[0001] 本发明属于园艺技术领域，具体涉及一种延长芍药切花瓶插寿命的方法。

[0002] 芍药属于芍药科芍药属宿根草本植物，是中国的传统名花。作为一种名贵花卉，芍药花大色艳、花型端庄、花香袭人，是作为切花的良好材料，近年来在国内外较为流行，广泛应用于婚礼等喜庆场合，市场前景十分广阔。但由于芍药花期短暂，自然花期主要集中于4～5月，其切花脱离母体后，其自然瓶插寿命仅为7天左右，这造成芍药切花供应期短，显著影响了芍药切花产业的发展。因此，找到一种能够使芍药切花保鲜、延长其瓶插寿命、增强观赏效果的方法至关重要。

[0003] 芍药切花采后生理生化会发生很大变化。首先是水分亏缺，这是影响芍药切花瓶插寿命的主要因素之一。保持芍药切花充足的水分对维持切花正常膨压与代谢活动都是必要的，因此，维持花枝水分及水分导度是抑制切花早期衰老、延长瓶插寿命的主要因子。而通过目前的研究得知，花枝导管堵塞是造成切花贮藏后期花枝吸水力下降的原因之一。其次是膜脂过氧化，这是影响芍药切花衰老的又一主要因素。芍药切花采后的可溶性蛋白质含量持续下降，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等保护酶活性下降，是其膜透性增大的重要原因之一。针对以上两个影响芍药切花衰老的主要生理生化变化，目前在生产上主要采用物理和化学两种保鲜技术。物理保鲜技术主要是采用低温冷藏，这种保鲜方法因使用范围和操作技术等限制，很难广泛使用。王荣花等在《杀菌剂和低温贮藏对芍药切花保鲜及其生理变化的影响》一文中指出，4～10℃的预冷处理6h可以降低切花的呼吸速率，延长瓶插寿命和贮藏保鲜期；但Waltona等人在《The dynamics of starch and sugar utilisation in cut peony(Paeonia lactiflora Pall.)stems during storage and vase life》中也指出，0℃的8周冷藏使得芍药切花的瓶插寿命缩短了近4天。而与物理保鲜技术相比，前人对化学保鲜技术的研究更为深入。魏秀俭等在《苯甲酸钠在芍药切花保鲜中的作用研究》中使用500mg/L的苯甲酸钠作为保鲜液可以延长瓶插寿命2天；徐萌等在《不同植物生长调节剂对芍药切花保鲜效果的影响》一文中分别在30g/L蔗糖+200mg/L 8-羟基喹啉+150mg/L柠檬酸中添加200mg/L多效唑和200mg/L矮壮素作为瓶插液，芍药切花的瓶插寿命分别延长3天和2.8天。这几种物质虽然可以作为芍药切花保鲜剂使用，但其瓶插寿命最多只能延长3天。中国发明专利(CN104255714 B)公开了一种牡丹、芍药鲜切花保鲜液，它是由有益菌液、无水亚硒酸盐、抗氧化剂、锌盐和水构成。该发明能有效延长牡丹、芍药鲜切花的观赏时间，并且具有安全、无毒、无污染的特点，但这种保鲜液成分存在配置工艺复杂、成本较高等缺点。姚连芳等人在《采前喷钙采后贮藏对芍药月季瓶插寿命影响》一文中分别于芍药切花采前一周、3天、2天重复喷钙处理3次，可延长其瓶插寿命2～3天。这一方法处理次数多、操作繁琐、需要耗费较多的人力、物力。因此，发明一种高效、经济、安全无毒、无污染、工艺简单的芍药切花保鲜剂及其操作方法就显得尤为必要。

[0004] 本发明的目的在于解决芍药作为切花生产时其瓶插寿命过短的问题，提供一种能够显著延长芍药切花瓶插寿命的保鲜剂及其操作方法，该保鲜剂经济、安全无毒、无污染，操作方法简便易行，可在生产上大规模推广应用。

