[0001] 本发明涉及药物领域，更具体地涉及含IL-12和IL-23抑制剂的制剂及其在促进骨形成中的应用。

[0002] 美国每年大约有790万人发生骨折，虽然大部分人通过骨修复可以正常痊愈，但是仍有5％至20％的病人由于延迟康复或修复失败需要再次进行手术治疗。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是成体干细胞的一种，获取容易，增殖快速且具有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞等。BMMSCs具有低免疫原性，已广泛应用于细胞组织工程、基因治疗等方面，尤其在骨组织、软骨组织、神经系统的组织工程中广泛应用。骨缺损修复是医学研究的难点问题，细胞因子、生物材料和种子细胞复合后植入人体内促进骨修复已广泛应用于临床。然而，早期临床报告显示，接受干细胞治疗后仍有10％-18％的骨折病人存在骨不连现象。这些病人必须接受二次手术，这不仅增加病人的疼痛和额外的家庭经济负担，而且还严重损害病人的生活和工作质量。

[0003] 生物材料作为一个异物进入体内后，会受到多种免疫细胞的作用。材料植入体内后立刻被血清蛋白和胞外基质蛋白包裹，从而激活免疫系统。这些蛋白引发异物反应的第一步：激活中性粒细胞和巨噬细胞。中性粒细胞和巨噬细胞释放不同的细胞因子和趋化因子，以吸引更多的免疫细胞向伤口部位迁移，从而激活适应性免疫反应，产生大量的炎症因子。炎症是骨再生的重要调节因素。骨折修复再生起始于炎症反应。适当的炎症反应可以清除组织碎片、细菌感染，刺激血管形成、招募BMMSCs并促进其向成骨细胞分化、增强胞外基质的合成。但是，剧烈或长期的炎症反应会延长骨修复或导致骨修复失败。众所周知，裸鼠体内可以异位成骨；而C57BL/6小鼠体内却无法成骨，正是由于其体内存在剧烈的炎症反应抑制BMMSCs的存活和分化。裸鼠由于T细胞缺陷，体内炎症因子浓度较低，有利于BMMSCs向成骨细胞分化以及促进体内骨形成。

[0004] 硬组织修复材料是生物材料的重要组成部分，临床上因创伤、肿瘤、感染以及先天性缺陷等原因导致的骨缺损必须进行骨修复。因此，临床上对硬组织材料的需求也持续增长，但是硬组织材料在体内主要以“异物”存在，引起异物反应，产生大量的炎症因子和长期的炎症反应。在利用硬组织材料进行骨修复过程中，既要保证有适当的免疫应答反应来清除病原体和危险信号，又要避免过度的炎症反应造成机体损害和修复失败。因此，了解硬组织修复材料与机体微环境如何相互作用，产生哪些大量的炎症因子以及这些炎症因子如何影响骨修复对于硬组织材料的临床应用至关重要，却鲜有人研究。

[0005] 本发明的目的在于提供一种含IL-12和IL-23抑制剂的制剂及其在促进骨形成中的应用。

[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种抑制IL-12和IL-23的抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(i)治疗炎症性骨丢失；和/或(ii)促进骨形成。

[0007] 在另一优选例中，所述的抑制IL-12和IL-23的抑制剂由IL-12抑制剂和IL-23抑制剂组成。

[0008] 在另一优选例中，所述的IL-12抑制剂和IL-23抑制剂相同或不同。

[0009] 在另一优选例中，所述的抑制IL-12和IL-23的抑制剂同时抑制IL-12和IL-23。

[0010] 在另一优选例中，所述的抑制IL-12和IL-23的抑制剂包括p40亚基抑制剂。

[0011] 在另一优选例中，所述的p40亚基抑制剂选自下组：

[0012] (i)Apilimod；

[0013] (ii)特异性抑制p40亚基表达和/或活性的拮抗剂；

[0014] (iii)上述(i)和(ii)的任意组合。

[0015] 在另一优选例中，所述的拮抗剂包括抗体。

[0016] 在另一优选例中，所述的抗体包括中和抗体。

[0017] 在另一优选例中，所述的抗体包括：ustekinumab(CNTO-1275)、Briakinumab(ABT-874)、或其组合。

[0018] 在另一优选例中，所述的拮抗剂包括MicroRNA、siRNA、shRNA、或其组合。

[0019] 在另一优选例中，IL-17抑制剂选自下组：Secukinumab(AIN457)、Ixekizumab(LY2439821)、Brodalumab(AMG 827)、或其组合。

[0020] 在另一优选例中，所述的IL-23抑制剂选自下组：Tildrakizumab(MK-3222；SCH 900222)、Guselkumab(CNTO-1959)、BI-655066、AMG 139、MEDI-2070、LY3074828、LY2525623、或其组合。

[0021] 在另一优选例中，所述的IL-12和IL-23来源于人或非人哺乳动物。

[0022] 在另一优选例中，所述的IL-12包含p40和p35亚基。

[0023] 在另一优选例中，所述的IL-23包含p40和p19亚基。

[0024] 在另一优选例中，所述的制剂或组合物还用于抑制免疫细胞产生IL-17和IFN-γ。

[0025] 在另一优选例中，所述的免疫细胞包括T细胞和NK细胞。

[0026] 在另一优选例中，所述的T细胞选自下组：CD4+T细胞、和CD8+T细胞。

[0027] 在另一优选例中，所述的制剂或组合物还用于促进骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的成骨分化。

[0028] 在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。

[0029] 在另一优选例中，所述药物组合物包含(a)抑制IL-12和IL-23的抑制剂；和(b)药学上可接受的载体。

[0030] 在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。

[0031] 在另一优选例中，所述的药物组合物为局部用药。

[0032] 在本发明的第二方面，提供了一种生物材料，所述生物材料包含：活性成分(a)骨修复材料、和活性成分(b)抑制IL-12和IL-23的抑制剂。

[0033] 在另一优选例中，所述的骨修复材料包括：人工骨修复材料、自体骨材料、异体骨材料。

[0034] 在另一优选例中，所述骨修复材料包含：陶瓷类修复材料、金属类修复材料、纳米类材料、复合类材料、或其组合。

[0035] 在另一优选例中，所述的陶瓷类修复材料包括羟基磷灰石、β-磷酸三钙。

[0036] 在另一优选例中，所述的金属类修复材料包括钛合金、铂。

[0037] 在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1000:1至1:1，较佳地为100:1至10:1。

