生物体内的氧化还原反应(oxidation-reduction)时,能够用作具有通用性的刺激转移物质。
[0079] 将植物细胞内被诱导的水杨酸或过氧化氢实验性地直接提供给植物体或植物细胞,实验性地进行了通过从外部施加氧化应激的基因表达的验证。然而,为了准确地验证基因表达,必须施用极高浓度的药物(0.1~0.5mM的水杨酸、2~10mM的双氧水);像这样,实际向植物施用了浓度大大超过原本植物体内生成的刺激浓度的情况,不但造成植物体自身的损害,导致局部细胞死亡,而且由于未被植物吸收,而残留在土壤和水环境中成为环境负担,因此实际上在农业现场不能使用这些。
[0080] 此外还有利用基因导入获得病原抗性的方法。然而,关于基因导入下的品种改良,考虑到对周围生态系统和人体的影响,必需长期性地验证基因的稳定性及安全性等;承担对其他植物无基因水平扩散等影响的义务,且产生持续确认没有扩散的义务等;并存在其使用限制及出口进口规定等;甚至农田栽培批准的诸多法律问题;到用于食材为止存在很多必须解决的困难和问题。
[0081] 目前,在水处理技术中,主要利用紫外线照射和臭氧曝气处理水中细菌的杀菌和微生物的驱虫,使水中溶解的臭氧气化,向大气中扩散残余臭氧,但由于残余臭氧的不稳定性,因而没有环境负担。然而,残余臭氧在几小时的稳定状态下,持续对环境造成影响。虽然常常与由平流层的臭氧层破坏导致的全球变暖加速混为一谈,但臭氧比二氧化重,地面生成的臭氧没有到达平流层,就不会加速全球变暖。有报道称:对流层的臭氧由于其本身就是很强的温室效应气体,因此存在由全部温室效应气体引起的全球变暖效果的20%~30%来自于对流层臭氧的辐射强迫(radiative forcing)(H.Akimoto and K.Sudo.Climate Sensitivity of Ozone.In:Air pollution and its relations to climate change and sustainable development,2.Climate change and air pollution,12-14 March,2007,Gothenburg,Sweden;http://asta.ivl.se/Workshops/)。并且,在最近的报告中,除由臭氧直接引起的温室效应外,还要考虑对吸收二氧化碳的植被造成间接影响,从而报告有源自对流层臭氧的温室效应的效果是以前的2倍的模拟实验结果(Nature 2007;Vol.448,No.7155:pp.791-794)。为此,需要开发用于使残留臭氧迅速消失的新技术,减少臭氧排出总量。
[0082] 在这种情况下,根据本发明,不仅能够防止一般由杀菌剂等农药所不能防治的植物病原性病毒,还能够同样地防治细菌和真菌,实现相比通常的农药能够对抗更广范围的病原微生物的效果。此外,对于植物抵抗性诱导型药剂(BTH、噻菌灵等)不能处理的、已附着于植物的病原微生物,也能够通过选择性的生成活性氧种来直接防治。由此能够大幅减少在本该大量使用药剂的农业现场中药剂的使用。
[0083] 作为该活性氧水与植物接触的方法(植物接触方法),例如,可以制成浸泡植物的水耕栽培溶液、或浸含在培育植物的土壤中、或直接喷洒在植物上。如此利用被植物吸收的水,能够在植物内引起氧化还原反应,使编码植物免疫刺激蛋白质(病程相关蛋白质pathogenesis-related protein)的病原抵抗性基因(PR基因簇)表达。并且,优选为不使活性氧水为气体状或雾状,而是直接与植物体接触。若为气体状或雾状,由于与大气中的有机物或浮游细菌作用而被消耗,活性氧种的检出半衰期(各个活性氧种都只能持续极短的时间,生成的活性氧水由于内部持续进行该反应,因而被检出的活性氧种如同具有的半衰期一样)变短,到达作用对象植物体的活性氧种浓度变低,难以使病原抗性基因有效表达。
[0084] 原本,通过施加超声波振动而在气液界面(水面)由超声波振动产生的能量,因使水雾化,或照射到其中的物质使附着的有机物分离等被消耗。
[0085] 然而,在密闭的反应容器内(密闭空间内),由超声波振动生成的能量不会消失,而是消耗在水中,因而能够直接作用于溶解在水中的氧原子,具有形成超氧化物阴离子自由基或单线态氧等的活性氧种。
[0086] 进一步地,在该密闭反应容器内设置催化剂体,通过施加超声波振动及电磁波照射,引起水或流水接触催化剂体而发生的催化反应,从而生成活性氧种。这些一系列的反应具有如下特点,能够增强在基于上述超声波振动的水中的活性氧种的产生,并带来协同效应。
[0087] 这里,所谓活性氧种虽然一般被称为超氧化物,但根据其特性,是指除了双氧水- 1 -(H2O2)的,超氧化物阴离子自由基(O2·)、羟基自由基(·OH)、单线态氧(O2)、卤化氧(XO、- -
例如次氯酸根离子(ClO))、一氧化氮自由基(NO·)、过氧化亚硝基(ONOO·)、含氧有机自由基(例如苯氧基自由基)等。
[0088] 为了在水中尽可能多的含有活性氧种,现有方法中是向浸渍在水中的光催化剂照射紫外线,使光催化剂表面生成的活性氧种扩散到水中。不过,根据该方法,在水中的紫外线透光率低的情况下(例如,在水中存在悬浊物时,或含有紫外线吸收物质时),由于在穿过水到达光催化剂的期间从紫外线源照射的紫外光衰减,使活性氧种的生成量变得极少。
[0089] 而且,通常水中存在的活性氧种寿命很短,例如,虽然作为定量试剂的超氧化物标准试剂KO2超氧化作为标准试剂使用,并作为标记物出示,但由于KO2的性质特别不稳定,溶解在DMPO中运送,作为爆炸性物质需要对其谨慎处理;水中的寿命,自向水中滴入后,仅数毫秒便失效,无法观察到2秒以上的发光。(在图4中作为标记物示出)
[0090] 上述为,当在植物体内引起氧化还原反应,诱导病原抵抗基因的表达时,活性氧种与细胞表面的氧化还原应答分子接触并反应的几率急剧减少的主要原因。
[0091] 因此,希望生成经过长时间也能在水中含有充足的活性氧种、且能够保持功能的含活性氧种的水。
[0092] 所以,本发明的发明人确立了如下技术,即在水中设置催化剂体,向氧化金属催化剂体施加超声波振动、紫外线、可见光、微波,来利用催化剂体、在水中生成活性氧种,通过单独使用上述方法或对上述方法组合的协同效应,生成含有大量活性氧种的水,进而选择性地生成作为活性氧种的超氧化物阴离子自由基、单线态氧等。
[0093] 与催化剂体接触的水可以是流水。通过使流水与催化剂体接触,而使催化剂体下游的流水含有大量活性氧种,并能够连续地生成含活性氧种的水。
[0094] 这里,引起这些反应的代表例有,使用紫外线光源和钛氧化物的光催化剂反应,下面说明在水中生成活性氧种的过程。
[0095] 通常认为,在纯水H2O的情况下,除了特殊状况以外,水中总是溶解有氧,加速下述反应,但紫外线的能量(hν)激发金属氧化膜表面的氧化金属原子(XnOm,例如TiO2或Al2O3等),生成自由电子及空穴(光子),进行了以下反应。
