防治高温水体中SRB的生物菌剂及其抑制SRB的方法 |
|||||||
| 申请号 | CN201410569095.9 | 申请日 | 2014-10-23 | 公开(公告)号 | CN104357035A | 公开(公告)日 | 2015-02-18 |
| 申请人 | 中国石油化工股份有限公司; 中国石油化工股份有限公司江苏油田分公司; | 发明人 | 吴伟林; 杨帆; 姚峰; 薛芸; 孟章进; 姜桂英; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及油田采出液中 硫酸 盐 还原菌抑制技术，特别涉及一种防治高温 水 体 中SRB的 生物 菌剂及其抑制SRB的方法，其中防治油田高温水体环境中SRB的生物菌剂为JSHD-4地芽孢杆菌，具有 序列表 SEQID NO：1所示的序列，保藏于中国 微生物 菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为Geobacillustoebii，保藏编号为CGMCCNO7273保藏日期为2013年3月5日。所述JSHD-4地芽孢杆菌通过微生物好 氧 发酵 制得菌液浓度为1.0×106～1.3×1010cfu/mL的工业发酵液，耐受 温度 为50—95℃，最佳生长温度为60—70℃。采用本发明的JSHD-4地芽孢杆菌配制的多功能生物菌剂投入井下后，在井下高温环境下使得 硝酸 盐还原菌群(DNB)迅速增生扩散，适合直接对井下高温环境的SRB进行在线处理。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种防治高温水体中SRB的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂为JSHD-4地芽孢杆菌，具有序列表SEQ ID NO：1 所示的序列，保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为 Geobacillus toebii，保藏编号为CGMCC NO 7273 保藏日期为 2013年3月5日。 |
||||||
| 说明书全文 | 防治高温水体中SRB的生物菌剂及其抑制SRB的方法技术领域背景技术[0002] 油井腐蚀问题长期困扰着石油开采业，也是油井生产和科研人员一直关注的课题，至今没有得到较好的解决。大量研究表明，油井生物腐蚀主要是有害微生物硫酸盐还原菌（SRB）大量滋生，引起硫化物浓度增大造成的。目前，油井控制SRB和硫化物主要是采取化学和物理方法，存在成本高、易二次污染、形成耐药性等不足。 [0003] 油田硫酸盐还原菌生物防治集输近年来逐渐兴起，该技术主要是利用生物竞争淘汰的方法，通过微生物种群的替代将有害的微生物问题变为有利因素；但是该技术主要研究对象为油田集输系统的SRB治理，对于油井这种高温极端环境（50℃以上）的研究较少。 [0004] 本发明中的多功能生物菌剂可以在50～95℃的油井高温环境下使用，使得硝酸盐还原菌群(DNB)迅速增生扩散，并在与SRB竞争生存空间和基质时，DNB优先选择使用油田系统中的基质，有效阻止SRB获得所需要的营养物，从而控制SRB的代谢活性。 发明内容[0005] 本发明的目的是针对现有技术中SRB生物抑制技术的不足，通过向油田井下高温环境中注入嗜热多功能生物菌剂，有效的抑制高温环境中SRB的快速生长，消除已经产生的硫化物，同时刺激反硝化细菌的生长，改变水体微生物群落结构，从而达到防止生物腐蚀的目的。 [0006] 本发明的目的之一是，提供一种防治油田高温水体环境中SRB的生物菌剂，所述生物菌剂为JSHD-4地芽孢杆菌，具有序列表SEQ ID NO：1 所示的序列，保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为 Geobacillus toebii，保藏编号为CGMCC NO 7273 保藏日期为 2013年3月5日。 [0007] 本发明中，所述JSHD-4地芽孢杆菌通过微生物好氧发酵制得菌液浓度为6 10 1.0×10 ～1.3×10 cfu/mL的工业发酵液，耐受温度为50—95℃，最佳生长温度为60— 70℃。本发明中的JSHD-4地芽孢杆菌耐受温度高，可以适应中高温的井下环境中SRB的抑制，防止井下生物腐蚀。 [0008] 本发明的另一个目的是，提供一种采用上述生物菌剂抑制油田高温水体环境中SRB的方法，按油田高温水体的量投加如下比例的多功能生物菌剂：JSHD-4地芽孢杆菌：通6 10 过微生物好氧发酵制得菌液浓度为1.0×10 ～1.3×10 cfu/mL的工业发酵液，所述工业发酵液的投加比例为油田高温水体体积0.5～1%；硝酸钠20～30 mg/L；亚硝酸钠50～ 150 mg/L；磷酸二氢钠5～10 mg/L 作为本发明方法的进一步改进，所述JSHD-4地芽孢杆菌通过好氧发酵的工业发酵液 8 的浓度为1.0～1.3×10cfu/mL，投加比例为油田高温水体体积0.8%；硝酸钠25 mg/L；亚硝酸钠75 mg/L；磷酸二氢钠8 mg/L。 [0009] 作为本发明的再一步改进，本发明的方法中，向目标油井中投加所述多功能生物菌剂时，先将油井套管气压放至套压回零，JSHD-4地芽孢杆菌菌液直接采用冲击式投加加入油井套管内，硝酸钠、亚硝酸钠和磷酸二氢钠按比例称量后先溶解到25—30L的水中，然后采用冲击式投加加入油井套管内，最后再向油井套管内投加50L水。 [0010] 本发明的有益效果是：本发明的JSHD-4地芽孢杆菌可以在50～95℃的油井高温6 10 环境下使用，菌种经生物好氧发酵可获得菌液浓度为1.0×10 ～1.3×10 cfu/mL芽孢的工业发酵液，采用JSHD-4地芽孢杆菌配制的多功能生物菌剂投入井下后，在井下高温环境下使得硝酸盐还原菌群(DNB)迅速增生扩散，可以有效的抑制高温环境中SRB的快速生长，消除已经产生的硫化物，同时刺激竞争微生物反硝化细菌的生长，改变水体微生物群落结构，其硫化物抑制率在93%以上，有效延长管道的使用寿命，改善水质，大大降低生产成本。 [0011] 生物保藏本发明所涉及的微生物已提交生物保藏： 具体实施方式[0012] 实施例1本发明的JSHD-4地芽孢杆菌通过如下过程筛选： （1）样品采集 在江苏油田采集7口油井的产出液，样品名称分别为：CH2-43、CH2-42、CH2-36、T83-1、T83-10、T83-7、H88-10。 [0013] (2)培养基配置富集培养基由A溶液和B溶液混合组成，其中： A溶液：无机盐K1 2.0 g，天冬酰胺1.0 g，蒸馏水500 ml，pH值7.0~7.2； B溶液：柠檬酸钠8.5 g，乙酸钠2 g，葡萄糖2 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，FeCl3·6H2O 0.05 g，CaCl2 0.1 g，yeast extract 0.5 g，蒸馏水500 ml。pH值7.0~7.2。 [0014] NRB液体培养基：A液和B液单独121 ℃灭菌20 min，灭菌后等比例混合。 [0015] NRB固体培养基：A液和B液中各加入质量比为1.5% ~ 2%的琼脂，单独灭菌后等比例混合。 [0016] （3）富集培养将步骤（1）中7口油井产出液样品等比例混合，然后加入NRB液体培养基，分别置于65 ℃、75 ℃（是否应改为70℃）培养箱中好氧培养；同时，以同样处理的采出液灭菌样品做为对照样。65 ℃条件下培养6d后以5%的接种量接种至相同的NRB液体培养基中进行转接培养，培养3 d后再次转接，转接培养3次，然后转接至70 ℃条件下进行驯化培养。培养后测定培养液中K1离子浓度见表1。 [0017] 经过三次转接，65 ℃、70 ℃条件下培养溶液浑浊，而对照样培养液澄清，表明实验组培养液中微生物大量生长，同时，由表1培养液K1浓度测定表明，70 ℃驯化培养2 d，K1浓度由2.0 g/L降低至0.24 g/L，而65 ℃第三次转接培养液K1浓度测定为0，培养后溶液K1离子浓度大幅度降低说明微生物生长同时伴随K1离子大量消耗，表明实验组培养液含有硝酸盐还原菌，且在实验条件下生长旺盛。（4）菌株分离纯化 将65 ℃三次转接、70 ℃驯化的样品涂布到NRB固体培养基平板培养，从所得培养平板上挑取单菌落于三角烧瓶中进行培养，培养3 d后置于4 ℃冰箱保存。 [0018] （5） 硝酸盐还原菌DNA提取与鉴定（I）DNA提取 将分离纯化后的硝酸盐还原菌富集培养3天，用2 mL离心管在12000 × g条件下离心收集细胞，采用Axygen DNA提取试剂盒提取硝酸盐还原菌DNA，具体操作步骤如下： 1)在装有细胞的离心管中加入450 μL裂解液，旋涡振荡15 s，65 ℃水浴10 min； 2)继续加入400 μL蛋白质变性剂和1 mL 相分离液(4 ℃预冷)，用力混合，12000 × g离心2 min； 3)弃上相，保留相间沉淀和下相，加入1 mL 4 ℃预冷的相分离液，混合，12000 × g离心2 min； 4)弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2 mL离心管中），12000 × g离心1 min； 5)弃滤器，在滤液中加入400 μL DNA结合液，混合均匀； 6)将制备管置于2 mL离心管中，将步骤(5)中的混合液移入制备管中，12000 × g离心1 min； 7)弃滤液，将制备管置回到原2 mL离心管中，加入500 μL冲洗液W1，12000 × g离心1 min； 8)弃滤液，将制备管置回到原2 mL离心管中，加入700 μL冲洗液W2，12000 × g离心1 min； 9)以同样的方法再用700 μL冲洗液W2洗涤一次； 10)弃滤液，将制备管置回到原2 mL离心管中，12000 × g离心1 min； 11)将制备管置于另一洁净的1.5 mL离心管中，在silica膜中央加100-200 μL Eluent或去离子水，室温静置1 min，12000 × g离心1 min洗脱DNA，保存在-20 ℃下以备用。 [0019] （II）样品PCR扩增将提取的JSHD04的DNA，采用16S rDNA基因通用引物1492R和27F进行PCR扩增。 [0020] 1) 细菌16S rDNA PCR反应体系PCR反应体系组成见表2。 [0021] 2) 引物序列2) 引物序列 1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 27F：5‘＞CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAGAGTTTGATCTTGGCTCAG＜3’ 3) PCR反应程序 1． 95 ℃ 3 min 2． 94 ℃ 40 sec 3． 52 ℃ 45 sec 4． Goto 2 35 times 5． 72 ℃ 10 min （III）测序结果 江苏油田产出液65 ℃富集样品分离出菌落（编号JSHD-4），挑取单菌落富集培养，培养细胞提取DNA，PCR扩增产物进行测序，结果如果如SEQ ID NO：1所示的序列。 [0022] 经分析比对与经分析比对与G. toebii strain R-32639 相似度为97%，为地芽孢杆菌的一个亚种。 [0023] 实施例2实验室体系条件下JSHD-4对SRB的抑制效果 按照表3改良SRB培养基配方，以无菌水为溶剂进行培养基配置，培养基经121 ℃灭菌 20 min，冷却后每升培养基再分别加入微量元素溶液（组成如表4所示）1 mL、维生素溶液（组成如表5所示）1 mL和经紫外线灭菌的硫酸亚铁铵0.1g和L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g； 从固体斜面上用接种环挑取保存的SRB菌种（脱硫肠状菌）3~4环接种到SRB培养基中，在 65℃下培养48小时，获得新鲜富集培养的SRB菌液。 [0024] 同时将保存的JSHD-4在75 ℃下使用NRB液体培养基（同实例1中的NRB液体培养基）活化培养1 d，获得新鲜富集培养的JSHD-4菌液，然后按2%的接种比例将JSHD-4菌液和SRB菌液接种到改良SRB的培养基中（试验瓶为250ml的厌氧瓶），并加入10 mmol/L的硝酸钠在65℃下进行培养，同时以只接种SRB菌液和添加10 mmol/L的硝酸钠而不接种硝酸盐还原菌的为对照组，比较培养液变化，通过检测H2S的含量来表征多功能生物菌剂中的JSHD-4对SRB活性的抑制能力，检测结果如表6所示）。培养7 d以后，只加SRB和添加10 mmol/L的硝酸钠的对照组中的H2S含量很高，而在加入含JSHD-4的抑制体系中H2S浓度在第3 d和第7 d均保持很低，表明实验组中SRB的活性被明显抑制。 [0025]实施例3 首先将反硝化细菌JSHD-4通过常规微生物好氧发酵制备获得芽胞浓度为 1.0×106cfu/mL工业发酵液，该工业发酵液可使用20L塑料桶储存，然后取硝酸钠、亚硝酸钠和磷酸二氢钠均为市售工业级产品，使用时按比例混合均匀，也可以依次加入目标油井采出液。 [0026] 将本发明JSHD-4多功能生物菌剂按如下比例投入江苏油田王39井，处理前该井产出液的硫化物浓度为28mg/L。投加量为：JSHD-4工业发酵液（1.0×106cfu/mL），投加量为采出液含量的0.5%；硝酸钠：20mg/L；亚硝酸钠：50mg/L；磷酸二氢钠：5mg/L向目标油井中投加上述多功能生物菌剂时，先将油井套管气压放至套压回零，JSHD-4工业发酵液直接采用冲击式投加加入油井套管内，硝酸钠、亚硝酸钠和磷酸二氢钠按比例称量后先溶解到25L的水中，然后采用冲击式投加加入油井套管内，最后再向油井套管内投加50L水。同时不定期检测硫化物含量，并适时补充添加多功能生物菌剂；以保持抑制效果。抑制效果如图1所示的硫化物变化曲线，60d抑制率达93.14%。 [0027] 实施例4与实施例3不同之处在于，实施油井为江苏油田韦2-53井，硫化物128.4mg/L，JSHD-4工业发酵液芽孢浓度为1.3×1010cfu/mL，投加量为油井采出液含量的1%；硝酸钠：30mg/L； 亚硝酸钠：150mg/L；磷酸二氢钠：10mg/L。抑制效果如图1所示的硫化物变化曲线，60d抑制率达97.73%。 [0028] 实施例5与实施例3不同之处在于，实施油井为江苏油田黄88-39井，硫化物56mg/L，JSHD-4 8 工业发酵液浓度为1.3×10cfu/mL，投加量为采出液含量的0.8%；硝酸钠：25mg/L；亚硝酸钠：75mg/L；磷酸二氢钠：8mg/L。抑制效果如图1所示的硫化物变化曲线，60d抑制率达 94.93%。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