蛋白构象病包括一系列不相关的疾病，包括传染性海绵样脑病，这些疾病 是由于蛋白质(构象病蛋白质)的异常构象转变引起的，这样的转变又会造成 异常蛋白形式的自我结合，继而导致组织沉积和损伤。这些疾病还在临床表现 方面具有惊人的相似性，典型的是在不同长度的潜伏期后从诊断到死亡进展迅 速。
构象病中的一类被称为“朊病毒疾病”或“传染性海绵样脑病(TSEs)”。 在人类中，这些疾病包括：克雅病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合 症(GSS)、致命性家族性失眠症、和库鲁病(参见，例如，Harrison′s Principles of Internal Medicine，Isselbacher等编，McGraw-Hill，Inc.New York，(1994)；Medori 等(1992)N.Engl.J.Med.326：444-9.)。在动物中，TSE包括：羊瘙痒病、牛海 绵样脑病(BSE)、传染性貂脑病、和捕获性长耳鹿和麇鹿(captive mule deer and elk)的慢性消耗性疾病(Gajdusek，(1990)亚急性海绵样脑病：由非常规病毒 引发的传染性脑淀粉样变性病(亚急性海绵样脑病：由非传统病毒引起的传染 性脑淀粉样变性病)2289-2324页，Virology，Fields，编New York：Raven Press， Ltd.)。传染性海绵样脑病都具有相同的特征标志：存在朊病毒蛋白的异常(富 含β折叠，抗蛋白酶K)构象，在实验中把朊病毒蛋白接种到实验动物(包括， 灵长类动物、啮齿类动物、和转基因小鼠)可传染疾病。
最近，牛海绵样脑病的迅速传播以及其与人海绵样脑病发生增多的关联性 提高了人们对非人哺乳动物中传染性海绵样脑病检测的兴趣。这些疾病的意 外传染造成的悲剧性结果(参见，例如，Gajdusek，传染性淀粉样蛋白，和 Prusiner，Fields Virology中的朊病毒，Fields等编，Lippincott-Ravin，Pub. Philadelphia(1996)；Brown等(1992)Lancet，340：24-27)，去除污染的困难(Asher 等(1986)59-71页：实验室安全：原则和实践，Miller编Am.Soc.Microb.)，以及 最近有关牛海绵样脑病的担心(British Med.(1995)311：1415-1421)都让人们意 识到拥有能够识别患有传染性海绵样脑病的人和动物的诊断测验以及对感染 对象的治疗的紧迫性。
朊病毒是引发海绵样脑病(朊病毒病)的传染病原体。朊病毒与细菌、病毒 和类病毒有显著的差别。主要的假说是，不同于所有其它的传染性病原体，其 传染是由朊病毒蛋白的异常构象引起的，该异常构象作为模板而将正常的朊蛋 白构象转变成异常构象。在1980年代早期第一次鉴定了朊病毒蛋白(参见，例 如，Bolton，McKinley等(1982)Science 218：1309-1311；Prusiner，Bolton等(1982) Biochemistry 21：6942-6950；McKinley，Bolton等(1983)Cell 35：57-62)。此后克 隆了完整的编码朊病毒蛋白的基因，测序并在转基因动物中表达。参见，例如， Basler，Oesch等(1986)Cell 46：417-428。
朊病毒疾病的主要特征即是从正常的(细胞或非致病的)朊病毒蛋白(PrP) 形式形成异常形状的蛋白质(PrPSc)，这种蛋白也称为羊瘙痒病蛋白。参见，例 如，Zhang等(1997)Biochem.36(12)：3543-3553；Cohen & Prusiner(1998) AnnRev.Biochem.67：793-819；Pan等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90： 10962-10966；Safar等(1993)J Biol Chem 268：20276-20284。光谱学和结晶学研 究已经揭示，朊病毒的疾病相关形式基本上富含β-折叠结构，而与其比较，非 疾病形式的蛋白则主要是α-螺旋折叠。参见，例如，Wille等(2001)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 99：3563-3568；Peretz等(1997)J.Mol.Biol.273：614-622；Cohen & Prusiner，第5章：《朊病毒生物学和疾病》中的朊病毒蛋白的结构研究，S. Prusiner编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，191-228页)。随结构改变 而来的即是生化特性的变化：PrPC可溶解在非变性去污剂中，而PrPSc则不溶； PrPC可以容易地被蛋白酶消化，而PrPSc则具部分抗性，消化后形成N-末端截短 的片段，称为″PrPres″(Baldwin等(1995)；Cohen & Prusiner(1995))，″PrP 27-30″ (27-30 kDa)或″PK-抗性″(蛋白酶K抗性)形式。此外，PrPSc可以将PrPC转变成致 病构象。参见，例如，Kaneko等(1995)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 92：11160-11164； Caughey(2003)Br Med Bull.66：109-20。
已证明在活体对象和取自活体对象的样品中检测构象病蛋白的致病异型 是很困难的。因此，在对象死亡之前对这些传染性和含有淀粉样的病症进行确 定诊断和姑息疗法仍然是基本上未解决的一大挑战。组织病理学对脑的活组织 检查对于对象是很危险的，而根据活组织检查样品取出的位置，可能会遗漏病 灶和淀粉样沉积。然而，对动物、病人和保健工作者进行活组织检查仍然存在 危险。此外，通常直到动物进入食物供给才能获得动物的脑检测结果。而且， 对朊病毒肽产生的抗体同时识别变性的PrPSc和PrPC，但不能选择性地识别感染 性的(未变性的)PrPSc。(参见，例如，Matsunaga等(2001)《蛋白质》：结构， 功能和遗传学，44：110-118)。
因此，仍有需要开发检测各种样品中(例如，取自活体对象的样品中、血 液供给中、家畜中以及其它人和动物的食物供给中)致病朊病毒蛋白存在情况 的组合物和方法。此外，仍需要诊断和治疗朊病毒相关疾病的方法和组合物。
发明概述
本发明部分涉及与朊病毒蛋白发生反应的试剂。更具体地，本文所述的肽 试剂优先与朊病毒蛋白的致病异型发生反应。这些肽试剂可以用在很大范围的 应用中，包括作为分离样品中致病朊病毒或检测样品中致病朊病毒存在的工 具，作为治疗性或预防性组合物的组分和/或用来产生朊病毒特异性抗体。例如， 相比较于PrPC优先与PrPSc发生反应的肽试剂可以用于直接检测取自活体对象 的样品中的致病形式，例如，用于疾病诊断或用来筛选捐献的血液样品或筛选 用于器官捐赠的器官。
在更广的方面，本发明包括优先与构象病蛋白的致病形式发生反应的肽试 剂。在某些实施方式中，相比较于朊病毒蛋白的非致病形式，本文所述的肽试 剂优先与致病形式的朊病毒蛋白发生反应。本文所述的肽试剂可能部分或全部 为合成的，例如，可以包含以下一个或多个部分：环化残基或肽，肽的多聚体， 标签，和/或其它化学部分。合适的肽试剂的实例包括由SEQ ID NOs：12-132肽 衍生而来的肽，例如，SEQ ID NOs：66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119， 120，121，122，123，124，125，126，127，14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101， 109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82， 或84中描述的肽，及其类似物和衍生物。本文所述的肽试剂可以与任何构象病 蛋白发生相互作用，例如，朊病毒蛋白(例如，致病性蛋白PrPSc，和非致病性形 式的PrPC)。在某些实施方式中，相比较于PrPC，肽试剂优先与PrPSc发生相互作 用。肽试剂一般对来源于多个物种的PrPSc具有特异性，但是也可仅对来自单个 物种的PrPSc具特异性。
在另一个实施方式中，提供了由本文所述的任何序列表示的肽衍生而来的 肽试剂。在某些实施方式中，肽试剂来源于朊病毒蛋白的某些区域，例如，采 用对应于残基23-43或85-156的区域(例如，对应于SEQ ID NO：2所示的小鼠朊 病毒序列中编号为23-30，86-111，89-112，97-107，113-135，和136-156的区域)。 为了方便起见，上文列出的氨基酸残基号码对应于SEQ ID NO：2所示的小鼠朊 病毒蛋白序列；本领域普通技术人员可以根据本领域已知的序列和本文提供的 指导很容易地在其它物种的朊病毒蛋白中识别对应区域。作为示例的肽试剂包 括从以下序列号的肽衍生而来的试剂，SEQ ID NO：66，67，68，72，81，96，97， 98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，或127；或从以下序列号的肽衍 生而来的试剂，SEQ ID NO：14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110， 111，112，113，114，115，116，117，118，129，130，131，132或128；或从以下序列号的 肽衍生而来的试剂，SEQ ID NO：56，57，65，82，或84。
在另一方面，本发明包括含有本文所述的一种或多种肽试剂和朊病毒蛋白 的复合物。
在另一方面，提供了产生识别朊病毒蛋白的抗体的方法，该方法包括以下 步骤，即给对象(例如，动物)施用本文所述的任何一种肽试剂(或编码该 肽试剂的多核苷酸)。在某些实施方式中，该方法进一步包含从动物中分离抗 体的步骤。本发明的一个相关方面包括用该方法制备的抗体。优选的抗体对致 病形式具有特异性。
在还有一个方面，本发明包括含有本文所述任何抗体和朊病毒蛋白的复合 物。在某些实施方式中，朊病毒蛋白是非致病性的异型，而在其它一些实施方 式中，其为致病性的异型。
本文所述的任何肽试剂和/或抗体可以全部或部分由，一种或多种多核苷酸 编码，这些多核苷酸也是本发明的一部分。
在还有一个方面，提供了检测朊病毒蛋白存在的方法。检测方法可以有多 种用途，如，与诊断朊病毒相关疾病的方法联合使用(例如，在人或非人动物对 象中)，确保供血、血制品供给、或食物供给中基本不含PrPSc，分析用于移植的 器官和组织样品，监测手术工具和仪器的去污染情况，以及任何其它的知道致 病性朊病毒的存在与否至关重要的情形。
该检测方法依赖本发明的肽试剂与致病性朊病毒异型的优先相互作用。在 某些实施方式中，提供了检测生物样品中是否存在致病性朊病毒的方法。
在一个实施方式中，该方法包括将怀疑含有致病性朊病毒的样品与本文所 述的一种或多种肽试剂相接触，所处的条件允许肽试剂与致病性朊病毒(如果 有致病性朊病毒存在)发生相互作用；并通过其与肽试剂的结合情况检测样品 中致病性朊病毒的存在与否。肽试剂与致病性朊病毒的相互作用可以在溶液中 进行，或者可以在固相中或固相上提供一种或多种反应物。可以进行夹心试验， 其中将本发明的肽试剂可以用做捕获试剂、检测试剂或两者。本方面中，可以 将其它朊病毒结合试剂(例如，与变性的朊病毒蛋白结合的抗体或其它结合分 子)与本发明的肽试剂联合使用。
在该实施方式的一个方面，提供了在固相支持物上的一种或多种本发明的 肽试剂，并将其与怀疑含有致病性朊病毒的样品接触，所处的条件允许致病性 朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)与肽试剂的结合。可以将未结合的样品材 料(包括任何非致病性朊病毒)去除，并检测致病性朊病毒，可以在其仍与肽 试剂结合的情况下加以检测，也可以在其从肽试剂上解离后加以检测。可以使 用带有可检测标记的肽试剂(与用来“捕获”致病性朊病毒相同的肽试剂或本 发明的第二个肽试剂)或带有可检测标记的抗朊病毒抗体或其它朊病毒结合试 剂来检测致病性朊病毒。该抗体或朊病毒结合试剂无需对致病形式的朊病毒具 备特异性。
在该实施方式的另一方面，提供了在固相支持物上的朊病毒结合试剂，并 将其与怀疑含有致病性朊病毒的样品接触，所处的条件允许致病性朊病毒(如 果有致病性朊病毒存在)结合于朊病毒结合试剂。可以将未结合的样品材料去 除，并检测致病性朊病毒，可以在其仍与肽试剂结合的情况下加以检测，也可 以在其从肽试剂上解离后加以检测。可以使用一种或多种带有可检测标记的本 发明的肽试剂来检测致病性朊病毒。
在该实施方式的另一方面，可以将样品中的致病性朊病毒非特异地结合到 固相支持物上(例如，ELISA板)，并通过与本发明的一种或多种带有可检测标记 的肽试剂(优先与致病性朊病毒异型发生相互作用)的结合进行检测。
在另一个实施方式中，该方法包括将怀疑含有致病性朊病毒的样品与一种 或多种选自具有SEQID NO：12-132序列的肽及其类似物和衍生物的肽试剂相 接触，所处的条件允许肽试剂与致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)的 结合；并通过其与肽试剂的结合检测样品中致病性朊病毒的存在与否。在优选 的实施方式中，将样品与一种或多种选自下组的肽试剂相接触：具有SEQID NO： 66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127， 14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116， 117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82，或84序列的肽，及其类似物和衍 生物。