[0096] XnOm(例如TiO2)+hν→e-+h+VB
[0097] h+VB→h+tr
[0098] O2+e-→O2·-
[0099] O2·-+h+VB(h+tr)→O2
[0100] OH-+h+VB→OH·
[0101] 在含有大量氧时,加速上述反应,生成大量的O2·-(超氧化物阴离子自由基)和OH·(羟基自由基)。
[0102] 这里,当在水中含氯离子时,会激活下述反应。
[0103] 2Cl-+O2+e-→2ClO-
[0104] 此外,当在水中含有大量的臭氧时,会激活下述反应。
[0105] O3+hν→O(1D)+O2(a1Δg)
[0106] O3+h+VB(h+tr)→O2·-
[0107] 通常,利用UV-A区域的紫外线直接激发臭氧不能有效地进行上述反应,但是当存在随光的作用成为激发状态的光催化剂体时,伴随单线态氧生成而进行上述反应。
[0108] 用以下3式表示。
[0109] OH-+h+VB→OH·
[0110] OH·+O3→O2+HO2
[0111]
[0112] 本发明的发明人如后述,利用源自海萤的荧光素类似物的化学发光来验证以臭氧水为前驱物的超氧化物阴离子自由基的增加和单线态氧的增加,并且发明人通过使用以5.5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)为自旋捕捉剂(Spin Trapping Reagents)电子自旋共振法来验证在上述反应中的羟基自由基的生成。
[0113] 进一步地,当在水中含有大量一氧化氮气体时,因以下的反应形成细胞毒性更强的离子。
[0114] NO+e-→·NO
[0115] NO-e-→NO2-
[0116] 2NO2--2e-→2·NO3-
[0117] ·NO+NO2-→N2O3
[0118] ·NO+O2·-→·ONOO-
[0119] ·ONOO-+H+→HOONO→OH·
[0120] 本发明人已利用基于与荧光探针的反应、叶酸的氧化测定(荧光法)、和电子自旋- -共振法的实验,分别验证了这里的O2· 的生成、·NO的生成、·ONOO 的生成、和OH·的生成。
[0121] 并且这些反应是仅利用电子转移而进行的反应,很容易成为可逆反应,由于生成的二次反应离子变回二次反应前的状态,使原本寿命极短的活性氧种继续产生,能够像形成具有活性半衰期的活性氧种一样发挥作用。
[0122] 此外,能够使如上所述的植物体获得病原抗性基因的、所谓含有活性氧种的水,在本说明书中是指,初始浓度为1μmol/L以上的含有除了过氧化氢以外的,超氧化物阴离子自由基、单线态氧等的活性氧种。但是,由于目前没有能简便地规定单线态氧的浓度的标记物,因此,使单线态氧的浓度表示为与换算为超氧化物阴离子自由基及臭氧水浓度相当的滴定度。
[0123] 设活性氧种的初始浓度小于1μmol/L,则不能对使植物体获得病原抗性基因进行诱导的氧化还原反应,因而缺乏实用性。
[0124] 此外,对于前述含有活性氧种的水,海萤产生的荧光素类似物(Cypridina luciferin analog)选择性地与超氧化物阴离子自由基及单线态氧反应,利用显示出定量的蓝色化学发光,能够检测出超氧化物阴离子自由基(发明人在Bioluminescence&Chemi luminescence,2008公开的方法);而且通过添加超氧化物除去剂的钛试剂(Tiron)来抑制其活性,并利用单线态氧除去试剂的DABCO的效果能够选择性地与单线态氧的鉴别。使用本方法,可以准确地在生成装置外验证能够使含有活性氧种的水所带来的效果,而且能验证其在水中扩散保持活性氧种的作用并持续进行反应。
[0125] 在该含活性氧种的水的生成装置中使用的催化剂体,其形状并没有特别的限制,可以是颗粒、粒状体、串珠妆、纤维体中的任一种;各催化剂体的表面由具有催化能的金属氧化膜包覆。
[0126] 这里的纤维体没有特别的限定,例如,可以使用由玻璃、陶瓷或无纺布形成的纤维体。
[0127] 为了在使用了上材料的纤维体的表面形成具有催化能的金属氧化膜,可以使用合适的公知方法,例如,可以使用浸渍涂覆法的方法。
[0128] 如此形成的金属氧化膜可以主要由氧化铝、氢氧化铝、氧化钛、氧化镁、氢氧化镁、氧化锌、氧化钨、钛酸钡、钛酸锶、钛酸钠、二氧化锆、氧化钨、氢氧化钨化合物、α-Fe2O3、硫化镉、硫化锌、铂、铜、钯等、金属氧化物构成。
[0129] 通过形成由这些物质构成金属氧化膜,可以有效地在水或流水中生成活性氧种。
[0130] 此外,也可以使上述纤维体为铝纤维体,并在该铝纤维体的表面烧结形成膜厚30nm以上的氧化铝膜。
[0131] 由具有该氧化铝膜的铝纤维体集合形成的催化剂体,显然能有效地生成活性氧种;也可以使用利用浸渍涂覆法涂覆了氧化钛膜涂层的光催化剂体。
[0132] 此外,含活性氧种的水的生成装置为,在水中设置光源,该光源发射电磁波中的紫外线,且在该紫外线光源周围保持一定间隙,环绕由纤维体形成的光催化剂体,形成水流,该水流包括流过紫外线光源和光催化剂体间隙并上升或下降的第一水流、以螺旋状流过光催化剂体的外周并上升或下降的第二水流、和流入流出光催化剂体结构内的第三水流。
[0133] 具体内容将在后面详细说明。但通过在筒状催化剂体内周面与紫外线光源之间形成的间隙形成上升或下降的第一水流,并在螺旋状地环绕催化剂体外表面形成第二水流,能够使水流与催化剂体充分接触,并且,由于该催化剂体由纤维集合体形成,能够形成从第一水流流过催化剂体内部而与第二水流合流的第三水流,能够使催化剂体内侧的水也有效地流动,更高效生成活性氧种。
[0134] 此处使用的超声波振子的效果,利用由催化剂体引起的催化剂反应,不仅生成电子及空穴,还使催化剂体轻微地振动,使通过光催化反应产生的活性氧种更加平稳地生成,能够使其游移。催化剂体为纤维状时,在装置内部,纤维状催化剂体的相对的位置虽然被固定,但各个纤维都具有自由端,维持相互缠绕接触的形态。
[0135] 即,对于流过纤维表面的水的流速,纤维在超声波振动下以超高速移动,由此使得界面上的流速显著提高,因此能够向释放到水中。
[0136] 即,该超声波促进经催化剂体产生的活性氧种游移,并且利用超声波与紫外线的波长的相互干涉作用相互增强反应。
[0137] 超声波振子,例如,优选为使用生成高频超声波(一般为500kHz以上)的雾化用超声波振子(高频超声波振子)。
[0138] 由该雾化用超声波振子产生的高频超声波振动,催化剂体的净化能力低,但该強力的汽蚀能量与溶解在水中的氧原子直接作用,不但生成活性氧种,还在金属氧化膜上引起催化反应,并具有足够的使由催化反应生成的电子和活性氧种扩散到水中的能力。