[0005] 本发明采用的技术方案是：

[0006] 一种延长芍药切花瓶插寿命的方法，是在芍药花朵处于硬蕾期时，在茎秆第3～4片复叶处进行剪切，迅速将伤口置于水中斜切茎秆基部，留取3片小叶2片复叶将剪切好的芍药切花茎秆置于30～100mg·L-1纳米银溶液中，静置处理36h，而后瓶插于2％的蔗糖溶液中，瓶口用锡箔纸覆盖，防止水分蒸发。

[0007] 上述方法中，剪切好的芍药切花的花枝长度为30cm。

[0008] 本发明中所述的硬蕾期，是本领域技术人员所熟知的，例如按文献《芍药花蕾成熟及开花的阶段划分与形态类型》(成仿云、高水平、于晓南，园艺学报，2009，36(4):611-613)划分。

[0009] 本发明的方法主要是通过提高SOD、CAT等保护酶活性的来清除芍药切花体内的自-由基，从而减少MDA、O 、H2O2等有害物质的积累；与此同时，该方法有效抑制了芍药花茎末端切口微生物繁衍，减轻茎秆导管的堵塞程度，从而很好地维持了切花体内的水分平衡，最终延长了芍药切花的瓶插寿命。

[0010] 本发明的有益效果体现在：

[0011] (1)该方法操作简便，易于在生产上推广应用，对环境无污染，可回收再利用，生产成本较低。

[0012] (2)该方法实用效果显著，不仅能显著延长芍药切花的瓶插寿命(可达4天)，还可以增加花朵的直径和鲜重，改善植株本身的水分运输，有效地提高了芍药切花瓶插的观赏品质。

[0013] (3)该方法主要是通过提高SOD、CAT等保护酶活性的来清除芍药切花体内的自由基，从而减少MDA、O-、H2O2等有害物质的积累；与此同时，该方法有效抑制了芍药花茎末端切口微生物繁衍，减轻茎秆导管的堵塞程度，从而很好地维持了切花体内的水分平衡，最终延长了芍药切花的瓶插寿命。附图说明

[0014] 图1是纳米银处理对芍药切花瓶插寿命的影响。

[0015] 图2是纳米银处理对芍药切花鲜重、花径的影响。

[0016] 图3是纳米银处理对芍药切花生理指标的影响。

[0017] 图4是纳米银处理对芍药切花保护酶活性的影响。

[0018] 图5是Ag+在芍药切花不同部位的分布。

[0019] 图6是纳米银处理对芍药切花吸水量的影响。

[0020] 图7是芍药切花底部茎秆扫描电镜观察。

[0021] 图8是分离菌株菌落形态及分生孢子形态；1：1号分离物；2：2号分离物；A：菌落正面；B：菌落背面；C：分生孢子。

[0022] 图9是分离菌株PCR电泳图；1：1号分离物；2：2号分离物。

[0023] 图10是1号分离菌株序列Blast比对结果。

[0024] 图11是2号分离菌株序列Blast比对结果。

[0025] 实施例1

[0026] 以生产上栽培应用普遍的芍药品种‘红艳争辉’(购于山东菏泽春秋园艺中心)为试材来开展本研究工作，田间栽植于扬州大学园艺与植物保护学院芍药种质资源圃(32°30′N，119°25′E)中：

[0027] 1、纳米银溶液的配制：本发明所使用的纳米银为上海沪正纳米科技有限公司生产(原浓度为1000mg·L-1)，使用去离子水将其稀释成30和100mg·L-1，所有溶液现配现用。

[0028] 2、材料准备：选取无病虫害、发育程度一致、花朵处于硬蕾期(按文献《芍药花蕾成熟及开花的阶段划分与形态类型》划分)的芍药植株，在茎秆第3～4片复叶处进行剪切，迅速将伤口置于水中斜切茎秆基部，留取3片小叶2片复叶，花枝长度为30cm。

[0029] 3、处理：将剪切好的芍药切花茎秆置于30mg·L-1纳米银溶液中，以去离子水为对照，静置处理36h，而后分别插于2％的蔗糖溶液中，瓶口用锡箔纸覆盖，防止水分蒸发，置于室内正常环境条件下。