在其它实施方式中，提供了检测样品中致病性朊病毒的方法，该方法包括： 提供一个含有第一种肽的固相支持物，其中第一种肽包括本文所述的一种或多 种优先与PrPSc相互作用的肽试剂；将固相支持物与样品接触，所处的条件允许 致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)与第一种肽结合；将固相支持物与 带有可检测标记的第二种肽相接触，其中第二种肽包括本文所述的一种或多种 优先与PrPSc蛋白相互作用的肽试剂，所处的条件允许第二种肽与结合在第一种 肽上的致病性朊病毒相结合；并检测由第一种肽、样品中致病性朊病毒和第二 种肽形成的复合物，以此检测样品中致病性朊病毒的存在情况。
在其它实施方式中，本文提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方 法，该方法包括：提供一个含有朊病毒结合试剂的固相支持物，其中朊病毒结 合试剂与朊病毒蛋白相结合；将固相支持物与样品相接触，所处的条件允许在 样品中存在朊病毒蛋白的情况下，朊病毒蛋白与朊病毒结合试剂相结合；将固 相支持物与本发明的带有可检测标记的肽试剂相接触，其中的肽试剂优先与致 病性朊病毒蛋白相互作用；并检测由朊病毒结合试剂、样品中的致病性朊病毒 和肽试剂形成的复合物。
在另一个实施方式中，提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法， 该方法包括以下步骤：提供含有本文所述第一肽试剂的固相支持物，其中第一 肽试剂优先与致病形式发生相互作用；将固相支持物与带有可检测标记的第一 配体(例如，纤维蛋白溶酶原、层粘连蛋白受体和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)) 相接触，所处的条件允许带有可检测标记的肽试剂与配体形成复合物，其中第 一肽试剂与带有可检测标记的第一配体的结合亲和力弱于第一肽试剂与致病 性朊病毒的结合亲和力；将怀疑含有致病性朊病毒的样品与固相支持物相接 触，所处的条件允许在样品中存在致病性朊病毒的情况下，致病性朊病毒取代 第一配体而与第一肽试剂结合；并通过固相支持物上带有可检测标记的配体的 减少来检测样品中致病性朊病毒的存在情况。
以上任何检测致病性朊病毒的方法都可以用在朊病毒相关疾病的诊断方 法中。
本发明还提供了分离致病性朊病毒的方法，该方法包括：提供一个含有本 发明的一种或多种肽试剂的固相支持物，将固相支持物与已知或怀疑含有致病 性朊病毒的样品相接触，所处的条件允许致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒 存在)与肽试剂的结合；并去除任何未结合的样品材料。其它的实施方式进一 步包括以下步骤，即将结合的致病性朊病毒从肽试剂上解离下来，并任选地， 回收解离的致病性朊病毒。
本发明还提供了从样品中去除致病性朊病毒的方法，该方法包括：提供含 有本发明的一种或多种肽试剂的固相支持物，将固相支持物与已知或怀疑含有 致病性朊病毒的样品相接触，所处的条件允许致病性朊病毒(如果有致病性朊 病毒存在)与肽试剂的结合；并回收未结合的样品材料。
对于上述所有的提供含有本发明的一种或多种肽试剂的固相支持物的实 施方式，也考虑了可选择的实施方式，其中在肽试剂结合到固相支持物之前将 肽试剂与样品相接触。在这些实施方式中，肽试剂含有结合对中的一个，而固 相支持物则含有结合对中的另一个。例如，本发明的肽试剂可以含有或经修饰 含有生物素。将生物素化的肽试剂与怀疑含有致病性朊病毒的样品相接触，所 处的条件允许肽试剂结合到致病性朊病毒上。然后，将含有抗生物素蛋白或链 霉抗生物素蛋白的固相支持物与生物素化的肽试剂相接触。本文也描述了其它 合适的结合对。
在任何本文所述的使用固相支持物的方法中，固相支持物可以是，例如， 硝化纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化 珠、和/或磁感应珠、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯乳胶、聚碳酸酯、尼龙、葡 聚糖、几丁质、砂、硅石、浮石、琼脂糖、纤维素、玻璃、金属、聚丙烯酰胺、 硅、橡胶、多糖；重氮化纸；活化珠；磁感应珠，和任何常用于固相合成、亲 和分离、纯化、杂交反应、免疫试验和其它此类应用的材料。固相可以是颗粒 的，或者可以是连续的平面形式，包括，膜、网格、板、丸、片、盘、毛细管、 空心纤维、针、钉、小片、固体纤维、凝胶(例如硅胶)和珠，(例如，带孔 玻璃珠、硅胶、任选与二乙烯基苯相互交联的聚苯乙烯珠、移植的共聚珠，聚 丙烯酰胺珠，乳胶珠，任选与N-N′-二-丙烯酰乙二胺交联的二甲基聚丙烯酰胺 珠、氧化铁磁珠，和包被疏水聚合物的玻璃颗粒)。
此外，在本文所述的任何方法中，样品可以是生物样品，也就是从活体或 曾经存活的生物体中获得或衍生而来的，例如，器官、全血、血液部分、血液 组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、 骨髓、尿、泪液、非神经系统组织、器官、和/或活组织检查或尸体剖检。在优 选实施方式中，生物样品包括血液、血液部分或血液组分。样品可以是非生物 样品。
在另一方面，本发明提供了诊断对象中朊病毒相关疾病的方法，该方法用 任何本文所述的检测方法通过检测来自所述对象的生物样品中致病性朊病毒 的存在情况进行诊断。
在另一方面，本发明包括制备基本上不含有致病性朊病毒的血液供给的方 法，该方法包括以下步骤，即用任何本文所述的方法筛选从采集的血液样品中 得到的血液部分(例如，全血、血浆、血小板或血清)；弃取任何其中检测到 致病性朊病毒的样品；合并其中未检测到致病性朊病毒的样品，以提供基本上 不含有致病性朊病毒的血液供给。
在还有一个方面，本发明包括制备基本上不含有致病性朊病毒的食物供给 的方法，尤其是肉类供给(例如，给人或动物消耗的牛肉、羔羊肉、羊肉或猪 肉)的方法，该方法包括以下步骤，即用任何本文所述的检测方法筛选采集自 将要进入食物供给的活的或死的生物体的样品或采集自意图进入食物供给的 食物的样品，鉴定出其中检测到致病性朊病毒的样品；并从食物供给中去除任 何其中检测到致病性致病性朊病毒的活的或死的生物体或意图进入食物供给 的食物；以提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供给。
在另一方面，本发明提供了含有本文所述一种或多种肽试剂的固相支持 物。该固相支持物的用途有，如，用在本发明的检测样品中致病性朊病毒蛋白 的方法中，用于从样品中分离朊病毒蛋白，以及从样品中去除致病性朊病毒蛋 白。固相支持物可以如上文所述。
在另一方面，本发明提供了各种试剂盒用以检测样品中致病性朊病毒存在 情况，用于从样品中分离朊病毒蛋白，从样品中去除致病性朊病毒蛋白，该试 剂盒含有：本文所述的一种或多种肽试剂；和/或含有本文所述一种或多种肽试 剂的固相支持物以及其它所需试剂，以及任选地，阳性和阴性对照。肽试剂可 以带有可检测标记。
在其它方面，本文提供了含有本文所述的一种或多种肽试剂、多核苷酸和 /或抗体的组合物。
在其它方面，提供了治疗或预防朊病毒疾病的方法，例如，这些方法包括 给动物(例如，非人哺乳动物或人)施用本文所述的一种或多种组合物。在其 它实施方式中，这些方法包括：在引发步骤中施用含有本文所述任何组合物的 第一种组合物，并施用含有本文所述任何组合物的第二种组合物作为增强剂， 例如，其用量足以在对象中诱发免疫反应。可以用以下方式施用组合物：肌肉 内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服和/或静脉内。
阅读本文的揭示以后，本领域的技术人员很容易了解本发明的这些及其它 实施方式。
附图简要说明
图1描述了人朊病毒蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：1)和小鼠朊病毒蛋 白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图2描述了来自人(SEQ ID NO：3)，叙利亚仓鼠(仓鼠)(SEQ ID NO：4)， 牛(SEQID NO：5)，羊(SEQ ID NO：6)，小鼠(SEQ ID NO：7)，麇鹿(SEQ ID NO：8)，扁角鹿(扁角)(SEQ ID NO：9)，长耳鹿(长耳)(SEQID NO：10)， 和白尾鹿(白)(SEQ ID NO：11)的朊病毒蛋白的序列比对。来自麇鹿、扁角鹿、 长耳鹿、和白尾鹿的蛋白相互之间仅有2个残基的差异：S/N128和Q/E226(黑体 表示)。
图3，A-F栏描述了制备本文所述的任何肽试剂而进行的示例性拟肽取代。 每一栏中圈出了拟肽，并在本文所述的示例性肽试剂中加以表示(SEQ ID NO： 14，QWNKPSKPKTNG)，其中脯氨酸残基(SEQ ID NO：14的残基8)用N-取代甘 氨酸(拟肽)残基加以替换。栏A表示的肽试剂中脯氨酸残基由拟肽残基N-(S)- (1-苯乙基)甘氨酸所取代；栏B表示的肽试剂中脯氨酸残基由拟肽残基N-(4-羟苯 基)甘氨酸所取代；栏C表示的肽试剂中脯氨酸残基由拟肽残基N-(环丙基甲基) 甘氨酸所取代；栏D表示的肽试剂中脯氨酸残基由拟肽残基N-(异丙基)甘氨酸 所取代；栏E表示的肽试剂中脯氨酸残基由拟肽残基N-(3，5-二甲氧基苯基)甘 氨酸所取代；栏F表示的肽试剂中脯氨酸残基由拟肽残基N-丁基甘氨酸所取代。
图4描述实施例2中所述的Western印迹实验的结果。泳道1和2表示在正常 的小鼠脑匀浆中(泳道1，标记为″C″)和变性的感染小鼠的脑匀浆中(泳道2，标 记为“Sc”)存在朊病毒蛋白。泳道3，4和5表示如本文所述的肽试剂(SEQ ID NO：68)在人血浆存在时与致病形式朊病毒的特异性结合。具体地，泳道3是人 血浆对照，而泳道4是正常小鼠脑匀浆样品。泳道5表示肽试剂与感染的小鼠脑 匀浆样品中的PrPSc具有很强的结合。
图5描述了如本文所述示例性的PEG连接肽试剂的结构。
详细描述
本发明涉及以下惊人的意外发现，即可以使用相对小的肽(长度小于50至 100个氨基酸的肽，优选长度小于50个氨基酸的肽，更优选长度小于约30个氨 基酸的肽)来区分非致病性和致病性的朊病毒蛋白。因此，本发明公开涉及一 项惊人的发现，即这些肽及其衍生物(总称为″肽试剂″)，可以不同的特异性 和/或亲和性结合致病性和非致病性的蛋白质形式，因此可以用在或本身用作诊 断/检测试剂或作为治疗组合物的组分。在本发明公开之前，据信只有更大的分 子(例如，抗体、PrPC，α型的rPrP和纤维蛋白溶酶原)可以用来区分致病和 非致病的形式。如此，使用先前所述的抗原肽来产生抗体，并评估它们区分致 病和非致病形式的能力。然而，由于朊病毒蛋白的相对非免疫原性特性，已证 实很难产生对致病形式具特异性的抗体。参见，例如，R.A.Williamson等，《朊 病毒生物学及疾病》：“抗体作为探究朊病毒蛋白生物学的工具”，S.Prusiner 编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，717-741页。
如本文所述的某些肽优先与致病性(PrPSc)朊病毒蛋白相互作用，这一发现 就使发展出新型的诊断、检测试验和治疗等成为可能。因此，本发明涉及肽试 剂，以及涉及使用这些肽试剂的检测试验和诊断试验，使用这些肽试剂的纯化 或分离方法和含有这些肽试剂的治疗组合物。还提供了编码这些肽试剂的多核 苷酸，和使用这些肽试剂产生的抗体。本文所述的肽试剂、多核苷酸和/或抗体 可用在检测致病性朊病毒存在情况(例如，生物样品中)的组合物和方法中。 此外，本发明还涉及使用这些肽试剂、抗体和/或多核苷酸作为治疗性或预防性 组合物的组分的方法。
本发明使用的肽试剂(和编码这些肽试剂的多核苷酸)包括，相比较于非 致病性异型，优先与致病性异型相互作用的肽。例如，在某些实施方式中，如 本文所述的肽试剂特异地结合构象病蛋白的致病形式，而不与非致病形式相结 合(或结合程度较低)。本文所述的肽试剂(和编码所述肽试剂的多核苷酸) 可以用来，例如，产生抗体。这些抗体可以识别致病形式、非致病形式或两者。 这些分子可以单独使用，或以各种组合用在诊断试验和/或预防或治疗组合物 中。
本发明的实施采用，除非另外说明，本领域技术范围内传统的化学、生化、 分子生物学、免疫学和药学方法。这样的技术在文献中有详尽的解释。参见， 例如，雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(Easton， Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；酶学方法(S.Colowick和N. Kaplan编，Academic Press，Inc.)；和实验免疫学手册，卷I-IV(D.M.Weir和C. C.Blackwell，编，1986，Blackwell Scientific Publications)；Sambrook等，分子克 隆：实验手册(第二版，1989)；表面和胶体化学手册(Birdi，K.S.编，CRC Press， 1997)；分子生物学简要方案，第四版(Ausubel等编，1999，John Wiley & Sons)； 分子生物学技术：强化实验室课程，(Ream等编，1998，Academic Press)；PCR(生 物技术介绍系列)，第二版(Newton & Graham编，1997，Springer Verlag)；Peters和 Dalrymple，Fields Virology(第二版)，Fields等编，B.N.Raven Press，New York， NY。