[0038] 在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的总含量为组合物的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。

[0039] 在另一优选例中，所述生物材料还包含促进骨修复的其他成分。

[0040] 在另一优选例中，所述的生物材料用于骨缺损的修复。

[0041] 在另一优选例中，所述的骨缺损由选自下组的原因导致：创伤、肿瘤、感染和先天性缺陷。

[0042] 在本发明的第三方面，提供了一种筛选促进成骨分化的候选药物的方法，所述方法包括步骤：

[0043] (a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对IL-12和IL-23的抑制情况，从而选出同时抑制IL-12和IL-23的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及

[0044] (b)测试所述经初筛的化合物对成骨分化的作用情况，从而选出促进成骨分化的化合物，作为候选药物。

[0045] 在另一优选例中，在步骤(a)中，在实验组中，在所述待测化合物存在下，用IL-12和IL-23刺激T细胞，测定IFN-γ和IL-17的表达量，记为Mt1和Mt2；并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，测定所述IFN-γ和IL-17的表达量，记为Mc1和Mc2；并对Mt1、Mt2、Mc1和Mc2进行比较；

[0046] 其中，如果Mt1显著低于Mc1且Mt2显著低于Mc2，则表明所述的待测化合物为同时抑制IL-12和IL-23的待测化合物，即作为经初筛的化合物；

[0047] 如果Mt1显著高于Mc1，则表明所述的待测化合物为促进IL-12的待测化合物；

[0048] 如果Mt2显著高于Mc2，则表明所述的待测化合物为促进IL-23的待测化合物。

[0049] 在另一优选例中，所述的“显著低于”指Mt1/Mc1或Mt2/Mc2≤1/1.5，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

[0050] 在另一优选例中，所述的“显著高于”指Mt1/Mc1或Mt2/Mc2≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

[0051] 在另一优选例中，所述的T细胞选自下组：CD4+T细胞、和CD8+T细胞。

[0052] 在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括设置阳性对照组、和/或阴性对照组。

[0053] 在本发明的第四方面，提供了一种(i)治疗炎症性骨丢失；和/或(ii)促进骨形成的方法，所述的方法包括步骤：

[0054] (i)给需要的对象施用抑制IL-12和IL-23的抑制剂。

[0055] 在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

[0056] 在另一优选例中，所述药物组合物的施用剂量为5-20mg/kg/次。

[0057] 在另一优选例中，所述的施用包括局部使用和全身施用。

[0058] 在另一优选例中，所述的施用是在所述对象出现过度炎症反应后进行施用。

[0059] 在另一优选例中，所述的过度炎症反应是指超出正常免疫应答的炎症反应。

[0060] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

[0061] 图1显示IL-12p40-/-小鼠促进骨形成，抑制骨吸收，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0062] 图1a显示了C56BL/6小鼠异位成骨后不同时间点局部细胞因子的表达，n＝5每组。

[0063] 图1b显示了显微CT检测对比8周IL-12p40-/-小鼠和野生型(WT)小鼠股骨骨量的差异，n＝5每组。

[0064] 图1c显示了8周IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠股骨骨矿物质密度(BMD)的差异，n＝5每组。

[0065] 图1d显示了8周IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠股骨骨体积/组织体积(BV/TV)的差异，n＝5每组。

[0066] 图1e显示了8周IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠股骨松质骨厚度(Tb.Th)的差异，n＝5每组。

[0067] 图1f显示了8周IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠股骨松质骨分离度(Tb.Sp)的差异，n＝5每组。

[0068] 图1g显示了8周IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠股骨松质骨的差异(H&E染色)，n＝5每组。标尺200μm。

[0069] 图1h显示了IL-12p40-/-小鼠比WT小鼠有较多的成骨表面(ALP染色)，n＝5每组。标尺100μm。

[0070] 图1i显示了IL-12p40-/-小鼠比WT小鼠有较少的破骨表面(TRAP染色)，n＝5每组。标尺100μm。

[0071] 图1j显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠血清中OCN浓度的差异，n＝5-8每组。

[0072] 图1k显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠血清中CTX-1浓度的差异，n＝5-8每组。

[0073] 图1l显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠新骨形成的差异(钙黄绿素双标法)，n＝5每组。标尺25μm。

[0074] 图2显示IL-12和IL-23间接抑制BMMSCs成骨分化，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0075] 图2a显示了裸鼠异位成骨检测新骨形成情况。β-磷酸三钙(β-TCP)复合BMMSCs,水凝胶缓释IL-12+IL-23或不加细胞因子(对照)。Con，对照；B，骨组织；CT，结缔组织。n＝5每组。标尺50μm。

[0076] 图2b显示了上述实验中植入物中一型胶原(Col1)的表达情况。n＝5每组。标尺20μm。

[0077] 图2c显示了不同浓度IL-12对BMMSCs成骨分化的影响。CM，普通培养基；OM，成骨诱导液。

[0078] 图2d显示了不同浓度IL-12对BMMSCs成骨标志基因表达的影响。

[0079] 图2e显示了不同浓度IL-23对BMMSCs成骨分化的影响。

[0080] 图2f显示了不同浓度IL-23对BMMSCs成骨标志基因表达的影响。

[0081] 图2g显示了IL-12(200ng/mL)和/或IL-23(200ng/mL)对BMMSCs成骨分化的影响。

[0082] 图2h显示了IL-12(200ng/mL)和/或IL-23(200ng/mL)对BMMSCs成骨标志基因表达的影响。

[0083] 图2i显示了IL-12+IL-23或水刺激CD4+T细胞后收集上清刺激BMMSCs成骨分化(茜素红染色及定量)。

[0084] 图3显示IL-12和IL-23上调IFN-γ和IL-17的表达，抑制BMMSCs成骨分化，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0085] 图3a显示了IL-12或IL-23刺激CD4+T细胞后IFN-γ和IL-17的表达。