[0139] 此外,所使用的超声波也可以是中频超声波(101-500kHz)。在使用中频超声波振子发生的中频超声波时,在超声波碰到催化剂体的时候,声波的衍射性提高,能够增强对在密闭容器内的水的搅拌,虽然能使活性氧种从催化剂体高效地游离,但与高频振子相比,不能否认对催化剂体的劣化。然而,在该中频超声波的作用下,能够对付着在催化剂体的污染成分等分子量较大的物质产生清洗效果。
[0140] 但是,100kHz以下的低频超声波,由于会有使催化剂体变形,使形成在催化剂体上的催化剂反应面剥离的危险,且活性氧种的生成效率差,因而不优选。
[0141] 此外,在与催化剂体接触的水中或流水中,如上所述通过预先混入规定的气体,可以生成与希望的活性氧种的反应物。调整气体浓度时,可以调节水自身分解并溶解形成的氧浓度及氢浓度。
[0142] 即,在施加催化剂体的催化功能前的水或流水中,通过混入氧气、臭氧气、氯气、一氧化氮气、氨气,能够在水中或流水中生成超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、- -双氧水(H2O2)、次氯酸离子(ClO)、一氧化氮自由基(NO·)、过氧化亚硝基(ONOO·)等各种活性氧种。
[0143] 此外,上述含有活性氧种的水以通过化学处理和/或物理处理,能够活性控制上述含有活性氧种的水。
[0144] 具体地,通过调整与催化剂体接触的水或流水的添加物、溶解氧浓度、溶解臭氧浓度、温度、pH、粘度等,能够控制活性氧种的活性。
[0145] 活性氧水中的活性氧量,如前所述,以固定的半衰期减少;但在本发明中,通过在含有活性氧种的水的生成装置中,设置活性氧浓度控制部,从而可以改变活性氧种浓度的减少速度。
[0146] 进一步地,本发明人发现,在水中,随着水温上升,溶解的氧浓度下降,若放置提高了溶解氧浓度的水,随着经过的时间,氧浓度会减少,但是,同样地根据水中的溶解氧浓度、温度、pH的变化,活性氧种的活性(浓度)及寿命(作用表达持续时间)也会变化。进一-7 -8步地发现了,得知通常在水中溶解的氧的10 ~10 %为稳定地含有的超氧化物阴离子自-4 -6
由基,通过含活性氧种的水的生成装置使该含有比例变化为10 ~10 ,由此使活性氧种所具有的強氧化力。
[0147] 即,活性氧种生成能力与溶解氧浓度及水温、pH有密切的关系,确立了如下所述活性氧控制方法,,预先利用电解法将导入到含活性氧种水生成装置的水分离为酸性水和性水后,仅冷却碱水并赋予氧,然后导入到生成装置内,导入到需要进行杀菌和驱虫·有机物分解等的处理槽进行规定时间处理,之后,再添加所储存的酸性水,从而使活性氧种寿命显著缩短。
[0148] 在向加气装置供给氧气时会上述控制方法及浓度变化,但添加气体的种类为臭氧气体、氯气、一氧化氮气、氨气等气体时也发生同样的现象。
[0149] 此外,在活性氧浓度控制部中,为了调整活性氧种浓度的减少速度,可以通过溶解离子浓度(例如铜离子或铝离子、铁离子等)及水溶液pH值的調整、或添加钛试剂(Tiron)等超氧化物除去剂药剂进行处理等化学处理方式,或者利用气相减压装置、水槽温度控制装置等物理方式。
[0150] 由于具有活性氧浓度控制部,在研究由基于本发明的含活性氧种的水生成装置生成的活性氧水的活性氧有效应用中,通过保持高气相压力或保持低水槽温度,维持高浓度的活性氧而延缓其减少速度;之后,能够通过利用真空等减压气相压力减压或者提高水槽温度来提高其减少速度。
[0151] 为了加快其减少速度而添加钛试剂(Tiron)、DABCO等的活性氧种除去剂或硫醇(thiol)类等还原剂,则能够快速去除。
[0152] 上述活性氧浓度的控制具有,仅在规定的期间内提高活性氧水的活性,然后回到普通水的不活跃的状态的效果。在使用物理方式的情况下,与使用化学方式的情况相比,可以使残存物质对环境的影响最小化;作为物理方式,除了上述真空泵等气压操作和水槽温度控制装置以外,也可以使用通过水泵或曝气法的搅拌、电中和等方式。
[0153] 并且,通过在后述的含活性氧种水的生成装置中设置活性氧浓度控制部,能够使该含活性氧种水的生成装置结构紧凑;但并不限定与此,例如,可以在活性氧水的水流路径中设置活性氧浓度控制部,也可以将含活性氧种的水的生成装置与活性氧浓度控制部分别设置。
[0154] 此外,在前述含活性氧种水的生成装置中,除了设置有助于发生活性氧的超声波振子之外,还可以设置另一超声波振子(以下,称为衰减超声波振子),其发出使由前述超声波振子发出的超声波衰减的超声波,能够调节活性氧的生成量。
[0155] 即,使从衰减超声波振子发出的超声波的频率,与由超声波振子发出的超声波的频率干涉,而使其衰减。
[0156] 利用如上所述结构,通过适当地调整流过超声波振子的电流和流过衰减超声波振子的电流,能够调整活性氧的生成量。
[0157] 而且,由于可以以电气方式调整活性氧的生成量,与利用药剂等的调整相比,可以更加细致地进行调整。
[0158] 以下,将通过实施例更加详细地说明本发明涉及的实施方式。
[0159] 【含活性氧水的生成装置的具体结构】
[0160] 首先,参照图1与图2,说明本实施方式的含有活性氧种的活性氧水生成装置A。图1所示为本实施方式的活性氧水生成装置A的侧视剖面图,图2所示为反应部10附近的俯视剖面图。
[0161] 本实施方式的活性氧水生成装置A是通过供给水(流动水)生成含有活性氧种的水的生成反应槽,包括设置有水流通路的反应部10和控制对设置于该反应部10上的超声波振子11进行驱动的控制部30。
[0162] 反应部10具有大致呈圆筒形状、且形成有作为水(流动水)的流入口的给水口13和作为活性氧水的取出口(流出口)的出水口27的反应部外壳12,由反应部底板14封闭该反应部外壳12的底部开口,由槽体(cell)卡止部件15覆盖顶部开口。
[0163] 如图2所示,反应部外壳12的外周面上形成有观察窗40,以便能够观察反应部外壳12内部的情况。
[0164] 当然,根据用途也可以不设置该观察窗。
[0165] 观察窗40形成为,在反应部外壳12外周面上一部分被去除的部分上设置开有规定形状的孔洞的窗框体41,在该窗框体41中嵌入由玻璃或丙烯酸类(acrylic)等透明材料形成的透明板42以封闭孔洞,并用透明板压制体43从外部固定上述透明板42。
[0166] 首先,对反应部外壳12的上部附近进行说明,槽体卡止部件15为从俯视图看,中央具有贯通的孔洞,大致呈环状,通过螺栓19固定于反应部外壳12。
[0167] 槽体卡止部件15的孔洞中安装有呈杯状的由透明材料制成且具有凸缘部16的槽体17,具体地,槽体17通过槽体卡止部件15中央开有的孔洞,插入到反应部外壳12的内部,并且使凸缘部16卡止在槽体卡止部件15的孔洞的周边部分。
[0168] 槽体17由电磁波透过率高的材料制成,例如,可以由石英玻璃制成。
[0169] 并且,槽体卡止部件15的孔洞的内壁面上设置有由弹性体形成的密封部件18,用于密封槽体卡止部件15的孔洞的内壁面与槽体17之间产生的间隙,防止水(流动水)漏到槽体17的上部。