可以理解的是本发明的肽试剂、抗体和方法不仅限于具体的配方或处理参 数，因为这些当然可以有所变动。同样可以理解的是本文使用的术语仅出于描 述本发明具体实施方式的目的，而不用以限制本发明。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请都全文引入本文作为参考。
I.定义
为了便于理解本发明，对本申请中选择使用的术语做以下描述。
术语″朊病毒″、″朊病毒蛋白″、″PrP蛋白″和″PrP″在本文中可以互换使用， 指的是蛋白质的致病形式(也称为羊瘙痒病蛋白、蛋白质致病形式、致病异型、 致病性朊病毒和PrPSc)和非致病形式(也称为细胞蛋白形式、细胞异型、非致病 异型、非致病性朊病毒蛋白、和PrPC)，以及变性形式和朊病毒蛋白的各种重组 形式，它们可以不含有致病构象或不含有正常的细胞构象。蛋白质的致病形式 与人和动物中的疾病状态(海绵样脑病)相关；非致病形式正常情况下存在于 动物细胞中，并可在合适的条件下转变为致病性的PrPSc构象。在很多哺乳动物 种类(包括人、羊、牛和小鼠)中天然产生朊病毒。人朊病毒蛋白的代表氨基 酸序列列于SEQ ID NO：1。小鼠朊病毒蛋白的代表氨基酸序列利于SEQ ID NO： 2。其它代表性的序列列于图2中。
如本文所述，术语″致病性″可以指蛋白质实际上引起疾病，或可以简单地 指蛋白质与疾病相关，并因此在疾病存在时存在。因此，与本发明公开关联使 用的致病性蛋白质不一定是某种疾病的特异性致病蛋白。致病形式可以是或可 以不是感染性的。术语“朊病毒的致病形式”更具体是指哺乳动物、禽或重组 朊病毒蛋白的构象和/或富含β折叠的构象。通常，富含β折叠的构象是具蛋白 酶K抗性的。用于指构象病蛋白质形式时，术语“非致病性”和“细胞的”可 以互换使用指其存在与疾病不相关的蛋白质的正常异型。
此外，本文使用的″朊病毒蛋白″或“构象病蛋白”不仅限于与本文所述多 肽具有完全相同序列的多肽。显而易见的是，该术语包括来自任何已识别或未 识别的物种或疾病(例如，阿尔兹海默氏病，帕金森，等等)的构象病蛋白质。 在阅读本发明的公开和技术之后，本领域的普通技术人员可以在任何其它朊病 毒蛋白中确定对应于图中所示序列的区域，使用例如，序列比对程序(例如， BLAST和其它本文所述程序)或结构特征或基序的识别和比对。
本文使用的术语″PrP基因″是用来描述任何表达朊病毒蛋白(包括已知的多 态性和致病性突变)的遗传物质。术语“PrP基因”通常是指任何物种中编码 PrP蛋白任何形式的任何基因。一些熟知的PrP序列描述于Gabriel等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89：9097-9101(1992)，和美国专利号5,565,186；5,763,740； 5,792,901；和WO97/04814中，引入本文作为参考以揭示和描述这些序列。PrP 基因可以来自任何动物(包括本文所述的“宿主”和“受试”动物)，及其任 何和全部的多态性和突变形式，可以理解的是这些术语包括其它这样的有待发 现的PrP基因。这样的基因表达的蛋白可以具备PrPC(非疾病)形式或PrPSc(疾病) 形式。
如本文使用的″朊病毒相关疾病″是指全部或部分由致病性朊病毒蛋白 (PrPSc)引起的疾病。朊病毒相关疾病包括，但不仅限于，羊瘙痒病、牛海绵样 脑病(BSE)、疯牛病、猫海绵样脑病、库鲁病、克-雅病(CJD)、克-雅病的新型 变异形式(nvCJD)、慢性消耗性疾病(CWD)、Gerstmann-Strassler-Scheinker病 (GSS)、和致命性家族性失眠症(FFI)。
本文使用的术语“肽试剂”是指任何含有天然存在的或合成的氨基酸或氨 基酸样分子聚合物的化合物，包括但不仅限于，仅含有氨基和/或亚氨基分子的 化合物。本发明的肽试剂优先与致病性朊病毒蛋白发生相互作用，它们通常来 源于朊病毒蛋白的片段。术语“肽”可以和“寡肽”或“多肽”互换使用，使 用这些术语时并不特指具体的大小。定义中还包括，例如，含有一个或多个氨 基酸类似物的肽(包括，例如，非天然氨基酸、拟肽，等等)，具有取代连接 (substituted linkage)的肽，以及其它本领域已知的修饰，天然存在的和非天 然存在的(例如，合成的)。因此，合成的肽、二聚体、多聚体(例如，串联 重复、多抗原肽(MAP)形式、线性连接肽)、环化的、分支分子，等等，都包 括在此定义内。该术语还包括含有一种或多种N-取代甘氨酸残基(“拟肽”) 和其它合成氨基酸或肽的分子。(关于拟肽的描述，参见，例如，美国专利号 5,831,005；5,877,278；和5,977,301；Nguyen等(2000)Chem Biol.7(7)：463-473； 和Simon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(20)：9367-9371)。适用于本发明 的肽的非限制性长度包括长度为3至5个残基的肽，长度为6至10个残基(或其间 任何整数)的肽，长度为11至20个残基(或其间任何整数)的肽，长度为21至75个 残基(或其间任何整数)的肽，长度为75至100个残基(或其间任何整数)的肽，或 长度超过100个残基的多肽。通常，适用于本发明的肽对于其目标应用可具有 一个合适的最大长度。优选地，肽的长度在3至100个残基之间。通常，本领域 的技术人员可以根据本文的指导容易地选择最大长度。此外，如本文所述的肽 试剂，例如合成肽，可以包括其它分子，如标记、接头、或其它化学部分(例如， 生物素、淀粉样蛋白特异性染料如控制红(Control Red)或硫磺素)。这些部分 可以进一步加强肽与朊病毒蛋白的相互作用和/或进一步检测朊病毒蛋白。
肽试剂还包括本发明氨基酸序列的衍生物，其含有一个或多个取代、插入 和/或缺失，包括一个或多个非天然存在的氨基酸。优选地，衍生物与任何野生 型或参考序列至少显示出约50％的同一性，优选地与本文所述的任何野生型或 参考序列至少具有约70％的同一性，更优选地至少约75％，80％，85％，90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。可以用下文所 述方法确定序列(或百分)同一性。这些衍生物可以包括多肽的表达后修饰， 例如，糖基化、乙酰化、磷酸化，等等。
肽衍生物也可以包括对天然序列的修饰，如缺失、插入和取代(通常在自 然界是保守的)，只要多肽仍旧保持所需的活性。这些修饰可以是有意的，如 通过定点诱变，或者可以是偶然发生的，如通过产生某蛋白质的宿主的突变或 由于PCR扩增引发的错误。此外，可以产生具备以下的一种或多种效果的修饰： 降低毒性；提高对朊病毒蛋白的亲和性和/或特异性；有利于细胞处理(例如， 分泌、抗原呈递，等等)；以及有利于呈递给B细胞和/或T细胞。本文所述的 多肽可以用重组的方法制备、合成、从天然来源中纯化、或在组织培养中制备。
如本文使用的“片段”是指仅由天然存在的完整全长蛋白质和结构的一部 分组成的肽。例如，包含蛋白质C末端缺失和/或N-末端缺失的片段。通常，片 段保留了其来源全长多肽序列的一种、部分或全部功能。通常，片段含有天然 蛋白质中至少5个连续的氨基酸残基；优选地，天然蛋白质中至少约8个连续的 氨基酸残基；更优选地，至少约10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，或30个连续的氨基酸残基。
如本领域已知的，术语“多核苷酸”通常是指核酸分子。“多核苷酸”可 以包括双链和单链序列，是指，但不仅限于，原核序列，真核mRNA，来源于病 毒、原核或真核mRNA的cDNA，来源于病毒(例如RNA和DNA病毒和逆转录 病毒)、原核DNA或真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组RNA和DNA序列， 特别是合成的DNA序列。该术语还包括含有任何DNA和RNA的已知碱基类似物 的序列，也包括对天然序列进行的修饰，如缺失、插入和取代(在自然界中通 常保守)。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是偶然产生的， 如通过宿主的突变，包括编码朊病毒的多核苷酸。多核苷酸的修饰可以具有任 何几项功能，包括，例如，利于多肽产物在宿主细胞中的表达。
多核苷酸可以编码生物活性(例如，免疫原性或治疗性的)蛋白质或多肽。 根据由多核苷酸编码的多肽的性质，多肽可以含有少至10个核苷酸，例如，当 多核苷酸编码抗原或表位时。通常，多核苷酸编码的肽至少具有18，19，20，21， 22，23，24，25，30或者更多个氨基酸。
“多核苷酸编码序列”或“编码”所选多肽的序列，是指当置于合适的 调控序列(或“控制元件”)的控制下时，在体内转录成(DNA的情况下)和 翻译成(mRNA的情况下)多肽的核酸分子。编码序列的边界由位于5′(氨基) 末端的起始密码子和位于3′(羧基)末端的翻译终止密码子所确定。转录终止序 列可以位于编码序列的3′端。典型的“控制元件”，包括，但不仅限于，转录 调控子，如启动子、转录增强子、转录终止信号、和多聚腺苷酸序列；而翻译 调控子，如翻译起始的优化序列，例如，Shine-Dalgarno(核糖体结合位点)序列， Kozak序列(也就是，翻译的优化序列，位于，例如，编码序列的5′位置)，前导序 列(异源或天然的)，翻译起始密码子(例如，ATG)，和翻译终止序列。启动子可 以包括可诱导启动子(与启动子可操作性连接的多核苷酸序列的表达是由分析 物、辅助因子、调控蛋白等所诱导的)，可抑制启动子(与启动子可操作性连 接的多核苷酸序列的表达是由分析物、辅助因子、调控蛋白等所诱导的)和组 成型启动子。
“可操作性连接”是指元件的排列顺序，其中所述组分的配置能够使其 发挥它们通常具有的功能。因此，与编码序列可操作连接的给定启动子能够在 有合适的酶存在的情况下实现编码序列的表达。启动子不需要与编码序列毗 邻，只要它能发挥指导表达的功能即可。因此，例如，在启动子和编码序列间 可插入非翻译然而转录的序列，而该启动子仍可以认为与编码序列“可操作性 连接”。
本文用以描述核酸分子的“重组”核酸分子是指根据其来源或操作属于半 合成或合成来源的基因组多核苷酸、cDNA多核苷酸：(1)不与其天然连接的多 核苷酸的全部或部分相连的多核苷酸；和/或(2)与其天然连接的多核苷酸以外 的多核苷酸相连的多核苷酸。本文使用的用以指蛋白质或多肽的术语“重组” 是指由重组多核苷酸表达产生的多肽。“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细 胞”、“细胞系”“细胞培养物”和其它此类术语表示以单细胞实体培养的原 核微生物或真核细胞系，它们可以互换使用，指的是可以用作或已经用作重组 载体或其它转移DNA的受体的细胞，包括已转染的原始细胞的后代。可以理解 的是，由于偶然地或有意地突变，单一亲代细胞的后代可以不一定与原始亲代 在形态学或基因组或总DNA上完全相同。通过相关特性，如编码所需肽的核苷 酸序列的存在情况，所表征的与亲代足够相似的亲代细胞的后代包括在本定义 的后代中，并被上述术语所涵盖。
在指多核苷酸或多肽时，“分离的”是指所述分子是单独的、与完整的生 物体分离，该分子天然存在于此生物体中，或者当该多核苷酸或多肽天然不存 在时，基本上不含有其它生物大分子，而使该多核苷酸或多肽可以用于其设想 的目的。
如本领域已知，“抗体”包括一种或多种通过化学或物理方法可以结合到 或缔合目的多肽表位的生物部分。例如，本发明的抗体可以与朊病毒的致病构 象优先发生相互作用(例如，特异地结合)。术语“抗体”包括从多克隆和单 克隆方法制备的抗体，以及以下抗体：杂交(嵌合)抗体分子(参见，例如， Winter等(1991)Nature 349：293-299；和美国专利号4,816,567；F(ab′)2和F(ab) 片段；Fv分子(非共价结合的异二聚体，参见，例如，Inbar等(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69：2659-2662；和Ehrlich等(1980)Biochem19：4091-4096)；单链Fv 分子(sFv)(参见，例如，Huston等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5897-5883)；二聚体和三聚体的抗体片段构建物；小型抗体(minibodies) (参见，例如，Pack等(1992)Biochem 31：1579-1584；Cumber等(1992)J Immunology 149B：120-126)；人化抗体分子(参见，例如，Riechmann等(1988) Nature 332：323-327；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534-1536；和英国专利 出版号GB 2,276,169，出版于1994年9月21日)；以及来自这些分子的任何功能 性片段，其中这些片段保留了亲代抗体分子的免疫结合特性。术语“抗体”还 包括通过非传统的步骤，如噬菌体展示，获得的抗体。