[0030] 4、芍药切花瓶插寿命观察及其他指标的测定：

[0031] (1)瓶插寿命观察：从瓶插当天开始，每天观测记录切花的外观变化，以花瓣出现萎蔫脱落为瓶插寿命的终止，记录瓶插天数。

[0032] (2)形态指标的测定：在瓶插期间，每天同一时间使用游标卡尺(0-150，台州市新上量量具有限公司)准确测量花朵直径，使用电子天平(T-500，常熟双杰测试仪器厂)精确测量花朵鲜重。

[0033] (3)生理指标的测定：

[0034] ①相对电导率：取新鲜的样品，用去离子水洗净，使用直径1cm的打孔器打孔；取0.2g放置于戴塞试管，加入20mL去离子水，每个处理重复3次；25℃80khz下超声15min，测定电导率值记为R1；室温静置30min，煮沸15min，冷却后测定电导率值记为R2。计算公式：相对电导率＝R1/R2×100％。

[0035] ②可溶性蛋白含量、丙二醛含量、超氧阴离子自由基含量、过氧化氢含量、脯氨酸含量的测定均参照试剂盒的说明书进行(南京建成生物工程研究所)。

[0036] (4)保护酶活性的测定：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性的测定均参照试剂盒的说明书进行(南京建成生物工程研究所)。

[0037] (5)离子运输与水分吸收测定：

[0038] ①Ag+含量：采用ICP方法测定芍药植株中的Ag+含量。在瓶插第2、4、6、8天采取对照芍药和纳米银处理植株的底部茎秆2cm、顶部茎秆2cm、花瓣和叶片，置于烘箱中杀青，而后烘干至恒重。分别称取茎秆顶部和底部干样各0.2g、花瓣和叶片各0.5g，将其放在灰化炉中(HKKH3000，恒科煤质化验设备公司)，每分钟升温15℃，700℃后保持5h直至样品全部灰化。取出后冷却至室温，用1mL 98％HNO3溶解灰分，将其转移到10mL容量瓶中，并用超纯水稀释，使用混合纤维素酯微孔滤膜(孔径0.45μm)过滤，最终使用Optima 7300 DV电感耦合等离子体光谱仪(美国PerkinElmer)测定芍药样品中Ag+含量。

[0039] ②吸水量：瓶插期间，每天同一时间测量瓶子+瓶插液的重量，记为W，则第n天吸水量为W(n)-W(n+1)。

[0040] (6)扫描电镜观察：取茎秆基部5mm固定在2.5％戊二醛溶液中，3h后用0.1M PBS缓冲液冲洗3次，每次15min，经过50％、70％、85％、95％、100％酒精梯度脱水，每次15min，丙酮和无水乙醇混合液处理15min，CO2临界点干燥，喷金，将其置于扫描电镜(XL-30ESEM，荷兰Philips)下观察茎秆底部堵塞情况。

[0041] (7)病原菌的鉴定：

[0042] ①土豆培养基的配制：新鲜去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。将200g马铃薯在适量的水中煮沸，纱布过滤，滤液中加20g蔗糖并搅拌使其溶解，将滤液用蒸馏水补足至1000mL，加入20g琼脂，加热使琼脂完全融化后，高温高压(121℃、110kPa)灭菌20min(LDZX-50XBS，上海申安医疗器械厂)，而后用于真菌分离与保存。

[0043] ②病样采集：将瓶插芍药花枝的底部茎秆切下，浸没在0.5％次氯酸钠溶液中消毒2min左右，然后用灭菌蒸馏水冲洗2～3次，用灭菌滤纸将组织块表面的水分吸干，将组织块分散放置于土豆培养基中，25℃黑暗条件下培养3天，待长出菌落后立即纯化。

[0044] ③病原菌形态学特征观察：将分离纯化的菌落块接种至土豆培养基中，25℃黑暗条件下培养3天，观察菌落形态。待培养基上生长出菌丝后，挑针刮取徒手切片，在显微镜下观察其孢子形态，并拍照。

[0045] ④病原菌分子生物学鉴定：gDNA提取参照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书进行(上海生工生物工程有限公司)。采用ITS4(28S)和ITS5(18S)引物扩增整个ITS区序列，包含其两端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中间的ITS1、5.8S rDNA、ITS2的完整序列。引物序列为：ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO.1)，ITS5：5’-GGAAGGTAAAAGTC AAGG-3’(SEQ ID NO.2)。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并与DL2000 Marker比对大小，切胶分离回收产物。将纯化后的PCR产物送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序，测得的序列采用NCBI网站在线工具BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行比对，根据比对结果，判断菌株的种类。