[0086] 图3b显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠异位成骨后血清中IFN-γ和IL-17的浓度。

[0087] 图3c显示了不同浓度IL-17对BMMSCs成骨分化的影响。

[0088] 图3d显示了不同浓度IL-17对BMMSCs成骨标志基因表达的影响。

[0089] 图3e显示了不同浓度IFN-γ对BMMSCs成骨分化的影响。

[0090] 图3f显示了不同浓度IFN-γ对BMMSCs成骨标志基因表达的影响。

[0091] 图3g显示了不同浓度IL-17和IFN-γ对BMMSCs成骨分化的影响。

[0092] 图3h显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)对BMMSCs成骨分化的影响。

[0093] 图3i显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)对BMMSCs成骨关键分子表达的影响。

[0094] 图3j显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)对BMMSCs成骨标志基因表达的影响。

[0095] 图4显示IL-17协同促进IFN-γ诱导的BMMSCs凋亡，(b)**P<0.01,***P<0.001(versus IFN-γ/IL-17)；##P<0.01,###P<0.001(versus IFN-γ/IFN-γ+IL-17).(e，f)*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(versus IFN-γ/IFN-γ+IL-17)*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

[0096] 图4a显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后相应通路激活的情况。

[0097] 图4b显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后细胞的存活率。

[0098] 图4c显示了不同浓度IFN-γ(10-200ng/mL)和IL-17(200ng/mL)刺激BMMSCs后细胞的存活率。

[0099] 图4d显示了不同浓度IL-17(10-200ng/mL)和IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后细胞的存活率。

[0100] 图4e显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后Fas的表达情况。

[0101] 图4f显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后TRAIL的表达情况。

[0102] 图4g显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后caspase活化情况。

[0103] 图4h显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后细胞凋亡情况(TUNEL染色)。

[0104] 图4i显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后细胞凋亡比例。

[0105] 图4j显示了IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs后细胞凋亡情况(甲苯胺蓝染色)。

[0106] 图4k显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠异位成骨后局部活化的caspase 3表达，n＝4每组。标尺20μm。

[0107] 图4l显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠异位成骨后局部TUNEL的表达，n＝4每组。标尺20μm。

[0108] 图5显示抑制凋亡可以部分反转IL-17和IFN-γ抑制的成骨分化，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0109] 图5a显示了Fas的敲除效率。NC，阴性对照。

[0110] 图5b显示了TRAIL的敲除效率。

[0111] 图5c显示了BMMSCs敲低Fas或TRAIL后用IL-17(200ng/mL)和/或IFN-γ(200ng/mL)刺激，western检测caspase活化水平。

[0112] 图5d显示了IL-17(200ng/mL)和IFN-γ(200ng/mL)刺激敲低Fas或TRAIL的BMMSCs后细胞的存活率。

[0113] 图5e显示了IL-17(200ng/mL)和IFN-γ(200ng/mL)刺激敲低Fas或TRAIL的BMMSCs对其成骨分化的影响。

[0114] 图5f显示了IL-17(200ng/mL)和IFN-γ(200ng/mL)刺激抑制caspase凋亡通路的BMMSCs后细胞的存活率。

[0115] 图5g显示了IL-17(200ng/mL)和IFN-γ(200ng/mL)刺激抑制caspase凋亡通路的BMMSCs对其成骨分化的影响。

[0116] 图6显示敲除IL-12p40可以促进BMMSCs介导的骨形成，*P<0.05,**P<0.01。

[0117] 图6a显示了实验流程示意图。

[0118] 图6b显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠异位成骨后新骨形成情况。B，骨组织；CT，结缔组织。n＝5每组。标尺50μm。

[0119] 图6c显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠新骨形成的比例。n＝5每组。

[0120] 图6d显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠异位成骨局部Col1的表达水平。n＝5每组。标尺20μm。

[0121] 图6e显示了IL-12p40-/-小鼠和WT小鼠异位成骨局部Col1表达的定量。n＝5每组。

[0122] 图6f显示了IL-12和IL-23在骨折修复过程中的作用。当剧烈炎症反应存在时，免疫细胞被招募至损伤局部。这些细胞释放大量的IL-12和IL-23，进一步促进免疫细胞产生其他的促炎因子(例如IFN-γ和IL-17)。局部产生的IFN-γ和IL-17可以影响BMMSCs的功能，导致其凋亡。

[0123] 本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现IL-12和IL-23抑制剂可以非常有效的(i)治疗炎症性骨丢失；和/或(ii)促进骨形成。实验表明，IL-12和IL-23可以促进T细胞分化，增加IFN-γ和IL-17水平。IFN-γ可以使BMMSCs凋亡，IL-17协同促进IFN-γ的促凋亡作用。IL-17和IFN-γ刺激BMMSCs可以上调Fas和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的表达，从而激活caspase级联反应，促进凋亡。小鼠体内敲除IL-12p40可以促进体内异位成骨，IL-12p40是治疗炎症性骨丢失的有效治疗靶点。在此基础上完成本发明。