如本文使用，术语“单克隆抗体”是指具有均质抗体群体的抗体组合物。 该术语不局限抗体的种类或来源，也不在其制备方法上受到限制。因此，该术 语包括来自鼠杂交瘤的抗体，以及使用人而不是鼠杂交瘤获得的人单克隆抗 体。参见，例如，Cote等，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，1985，77页。
如果希望使用多克隆抗体，通常用免疫原性的组合物(例如，如本文所述 的肽试剂)免疫选择的哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马，等等)。收集 免疫动物的血清，再根据已知程序进行处理。如果含有抗所选择肽试剂的多克 隆抗体的血清还含有其它抗原的抗体，则可以用免疫亲和层析纯化该多克隆抗 体。生产和处理多克隆抗血清的技术是本领域已知的，参见例如，Mayer和 Walker编，(1987)《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Academic Press， London)。
本领域技术人员也可以很容易制备抗本文所述肽试剂的单克隆抗体。用杂 交瘤制备单克隆抗体的常用方法是熟知的。可以用细胞融合方法生产永生的抗 体生产细胞系，也可以用其它技术来生产，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞， 或用EB(Epstein-Barr)病毒进行转染。参见，例如，M.Schreier等(1980)《杂交 瘤技术》；Hammerling等(1981)，《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》；Kennett等(1980) 《单克隆抗体》；以及参见，美国专利号4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444, 887；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。
如本文使用，“单结构域抗体”(dAb)是由一个VH结构域构成的抗体，其 与指定的抗原特异结合。dAb不含有VL结构域，但是可以含有其它的已知存在 于抗体中的抗原结合结构域，例如，κ和λ结构域。制备dab的方法是本领域已 知的。参见，例如，Ward等，Nature 341：544(1989)。
抗体也可以由VH和VL结构域组成，以及其它已知的抗原结合结构域。这 些类型抗体的实例以及它们的制备方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利 号4,816,467，引入本文作为参考)，包括以下这些。例如，“脊椎动物抗体” 是指四聚体的抗体或其聚集体，包含通常以″Y″构型聚集的轻链和重链，其在 链之间可以有或没有共价连接。在脊椎动物抗体中，链的氨基酸序列与脊椎动 物体产生(原位或体外(例如，在杂交瘤中))的抗体序列同源。脊椎动物抗 体包括，例如，纯化的多克隆抗体和单克隆抗体，它们的制备方法描述于下文 中。
“杂交抗体”中的链分别与哺乳动物抗体链同源，并代表它们的新型装 配，这样两种不同的抗原可由四聚体或聚集体沉淀下来。在杂交抗体中，一对 重链和轻链与对第一种抗原产生的抗体中的链同源，而第二对链则与对第二种 抗原产生的抗体中的链同源。这样就得到“二价”特性，也就是，与两种抗原 同时结合的能力。也可以使用嵌合链形成这样的杂交抗体，如下文所述。
“嵌合抗体”是指其中的重链和/或轻链是融合蛋白的抗体。通常，链的 氨基酸序列的一部分与来源于某一特定物种或特定纲的抗体的对应序列同源， 而链的其余部分则与来源于另一物种和/或另一纲的序列同源。通常，轻链和重 链的可变区拟似来源于一种脊椎动物的抗体可变区或抗体，而其恒定区则与来 源于另一种脊椎动物的抗体中的序列同源。然而，该定义并不局限于此特定实 例。还包括重链或轻链之一或两者由拟似不同来源抗体中序列的序列组合而组 成的任何抗体，不论这样的来源是不同的纲或是不同的种，也不管融合点是否 位于可变区/恒定区的交界处。因此，产生的抗体可以是其恒定区或可变区均不 与已知抗体序列拟似的抗体。这样，可以，例如构建其可变区对特定抗原具有 更高特异亲和性的抗体，或其恒定区可以引发增强的补体结合，或在特定恒定 区具有的特性上进行其它改进。
另一实例是“变化的抗体”，是指脊椎动物抗体中天然存在的氨基酸序列 已经发生改变。利用重组DNA技术，可以重新设计抗体以获得所需的特性。可 能的变化有很多，从改变一个或多个氨基酸到完全重新设计一个区域，例如， 恒定区。通常，恒定区中的变化可以获得所需的细胞处理特性，例如，补体结 合的改变，与膜相互作用的改变，及其它效应子功能的改变。可以对可变区进 行变化来改变抗原结合特性。也可以设计抗体以辅助将分子或物质递送到特定 的细胞或组织区域。可以用分子生物学已知的技术进行所需的改变，例如，重 组技术，定点诱变，等等。
还有另一个实例是“单价抗体”，它是由重链/轻链二聚体结合到第二条重 链的Fc(也就是，茎部)区域而形成的聚集体。此类抗体逃过抗原调节。参见， 例如，Glennie等，Nature 295：712(1982)。包含在此定义内的抗体还有抗体的 ″Fab″片段。″Fab″区域是指重链和轻链中与包含重链和轻链分支部分序列近似 等同或类似的部分，并且已经显示该区域对特定的抗原表现出免疫结合，但其 缺乏效应器Fc部分。″Fab″包括一条重链和一条轻链的聚集体(常称为Fab′)， 以及含有2H和2L链的四聚体(称为F(ab)2)，其能够与指定的抗原或抗原家族选 择性地发生反应。Fab抗体可以与如上所述类似地分为几个亚组，也就是“脊 椎动物Fab”、“杂交Fab”、“嵌合Fab”、和“变化的Fab”。生产抗体Fab 片段的方法是本领域已知的，包括，例如，蛋白水解和用重组技术合成。
″抗原-抗体复合物″是指由特异结合到抗原上某一表位的抗体形成的复合 物。
如果肽(或肽试剂)与另一肽或蛋白质特异地、非特异地或以特异和非特 异的某种组合形式相结合，则说该肽(或肽试剂)与另一肽或蛋白质发生“相 互作用”。如果肽(或肽试剂)与朊病毒蛋白的致病形式结合的亲和性和/或特 异性比其与非致病异型结合的亲和性和/或特异性高，则说肽(或肽试剂)“优 先与致病性朊病毒蛋白相互作用”。优先与致病性朊病毒蛋白发生相互作用的 肽试剂也在本文中称作致病性朊病毒特异性的肽试剂。可以理解的是，优先的 相互作用不一定需要有各肽中特定氨基酸残基和/或基序之间的相互作用。例 如，在某些实施方式中，本文所述的肽试剂优先与致病异型发生相互作用，但 是它可能能够与非致病异型以较弱的，却可以检测的水平(例如，对感兴趣的多 肽显示出10％或更低的结合)相结合。通常，与感兴趣的化合物或多肽之间的较 弱的结合，或背景结合，可以很容易地与优先相互作用区分开来，例如，使用 合适的对照。通常，在存在106倍过量的非致病形式的情况下，本发明的肽仍与 致病性朊病毒相结合。
术语“亲和性”是指结合的强度，可以定量地表示为解离常数(Kd)。优选 地，优先与致病异型相互作用的肽(或肽试剂)其与致病异型的相互作用亲和 性比其与非致病异型的相互作用亲和性优选地至少高2倍，更优选地，至少高 10倍，更优选地，至少高100倍。可以使用标准技术确定结合亲和性(也就是， Kd)。
确定氨基酸序列“相似性”或“百分同一性”的技术是本领域所熟知的。 通常，“相似性”是指两个或更多多肽在合适的位置进行的氨基酸对氨基酸的 比对，其中氨基酸是相同的或具有相似的化学和/或物理特性，如电荷或疏水性。 然后，就可以在比较的多肽序列之间确定所定义的术语“百分同一性”。确定 核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域所熟知的，包括确定基因mRNA的核 苷酸序列的技术(通常通过cDNA中间物)并确定其编码的氨基酸序列，再将 其与第二个氨基酸序列加以比较。通常，“同一性”是指两个多核苷酸或多肽 序列的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸完全相同。
可以通过确定它们的“百分同一性”来比较两个或多个氨基酸或多核苷酸 序列。可以对两个分子(一个参考序列及一个与参考序列的％同一性未知的序 列)之间的序列信息直接进行比较来确定“百分同一性”：比对序列，对两个 比对序列之间完全相同的数目进行计数，除以参考序列的长度，并将所得结果 乘以100。可以使用很方便获得的计算机程序来辅助分析，如ALIGN，Dayhoff，M. O.，蛋白序列和结构图册，M.O.Dayhoff编，5增刊3：353-358，国家生物医 药研究基金会，Washington，DC，其采用的是Smith和Waterman的局部同一性算 法，Advances in Appl.Math.2：482-489，1981用于肽分析。确定核苷酸序列同 一性的程序可以获自Wisconsin序列分析包，第8版(可购自Genetics Computer Group，Madison，WI)例如，BESTFIT，FASTA和GAP程序，其也依赖于Smith和 Waterman的算法。可以采用生产商推荐的以及上述Wisconsin序列分析包中描述 的缺省参数很容易地运用这些程序。例如，可以使用Smith和Waterman的同源 性算法来确定特定核苷酸序列对参考序列的百分同一性，使用缺省评分表和6 个核苷酸位置的间隙罚分。
在本发明背景下的确定百分同一性的另一种方法是使用MPSRCHTM程序 包，爱丁堡大学版权所有，开发者为John F.Collins和Shane S.Sturrok，可获自 多个来源，例如在因特网上。从这组程序包中，可以采用Smith-Waterman算法， 其中将缺省参数用于评分表(例如，间隙开放罚分12，间隙延伸罚分1，间隙6)。 从数据产生的“配对”值反映出“序列同一性”。用于计算序列之间百分同一 性或相似性的其它合适程序是本领域所熟知的，例如，另一个比对程序是 BLAST，采用缺省参数。例如，可以使用下列缺省参数来运用BLASTN和 BLASTP：遗传密码＝标准；滤过＝没有；链＝两者；截断值＝60；期望＝10；Matrix ＝BLOSUM62；Descriptions＝50个序列；选择＝高分；数据库＝非冗余，GenBank +EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。很 容易获得这些程序的细节。
如本文使用的“免疫原性组合物”是指将其施用给对象时，能够在对象体 内产生体液和/或细胞免疫反应的任何组合物(例如，肽、抗体和/或多核苷酸)。 可以将免疫原性组合物直接导入接受对象中，如通过注射，吸入，口服或鼻内 或其它任何胃肠道外或粘膜施用途径(例如，直肠内或阴道内)。
“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞对其产生应答的抗原上的区域，这 使该分子(包括该表位)能够引发免疫原性反应或能够与存在于生物样品中的 抗体发生反应。该术语也可以和“抗原决定簇”或“抗原决定区”互换使用。 表位可以包含3个或更多氨基酸，其具有表位独特的空间构象。通常，表位至 少含有5个这样的氨基酸，更通常，含有至少8-10个这样的氨基酸。确定氨基酸 空间构象的方法是本领域已知的，包括，例如，x射线晶体学和2-维核磁共振。 此外，使用本领域熟知的技术很容易可以在给定的蛋白质中确定表位，如使用 疏水性研究和通过定点血清学。也可参见，Geysen等，Proc.Natl.Acad Sci.USA (1984)81：3998-4002(快速合成肽以在给定的抗原中确定免疫原性表位位置的 常用方法)；美国专利号4,708,871(识别和化学合成抗原表位的方法)；以及 Geysen等，Molecular Immunoogy(分子免疫学)(1986)23：709-715(识别对给定 抗体具有高亲和性的肽的技术)。可以在简单的免疫测定中(显示出一种抗体具 有阻碍另一种抗体与靶抗原结合的能力)鉴定出识别相同表位的抗体。
如本文使用的“免疫应答”是指在对象中对如本文所述的肽(当多肽存在 于疫苗组合物中)产生体液和/或细胞免疫应答。这些抗体也可以中和感染性， 和/或介导抗体-补体或抗体依赖细胞毒性，以给经过免疫的宿主提供保护。可 以在标准的免疫测定中确定免疫反应性，如本领域所熟知的竞争测验。
“基因转移”或“基因递送”是指可靠地将感兴趣的DNA插入到宿主细 胞中的方法或系统。这样的方法可以使非整合的转移的DNA瞬时表达，进行染 色体外复制和转移的复制子(例如，游离体)表达，或将转移的遗传物质整合 到宿主细胞的基因组DNA中。基因递送表达载体包括，但不仅限于，来源于甲 病毒、痘病毒和牛痘病毒的载体。用于免疫时，这样的基因递送表达载体可以 指疫苗或疫苗载体。
术语“样品”包括生物和非生物样品。生物样品是那些从活的或曾经存活 的生物体中获得或来源的样品。非生物样品不来源于活的或曾经存活的生物 体。生物样品包括，但不仅限于，来自动物(活的或死的)的样品，如器官(例 如，脑、肝、肾，等等)，全血，血液部分，血浆，脑脊液(CSF)，尿，泪液，组 织，器官，活组织检查。非生物样品的实例包括药物、食物、化妆品，等等。