[0170] 对于槽体17,由于其凸缘部16卡在槽体加压部件20和槽体卡止部件15之间,限制了槽体17向上方的移动,并用螺栓19将槽体加压部件20与槽体卡止部件15固定。
[0171] 在槽体加压部件20上,其中央部分开设有电磁波发生装置的插入孔,从俯视图看大致呈环状,从该电磁波发生装置的插入孔可以插入电磁波发生装置21。
[0172] 在本实施方式的含活性氧种水的生成装置中,电磁波发生装置21例如为一般被称为灯泡荧光灯形状的紫外线灯管(黑光,有效紫外线波长356nm),也可以使用杀菌灯(有效紫外线波长256nm)或高亮度LED,还可以是在微波炉中使用的微波发生装置。
[0173] 通过在形成于该电磁波发生装置21上部的通电部22连接灯泡插口并通电,从而发射电磁波。
[0174] 通过将电磁波发生装置21从电磁波发生装置的插入孔插入,使该电磁波发生装置21的管部23达到从槽体17的内部,可以经槽体17向反应部外壳12的内部照射电磁波。
[0175] 并且,电磁波发生装置21电磁波发生装置固定部件24固定于槽体加压部件20上,并利用螺栓19将电磁波发生装置固定部件24与槽体加压部件20连接固定。
[0176] 例如如上所述结构,例如,在使活性氧水生成装置A流通水的状态下,能够不用停止水流动而更换电磁波发生装置21。
[0177] 接下来,对反应部外壳12的内部结构进行说明。在反应部外壳12的内部设置有形成为筒状、围绕槽体17外周面的催化剂体25,在该催化剂体25的外周形成沿反应部外壳12内壁呈螺旋状的螺旋板26。
[0178] 在槽体17的外周面和催化剂体25的内周面之间形成能够让水向上下方向流通的第一流路50。
[0179] 在催化剂体25的外周面与反应部外壳12的内周面之间,使螺旋板26沿催化剂体25的外周面环绕多圈,从而在螺旋板26上下方向重叠的板与板之间形成第二流路51,使水流沿着该螺旋板26上升流动。
[0180] 催化剂体25是由直径大致50~200μm(本实施方式中100μm)的金属纤维体的集合体的纤维体形成,该纤维体为在铝纤维表面上烧结氧化铝膜,在形成的氧化铝纤维上涂覆钛氧化物的纤维体等,可根据不同的目的改变各种纤维体的种类或数量。
[0181] 特别地,本实施方式中使用的催化剂体25,由具有因超声波振动而振动的自由端的纤维体制成,通过向催化剂体25施加超声波振动,使催化剂体25的纤维的自由端振动,能够提高与催化剂体25的表面接触的水的流速,并将大量的活性氧种扩散到流过催化剂体表面的水中。这里所谓的“自由端”是指纤维状物质的集合体中的纤维的各个端部。
[0182] 具体地,利用将每根纤维所具有的表面积集合而形成巨大表面积的催化剂体25,在其表面产生活性氧种,并利用超声波的振动使产生的大量的活性氧种迅速地从催化剂体25的表面扩散而游离到水中。
[0183] 之后,在催化剂体25的表面上随时产生新的活性氧种,并再次配合超声波的振动而扩散并游离到水中。
[0184] 上述动作在短时间内重复多次,因此能够十分高效地使水中含有活性氧种。
[0185] 直径50~200μm的纤维状的催化剂体25,例如,与板状的催化剂体相比,容易配合超声波的轻微振动而引起振动,能够更容易使活性氧种从光催化剂体的表面游离。
[0186] 进一步地,催化剂体25中大量存在的金属纤维的末端部分,由于在超声波振动下以自由端振动,能够高效地使活性氧种从催化剂体扩散(振落)到水中。
[0187] 即,为使催化剂体25上产生的活性氧种高效地分散到水中,催化剂体25由具有自由端的纤维体制成,进而,施加超声波振动,由于大幅提高催化剂体25的自由端与水流的相对速度,因而能够生成含活性氧种的水。
[0188] 并且,向水中赋予活性氧种,使该水成为活性氧水而从活性氧水生成装置A排出、取出。
[0189] 因此,根据溶于水中的活性氧种的前驱物,能够大量地游离出超氧化物阴离子自由基及单线态氧,即使将该活性氧水从活性氧水生成装置A中取出后,也能够在长时间持续维持活性氧种,并能够诱导植物体具有的病原抗性基因。
[0190] 返回图1与图2,催化剂体25能够使水在第一流路50和第二流路51之间流通,穿过该催化剂体25流动的第三水流的流路成为第三流路52。
[0191] 在图2所示的剖面图中,第二流路51的起始端部分,即螺旋板26的下端部分,与设置于反应部外壳12的外周侧面下方的给水口13方向相对的设置。
[0192] 通过构成该形状,与第一流路50相比,从给水口13供给的水更容易在第二流路51中流动,因而在第一流路50和第二流路51之间,因流速不同产生压力差。
[0193] 因此,能够高效地产生形成于催化剂体25的第三流路52中的第三水流,能够有效地使水中含有催化剂体25上产生的活性氧种。
[0194] 之后,含有活性氧种的水(流动水)能够从形成于反应部外壳12的外圆周面上方的出水口27流出而取出。
[0195] 接下来,对反应部外壳12的下部附近进行说明。利用反应部底板14封闭反应部外壳12的底面部分开口,在该反应部底板14上开设露出孔28,用于使超声波振子11的一部分露出到反应部外壳12内部的。
[0196] 在反应部底板14的下方设置有多个(本实施方式中为2个)超声波振子11,使该超声波振子11的振动板29从上述露出孔28露出到反应部外壳12的内部,用于向充满反应部外壳12的水(水流)或催化剂体25施加超声波振动。
[0197] 设置在超声波振子11上的振动板29,对水平方向以规定的度倾斜设置,高效地向催化剂体25施加超声波振动。
[0198] 接下来,对设置于反应部10下方的控制部30进行说明。
[0199] 介由支柱32安装控制部30与反应部10。
[0200] 控制部30呈箱状,且内置有超声波发振装置31;具体为,设置有封闭控制部30上部的控制部盖板33和封闭下部的控制部底板34,控制部30的相对的两个侧面上分别设置有用于冷却内置的超声波发振装置31的吸气口35和排气口36。
[0201] 在控制部底板34的上面设置有超声波发振装置31,该超声波发振装置31通过从电源(未示出)通电,形成具有规定频率的电信号,并传递给相连的超声波振子11,产生超声波的。
[0202] 在控制部底板34的下面一侧,设置有由弹性材料制成的支脚37,防止伴随超声波振子11振动而产生的活性氧水生成装置A的振动向周围传播。
[0203] 在吸气口35处,设置有由电源(未示出)驱动的冷却风扇38,在排气口36处设置了具有能够使空气流通的网眼的网状板39,能够利用由冷却风扇38生成的气流冷却超声波发振装置31,并通过网状板39排气。
[0204] 如上所述,根据上述结构,以如下方式驱动本实施方式的活性氧水生成装置A。
[0205] 首先,向给水口13供给水(流动水),水慢慢充满反应部10的内部(反应部外壳12的内部),催化剂体25浸没于水中。水从出水口27流出。