[0046] PCR反应体系：

[0047]

[0048] 反应条件：

[0049]

[0050] 5、结果：

[0051] ①纳米银处理对芍药切花瓶插寿命的影响

[0052] 芍药切花在瓶插期间经历了由花蕾到初开、盛开、衰败的过程，这一过程大约为8天时间。在使用30mg·L-1纳米银处理后，芍药切花不仅提前到达初开期，而且花朵绽放的时间更长，衰败时间比对照推迟了4天(图1)。而在使用100mg·L-1，纳米银处理后，芍药切花的瓶插寿命也延长了2天。由此可见，纳米银处理能够延长芍药切花的瓶插寿命，但不同浓度差异显著，下面将着重针对30mg·L-1纳米银处理材料进行深入研究。

[0053] ②纳米银处理对芍药切花鲜重、花径的影响

[0054] 图2为芍药切花瓶插期间鲜重、花径的变化情况，两者均总体上呈现了先上升后下降的趋势。而就纳米银处理而言，芍药切花在瓶插的第1-2天时，两者的差异并不大，而后差异逐渐变大，并且NS处理后的切花鲜重、花径一直高于对照，最大差异达到6.58g和3.52cm。

[0055] ③纳米银处理芍药切花生理指标的影响

[0056] 由图3可知，芍药切花在瓶插期间可溶性蛋白含量也呈现了先增加后减少的趋势，只是对照的最高含量出现在第4天，而纳米银处理的最高含量出现在第6天。此外，在瓶插第2和4天时，纳米银处理切花的可溶性蛋白含量一直低于对照，而后开始急剧增加，显著高于-1
对照，在瓶插第6天时差异最大，达到0.24gprot·L 。

[0057] 相对电导率是反映细胞膜的通透性、细胞受损程度的指标，通过测量芍药切花的相对电导率可以直观地了解其细胞膜受损程度。在芍药切花的整个瓶插期间，纳米银处理切花和对照的相对电导率均呈现一直上升趋势，其两者衰败期的值分别是花蕾期的1.63倍和1.29倍。此外，对照切花的相对电导率一直高于纳米银处理，其高出的幅度范围在6.36％～18.43％之间。

[0058] MDA含量反映芍药内脂质过氧化程度，间接地反映出细胞损伤程度，通过测量芍药切花MDA含量可以直接地了解其膜脂过氧化程度。在芍药的整个瓶插期间，纳米银处理切花-和对照的MDA含量一直呈现上升趋势，在瓶插初期，两者的MDA含量分别为4.00nmol·mg
1prot和7.18nmol·mg-1prot。随着瓶插时间的增加，花朵衰败，此时的MDA含量分别达到了
8.73nmol·mg-1prot和8.9nmol·mg-1prot。对照切花的MDA含量一直高于纳米银处理，高出约为3nmol·mg-1prot。

[0059] 植物体内产生超氧阴离子不能被及时清除造成膜脂过氧化，引起切花衰老。NS处理切花和对照的超氧阴离子含量随着花的开放进程不断增加，两者初期的超氧阴离子含量分别为16U·g-1prot和29U·g-1prot，衰败期的含量分别为蕾期的1.95倍和1.55倍。此外，对照切花的超氧阴离子含量一直NS处理，高出幅度在80％～95％之间。

[0060] 在芍药的整个瓶插期间，纳米银处理切花和对照的H2O2含量一直呈现上升趋势，瓶插初期，纳米银处理切花和对照的H2O2含量分别为136mmol·g-1prot和141mmol·g-1prot，衰败期的含量分别为蕾期的1.95倍和1.55倍。而且对照切花的含量始终高于纳米银处理，高出幅度约为3％-16％。

[0061] 脯氨酸的积累一定程度上反映了植物水分亏缺程度。图3显示的是整个瓶插过程中纳米银处理切花和对照的游离脯氨酸含量的变化，两者整体都呈现上升趋势，初期含量分别为35.8μg·g-1FW和45.3μg·g-1FW，瓶插末期两者的含量分别为初期的1.11倍和1.76-1倍。对照切花的游离脯氨酸含量一直高于纳米银处理，高出量10μg·g FW左右。