术语“标记”和“可检测标记”是指能够检测的分子，包括，但不仅限于， 放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、酶、酶的底物、酶的辅因子、酶的 抑制剂、发色团，染料、金属离子、金属盐、配体(例如，生物素或半抗原) 等等。术语“荧光物质”是指一种物质或其部分能够在可检测的范围内显示荧 光。可以和本发明一起使用的标记的特定实例包括，但不仅限于，荧光素、罗 丹明、二甲氨基萘磺酰、伞形花内酯、得克萨斯红(Texas red)、鲁米诺、acradimum 酯、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶 和脲酶。标记也可以是表位标签(例如，His-His标签)，抗体或可扩增或者可检测 的寡核苷酸。
II.综述
本文所述的是含有肽试剂(和/或编码这些肽试剂的多核苷酸)的组合物， 其中肽试剂能够区分朊病毒蛋白的致病和非致病异型，例如，通过优先与其中 的一种形式发生相互作用而不优先与另一种形式发生相互作用。也提供了使用 这些肽试剂产生的抗体，以及含有这些肽试剂和/或抗体的组合物和制备及使用 这些肽试剂和/或抗体的方法(例如，用于分离和/或检测致病性朊病毒蛋白)。
本发明部分有赖于本发明者做出的以下发现，即相对小片段的朊病毒蛋白 可以优先与朊病毒的致病形式相互作用。这些片段不需要是更大的蛋白质结构 或其它类型支架分子的一部分即可表现出与朊病毒致病异型的优先相互作用。 尽管不希望受任何特殊理论的约束，然而这些肽片段似乎同时具有允许其与朊 病毒致病异型相结合而不和朊病毒非致病异型相结合的构象，这可能是通过拟 似存在与非致病异型中的构象的结果。这一总体原则，即构象病蛋白的某些片 段优先与该构象病蛋白(本文中指朊病毒)的致病形式发生相互作用，可以方 便地运用到其它构象病蛋白中以产生优先与致病形式相互作用的肽试剂。对于 本领域普通技术人员显而易见的是，尽管片段提供了起始点(例如，在大小或 序列特征方面)，但是可以对这些片段进行多种修饰以产生具有更合乎需要特 征的肽试剂(例如，更高的亲和性，更好的稳定性，更佳的溶解性，较低的蛋 白酶敏感性，更好的特异性，更容易合成，等等)。
通常，本文所述的肽试剂能够优先与朊病毒蛋白的致病形式发生相互作 用。因此，这些肽试剂就能容易地检测致病性朊病毒蛋白的存在情况，所以事 实上能在几乎任何样品包括生物样品或非生物样品(包括活体或死亡的脑、脊 髓、或其它神经系统组织以及血液)中容易地诊断朊病毒相关疾病。
此外，可以使用本文所述的肽试剂来产生抗体，这些抗体可以用在诊断性 或治疗性组合物和方法中。特别地，当肽试剂和/或抗体优先与致病性蛋白发生 相互作用时，可以用其检测致病异型的存在情况，例如，通过排列(ordering) 聚集或其它方式诱导致病形式的蛋白质成为可以被检测到的状态。本文所述的 肽试剂可以用在各种诊断试验中，包括在含血液的样品中检测致病形式。可以 标记或标志抗体和/或肽试剂(或它们的一个或多个组成部分)以利于检测和/或 增强其与朊病毒蛋白的相互作用。
此外，可以使用任何合适的信号放大系统进一步有利于检测，包括但不仅 限于，使用分支DNA用于信号放大(参见，例如，美国专利号5,681,697；5,424, 413；5,451,503；5,4547,025；和6,235,483)；应用靶向扩增技术如PCR，滚环 扩增，Third Wave′s invader(Arruda等，2002 Expert.Rev.Mol.Diagn.2：487；美 国专利号6090606，5843669，5985557，6090543，5846717)，NASBA，TMA，等等 (美国专利号6,511,809；EP0544212A1)；和/或免疫-PCR技术(参见，例如，美国 专利号5,665,539；国际出版物WO 98/23962；WO 00/75663；和WO 01/31056)。
此外，本文所述的肽试剂和抗体可以单独或以任何组合形式使用，来治疗 或预防疾病。
III.A.肽试剂
本文所述的肽试剂与构象病蛋白的致病形式发生相互作用。本文以朊病毒 蛋白作为构象病蛋白的示例。
下表非限制性地列举了其相关蛋白具有两种或多种不同构象的疾病。
疾病 构象病蛋白质 朊病毒疾病(例如，克雅病、羊瘙痒病、 牛海绵样脑病) PrPSc 阿尔兹海默病 APP，A*肽，*1-抗胰凝乳蛋白酶，tan，非 -A*组分 ALS SOD和神经丝 Pick病 Pick小体(body) 帕金森病 Lewy小体(body)
I型糖尿病 胰岛淀粉样多肽 多发性骨髓瘤-浆细胞恶液质 IgGL-链 家族性淀粉样变性多发性神经病 甲状腺运载蛋白 甲状腺髓样癌 前降钙素 慢性肾衰竭 β2-微球蛋白 充血性心力衰竭 心房利钠因子 老年心脏和系统性淀粉样变性病 甲状腺运载蛋白 慢性炎症 血清淀粉样蛋白A 动脉粥样硬化 ApoAl 家族性淀粉样变性病 凝溶胶蛋白
此外，以上列举的构象病蛋白中的每一个都包括很多变异及突变，这样得 到的不同种类都包括在本发明的范围内。下文列出了对小鼠朊病毒蛋白的各个 区域及序列进行的功能分析。也可以参见，Priola(2001)Adv.Protein Chem.57： 1-27。可以根据本文所述的标准步骤和指导容易地确定其它物种中对应于下表 列举的小鼠(Mo)，仓鼠(Ha)，人(Hu)，禽(A)和羊(Sh)的区域和残基。
氨基酸 功能 Mo1-28 易位域(切割的) 22 推测的切割位点 23-28 可能与蛋白质X结合位点发生相互作用的碱性(basic)区域， 因为其缺失会废除朊病毒蛋白C-末端处蛋白质X相关突变所带 来的效果 23-88 八重复区域(1-9插入或2缺失可能会增强疾病)；在每个重复 中由组氨酸络合铜 34-52 所示八重复的部分，用以形成聚脯氨酸螺旋，以及形成羟脯氨 酸 86-91 用蛋白酶K消化时PrPSc的切割位点 Hu82-146 在GSS病人的病变脑组织中发现的7Kda片段；对应于该区域的 合成肽形成离子通道。 HuP102 与GSS相关的P102L突变，其似乎不会引起朊病毒蛋白向蛋白 酶抗性构象的自发转变；在所有检测物种中，脯氨酸保守。 HuP105 与GSS相关的P105L突变，其似乎不会引起朊病毒蛋白向蛋白 酶抗性构象的自发转变；在所有检测物种中，脯氨酸保守。
Hu102-105 PXXP基序；可能的聚脯氨酸II型螺旋 Mo_106 与疾病抗性相关 Hu106-126 合成肽的突变形式，提示形成铜调节离子通道；G114和G119 显示能够降低该肽的原纤维形成行为，因为当它们突变成A时， 肽更容易形成淀粉样变性 Mo_111 与疾病抗性相关 Sh104-113 与D13 Fab共结晶的肽 Ha109-112 被D13肽特异性识别的环，如结晶结构中所示(M109和M112 插入到Fab内部的结合口袋中) Hu113-120 回文序列：完全保守 A117V 回文序列中的致病性突变；提高含有该区域的肽的形成淀粉样 变性的特性 Ha129-131 PrPC中的β-折叠1 Hu129/Go132 与对朊病毒疾病的敏感性/抗性相关的多态性 Ha136 与羊中包被的小窝(coated pit)的增加相关的丙氨酸多态性 Mo138/Go142 与对朊病毒疾病的敏感性/抗性相关的多态性 Mo141-176 在小鼠小朊病毒(miniprion)PrP106中该区域(23-88)的缺失 没有效果；提示该区域的非必需功能 Ha144-154 螺旋A Ha155 与对朊病毒疾病的敏感性/抗性相关的多态性 Ha160-163 折叠2 MoV165 物种屏障；当人转基因小鼠的这些残基回复突变成小鼠的序列 时，获得快很多的潜伏(incubation)期 MoQ167 物种屏障；当人转基因小鼠的这些残基回复突变成小鼠的序列 时，获得快很多的潜伏期 MoQ168 推测的蛋白质X结合区；突变时，其保护免患朊病毒疾病 Sh171 与对朊病毒疾病的敏感性/抗性相关的多态性 MoQ172 推测的蛋白质X结合区；突变时，其保护免患朊病毒疾病 176 二硫键连接的半胱氨酸 Ha173-194 螺旋B 178 疾病相关突变 180 疾病相关突变；糖基化位点 196 糖基化位点 198 疾病相关突变 Hu200-228 螺旋C
HuE200 突变成K与Lybian犹太人家族性CJD相关(在combo中的M129 多态性也提高了患病机率) 208 疾病相关突变 210 疾病相关突变 MoT215 推测的蛋白质X结合区；突变时，其保护免患朊病毒疾病 217 疾病相关突变 MoQ219 推测的蛋白质X结合区；突变时，其保护免患朊病毒疾病 232 疾病相关突变 232 糖基磷酯酰肌醇(GPI)锚区 ～233 推测的糖基磷酯酰肌醇锚区切割位点 233-254 从成熟蛋白质中去除的部分
同样应当指出的是，朊病毒蛋白(及其它构象病蛋白)对于相同的氨基酸序 列具有两种不同的三维构象。一种构象与疾病特征相关并通常是不可溶的，而 另一种构象不与疾病特征相关且是可溶的。参见，例如，Wille，等，″用电子结 晶学对羊瘙痒病朊病毒蛋白进行的结构研究″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(6)： 3563-3568(2002)。尽管用朊病毒蛋白作为示例，本发明并不仅限于列出的疾 病、蛋白和种类。
因此，在某些方面，本文所述的肽试剂含有从天然存在的蛋白衍生而来的 氨基酸序列，例如，构象病蛋白(例如，朊病毒蛋白)，或者是含有的基序或 序列与朊病毒蛋白表现出同源性的蛋白。具体地，本发明的肽试剂通常是由天 然存在的朊病毒蛋白衍生而来的。优选地，肽试剂衍生自朊病毒蛋白某些区域 的氨基酸序列。以小鼠朊病毒序列(SEQ ID NO：2)来示例这些优选的区域，氨 基酸残基23-43和85-156的区域，及其亚区域。本发明并不仅限于从小鼠序列衍 生而来的肽试剂，而是包括以如上文所述类似的方式从任何物种(包括，人、 牛、羊、鹿、麇鹿、仓鼠)的朊病毒序列衍生而来的肽试剂。衍生自朊病毒蛋 白时，本文所述的肽试剂可以包括聚脯氨酸II型螺旋基序。该基序通常含有一 般序列PxxP(例如，SEQ ID NO：1的残基102-105)，尽管已经提出其它序列， 具体是丙氨酸四肽，也可以形成聚脯氨酸II型螺旋(参见，例如，Nguyen等Chem Biol.2000 7：463；Nguyen等，Science 1998 282：2088；Schweitzer-Stenner等J. Am.Chem Soc.2004 126：2768)。在PxxP序列中，″x″可以是任何的氨基酸而″P″ 在天然存在的序列中是脯氨酸，但在本发明的肽试剂中可以由脯氨酸替代物所 替换。这样的脯氨酸替代物包括通常称为拟肽的N-取代甘氨酸。因此，在包括 基于PxxP序列的脯氨酸II型螺旋的本发明肽试剂中，″P″代表脯氨酸或N-取代甘 氨酸残基，而″x″则代表任何氨基酸或氨基酸类似物。本文所述尤其优选N-取代 甘氨酸。
此外，已知由多个不同物种产生的朊病毒蛋白的多核苷酸和氨基酸序列， 这些包括人、小鼠、羊和牛。这些序列的变体也存在于每个物种中。因此，本 发明使用的肽试剂可以包含任何物种或变体的氨基酸序列的片段或衍生物。例 如，在某些实施方式中，本文所述的肽试剂衍生自图2列出的任何序列(SEQ ID NOs：3-11)。本文具体公开的肽试剂序列总体是基于小鼠的朊病毒序列，然而， 本领域的技术人员可以很容易地在合适时用来自其它物种的对应序列进行替 换。例如，如果需要对人进行诊断或治疗，可以方便地用对应于小鼠序列的人 序列进行替换。在一个具体实例中，从约85残基至约112残基的区域衍生而来 的肽试剂(例如，SEQ ID NO：35，36，37，40)中，可以用甲硫氨酸取代对应于残基 109位置的亮氨酸，可以用甲硫氨酸取代对应于残基112位置的缬氨酸，可以用 丝氨酸取代对应于残基97位置的天冬氨酸。类似地，如果需要对牛进行诊断， 可以对公开的肽序列进行合适的取代以反应牛朊病毒序列。因此，继续用上述 实例中从约85残基至约112残基的区域衍生而来的肽试剂，可以用甲硫氨酸取 代对应于残基109位置的亮氨酸，可以用甘氨酸取代对应于残基97位置的天冬 氨酸。也可以使用朊病毒蛋白的衍生物，包括对这些序列进行的氨基酸取代、 缺失、插入和其它突变。优选地，任何对朊病毒蛋白序列所做的氨基酸取代、 插入和缺失不影响肽试剂与致病形式发生相互作用的能力。
应当理解的是，无论用于本文所述肽试剂的来源是什么，这些肽试剂不一 定要与已知的朊病毒蛋白表现出序列同源性。因此，本文所述的肽试剂可以包 括相对于天然存在的朊病毒蛋白或本文公开的序列有一个或多个氨基酸取代、 插入、和缺失的序列，只要它们仍旧保留其优先与构象病蛋白的致病形式发生 相互作用的能力。在某些实施方式中，优选保守的氨基酸取代。保守的氨基酸 取代是指那些发生在侧链相关的氨基酸家族之内的取代。遗传编码的氨基酸通 常分为四个家族：(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸，甘氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸， 精氨酸，组氨酸；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯 氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸＝甘氨酸， 天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，和酪 氨酸有时也一起归类为芳香族氨基酸。例如，可以合理地预测分别用异亮氨酸 或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结 构相关的氨基酸进行类似的保守取代，不会对生物学活性造成很大的影响。