[0206] 在第一流路50中,产生在槽体17的外周面与催化剂体25的内周面之间流通的第一水流,并且,在第二流路中,产生沿螺旋板26上升的第二水流。
[0207] 在此处,关于第二流路,由于第二水流沿着反应部外壳12的内周面上升并具有离心力,反应部外壳12的内周面附近的水压与催化剂体25的外表面附近的水压相比,催化剂体25的外表面附近的水压低。
[0208] 由于从给水口13直接流入第一流路的第一水流为沿着以短距离连接给水口13与出水口27的旁路流动的水,因阻力产生的压力损失小,具有比较高的压力。
[0209] 因此,在催化剂体25的内外周面附近,因第一流路50与第二流路51的水压差,主要产生从第一流路50通过催化剂体25的内部到达第二流路(通过第三流路)的第三水流。
[0210] 在此状态下,超声波发振装置31通电后,由超声波振子11发出超声波,超声波被施加到反应部10内部的水(流动水)和催化剂体25。
[0211] 在被施加了超声波的催化剂体25的表面上,产生活性氧种,并且活性氧种向催化剂体25附近的水中游离。
[0212] 关于催化剂体25内部产生的活性氧种,经第三水流与第二水流合流,生成含有活性氧种的水。之后,该含有活性氧种的水从出水口27流出,被应用于不同的用途。
[0213] 另外,电磁波发生装置21的通电部22在通电,则从管部23发生电磁波,电磁波经槽体17照射到催化剂体25上。
[0214] 据此,催化剂体25表面上产生的活性氧种进一步增加,能够产生含有更多活性氧种的水。
[0215] 【活性氧水生成装置的另一实施方式】
[0216] 接下来,参照图3说明本发明另一实施方式的活性氧水生成装置B的具体结构。并且,在以下活性氧水生成装置B的说明中,对与上述结构相同的部件用同一符号标注,且相关说明从略。
[0217] 在活性氧水生成装置B上连接有给水管60和出水管61,由于从给水管60供给的水中含有活性氧种,并能够从出水管61取出,因此能够以管线式(in line)生成活性氧水。
[0218] 具体地,活性氧水生成装置B为由紫外线或微波吸收率小的材料,即由对紫外线或微波透明的材料制成的透明管体62与分别封闭其上下开口的上盖体63和超声波发振装置31形成的密闭容器。并且,构成管体62的对紫外线或微波透明的材料为,可列举出石英玻璃或丙烯酸树脂等。
[0219] 在管体62的壁面上设置有能够使水流通的给水管60的给水口13和出水管61的出水口27,从给水管60经给水口13供给的水在管体62内形成含活性氧水,并通过出水口27排出管体62。
[0220] 在管体62的内部收容填充有催化剂体25。并且,图中符号68为用于防止催化剂体25向出水管61流出的圆板形的网状体,并利用安装固定件66固定于管体62的内壁面上。
[0221] 该催化剂体25为具有在前述活性氧水生成装置A中使用的在超声波振动下振动的自由端的纤维体,内部能够流通液体,且形成有连通的间隙,以使紫外线能够从管体62内壁面向内部方向透过1.5cm左右。催化剂体25受到从设置于管体62周围的作为紫外线照射部的紫外线灯67放射的紫外线的照射而激发,使水中含有活性氧种。即,在该另一优选实施方式的活性氧水生成装置B中,由于紫外线灯67设置在容器的周围,为了能够对催化剂体25照射紫外线,而使管体62的内部几乎全部区域都成为紫外线的照射区域。
[0222] 设置在管体62一端的开口上的作为超声波照射部的超声波发振装置31具有向水中发射超声波的振动板29,并将该振动板29的露出设置与管体62的底部,能够向流过催化剂体25或催化剂体25的间隙的水照射超声波。该超声波发振装置31的振动板29优选设置于在10~15cm范围内包含下述微波照射区M的位置。虽然还取决于超声波发振装置31的输出,如果超出该距离范围(超声波照射区域),在使用实际的超声波发振装置31时,因超声波的衰减显著而不能向催化剂体25或水中照射足够的超声波。
[0223] 在管体62的外壁面上设置有从微波发生器(未示出)延伸出的微波供给管64和微波返回管65,从微波供给管64放射出微波穿过管体62的侧壁,经过催化剂体25的内部(图中所示由左向右的白色箭头线),再次穿过管体62,到达微波返回管65。图中虚线框所示的部分为微波经过的微波照射区M。微波供给管64和微波返回管65具有微波照射部的功能。
[0224] 从微波供给管64与管体62的接触部分到微波返回管65与管体62的接触部分之间形成的微波照射区M的长度虽然也取决于微波的输出等,但优选大致为1~3cm左右。因为若低于1cm,流过催化剂体25的水或活性氧水的流量会下降;若超过3cm,微波全部被催化剂体25或含有活性氧的水吸收,可能会存在未被微波照射到的催化剂体25和水,因此不优选。
[0225] 在具有如上结构的活性氧水生成装置B中由给水管60供给的水通过给水口13流入管体62的内部,并沿管体62的内圆周壁在催化剂体25的内部通过螺旋形状的流路,或由催化剂体25空隙形成的流路,并向箭头线R的方向流动,流向出水口27。
[0226] 此处,由超声波发振装置31的振动板29施加超声波,并且由微波供给管64照射微波,能够在水中引起光催化剂类似反应。即利用微波的能量激发金属氧化膜表面的氧化金属原子(XnOm,例如TiO2或Al2O3等),产生游离电子以及空穴(光子),通过紫外线与微波的同时作用,被协同施加了能量的催化剂在水中产生大量的活性氧种。
[0227] 在管体62内朝箭头线R所示方向流动,形成含有大量活性氧种的活性氧水,并到达网状体68,经水口27流入到出水管61并出水。虽然从给水口13供给到管体62的水沿管体62的内壁面回转,并穿过催化剂体25的空隙流动等沿复杂流路前进,但全部朝出水口27沿箭头线R所示方向流动。
[0228] 如上所述地,即使利用活性氧水生成装置B也能使水中含有活性氧,形成活性氧水,并且,由于超声波、微波和紫外线能够同时对水进行照射,能够高效的使水中含有活性氧。换言之,由于将催化剂体25的至少一个部分设置在由微波照射部照射的微波的照射区域、由超声波照射部照射的超声波的照射区域以及由紫外线照射部照射的紫外线的照射区域的重合区域内,能够高效的使水中含有活性氧种。
[0229] 并且,活性氧水生成装置B本体也能够按管线式(in line)使用,能够具有紧凑的结构。
[0230] 该活性氧水生成装置B的催化剂体25,虽然使用填充在管体62内的上述纤维体,然而并不仅限于此,也可以收容上述纤维体聚集形成的绵状、粉末状或珠状的催化剂(例如,颗粒状的载体上涂覆有催化剂涂层等)作为催化剂25。
[0231] 下面,对由活性氧水生成装置A生成的活性氧水中含有的活性氧的含量进行检测。
[0232] 在各种活性氧种的表达验证时,确立了作为表达验证系统的循环系统:使用小型离心泵(日本美敦力株式会社制造的生物泵),从储水槽向使用膜型人工(Solin株式会社制造的Synthesis M(シンセシスM))的前驱物附加装置引导循环水,强制提高溶解前驱物的浓度,并向活性氧水生成装置A中供给循环水,制成表现并含有活性氧的水,然后流回储水槽。