[0124] 术语

[0125] IL-12和IL-23

[0126] 白介素12(IL-12)和IL-23结构相似，都是由二硫键共价连接的异源二聚体分子。IL-12由p40和p35亚基组成，IL-23由p40和p19亚基组成，它们共享IL-12p40亚基。IL-12和IL-23是IL-12家族分子中的两个促炎因子，在适应性免疫中起重要作用。IL-12主要由树突细胞、巨噬细胞和B细胞分泌，通过与其受体结合可以激活自然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒活性，并且可以促进Th0细胞向Th1细胞分化，分泌γ干扰素(IFN-γ)，调节Th1/Th2细胞的平衡。IL-23于2000年被发现，主要由激活的树突细胞和巨噬细胞分泌。IL-23也通过与其受体结合发挥作用，而且IL-23可以诱导IL-23受体的表达，起正反馈作用。IL-23在Th17细胞分化发育过程中起重要作用，它可以稳定Th17细胞并促进IL-17的表达。炎症细胞分泌的IL-12和IL-23可以促进辅助性T细胞的分化成熟，产生更多的炎症细胞和因子，扩大炎症效应，而剧烈的炎症反应会导致骨修复延迟或失败。目前，IL-12和IL-23对BMMSCs成骨分化和体内骨形成的影响作用国内外均未见报道。因此，阐明IL-12家族促炎因子在骨修复过程中的来源以及调节作用非常重要。

[0127] 本发明首次发现：IL-12家族促炎因子，即IL-12和IL-23，在C57BL/6小鼠异位成骨的局部高表达，并且IL-12p40-/-小鼠(缺失IL-12和IL-23)与正常小鼠相比骨量增多、骨形成增加，这些均提示IL-12和IL-23可能与C57BL/6小鼠体内无法异位成骨有关。然而，裸鼠体内异位成骨同时缓释IL-12和IL-23并不能直接抑制体内骨形成。进一步研究发现，IL-12和IL-23通过CD4+T细胞间接抑制BMMSCs成骨分化。IL-12和IL-23可以促进T细胞分化，增加IFN-γ和IL-17水平。IFN-γ可以使BMMSCs凋亡，IL-17协同促进IFN-γ的促凋亡作用。IL-17和IFN-γ刺激BMMSCs可以上调Fas和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的表达，从而激活caspase级联反应，促进凋亡。小鼠体内敲除IL-12p40可以促进体内异位成骨。因此，IL-12p40是治疗炎症性骨丢失的有效治疗靶点。

[0128] IL-12和IL-23抑制剂

[0129] 如本文所用，术语“IL-12和IL-23抑制剂”、“抑制IL-12和IL-23的抑制剂”可互换使用，指能够同时抑制IL-12和IL-23的抑制剂，这样的抑制剂可以是IL-12抑制剂和IL-23抑制剂的混合物，也可以是能够同时抑制IL-12和IL-23的单一物质或制剂。一种优选的IL-12和IL-23抑制剂为p40亚基抑制剂。

[0130] IL-12和IL-23抑制剂：Apilimod，已有临床前研究报道apilimod可以成功抑制IL-12和IL-23的产生。此外，apilimod报道已应用于类风湿性关节炎II期临床试验。该化合物可以口服，是一种有前途的免疫疾病治疗药物。

[0131] IL-12p40中和抗体有：ustekinumab(CNTO-1275)、Briakinumab(ABT-874)[0132] IL-23p19中和抗体有：Tildrakizumab(MK-3222；SCH 900222)、Guselkumab(CNTO-1959)、BI-655066、AMG 139、MEDI-2070、LY3074828、LY2525623

[0133] 上述中和抗体在有些疾病治疗中已被批准，对于另一些免疫疾病的治疗还在临床试验中。

[0134] 组合物和施用方法

[0135] 本发明还提供了一种含有抑制IL-12和IL-23的抑制剂作为活性成分的用于(i)治疗炎症性骨丢失；和/或(ii)促进骨形成的制剂或组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。

[0136] 在本发明中，抑制IL-12和IL-23的抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，用于治疗炎症性骨丢失。在使用本发明抑制IL-12和IL-23的抑制剂时，还可同时使用其他治疗剂，如促进骨形成的药物等。

[0137] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抑制IL-12和IL-23的抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明抑制IL-12和IL-23的抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。

[0138] 对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：外用、口服、注射、雾化吸入等。

[0139] 使用药物组合物时，是将安全有效量的抑制IL-12和IL-23的抑制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

[0140] 本发明的主要优点包括：

[0141] (a)通过直接抑制上游IL-12和IL-23的产生可以抑制炎症性骨丢失和/或促进骨修复

[0142] (b)阐明了IL-12和IL-23在疾病中起重要作用，抑制其产生或功能可以有较好的治疗效果

[0143] (c)安全有效，方法简单，便于应用于临床

[0144] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0145] 材料与方法

[0146] 1、小鼠BMMSCs分离和体外扩增

[0147] 将8周的C57BL/6小鼠处死，分离股骨和胫骨，去除骨骺端将骨髓用注射器冲出，去除红细胞。密度梯度离心后取单个核细胞层种于培养皿中，37℃5％CO2培养3天后换液去除未贴壁的细胞。每三天换液直至细胞汇合至80％-90％后传代。形态均一后的BMMSCs用流式鉴定表面标记来确定其纯度(CD44、CD105、Sca-1为阳性，CD11b、CD11c、CD34、CD45为阴性)。

[0148] 2、C57BL/6小鼠体内异位成骨模型

[0149] 将3×106个BMMSCs种于45mgβ-TCP上植入C57BL/6小鼠背部皮下，在不同时间点(2天、4天、7天、14天和21天)将其取出。加入200μl组织裂解液研磨，12000rpm离心后取上清用于ELISA检测。

[0150] 3、micro-CT检测及骨形态计量学

[0151] 取8周年龄的C57BL/6小鼠或IL-12p40-/-小鼠股骨，去除肌肉后固定于4％多聚甲醛中。Scanco Medical CT-40检测松质骨骨小梁BMD、BV/TV、Tb.Th和Tb.Sp；皮质骨厚度。石蜡包埋切片后，H&E染色观察松质骨骨量；ALP染色检测成骨水平；TRAP染色检测破骨水平。