同样显而易见的是可以使用天然氨基酸和非天然氨基酸类似物的任意组 合来制备本文所述的肽试剂。经常用到的非遗传编码的氨基酸类似物包括，但 不仅限于，鸟氨酸(Orn)；氨基异丁酸(Aib)；苯并硫代苯丙氨酸(BtPhe)；脲基丙 氨酸(Abz)；叔丁基甘氨酸(Tle)；苯基甘氨酸(PhG)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨 酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1-萘基丙氨酸(1-Nal)；2-噻吩丙氨酸(2-Thi)；1， 2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)；高精氨酸(Har)；Na-甲 基精氨酸(N-MeArg)；磷酸酪氨酸(pTyr或pY)；六氢吡啶羧酸(Pip)；4-氯苯丙氨酸 (4-ClPhe)；4-氟苯丙氨酸(4-FPhe)；1-氨基环丙羧酸(1-NCPC)；和肌氨酸(Sar)。任 何用在本发明肽试剂中的氨基酸可以是D-，或更典型的，L-异构体。
可以用其它非天然存在的氨基酸类似物来形成本文所述的肽试剂，包括拟 肽和/或肽拟似化合物，如氨基酸的磺酸和硼酸类似物，这些生物学功能等价物 也可以用在本发明的化合物中，其包括具有一个或多个酰胺键的化合物，可任 选地用同电子排列体进行取代。在本发明的背景下，例如，可用--CH2NH--， --NHCO--，--SO2NH--，--CH2O--，--CH2CH2--，--CH2S--，--CH2SO--， --CH--CH--(顺式或反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--和1，5-二取代四唑来取代 --CONH--，这样由这些同电子排列体连接的基团可以和用--CONH--连接的基团 具有相似的空间取向。本文所述肽试剂中的一个或多个残基可以含有拟肽。
因此，肽试剂也可以含有一个或多个N-取代的甘氨酸残基(含有一个或多 个N取代的甘氨酸残基的肽可以称为“拟肽”)。例如，在某些实施方式中， 本文所述任何肽试剂的一个或多个脯氨酸残基由N取代甘氨酸残基所取代。适 用于此的特定的N取代甘氨酸残基包括，但不仅限于，N-(S)-(1-苯乙基)甘氨酸； N-(4-羟苯基)甘氨酸；N-(环丙基甲基)甘氨酸；N-(异丙基)甘氨酸；N-(3， 5-二甲氧基苯)甘氨酸；和N-丁基甘氨酸。(例如，图3)。其它的N取代甘氨酸 也可以用来取代本文所述肽试剂序列中的一个或多个氨基酸残基。关于这些和 其它氨基酸类似物及肽拟似物的综述，参见，Nguyen等(2000)Chem Biol.7(7)： 463-473；Spatola，A.F.，氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学，肽和蛋白质， B.Weinstein编，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。也可以参见，Spatola， A.F.，肽骨架修饰(综述)，Vega Data，卷1，第3期，(1983年3月)；Morley，Trends Pharm Sci(综述)，463-468页(1980)；Hudson，D.等，Int J Pept Prot Res，14： 177-185(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola等，Life Sci，38：1243-1249(1986) (--CH2--S)；Hann J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，307-314(1982)(--CH--CH--，顺 式和反式)；Almquist等，J Med Chem，23：1392-1398 (1980)(--COCH2--)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett，23：2533 (1982)(--COCH2--)；Szelke等，European Appln.EP 45665 CA：97：39405(1982) (--CH(OH)CH2-)；Holladay等，Tetrahedron Lett，24：4401-4404(1983)(--C (OH)CH2--)；和Hruby，Life Sci，31：189-199(1982)(--CH2--S--)；每一篇都引入本 文作为参考。C末端羧酸可由硼酸--B(OH)2或硼酸酯--B(OR)2或其它这样的硼酸 衍生物取代，如美国专利号5,288,707所述，引入本文作为参考。
本文所述的肽试剂可以含有单体、多聚体、环状分子、分支分子、接头， 等等。也考虑了本文所述任何序列或其生物学功能等价物的多聚体(也就是， 二聚体、三聚体，等等)。多聚体可以是同型多聚体，也就是由相同的单体组 成，例如，每个单体都是相同的肽序列。或者，多聚体可以是异型多聚体，就 是指不是所有组成多聚体的单体都是相同的。
可以通过单体之间的直接相互附着或直接将单体附着到基质上形成多聚 体，包括，例如，多抗原肽(MAPS)(例如，对称的MAPS)，附着到聚合物支架 上的肽，例如，PEG支架，和/或串联连接的肽(之间有或没有间隔单位)。
或者，可以将连接基团添加到单体序列上而将单体连接在一起并形成多聚 体。使用连接基团形成的多聚体的非限制性实例包括使用甘氨酸接头的串联重 复序列；MAPS通过接头连接到基质上和/或线性连接的肽通过接头连接到支架 上。连接基团可以包括使用双功能间隔单位(同型双功能或异型双功能)，正 如本领域的技术人员已知的。用作实例而不作为限制，有许多方法可以整合连 接的肽中的这样的间隔单位，使用的试剂如琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺甲基) 环己烷-1-羧化物(SMCC)，琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺甲基苯)丁酸盐等等，描 述于Pierce免疫技术手册(Pierce Chemical Co.，Rockville，Ill.)，可以购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)和Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，Wis.)，以及描 述于″综合有机转化″，VCK-Verlagsgesellschaft，Weinheim/德国(1989)。可以用 于将单体序列连接在一起的连接基团的一个实例是--Y1--F--Y2，其中Y1和Y2 是相同或不同的0-20个碳原子的烯烃基团，优选地0-8个碳原子，更优选地0-3个 碳原子，而F是一个或多个功能基团，如--O--，--S--，--S--S--，--C(O)--O--，--NR--， --C(O)--NR--，--NR--C(O)--O--，--NR--C(O)--NR--，--NR--C(S)--NR--，- -NR--C(S)--O--。Y1和Y2可以任选地用羟基、烷氧基、羟基烷基、烷氧基烷基、 氨基、羧基、羧基烷基等等加以取代。可以理解的是，单体的任何合适的原子 都可以连接到连接基团上。
此外，本发明的肽试剂可以是线形的，分支的或环状的。单体单位可以是 环状的或可以连接在一起而以线形或分支的方式提供多聚体，以环状的形式 (例如，大环)，以星形(树突状)或球形(例如，呋仑碳)。熟练的技术人员很 容易识别可以由本文公开的单体序列形成的很多多聚物。在某些实施方式中， 多聚体是环形二聚体。使用如上所述相同的术语，二聚体可以是同型二聚体或 异型二聚体。
可以用上述连接中的任何一种制备环形的单体或多聚体，如，但不仅限于， 例如：(1)将N末端胺与C末端羧酸环化，或者通过在氮和C末端羧基之间直接 形成酰胺键，或者通过间隔基团中间物，例如，用ε氨基羧酸进行缩合；(2) 在两个残基的侧链之间成键而环化，例如，通过在天冬氨酸或谷氨酸侧链和赖 氨酸侧链之间形成酰胺键，或通过在两个半胱氨酸侧链之间形成二硫键或在青 霉胺和半胱氨酸侧链之间成键，或在两个青霉胺侧链之间成键；(3)通过在一个侧 链(例如，天冬氨酸或赖氨酸)和N末端氨基或C末端羧基之间形成酰胺键而环 化；和/或(4)通过短碳间隔基团中间物而连接两个侧链。
优选地，本文所述肽试剂是非致病性的和/或非感染性的。
本发明肽试剂的长度可以是3至约100个残基之间的任意长度(或其间任意 值)或更长，优选地从约4个至75个残基(或其间任意值)，优选地从约5个至 约63个残基(或其间任意值)，更优选地从约8个至约30个残基(或其间任意值)， 最优选的肽试剂的长度为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25， 26，27，28，29或30个残基。
适用于本文所述组合物和方法的肽试剂的非限制性实例来源于表1和表4 所示序列。表中的肽试剂是用传统的单字母氨基酸符号所表示的，N末端在左 侧而C末端在右侧。方括号中的氨基酸表示在不同的肽试剂中该位置可以选择 使用的残基。圆括号表示残基可以存在或不存在于肽试剂中。任何脯氨酸残基 都可以用N取代甘氨酸残基取代以形成拟肽。表中的任何序列可以任意地在N 和/或C末端含有Gly接头(Gn，其中n＝1，2，3，或4)。
表1
    肽序列  SEQ ID NO  KKRPK     12  MANLGCWMLVLFVATWSDLGLC     13
(GGG)QWNK PSK PKTN     14 QWNKPSKPKTNMKHV     15 NQNN[N/T]FVHDCVNIT[I/V]K[Q/E]HTVTTTTKGEN     16 TTKGENFTETD     17 GENFTETD     18 GENFTETD[V/I]K[M/I]MERVVEQMC[I/V]TQY[E/Q]ESQ AYY[Q/D](G)(R)R[G/S][S/A]S     19 NQNN[N/T]FVHDCVNIT[I/V]K[Q/E]HTVTTTTKGENFTE TD[V/I]K[M/I]MERVVEQMC[I/V]TQY[E/Q]ESQAYY[Q/D ](G)(R)R[G/S][S/A]S     20 [A/V/T/M][V/I]LFSSPPVILLISFLIFL[I/M]VG     21 G[N/S]D[W/Y]EDRYYRENM[H/Y]RYPNQVYYRP[M/V]D [Q/E/R]Y[S/N]NQN[N/T]FVH     22 N[N/T]FVHDCVNIT[I/V]K[Q/E]HTVTTTTK     23 VYYR     24 RYPNQVYYRP[M/V]D[Q/E/R]     25 KKRPKPGG(G)WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG     26 WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG(G)     27 WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG(G)[G/T]WGQPHGG     28 GGWGQGGTHSQWNKPSKPKTN     29 GGTHSQWNKPSKPKTN     30 WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG(G)[G/T]WGQPHGG GWGQPHGGGWGQPHGG     31 GQPHGGGW     32 RPIIHFGSDYEDRYYRENMHR     33 RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR     34 (GGGG)C(GG)GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV( GGGG)C     35 (GGGG)GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV     36 GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV(GGGG)     37 [M/L]KH[M/V]     38 KPKTN[M/L]KH[M/V]     39