[0233] 利用该系统能够固定地控制循环水流量在500ml/分~20L/分,水温在水温0℃~43℃,溶解氧浓度在1~45mg/L的范围内。
[0234] 并能够排除为提高氧的浓度而直接向管路内投放氧时产生的气泡的影响。该前驱物附加装置并不限定于使用膜型人工肺,只要能调节溶解气体的浓度,任何方法都可使用。在实际应用时,可以直接鼓泡混入气体,进一步可以利用搅拌装置使混入气体的气泡变小并混合,并通过对小气泡施加超声波振动以更小的分子状的气体溶解于水中,以此来调节溶解气体的浓度。
[0235] 在此,对于要调节的气体浓度以氧浓度为例,虽然采取了调节溶解氧浓度的例子,但能够根据目标活性氧种的种类,混入臭氧或含有大量臭氧的氧(向陶瓷臭氧发生装置中注入纯氧,能够生成含有300ppm臭氧的高浓度氧。)、一氧化氮气体、氯气等,调节溶解气体浓度。
[0236] 通过在装置中内置雾化超声波振子,几乎未见循环水减少。
[0237] 使10L自来水按15L/min循环,添加作为前驱物的氧,使溶解氧的浓度为30mg/L,活性氧水生成装置A中设置的超声波振子11为串联设置的两台2.4MHZ超声波雾化振子(型号HM-2412,雾化能力250±50mL/h(水温25°))或者1.6MHz超声波雾化振子(型号HM-1630,雾化能力575±125mL/h(水温25°)),电磁波发生装置21使用黑光(Toshiba Lighting&Technology Corporation制造的EFD15BLB,紫外线输出1.8W),并进行以下的验证。
[0238] 以下,为避免混淆,将“大量含有活性氧种,并具有长时间保持作用的生成水”以“ROS-W(Reactive Oxygen Species Water)”进行标注,
[0239] 将“大量含有超氧化物阴离子自由基,并具有长时间保持作用的生成水”以“SA-W(Superoxide Anion radical Water)”进行标注,
[0240] 将“大量含有单线态氧,并具有长时间保持作用的生成水”以“SO-W(Singlet Oxygen rich Water)”进行标注。
[0241] 【超氧化物阴离子自由基的生成确认】
[0242] 水中的超氧化物阴离子自由基的测量使用由海萤中提取的荧光素类似物(以下简称CLA)其对超氧化物阴离子自由基具有特异性,对单线态氧也表现出一定程度的反应性的化学发光试剂的,利用光度计测出CLA依存性的化学发光,并记录。
[0243] 采样时刻为反应刚开始前、反应开始后15分钟、反应开始后30分钟,分别在各时间,使用微升移液管采样储水槽内的500μl溶液,并加入到事先添加有CLA的25mM磷酸镓缓冲溶液(PH值7.0)500μl(1∶1混合,总计1ml),测量滴入后5分钟内的CLA发光。发光强度用相对发光单位(relative luminescence unit,以下为rlu)表示。
[0244] 图4表示通过CLA发光得出的超氧化物阴离子自由基的浓度经时变化的结果。如图4所示,从储水槽取出,即从与催化剂反应隔离,即使放置在光度计中,也可够验证活性氧水长时间持续CLA发光。原本应该看到尖峰状的CLA发光,但却如图4所示,测量开始后10分钟内,发光量渐增,之后缓慢减少。
[0245] 一般地,由于超氧化物阴离子自由基的反应性非常强,不稳定,在水中会迅速消失。
[0246] 然而,该结果验证了流过活性氧水生成装置A的水,即活性氧水即使长时间在装置之外,也持续进行超氧化物阴离子自由基的生成。
[0247] 并且该时间极长,自检测开始后即便超过30分钟,该反应仍持续进行。
[0248] 如图5所示,在活性氧水生成装置A内随着使水的循环时间变长,超氧化物阴离子自由基的数量增加,在采样后随着时间增加生成量增加。
[0249] 已知,通常CLA被用作超氧化物阴离子自由基的特异性检测试剂,但对单线态氧也表现出一定程度的反应性。
[0250] 此处,为验证观察到的化学发光反映了超氧化物阴离子自由基的生成,通过添加超氧化物除去剂的钛试剂(Tiron)和单线态氧除去剂的DABCO,能够确认本次所示的CLA发光反映了超氧化物阴离子自由基单独的生成。
[0251] 同样,过氧化氢的检测也使用化学发光基质的发光氨,利用作为检测用催化剂的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase),在中性的PH值条件下进行检测。
[0252] 其结果,检测到发光氨的发光,证明在流过活性氧水生成装置A的水中存在1~20nmol/L极低浓度的过氧化氢。
[0253] 然而,该生成量在每次测量时都有变动,表明了过氧化氢参与了活性氧水种的反应过程。但是,含有的过氧化氢浓度极低,通过细胞外刺激无法引发生物体的氧化还原反应。
[0254] 进一步地由于考虑到臭氧参与反应,利用气体检测管对储水槽附近空气中的臭氧进行检测,但完全检测不出来,在循环水中利用靛蓝胭脂红(Indigo Carmine)比色法验证是否产生臭氧,也完全检测不出来,确认了臭氧的产生极少。
[0255] 将在有机溶剂中溶解有KO2(超氧化钾)的KO2溶液添加到CLA溶液中,制作通过CLA依存性的化学发光的超氧化物阴离子的标准曲线。一般地,利用在将KO2溶解于冠醚类有机溶剂中来定量超氧化物中所使用的方法,但由于不是疏水性环境,可能会与水溶液中的CLA反应,因此利用二甲基亚砜(DMSO)作为有机溶剂。通过该方法,能够诱导基于添加KO2溶液的CLA发光,制作超氧化物阴离子标准曲线。
[0256] 其结果显示,通过活性氧水生成装置A生成的活性氧水其是能够生成SA-W,即生成含有大量的超氧化物阴离子自由基并能长时间保持功能的水,并且超氧化物阴离子自由基最大含量为200μmol/L。
[0257] 【单线态氧的产生确认】
[0258] 接下来,在与上述进行超氧化物阴离子自由基的生成确认的系统相同的循环系统中,使用初始浓度2.5ppm的10L臭氧水作为循环水进行与上述相同的测量。使用株式会社AI电子工业制QUICK OZONE 10(产品名),利用电离法生成含有大量活性氧种前驱物的臭氧的臭氧水,并利用靛蓝胭脂红比色法,测量溶解臭氧的浓度。
[0259] 如图6所示,在不使含前驱物臭氧的初始浓度为2.5ppm的臭氧水与催化剂体反应的情况下,经大约30分钟浓度维持在1.5ppm左右。已知利用杀菌灯程度的紫外线可使臭氧分解。但是,在引发光催化剂反应的UV-A(365nm)中未促进臭氧的分解,维持高浓度的臭氧。
[0260] 利用初始浓度2.5ppm的臭氧水进行实验的结果如图7所示。在存在催化剂体的前提下,从施加紫外线照射和超声波振动之后的5分钟内,CLA发光产生了最大值超过1000000rlu的爆发性的化学发光,在反应开始后3分钟的时刻,臭氧浓度分解到0.2ppm几乎没有臭氧活性的水平。