[0062] ④纳米银处理对芍药切花保护酶活性的影响

[0063] 纳米银处理切花和对照切花的SOD活性在瓶插期间的变化趋势相一致，总体呈现先上升后下降的趋势，两者均在瓶插第4天达到最大值，分别为44.8U·mg-1Prot和40.2U·-1mg Prot，比对照高11.4％，并在整个瓶插期间纳米银处理切花的SOD活性要比对照的高(图
4)。

[0064] 纳米银处理切花和对照的CAT活性与SOD活性一样，呈现先上升后下降的趋势，纳米银处理切花的最高活性出现在第8天，而对照的最高活性出现在第6天。两者蕾期的CAT活-1 -1性分别为2.12U·mg Prot和0.62U·mg Prot，而最高活性分别为蕾期的3.77倍和7.1倍。
纳米银处理切花的CAT活性一直高于对照，高出幅度范围在1.6～6.0U·mg-1Prot之间(图
4)。

[0065] ⑤纳米银处理对芍药切花离子运输与水分吸收的影响

[0066] 通过对Ag+在芍药切花不同部位的分布检测，结果显示，纳米银处理的切花在整个植株中均能检测到Ag+的存在，而对照中均未检测到Ag+或低于检测线(图5)。在纳米银处理的切花不同部位中，底部茎秆的Ag+含量最高(44.26～87.34μg·g-1DW)，而后是叶片(1.44～6.13μg·g-1DW)和顶部茎秆(0.46～1.59μg·g-1DW)，花瓣中的Ag+含量最低(0.35～0.82μg·g-1DW)，并且它们的含量均随着瓶插时间的推移而下降。

[0067] 芍药切花瓶插期间，纳米银处理切花和对照的吸水量总体呈现下降趋势，瓶插第2天，两者的吸水量分别为6.0g和5.2g，瓶插末期，两者的吸水量分别为蕾期的20％和67％，但纳米银处理切花的吸水量普遍高于对照(图6)。

[0068] ⑥芍药切花底部茎秆结构观察

[0069] A：对照瓶插0天；B：纳米银处理瓶插0天；C：对照瓶插8天；D：纳米银处理瓶插8天[0070] 采用扫描电镜对底部茎秆结构进行观察，无论是NS处理还是对照，两者的结构完全一致(图7)。在瓶插初期，两者的导管组织结构清晰可见，几乎观察不到微生物的存在(图7A、B)。而到了瓶插第8天，对照切花底部茎秆被大量微生物代谢物或菌丝所覆盖(图7C)，而NS处理的底部茎秆几乎观察不到被微生物代谢物或菌丝所覆盖的现象(图7D)。

[0071] ⑦芍药切花瓶插易滋生病原菌种类鉴定

[0072] 将瓶插芍药切花的底部茎秆在土豆培养基平板上培养后，共分离出两种分离物(图8)，1号分离物在平板上菌落初为灰白色，随后逐渐转变为灰黑色，生长迅速，8天左右即可铺满平板。通过显微镜对1号分离物的分生孢子进行观察，发现分生孢子梗单生，直或略弯，淡褐色，分生孢子倒棍棒形或卵形，具有1-6个纵膈膜，2-8个横膈膜，隔膜深褐色，推测其为链格孢属菌(Alternaria sp.)。2号分离物在平板上菌落初为白色，随后渐渐转变黄白色，并伴有白色粘液产出，生长迅速，8天左右也可铺满平板，通过显微镜对2号分离物观察，发现2号分离物没有分生孢子，推测为茎点霉属菌(Phoma sp.)。

[0073] 通过设计的ITS4、ITS5特异性引物对分离物进行PCR鉴定，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，两者均获得约600bp的单一、明亮条带(图9)。随后便将目的条带回收测序，并将获得的序列在NCBI上进行Blast比对，结果显示，确认1号分离物为链格孢属(Alternaria sp.)(图10)，2号分离物为茎点霉属(Phoma sp.)(图11)。