[0152] 4、血清OCN、CTX-1浓度检测

[0153] 8周大小的C57BL/6小鼠或IL-12p40-/-小鼠取外周血，分离血清。使用OCN及CTX-1ELISA试剂盒检测其血清浓度。

[0154] 5、钙黄绿素双标

[0155] 8周大小的C57BL/6和IL-12p40-/-小鼠在处死前10天和3天分别腹腔注射钙黄绿素(10μg/g)，处死后70％乙醇固定，LR White树脂包埋后荧光显微镜拍照。

[0156] 6、裸鼠体内异位成骨模型

[0157] 将3×106个BMMSCs种于45mgβ-TCP上植入裸鼠背部皮下，同时用水凝胶包裹200ng IL-12和200ng IL-23或对照(PBS)在体内缓释，8周后将其取出。4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片。H&E染色观察异位成骨骨量，Col1免疫组化检测胞外基质沉积情况。

[0158] 7、体外成骨分化实验

[0159] 将BMMSCs种于24孔板中，加入成骨诱导液(生长培养基+100nM地塞米松，50μM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠)诱导，同时加入不同浓度的IL-12(10-200ng/mL)或/和IL-23(10-200ng/mL)、IFN-γ(10-200ng/mL)或/和IL-17(10-200ng/mL)。7天后收RNA，Realtime PCR和Western Blot检测成骨标志基因，14天后茜素红染色检测胞外基质沉积情况。

[0160] 8、逆转录和Realtime PCR

[0161] 1)按照以下配方配制cDNA逆转录反应体系：

[0162]试剂 体积
RNA(1μg) X
dNTP 2
5x buffer 4
primer 0.5/0.5
DEPC水 总体积补足至20μl

[0163] 反应条件：42℃，1h—70℃，10min。

[0164] 2)RT产物稀释10倍后按以下反应条件做荧光定量PCR反应：

[0165]试剂 体积
SYBR Premix Ex Taq 5
正向引物 0.4
反向引物 0.4
RT产物 4
ROX 0.2

[0166] Real-time PCR程序：95℃，30s—95℃，5s；60℃，30s；72℃，30s(50cycles)—解离曲线—4℃。

[0167] 3)所用引物如下：

[0168] 碱性磷酸酶alkaline phosphatase(ALP)：

[0169] 5′-AGGGCAATGAGGTCACATCC-3′SEQ ID NO.:1和

[0170] 5′-GCAT CTCGTTATCCGAGTACCAG-3′SEQ ID NO.:2；

[0171] runt-相关转录因子runt-related transcription factor 2(Runx2)：

[0172] 5′-TGTTCTCTGATCGCCTCAGTG-3′SEQ ID NO.:3和

[0173] 5′-CCTGGGATCTGTAATCTGACTCT-3′SEQ ID NO.:4；

[0174] 成骨相关转录因子osterix(Osx)：

[0175] 5′-ATGGCGTCCTCTCTGCTTG-3′SEQ ID NO.:5和

[0176] 5′-TGAAAGGTCAGCGTATGGCTT-3′SEQ ID NO.:6；

[0177] 骨钙素osteocalcin(OCN)：

[0178] 5′-AAGCAGGAGGGCAATAAGGT-3′SEQ ID NO.:7和

[0179] 5′-TTTGTAGGCGGTCTTCAAGC-3′SEQ ID NO.:8；

[0180] I型胶原type I collagen(Col1)：

[0181] 5′-TGTGTGCGATGACGTGCAAT-3′SEQ ID NO.:9和

[0182] 5′-GGGTCCCTCGACTCCTACA-3′SEQ ID NO.:10；

[0183] Fas：

[0184] 5′-GCGGGTTCGTGAAACTGATAA-3′SEQ ID NO.:11和

[0185] 5′-GCAAAATGGGCCTCCTT GATA-3′SEQ ID NO.:12；

[0186] TRAIL：

[0187] 5′-ATGGTGATTTGCATAGTGCTCC-3′SEQ ID NO.:13和

[0188] 5′-GCAAGCAGGGTCTG TTCAAGA-3′SEQ ID NO.:14

[0189] β-actin：

[0190] 5′-ACTGGGACGACATGGAGAAG-3′SEQ ID NO.:15和

[0191] 5′-GGGGTGTTGAAGGTC TCAAA-3′SEQ ID NO.:16

[0192] 9、CD4+T细胞分离、刺激

[0193] 将C57BL/6小鼠处死取脾脏，研磨至组织发白后经70μm滤网过滤。去除红细胞后，用CD4+T细胞分选试剂盒进行磁珠分选。得到的CD4+T细胞放入培养板中，用anti-CD3和anti-CD28抗体处理后加IL-12或IL-23刺激，3天后收取上清，细胞收RNA。

[0194] 10、IL-12和IL-23刺激CD4+T细胞产生炎症因子检测

[0195] Realtime PCR检测上述收取的RNA中各T细胞衍生因子的表达情况。同时，ELISA芯片检测培养上清中各因子的表达情况。

[0196] 11、Western Blot

[0197] 1)样品制备：取30μg蛋白，加入5×loading buffer，混匀，95℃加热10min，将蛋白变性，二硫键打开；

[0198] 2)电泳：在电泳槽内加入电泳缓冲液，取蛋白marker 5μl及变性的蛋白，加入上样孔，80V电泳约30分钟，至溴酚兰进入分离胶，改为120V电压，电泳约1小时；

[0199] 3)转膜：小心取下SDS-PAGE凝胶，与PVDF膜，定性滤纸以及纤维垫放在电泳槽转膜缓冲液中，以夹三明治方式(由下至上依次是纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫)夹牢，彻底清除内部的气泡，放入装有转膜缓冲液的转移槽内，放入冰盒，以300mA恒流转膜1.5小时；