[0261] 对于该反应开始后第3分钟的样品,通过添加超氧化物除去剂的钛试剂(Tiron)和单线态氧除去剂的DABCO进行抑制试验,其实施结果如图8所示。
[0262] 图8表明,尖峰状的CLA发光的大部分是因单线态氧生成产生的。由于没有对应于单线态氧标尺的标记物,因此换算成超氧化物阴离子自由基为1.7mM/L,可知生成极高浓度的活性氧种。以臭氧水为要进行处理的水时,SO-W,即大量含有单线态氧,并能够长时间保持工作的水,能够被持续地生成。
[0263] 接下来,使用这些SA-W和SO-W,对植物观察伴随PR遗传基因表达的SAR表达效果。
[0264] PR基因簇表达的验证为,从植物样品中提取的RNA通过逆转录酶转化为cDNA之后,通过实施PCR法(RT-PCR法),进行表达的确认。
[0265] 对于病原抗性基因,根据植物种类由相同的基因表达,但若植物种类不同基因的序列不同,名称叫法也各异。烟草(nicotiana tabacum L.)中作为SAR指标的水杨酸应答性的PR基因簇中最有代表性的基因为PR1a基因,番茄(solanum lycopersicum)中也同样地识别为PR-1基因。
[0266] 臭氧感受性(具有对于活性氧的耐受性低的性质)系统的烟草是Bel-W3系统的植物体和细胞,臭氧耐受性(对于活性氧的耐受性高的品种)系统的烟草是Bel-B系统的植物体与细胞,其具有共同的病原抗性基因PR1a。由于番茄的PR1基因序列不同,在利用RT-PCR的表达检测中,必需具有与烟草不同的DNA序列的引物。提高在病原抗性基因的表达的确认中使用的烟草PR1a基因中的423bp区域的引物(5’-GTAATATCCCACTCTTGCCGTGCC-3’和5’-CGTGAAATGGACGTAGGTCG-3’)由烟草PR1a cDNA的碱基序列中设计,同样地引物(5’-GGTTAAGGCTGGATTTGCTG-3’和5’-CCACCACCTTGATCTTCATG-3’)从烟草的肌动蛋白cDNA的碱基序列中设计,作为表达量不受刺激影响的基因在对照试验中使用。在PCR时的退火温度(Tm)以及PCR循环数为烟草PR1a中Tm:58,循环数:30,烟草肌动蛋白为Tm:60,循环数:30条件下进行。提高番茄PR-1基因的393bp的引物(5’-CTTCTCATGGTATTAGCC-3’和5’-CCACCATCCGTTGTTGC-3’)由番茄PR-1基因的cDNA的碱基序列设计,同样地引物(5’-CACACTGTCCCTATTTACGA-3’和5’-GTAATAACTTGTCCATCAGG-3’)从番茄肌动蛋白cDNA的碱基序列中设计,并作为对照使用。进行PRC时的基因结合的退火温度(Tm)以及PCR循环数为番茄PR-1中Tm:54.8,循环数:30,用番茄肌动蛋白在Tm:58,循环数:30的条件下进行。
[0267] 首先,如图9的确认烟草PR1a基因表达的琼脂糖电泳照片所示。图9所示的数据为将对氧化应激的感受性高的Bel-W3系统的植物中调整的叶盘(直径10mm,每处理区25片)静止放置在直径6mm的塑料培养皿内,添加30ml的SA-W(利用移液管从存在催化剂,紫外线,超声波为最适宜的条件下循环了30分钟以上的10L水(超氧化物阴离子自由基浓度200μmol/L)中采样)或者SO-W(在充满含有初始浓度2.5ppm作为活性氧种前驱物的臭氧的10L臭氧水的装置内,在存在催化剂,紫外线,超声波为最适宜的条件下,在反应进行3分钟的时间点利用移液管采样)后,在室温(遮光条件下)放置12小时或24小时,冻结破碎后从促进了基因表达的试样中提取RNA,通过RT-PCR进行目标基因的表达分析的数据。
[0268] 图9所示为(1)对象实验区(叶盘调整之后,在图中记载为“对照”),(2)添加SA-W,放置12小时后的试样(在图中记载为SA-W12H),(3)添加SA-W后24小时的试样(在图中记载为SA-W 24H),(4)添加SO-W后12小时的试样(在图中记载为SO-W 12H),(5)添加SO-W后24小时的试样(在图中记载为SO-W 24H)的结果。为使结果更明显,与对刺激的表达水平不变的肌动蛋白基因作对比,由于PR1a基因的表达水平大幅上升,显示了PR1a基因的表达被SA-W和SO-W诱导。并且,在图9中,将叶盘制作之后的数据作为对照实验示出,确认了通过添加自来水在12小时、24小时内不发生PR1a基因表达的诱导。
[0269] 作为应当注意的地方,与SA-W相比,SO-W在早期诱导了病原抗性基因的表达。
[0270] 可认为上述显示了单线态氧诱导了更强的氧化还原反应,经过细胞内的刺激,产生病原抗性基因的表达。
[0271] 另一方面,在从对氧化应激的感受性低的Bel-B系统的烟草植物中调整的叶盘中,在上述的条件下,在也添加了SA-W和SO-W的情况下,虽然比Bel-W3系统的水平低,但也能够确认PR1a基因的表达诱导。可认为两系统的烟草之间的表达诱导的程度差别来自于两系统之间原本就存在的对氧化应激的感受性的差别。在向两系统的烟草植物体内直接添加SA-W的情况下的PR-1a表达诱导实验中也验证到相同的差别。即,在Bel-W3的植物体中,即使在短时间的SA-W处理中也看到显著的PR1a表达诱导,在Bel-B的植物体中,则需要更强水平的处理。
[0272] 该结果显示,应该特别强调的是通过向叶片直接施加仅仅1次的刺激便能够确认PR-1a基因的表达诱导,为了确实地进行刺激,通过多次的施加以及持续地施加,能够有效地使PR-1a基因表达,确实地进行植物体全体的SAR诱导。
[0273] 进一步地,考虑像这样的,植物本身具有的对氧化应激的感受性差别,可以说通过改变使用SA-W以及SO-W处理的程度(浓度、处理时间、处理的时间等),能够实现给予有效的病原抗性。
[0274] 另一方面,利用SA-W以及SO-W的烟草PR-1a基因的表达诱导效果也能由细胞水平的实验确认。即,在对MS液体培养基培养的,由Bel-W3中提取的悬浊培养细胞(23℃下培养5天的对数生长期的细胞)的SA-W(超氧化物阴离子自由基浓度200μmol/L)以及SO-W添加实验(在1~12小时之后提取RNA,利用与上述相同的RT-PCR实验证实)中也能确认。
[0275] 上述结果显示,通过使本实施方式中生成的活性氧水与烟草的植物体表面、叶盘表面、和细胞表面接触,通过氧化应激应答反应,能够诱导烟草PR1a基因的表达。这样,由于在植物体水平、组织水平、细胞水平得到相同的结果,所以活性氧水的效果显示了在植物全身都能观察到直到PR1a基因的表达诱导的细胞生物学的反应,很好地显现出了系统获得抗性的特征。
[0276] 即,表明了通过活性氧水能使烟草的病原抗性基因表达,并能够预防烟草的病害。