C(GG)GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV(GGGG) C     40 SRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPN     41 PMIHFGNDWEDRYYRENMYRPVD     42 AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM     43 RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR(GGG)     44 GGGRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRGG     45 (GG)C(GGG)RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR(GGG)C     46 AGAAAAGAVVGGLGG     47 GGLGG     48 LGS     49 QWNKPSKPKTN(GGG)     50 QWNKPSKPKTN(GGG)QWNKPSKPKTN     51 QWNKPSKPKTNLKHV(GGG)     52 GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTN     53 GGTHNQWNKPSKPKTN     54 (GGG)AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM     55 (GGG)AGAAAAGAVVGGLGG     56 (KKK)AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM     57 YMLGSAM[S/N]R     58 [S/N]RP[M/I/L][I/L]H     59 YMLGSAM[S/N]RP[M/I/L][I/L]H     60 YMLGSAM[S/N]RP[M/I/L][I/L]HFG[N/S]D     61 [W/Y]EDRYYRENM[H/Y]RYPNQVYYRP[M/V]D[Q/E/R]Y     62 [W/Y]EDRYYRENM[H/Y]RYPNQVYYRP[M/V]D[Q/E/R]Y [S/N]NQN[N/T]     63 D[Q/E/R]Y[S/N]NQN[N/T]     64 (KKK)AGAAAAGAVVGGLGG     65 (GGG)KKPPKPGGWNTGGSRYPGQGS     66 (GGG)KKRPK PGGWNTGG     67 (GGG)KKRPK PGG     68
PHGGGWGQHGGSWGQPHGGSWGQ     69 PHGGGWGQPHGGSWGQ     70 PHGGGWGQ     71 (GGG)KKRPKPGGGKKRPKPGG     72 (GGG)GPKRKGPK     73 (GGG)WNTGGSRYPGQGS     74 (GGG)WNKPSKPKT     75 (GGG)RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR(GG)C     76 QWNKPSKPKTNLKHV(GGG)     77 (GGG)AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM     78 (GGG)NKPSKPK     79 (GGG)KPSKPK     80 (GGG)KKRPKPGGGQWNKPSKPKTN     81 KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMDDD     82 DDDAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM     83 KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMKKK     84 (GGG)KKKKKKKK     85 DDDAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMDDD     86 (GGG)NNKQSPWPTKK     87 DKDKGGVGALAGAAVAAGGDKDK     88 (GGG)QANKPSKPKTN     89 (GGG)QWNKASKPKTN     90 (GGG)QWNKPSKAKTN     91 (GGG)QWNAPSKPKTN     92 (GGG)QWNKPSAPKTN     93 (GGG)QWNKPSKPATN     94 (GGG)QWNKASKAKTN     95 (GGG)KKRAKPGG     96 (GGG)KKRPKAGG     97 (GGG)KKRAKAGG     98 (GGG)QWNKASKPKTN     99
(GGG)QWAKPSKPKTN    100 (GGG)QWNKPAKPKTN    101 (GGG)QWNKPSKPKAN    102 (GGG)QWNKPSKPKTA    103 (GGG)AKRPKPGG    104 (GGG)KARPKPGG    105 (GGG)KKAPKPGG    106 (GGG)KKRPAPGG    107 (GGG)KKAPKAGG    108 (GGG)KKRPK PGGGWNTGG    127 QWNKPSKPKTNGGGQWNKPSKPKTNGGGQWNKPSKP KTN    128
在一个方面，本发明的肽试剂包括本文公开的每个肽及其衍生物(如本文 所述)。因此，本发明包括由SEQ ID NO：12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47， 48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71， 72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94， 95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，11 1，112， 113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129， 130，131，或132的肽衍生而来的肽试剂。
本发明优选地包括从SEQ ID NO：12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，45，46，47，48， 49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，72，74，76， 77，78，81，82，84，89，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109， 110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127， 128，129，130，131，或132的肽衍生而来的肽试剂。
在某些优选实施方式中，肽试剂特异地结合到致病性朊病毒上，例如，从 SEQ ID NOs：66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124， 125，126，127，14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114， 115，116，117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82，或84的肽衍生而来的肽试 剂，及其类似物(例如，用N取代的甘氨酸取代一个或多个脯氨酸)和衍生物。
如上文所述，本文所述的肽试剂可以包括一个或多个取代、插入、和/或突 变。例如，可以用其它残基(例如，丙氨酸残基)或氨基酸类似物或N取代的 甘氨酸残基替换肽试剂中的一个或多个残基以形成拟肽(参见，例如，Nguyen 等(2000)Chem Biol.7(7)：463-473)。
此外，本文所述的肽试剂也可以含有其它的肽或非肽组分。其它的肽或非 肽组分的非限制性实例包括间隔残基，例如位于一个末端或两个末端的两个或 更多个甘氨酸(天然或衍生的)残基或氨基己酸接头，或可以辅助肽试剂溶解的 残基，例如酸性残基，如天冬氨酸(Asp或D)，例如SEQ ID NOs：83，86中所示。 在某些实施方式中，例如，可以将肽试剂合成为多抗原肽(MAPs)。通常，将肽 试剂的多个拷贝(例如，2-10个拷贝)直接合成到MAP载体上，如分支的赖氨 酸或其它MAP载体核。参见，例如，Wu等(2001)J Am Chem Soc.2001123(28)： 6778-84；Spetzler等(1995)Int J Pept Proteiii Res.45(1)：78-85。
可以包含在本文所述肽试剂中的非肽组分的非限制性实例(例如，化学部 分)包括，一个或多个可检测标记，标签(例如，生物素，His-标签，寡核苷酸)， 染料，结合对的成员，等等，可以位于肽试剂的末端或内部。也可以将非肽组 分(例如，通过一个或多个标记的共价连接)直接地或通过间隔(例如，氨基基 团)连接到化合物的某些位置上，这些位置由定量结构活性数据和/或分子模型 分析不会产生干扰。如本文所述的肽试剂也可以包括朊病毒特异性化学部分， 如淀粉样蛋白特异性染料(例如，刚果红，硫磺素，等等)。化合物的衍生(例如， 标记，环化，连接化学部分，等等)应当基本上不会干扰(甚至可能增强)肽试 剂的结合特性、生物学功能和/或药理活性。
典型地，本发明的肽试剂与本文列出的朊病毒蛋白片段或肽序列至少具有 约50％的同一性。优选地，肽试剂与本文列出的朊病毒蛋白片段或肽序列至少 具有70％的同一性，更优选地至少约75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％， 95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。
如本文所述的肽试剂优先与致病形式发生相互作用，并因此可以广泛地用 于分离、纯化、检测、诊断和治疗中。例如，在肽试剂优先与致病形式发生相 互作用的实施方式中，可以用肽试剂本身检测样品中的致病形式，样品如血液， 神经系统(脑、脊髓、CSF，等等)或其它组织或器官样品。同样，肽试剂也 可用于诊断与致病形式相关的疾病，分离致病形式和通过去除致病形式而去除 样品的污染。
可以使用任何已知的结合试验来检测肽试剂与朊病毒蛋白的相互作用，例 如，标准的免疫试验，如ELISA，Western印迹，等等。
检测本发明肽试剂特异性的一个简便方法就是选择含有致病性和非致病 性朊病毒的样品。通常，这样的样品包括来自患病动物的脑或脊髓组织。将特 异地与致病形式结合的如本文所述的肽试剂结合到固相支持物上(采用的方法 是本领域已知的，并在下文中有进一步描述)，并用它从其它样品组分中分离 (“下拉(pull down)”)致病性的朊病毒，从而获得与固相支持物上的肽- 朊病毒结合相互作用直接相关的定量数值。也可以使用该方法的改进方法及其 它本领域已知的试验来证实本发明肽试剂的特异性。参见，例如，实施例。
尽管在使用本文所述的肽试剂时并不是所需的条件，但是这些试验可能利 用了以下事实，即具有致病构象的朊病毒通常对某些蛋白酶具有抗性，如蛋白 酶K。相同的蛋白酶能够降解非致病构象的朊病毒。因此，在使用蛋白酶时， 可以将样品分为两份相同的体积。可以将蛋白酶加入第二份样品中，并进行相 同的试验。因为第二份样品中的蛋白酶会降解任何非致病性的朊病毒，所以第 二份样品中的任何肽-朊病毒结合相互作用都可以归因于致病性的朊病毒。
因此，评估本文所述肽试剂的结合特异性和/或亲和性的方法的非限制性实 例包括标准的Western和Far-Western印迹方法；标记的肽；ELISA类似试验；和 /或基于细胞的试验。例如，Western印迹法，通常采用标记过的一抗，其从 SDS-PAGE胶中检测到变性的朊病毒蛋白，该凝胶上的样品来自“下拉(pull down)”试验(如本文所述)，该样品已经用电印迹法转移到硝化纤维素或PVDF 上。识别变性朊病毒蛋白的抗体已有描述(描述于，Peretz等1997 J.Mol.Biol. 273：614；Peretz等2001 Nature 412：739；Williamson等1998 J.Virol.72：9413； 美国专利号6,765,088；美国专利号6,537548，等等)，一些是可以通过商业途径 购买到的。其它朊病毒结合分子已有描述，例如，基序嫁接杂交多肽(参见， WO03/085086)，某些阳离子或阴离子聚合物(参见，WO03/073106)，某些作为 “增殖催化剂(propagation catalysts)”的肽和纤维蛋白溶酶原(参见， WO02/0974444)。然后，用检测标签(例如，链霉抗生物素偶联的碱性磷酸酶， 辣根过氧化物酶，ECL试剂，和/或可扩增的寡核苷酸)的探针检测(和/或扩增) 一抗。也可以使用检测试剂来评估结合，如携带亲和标签(例如，生物素)用 检测亲和标签(例如，链霉抗生物素偶联的碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，ECL 试剂，和/或可扩增的寡核苷酸)的探针标记和扩增的肽。此外，可以使用类似 于夹心ELISA的微量滴定板方法，例如，使用本文所述的朊病毒特异性肽试剂 将朊病毒蛋白固定在构象支持物上(例如，微量滴定板的孔，珠，等等)，其 它的检测试剂可以包括，但不仅限于，具有亲和性和/或检测标记的另一种朊病 毒特异性肽试剂，如偶联的碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，ECL试剂，或可扩 增的寡核苷酸。也可以采用基于细胞的试验，例如，直接在单个细胞上检测朊 病毒蛋白(例如，使用荧光标记的朊病毒特异性肽试剂，这样就能够进行基于 荧光的细胞分选，计数，或检测特异标记的细胞)。
III.B.肽试剂的生产
可以用多种方式制备本发明的肽试剂，所有的方法都是本领域所熟知的。
在一个实施方式中，肽试剂全部或部分是遗传编码的肽，可以使用本领域 所熟知的重组技术来生产这样的肽。本领域的技术人员可以使用本文的标准方 法和指导很容易地确定编码所需肽的核苷酸序列。一旦分离了重组的肽，可任 选地对其进行修饰而使其包含非遗传编码的组分(例如，可检测的标记，结合 对成员，等等)来制备肽试剂，如本文所述，也如本领域所熟知的。