[0200] 4)封闭：将转有蛋白的PVDF膜取出，标记方向，浸入封闭液，摇床上室温孵育1小时以封闭非特异性蛋白结合位点；

[0201] 5)一抗：将PVDF膜依照相应蛋白的分子量剪开，一抗孵育，4℃过夜；

[0202] 6)洗膜：吸去一抗，用TBST于摇床上洗膜3次，每次5min；

[0203] 7)二抗：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温于摇床上孵育1小时；

[0204] 8)洗膜：吸去二抗，用TBST于摇床上洗膜3次，每次5min；

[0205] 9)显色和压片：将显色液1:1混合后，加到膜上，室温显色1-5分钟，用X-感光胶片压片适当时间，冲片。

[0206] 12、BMMSCs存活率检测

[0207] 将BMMSCs种于12孔板中，加入不同刺激反应后，使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。

[0208] 13、体外检测凋亡

[0209] 将BMMSCs种于12孔板中，加入200ng/mL IFN-γ或/和200ng/mL IL-17刺激，Western Blot检测caspase信号通路(cleaved caspase 8和cleaved caspase 3)、免疫荧光检测TUNEL表达以及甲苯胺蓝染色检测活细胞。同时，在不同刺激时间点(0h、24h、48h和72h)用Realtime PCR和Western Blot检测Fas/FasL、TRAIL/DR5的表达。

[0210] 14、体内检测凋亡

[0211] 将3×106个BMMSCs种于45mgβ-TCP上植入C57BL/6或IL-12p40-/-小鼠体内，7天后将植入物去除。4％多聚甲醛固定、包埋、切片，免疫组化检测cleaved caspase 8、cleaved caspase 3和TUNEL的表达水平。

[0212] 15、细胞转染

[0213] 将BMMSCs种于24孔板中，使用LipofectamineTM 2000转染siRNA。4小时后换液，第二天开始实验。成骨分化实验中，每三天转染一次siRNA。

[0214] 16、Caspase抑制剂处理

[0215] pan-caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)工作浓度为20μM，caspase 3抑制剂(Z-DEVD-FMK)工作浓度为20μM。细胞在加刺激前先用抑制剂处理细胞4小时。

[0216] 17、体内异位成骨及组织学分析

[0217] 将3×106个BMMSCs种于45mgβ-TCP上植入C57BL/6或IL-12p40-/-小鼠背部皮下。8周后将其取出。4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片。H&E染色观察异位成骨骨量，Col1免疫组化检测胞外基质沉积情况。

[0218] 实施例1

[0219] IL-12和IL-23影响BMMSC-成骨细胞分化，抑制体内骨形成

[0220] 为了找出影响骨修复中的炎症因子，利用C57BL/6小鼠异位成骨实验检测局部炎症因子的表达。发现IL-12家族促炎因子(IL-12和IL-23)在异位成骨模型中有表达，且IL-23在第7-21天表达较高(图1a)。为了研究他们的作用，利用IL-12p40-/-敲基因小鼠(敲除IL-12和IL-23)检测其骨量表型。不论从micro-CT结果还是HE染色都可以发现，IL-12p40-/-小鼠的骨量明显增加(图1b-g)。C57BL/6及IL-12p40-/-小鼠切片染色观察发现，敲除IL-
12p40基因以后小鼠成骨能力增强(ALP染色，图1h)，破骨能力减弱(TRAP染色，图1i)。同时，ELISA检测血清中OCN及CTX-1的表达也显示IL-12p40-/-小鼠成骨能力增强，破骨能力减弱(图1j，k)。最后，钙黄绿素双标实验同样显示敲除IL-12p40基因以后小鼠骨形成增加(图
1l)。所以，IL-12和IL-23抑制体内BMMSCs成骨分化及骨形成。

[0221] 实施例2

[0222] IL-12和IL-23通过CD4+T细胞间接抑制BMMSCs成骨分化

[0223] IL-12p40-/-小鼠骨量增加，因此猜测IL-12和IL-23可能直接抑制BMMSCs成骨分化。为了验证这一猜想，将β-TCP复合BMMSCs外加缓释IL-12和IL-23细胞因子植入裸鼠背部皮下观察体内成骨情况。然而，IL-12和IL-23并不能抑制裸鼠体内异位成骨(图2a)。Col1免疫组化也显示对照组和细胞因子刺激组并无差异(图2b)。体外BMMSCs成骨分化，外加不同浓度的IL-12或IL-23并不能抑制BMMSCs成骨分化(图2c-f)。同样地，IL-12和IL-23联合刺激BMMSCs也不能抑制其成骨分化(图2g，h)。所以，IL-12和IL-23并不是直接抑制BMMSCs成骨分化。

[0224] IL-12和IL-23并非直接抑制BMMSCs成骨分化，那它们是否通过间接作用来影响BMMSCs成骨分化？为了验证这一猜想，分选小鼠CD4+T细胞，并用IL-12和IL-23刺激。然后，收集培养上清，并刺激BMMSCs成骨分化。IL-12和IL-23刺激的CD4+T细胞培养上清可以抑制BMMSCs的成骨分化(图2i)。所以，IL-12和IL-23并不能直接影响BMMSCs成骨分化，但是它们可以通过调节CD4+T细胞来间接抑制BMMSCs成骨分化。