[0277] 接下来,图10所示为确认了向作为分子遗传学的模型材料使用的番茄品种(微型番茄(Micro-Tom),图中标注为Micro-Tom)的植物体中添加SA-W以及SO-W的情况下的PR-1基因表达诱导的琼脂糖电泳照片。在该实验中,为使在盆栽状态下生长,发芽后大约1个月的植物体再现与水耕种植相同的条件,先用自来水洗净,去除根系中的土壤,静止放置于烧杯中,分别浸泡在100ml的自来水、SA-W(超氧化物阴离子自由基浓度200μmol/L)、SO-W中,使植物体分别吸收各个水,并放置24小时,利用液化氮冻结、破碎后,提取RNA,通过RT-PCR分析PR-1基因的表达。该结果如图10所示,通过SA-W和SO-W处理,能够看到PR-1基因的表达显著地增加。
[0278] 在24小时的试样中,SA-W与SO-W相比,得到了更高的基因表达诱导效果的数据。然而,SA-W和SO-W的效果,根据烟草(Bel-W3)的数据(图9)清楚显示:由于具有在各自不同的时间段显示最大效果的倾向,因而可以根据目的使用。
[0279] 上述结果显示,对于本实施方式中生成的活性氧水,通过使SO-W、SA-W接触番茄(Micro-Tom)的植物体表面,能够诱导番茄PR-1基因的表达。
[0280] 即,表明通过活性氧水能使番茄的病原抗性基因表达,并能够预防番茄的病害。
[0281] 显示上述结果的烟草与番茄在植物分类学上为不同属的植物。并且分别为代表主要生产物为叶的作物的植物种和代表主要生产物为果实的作物的植物种,农业上的重要性自不必说;在学术上,也分别被用作农学以及植物生理学的重要模型植物材料。因此,从图9和图10所示的结果,可认为活性氧水对于跨越种和属的所有植物都能诱导病原抗性基因,使其基因产物表达,从而预防该植物的病害。
[0282] 在上述的病原抗性基因的诱导中,虽然为分别使用SA-W和SO-W的诱导,但也可以调制或产生将其组合的活性氧水,并应用于指定的植物。
[0283] 即,也可以使含有单线态氧的SO-W与含有比单线态氧的反应性低,且具有长时间保持功能(长寿命的)的超氧化物阴离子自由基的SA-W混合得到的活性氧水,或者直接生成含有单线态氧和超氧化物阴离子自由基的水得到的活性氧水与植物接触,诱导该植物的病原抗性基因。
[0284] 该情况下,使用单线态氧作为第一活性氧,使用超氧化物阴离子自由基作为第二活性氧。所谓第一活性氧与第二活性氧并不仅限于此,其为从超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧、含氧有机自由基中选择的合适的种类。但,第一活性氧与第二活性氧的其中一个比另一个反应性低,且能够具有长时间保持的功能。
[0285] 具体地,含有单线态氧和超氧化物阴离子自由基的活性氧水中,优选使用单线态氧的反应以与相对于使用超氧化物阴离子自由基的反应具有像尖峰状突出(如图11所示)的反应性平衡的比例存在。并且,图11为表示含有单线态氧和超氧化物阴离子自由基的活性氧水的反应性经时间变化的图表,取纵轴为反应性(CLA发光量),取横轴为时间。
[0286] 注意观察图11中所示的1个跨度,由于超氧化物阴离子自由基比单线态氧寿命长且反应性低,具有迟效性(缓慢起效),形成为基线。
[0287] 另一方面,由于单线态氧寿命短且反应性高,具有速效性,形成为尖峰状的波峰。
[0288] 由于对植物数个跨度连续地使用此种活性氧水,能够持续表达植物具有的病原抗性基因,并能够使植物长时间抗病。
[0289] 附带说一下,通过利用具有迟效性的超氧化物阴离子自由基对植物提供长时间的负荷,同时利用单线态氧向植物提供尖峰状的短时间内大的负荷,与单独使用SA-W和SO-W的情况相比,能够进一步提高病原抗性基因的表达效率。
[0290] 反应性高,具有速效性的单线态氧起到了杀灭植物感染的细菌或病毒等微生物的功用,同时反应性较低,具有迟效性的超氧化物阴离子自由基对于由单线态氧抑制了微生物污染状态下的植物,具有慢慢进行病原抗性基因表达的效果。
[0291] 进一步地,作为特征点,与过氧化氢或现有的用于病原抗性基因的水杨酸等芳香族化合物相比,由于活性氧水中含有的超氧化物阴离子自由基或单线态氧寿命极短,不会积存在土壤中或植物中,不存在产生土壤污染或对人的健康危害的风险。可以说,该情况在SA-W与SO-W单独使用时也是一样的。
[0292] 在催化剂存在下,24小时连续地在最适宜的紫外线与超声波条件下循环的10L的SA-W(超氧化物阴离子自由基浓度200μmol/L)中,维持在泡沫聚苯乙烯制成的浮体上的固定状态的Micro-Tom植物体,也被确认了显著地表达PR-1。虽然此时已经与连续24小时反应的SA-W持续地接触,但观察不到对植物体的损害。上述表明,在番茄的水耕种植中实际使用SA-W的情况下,用连续的处理SA-W的方法,能够有效地提供抗药性。
[0293] 由细胞水平实验也验证了对植物体自身的损害低。即,向源自烟草(Bel-W3,Bel-B)的悬浊培养细胞和源自Micro-Tom的悬浊培养细胞中添加SA-W(超氧化物阴离子自由基浓度200μmol/L)和SO-W,经过12小时后,完全没有诱导细胞死亡。相反的在添加臭氧水的实验区内,细胞死亡被诱导。上述表示,与臭氧水相比,SA-W与SO-W对植物为低毒性,同时成功地向细胞提供了适度的氧化应激。向该农作物的处理提供适宜水平的氧化应激,对利用SAR的表达向植物提供病原抗性很重要。
[0294] 如上所述,通过本实施方式的植物病害的预防方法,使含有活性氧种,并具有能够长时间保持功能的活性氧水与植物接触,通过诱导上述植物具有的病原抗性基因,预防上述植物的病害。
[0295] 因此,如利用图9与图10的说明所述,能够跨越植物的种或属,诱导该植物具有的病原抗性基因。
[0296] 进一步,使10L自来水按循环流量15L/min循环,添加作为前驱物的氧,使溶解氧浓度为30mg/L,活性氧水生成装置A中设置的超声波振子11为仅设置为1部的2.4MHZ超声波雾化振子(型号HM-2412,雾化能力250±50mL/h(水温25°)),使用黑光(Toshiba Lighting&Technology Corporation制造的EFD15BLB,波峰波长352nm,紫外线输出1.8W)作为电磁波发生装置21,进行了上述的实验。
[0297] 生成的SA-W的超氧化物阴离子自由基浓度变为50μmol/L,无法完成上述的病原抗性基因的诱导,在使用作为实验植物的白荠菜的各种转化酶的缺陷性基因株中研究的结果,证明了具有在低浓度的超氧化物阴离子自由基中,通路未被打开,反而被封闭的功能。可认为超氧化物阴离子自由基浓度50μmol/L是反应诱导的下限值。
[0298] 最后,上述说明的各实施方式只是本发明的一个例子,本发明并不限定于上述实施形态。因此,即使在上述的各实施方式之外,只要未脱离本发明的技术思想的范围,根据设计需要作出的各种改变都是显而易见的。
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