[0225] 实施例3

[0226] IL-12和IL-23上调IFN-γ和IL-17的表达，间接抑制BMMSCs成骨分化[0227] IL-12和IL-23刺激的CD4+T细胞培养上清可以抑制BMMSCs的成骨分化，所以猜测CD4+T细胞被刺激后产生了一些细胞因子抑制了BMMSCs分化。为了研究其中的作用机制，用IL-12或IL-23刺激CD4+T细胞，然后检测T细胞衍生因子的表达情况。在检测的所有T细胞衍生因子中，IL-12刺激后只有IFN-γ表达上调。同样地，IL-23刺激后只有IL-17表达上调(图3a)。因此，推测IL-12和IL-23抑制BMMSCs成骨分化是通过IFN-γ和IL-17介导的。异位成骨后，IL-12p40-/-小鼠与WT小鼠相比含有较低的血清IFN-γ和IL-17水平(图3b)。不同浓度的细胞因子(10-200ng/mL)加入体外成骨诱导分化体系来进一步评价IFN-γ和IL-17的作用。
茜素红染色发现高浓度的IL-17抑制成骨分化(图3c)，实时定量PCR(RT-PCR)检测成骨标志基因Osterix(Osx)，Osteocalcin(OCN)和一型胶原(Col 1)也验证了茜素红染色结果(图
3d)。进一步的，茜素红染色显示IFN-γ以剂量依赖的方式抑制成骨分化(图3e)。成骨标志基因Osx，OCN和Col1表达也显著减少(图3f)。IFN-γ和IL-17联合刺激可以比单一因子刺激产生更强的抑制作用，特别是在高浓度时(图3g，h)。因此，之后的实验中用200ng/mL IFN-γ和200ng/mL IL-17处理BMMSCs。IL-17可以轻微地抑制成骨分化，而IFN-γ强烈地抑制runt-related transcription factor 2(Runx2)，alkaline phosphatase(ALP)，Osx，OCN，Col1的表达。然而IL-17可以显著地增强IFN-γ的成骨抑制作用(图3i，j)。所以，这些结果表明IL-12和IL-23间接抑制BMMSCs成骨分化通过增加IFN-γ和IL-17的表达。

[0228] 实施例4

[0229] IL-17协同促进IFN-γ诱导的BMMSCs凋亡

[0230] IL-17可以增强IFN-γ的抑制成骨作用，猜测IL-17和IFN-γ起了一个叠加作用。为了验证猜测，检测了IFN-γ和IL-17相关的信号通路。发现IL-17激活NF-κB(p65)和MAPK(p38，JNK)信号通路，IFN-γ激活STAT1信号通路。但是，IFN-γ和IL-17联合刺激并没有增强上述通路，相反，和单独刺激相比，p65，p38和JNK信号通路在联合刺激时反而减弱了(图
4a)。所以，IFN-γ和IL-17的影响并不是简单地叠加作用，这促使发明人寻找其他的信号通路。

[0231] 当用IL-17或者IFN-γ刺激BMMSCs时，IL-17并不能促进BMMSCs死亡，但是IFN-γ可以以剂量依赖的方式诱导BMMSCs死亡。在IL-17的存在下，IFN-γ可以进一步诱导BMMSCs死亡(图4b)。为了确定IL-17对IFN-γ诱导BMMSCs死亡的作用，在IL-17(200ng/mL)刺激BMMSCs的同时加入不同剂量的IFN-γ(10-200ng/mL)。在IL-17存在的情况下，只要10ng/mL的IFN-γ就可以显著增强BMMSCs的死亡(图4c)。为了进一步确定IL-17协同IFN-γ诱导BMMSCs死亡，在IFN-γ(200ng/mL)刺激BMMSCs的同时加入不同剂量的IL-17(10-200ng/mL)。随着IL-17浓度的逐步提升，BMMSCs死亡率逐渐增大。当IL-17浓度达到200ng/mL时，BMMSCs死亡率达到最大(图4d)。这些结果表明IL-17可以协同促进IFN-γ诱导的BMMSCs死亡。

[0232] 下一步想要确定BMMSCs的死亡是否是凋亡，首先加IL-17和IFN-γ刺激BMMSCs，RT-PCR检测不同时间点凋亡信号通路分子及其受体Fas/Fas ligand(FasL)，tumor necrosis factorα(TNF-α)/tumor necrosis factor receptor 1(TNFR1)，tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)/death receptor 5(DR5)的表达。IL-17不会增加Fas和TRAIL的表达，IFN-γ刺激会增加TRAIL的表达。而IL-17和IFN-γ联合刺激会进一步增强BMMSCs中Fas和TRAIL的表达(图4e，f)。此外，western blot分析显示IL-17和IFN-γ联合刺激会增强caspase 8和caspase 3的活性(图4g)。TUNEL染色检测发现IL-17无促凋亡作用，IFN-γ可以诱导BMMSCs凋亡，而IL-17和IFN-γ联合刺激相比单独刺激会有一个较高的凋亡率和较低的生存率(图4h-j)。小鼠异位成骨组织切片免疫组化进一步确认了IL-12p40-/-小鼠植入物中cleaved caspase 3活性较弱(图4k)。与caspase 3染色一致，IL-12p40-/-小鼠植入物中TUNEL染色也显著减弱(图4l)，与体外结果一致。

[0233] 实施例5

[0234] 抑制凋亡通路的激活可以援救BMMSCs成骨分化

[0235] IL-17和IFN-γ可以促进BMMSCs凋亡，那抑制凋亡信号通路是否可以反转IL-17和IFN-γ的抑制成骨作用？为了回答这个问题，使用small interfering RNA(siRNA)和caspase抑制剂来抑制凋亡。Fas和TRAIL siRNA可以下调它们在BMMSCs中的表达(图5a，b)。敲低Fas或者TRAIL后可以阻止IL-17和IFN-γ引起的caspase 8和caspase 3活化(图5c)和BMMSCs凋亡(图5d)。因此，这些结果表明Fas和TRAIL信号通路对于IL-17和IFN-γ诱导的BMMSCs凋亡是至关重要的。同样地，减少Fas或者TRAIL表达可以反转IL-17和IFN-γ的成骨抑制作用(图5e)。进一步地，使用caspase 3抑制剂(Z-DEVD-FMK)或者pan-caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)也可以减少BMMSCs凋亡(图5f)。Z-DEVD-FMK或Z-VAD-FMK阻止caspase信号级联也可以反转IL-17和IFN-γ的成骨抑制作用(图5g)。

[0236] 实施例6

[0237] IL-12p40可以作为一个有效的治疗靶点，促进BMMSCs介导的骨形成[0238] 上述结果表明IL-12和IL-23通过上调IL-17和IFN-γ来抑制BMMSCs成骨分化。体内敲除IL-12p40(即敲除IL-12和IL-23)可以增加骨量。接下来的问题是敲除IL-12p40是否可以促进体内BMMSCs介导的骨形成。将3x106个BMMSCs和45mgβ-TCP复合后分别植入WT小鼠和IL-12p40-/-小鼠背部皮下。八周后将植入的材料和细胞复合物取出(图6a)。组织学分析发现在IL-12p40-/-小鼠中有更多的新骨形成(图6b，c)。免疫组化染色也发现IL-12p40-/-小鼠植入物中有较多的Col1表达阳性的细胞(图6d，e)。因此，这些结果表明IL-12和IL-23在体内BMMSCs介导的骨形成中起重要作用。这两个细胞因子可以延迟骨形成以及损害骨修复。但是，减少IL-12和IL-23可以促进体内骨形成。在正常生理状态下炎症起始骨折修复。在炎症阶段细菌和细胞碎片被清除。适当的炎症因子刺激MSC向成骨细胞分化。然而，当机体产生严重炎症反应时，大量的免疫细胞(残留的巨噬细胞，树突细胞，T细胞和B细胞)被招募至损伤组织。这些免疫细胞释放大量的促炎因子，例如，IL-12和IL-23。这些促炎因子诱导免疫细胞产生其他的炎症因子(例如，IL-17和IFN-γ)。BMMSCs迁移至损伤部位进行修复，局部产生的IL-17和IFN-γ可以影响BMMSCs的功能，并上调BMMSCs中Fas和TRAIL的表达。增加的Fas和TRAIL激活caspase级联，导致BMMSCs凋亡以及损害骨修复(图6f)。

[0239] 对比例

[0240] IL-12p35-/-小鼠成骨分化实验

[0241] 实验方法与实施例1相同，其区别仅在于利用IL-12p35-/-敲基因小鼠(敲除IL-12),检测其骨量表型。结果显示，IL-12p35-/-小鼠并没有明显增加，成骨能力没有增强，IL-
12p35-/-小鼠骨量与相同实验条件下的IL-12p40-/-小鼠相比较少。结果表明敲除IL-
12p35-/-基因以后小鼠骨形成没有增加，单纯的抑制IL-12不能促进体内BMMSCs成骨分化及骨形成。

[0242] 讨论

[0243] 骨折修复分为三个重叠的过程，即炎症期、修复期和重塑期。骨修复起始于炎症反应，早期炎症事件对于骨折修复的成功至关重要。但是，过度、持续的炎症反应会导致骨修复失败。但是免疫微环境和骨形成的关系却鲜有报道。发现在C57BL/6小鼠植入物周围存在IL-12和IL-23的表达，且IL-23在7-21天持续高表达。IL-12和IL-23共享IL-12p40亚基，为了研究IL-12和IL-23在炎症性骨疾病中的影响，利用IL-12p40-/-小鼠模型检测其骨量变化。IL-12p40-/-小鼠骨形成增加，骨量增多。这些结果表明IL-12和IL-23在体内骨形成中可能起重要作用。

[0244] 进一步的研究发现IL-12和IL-23并不能直接抑制裸鼠体内骨形成。裸鼠是T细胞+缺陷。T细胞，尤其是CD4 T细胞在骨再生和骨折修复中发挥重要作用。因此，猜测IL-12和IL-23对裸鼠异位成骨没有影响是因为裸鼠体内缺乏成熟的T细胞。为了证明这个猜想，分选CD4+T细胞，并用IL-12和IL-23刺激。IL-12和IL-23刺激的上清可以抑制BMMSCs成骨分化，表明IL-12和IL-23抑制BMMSCs成骨分化需要CD4+T细胞的参与。

[0245] 但是IL-12和IL-23调控CD4+T细胞抑制BMMSCs成骨分化的机制还不清楚。IL-12或IL-23刺激CD4+T细胞后检测T细胞衍生因子的表达情况，IL-12刺激后只上调IFN-γ的表达，同样地，IL-23刺激后只上调IL-17的表达。IFN-γ或IL-17处理后以剂量依赖效应抑制BMMSCs成骨分化。更重要的是，IL-17可以显著放大IFN-γ的抑制成骨作用。为了确定IL-17和IFN-γ是简单的叠加作用还是存在其它机制，检测了IL-17和IFN-γ相关的信号通路。结果显示IL-17和IFN-γ并不是简单地叠加作用，相反，联合刺激后IL-17相关的通路反而降低了。文献报道IFN-γ可以诱导细胞死亡，为了验证IFN-γ是否可以导致BMMSCs死亡，采用CCK-8检测细胞存活率。IFN-γ随着浓度增加显著促进BMMSCs死亡，IL-17的存在可以进一步促进IFN-γ诱导的死亡，表明IL-17可以协同促进IFN-γ诱导的死亡。IFN-γ可以增加Fas/FasL的表达，促进TRAIL诱导的凋亡。本发明的结果与文献报道的一致，IFN-γ诱导BMMSCs凋亡。IL-17可以协同增强IFN-γ诱导的BMMSCs凋亡，具体机制是联合刺激可以上调BMMSCs细胞中Fas和TRAIL的表达，从而激活caspase信号级联，导致细胞凋亡的发生。此外，阻止凋亡信号可以部分援救IFN-γ和IL-17抑制的成骨分化。

[0246] 最后，利用IL-12p40-/-小鼠确认IL-12p40能否作为炎症性骨失调疾病的治疗靶-/-点。IL-12p40 小鼠中异位成骨情况显著好于C57BL/6小鼠，表明IL-12p40在临床试验中是一个很有希望的治疗靶点。IL-12p40中和抗体已经在临床试验中使用，用于治疗多种免疫失调疾病，如类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎和克罗恩病。本研究中，发现IL-12p40是炎症性骨丢失疾病有效的治疗靶点，抑制IL-12p40对于骨再生可能是一个可行和有效的方法。希望IL-12p40可以成为检测骨修复成败的一个生物指标，以及促进BMMSCs介导的骨修复的治疗靶点。

[0247] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。