可以根据已知序列来设计寡核苷酸探针，并用做基因文库和cDNA文库的 探针。然后，可以使用标准的技术进一步分离序列，并例如，使用限制性内切 酶在全长序列的所需位置截断基因。类似地，可以使用已知的技术(如苯提取) 直接从含有感兴趣序列的细胞和组织中分离这些序列，并进一步对这些序列进 行操作以产生所需的截断的基因。参见，例如，Sambrook等，上文所述，有关DNA 获取和分离技术的描述。
也可以合成编码肽的序列，例如，基于已知的序列。可设计核苷酸序列使 其具有编码所需的特定氨基酸序列的合适的密码子。通常用标准的方法制备寡 核苷酸，并用重叠的寡核苷酸装配出完整的编码序列，以此获得全长序列。参 见，例如，Edge(1981)Nature 292：756；Nambair等(1984)Science 223：1299；Jay 等(1984)J.Biol.Chem.259：6311；Stemmer等(1995)Gene 164：49-53。
可以容易地用重组技术克隆编码用于所述肽试剂的多肽的序列，然后替换 合适的碱基对进行体外诱变，以产生对应于所需氨基酸的密码。这样的改变可 以包括小至一个碱基对的改变，一个氨基酸的改变，或者可以涵盖几个碱基对 的改变。或者，可以使用与亲代核苷酸序列(通常是对应于RNA序列的cDNA) 杂交的错配引物在温度低于错配双链的熔解温度时来产生突变。可以通过控制 引物长度和在较窄的限制条件下控制碱基组成以及将突变碱基控制在中央位 置来制备特异性引物。参见，例如，Innis等，(1990)PCR应用：功能基因组学 方案；Zoller和Smith，Methods Enzymol.(1983)100：468。使用DNA聚合酶完成 引物延伸，选择克隆的产物和含有突变DNA的克隆(含有突变的克隆来源于对 引物延伸链的分离)。可以使用突变引物作为杂交探针来进行选择。该技术也 可用于产生多点突变。参见，例如，Dalbie-McFarland等Proc.Natl.Acad.Sci USA(1982)79：6409。
一旦分离和/或合成了编码序列，可以将它们克隆到任何合适的载体或复制 子中用于表达。(也可以参见，实施例)。从本文的指导中显而易见的是，可 以通过表达构建物的制备来产生很多编码修饰多肽的载体，这些表达构建物以 各种组合方式可操作性连接编码(含有本文所述缺失或突变的)多肽的多核苷 酸。
多种克隆载体是本领域的技术人员已知的，对于合适的克隆载体的选择只 是选择的问题。用于克隆的重组DNA载体及其它们可以转化的宿主细胞的实例 包括，噬菌体λ(大肠杆菌)，pBR322(大肠杆菌)，pACYC177(大肠杆菌)， pKT230(革兰氏阴性细菌)，pGV1106(革兰氏阴性细菌)，pLAFRl(革兰氏阴性 细菌)，pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性细菌)，pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆 菌)，pBD9(杆菌)，pIJ61(链霉菌)，pUC6(链霉菌)，YIp5(酵母)，YCp19(酵母)和 牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。总体参见，DNA克隆：卷I & II，上文中； Sambrook等，上文中；B.Perbal，上文中。
也可以使用昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，这些是本领域技术人员 已知的，描述于，例如，Summers和Smith，得克萨斯农业实验站报1555号(1987)。 用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以以试剂盒的形式从 Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″试剂盒)等购得。
也可以用植物表达系统来生产本文所述的肽试剂。通常，这样的系统使用 基于病毒的载体用异源基因转染植物。关于这些系统的描述，参见，例如，Porta 等，Mol.Biotech.(1996)5：209-221；和Hackland等，Arch.Virol.(1994)139：1-22.
病毒系统，如基于牛痘病毒感染/转染的系统，如Tomei等，J.Virol.(1993)67： 4017-4026和Selby等，J.Gen.Virol.(1993)74：1103-1113所述，也可以运用于本 发明中。在该系统中，先在体外用编码细菌噬菌体T7 RNA聚合酶的重组牛痘病 毒转染细胞。该聚合酶表现出精确的特异性，其只转录带有T7启动子的模板。 感染以后，用感兴趣的DNA转染细胞，该DNA由T7启动子所驱动。由重组牛痘 病毒在细胞质内表达的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后RNA再由宿主的 翻译机器翻译成蛋白质。该方法提供了高水平、瞬时、细胞质内生产大量RNA 及其翻译产物的方法。
可以将基因置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)，和任选地操 纵子的控制中，(这些在本文中统称为“控制”元件)，这样编码所需多肽的 DNA序列就能在用含有表达构建物的载体转化的宿主细胞内转录成RNA。编码 系列可以含有不含信号肽或前导序列。在本发明中，可以使用天然存在的信号 肽或者也可以使用异源序列。前导序列可以在翻译后加工中被宿主去除。参见， 例如，美国专利号4,431,739；4,425,437；4,338,397。这样的序列包括，但不仅 限于，TPA前导序列，以及蜜蜂六甲基苯(mellitin)信号序列。
也可能希望使用其它调控序列，这些序列用以相对宿主细胞的生长而调控 蛋白质序列的表达。这些调控序列是本领域的技术人员已知的，实例包括那些 对化学或物理刺激(包括调控化合物的存在情况)产生应答而使基因表达开放 和关闭的调控序列。载体中也可以存在其它类型的调控元件，例如，增强序列。
可以在插入载体之前，将控制序列和其它调控序列连接到编码序列上。或 者，可以直接将编码序列克隆到已含有控制序列和合适的限制性位点的表达载 体中。
在某些情况下中，可能需要修饰编码序列以使其能以合适的方向与控制序 列相连接；也就是，保留正确的阅读框。可以通过蛋白质编码序列的部分缺失， 序列的插入，和/或通过序列内一个或多个核苷酸的取代来制备突变体或类似 物。用以修饰核苷酸序列的技术，如定点诱变，是本领域的技术人员所熟知的。 参见，例如，Sambrook等，见上文；DNA克隆，卷I和II，见上文；核酸杂交，见 上文。
然后，用表达载体转化合适的宿主细胞。本领域已知多种哺乳动物细胞系， 包括可获自美国典型培养物保藏(ATCC)的永生细胞系，如，但不仅限于，中国 仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，小仓鼠肾(baby hamster kidney)(BHK)细 胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)，Vero293细胞，以及其它 细胞。类似地，细菌宿主如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，和链球菌，也可以用 在本发明的表达构建物中。适用于本发明的酵母宿主包括，酿酒酵母，白色假丝 酵母(Candida albicans)，Candida maltosa，多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)， Kluyveromyces fragilis，Kluyveromyces lactis，Pichia guillerimondii，Pichia pastoris，Schizosaccharomyces pombe和Yarrowia lipolytica，等等。用于杆状病毒 表达载体的昆虫细胞包括，埃及伊蚊(Aedes aegypti)，Autographa californica，家 蚕(Bombyx mori)，黑腹果蝇，Spodoptera frugiperda，和Trichoplusia ni。
根据所选择的表达系统和宿主，在感兴趣的蛋白质能够表达的条件下，通 过培养转化了上文所述表达载体的宿主细胞而生产本发明的蛋白质。对于合适 生长条件的选择属于本领域的技术范围内。
在一个实施方式中，转化的细胞将多肽产物分泌到周围培养基中。可以在 载体中包括某些调控序列以增强蛋白产物的分泌，例如，使用组织纤维蛋白溶 酶原激活剂(TPA)前导序列，干扰素(γ或α)信号序列或其它来自已知分泌 型蛋白的信号肽序列。然后，可以用本文所述的各种技术分离所分泌的多肽产 物，例如，使用标准的纯化技术，如，但不仅限于，羟[基]磷灰石树脂，柱层析， 离子交换层析，排阻层析，电泳，HPLC，免疫吸附技术，亲和层析，免疫沉 淀，等等。
或者，可以使用化学、物理或机械方法破碎转化的细胞，这些方法能够裂 解细胞但仍旧使重组多肽基本上保持完整。也可以从细胞壁或细胞膜去除组分 以获得细胞内蛋白，例如，通过使用去污剂或有机溶剂，这样就造成多肽的泄 漏。这些技术是本领域的技术人员已知的，描述于，例如，蛋白纯化应用：实 践方法(E.L.V.Harris和S.Angal编，1990)。
例如，可以用于本发明的细胞破碎方法包括，但不仅限于：声波或超声破 碎；振荡；液体或固体挤压；热处理；冻融；干燥；爆炸减压；渗透冲击；裂 解酶包括蛋白酶，如胰蛋白酶，神经酰胺酶和溶菌酶处理；碱处理；以及使用 去污剂和溶剂如胆盐，十二烷基磺酸钠，Triton，NP40和CHAPS。用于细胞破 碎的特定技术大部分是选择的问题，其依据的条件是表达多肽的细胞类型，培 养条件和使用的任何预处理。
细胞破碎以后，去除细胞碎片，通常是用离心的方法，再对细胞内产生的 多肽进一步纯化，使用标准的纯化技术，如，但不仅限于，柱层析，离子交换 层析，排阻层析，电泳，HPLC，免疫吸附技术，亲和层析，免疫沉淀，等等。
例如，获得本发明细胞内多肽的一种方法包括使用亲和纯化，如通过使用 抗体(例如，先前产生的抗体)进行的免疫亲和层析，或用植物凝集素亲和层 析。特别优选的植物凝集素树脂是能识别甘露糖部分的树脂，如，但不仅限于， Galarathus nivalis凝集素(GNA)，Lens culinaris凝集素(LCA或扁豆凝集素)， Pisumsativum凝集素(PSA或豌豆凝集素)，Narcissus pseudonarcissus凝集素(NPA) 和Allium ursinum凝集素(AUA)衍生而来的树脂。合适的亲和树脂的选择属于本 领域的技术范围内。亲和纯化后，可以使用本领域熟知的传统技术对多肽进一 步纯化，如使用上文所述的任何技术。
可以用化学方法方便地合成肽试剂，例如使用肽领域技术人员已知的多种 技术中的任何技术。通常，这些方法将生长着的肽链连续添加一个或多个氨基 酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基由合适的保护基团加以保护。然后，可 以将保护的或衍生的氨基酸连到惰性的固相支持物上，或在溶液中应用，加入 序列中的下一个氨基酸，其含有以合适方法保护的互补(氨基或羧基)基团， 反应条件允许形成酰胺键。然后，从新添加的氨基酸残基中去除保护基团，再 添加下一个(以合适方法保护的)氨基酸，等等。在所需的氨基酸已经以恰当 的顺序连接后，依次或同时去除任何残留的保护基团(和任何固相支持物，如 果使用的是固相合成技术)，这样就得到了最终的多肽产物。通过对这样的常 用步骤的简单改进，可以同时对生长着的肽链添加多个氨基酸，例如，通过将 保护的三肽与以合适方法保护的二肽偶联(所处的条件不会使手性中心外消旋 化)，而在脱保护后形成五肽。有关固相肽合成技术参见，例如，J.M.Stewart 和J.D.Young，固相肽合成(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL 1984)以及G. Barany和R.B.Merrifield，肽：分析、合成、生物学，编者E.Gross和J.Meienhofer， 卷2，(Academic Press，New York，1980)，3-254页；和M.Bodansky，肽合成原则， (Springer-Verlag，Berlin 1984)和E.Gross和J.Meienhofer编，肽：分析、合成、生 物学，卷I，有关经典的液相合成。这些方法通常用于相对较小的多肽，也就是， 长度达约50-100个氨基酸的多肽，但是也可以应用于更大的多肽。
典型的保护基团包括，叔丁基氧羰基(Boc)，9-芴甲氧羰基(Fmoc)苄氧羰基 (Cbz)；对甲苯磺酰(Tx)；2，4-二硝基苯；苄基(Bzl)；二苯异丙氧羰基-羰基，叔戊 基氧羰基，异冰片基氧羰基，邻溴苯氧羰基，环己基，异丙基，乙酰基，邻硝基 苯磺酰基，等等。
典型的固相支持物是交联的聚合支持物。可以包括基于二乙烯苯交联苯乙 烯的聚合物，例如，二乙烯苯-羟甲基苯乙烯共聚物，二乙烯苯-氯甲基苯乙烯 共聚物和二乙烯苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。
可以根据，例如，美国专利号5,877,278；6,033,631；Simon等(1992)Proc. NatlAcad.Sci.USA 89：9367，来合成含拟肽的共聚物。
本发明的肽试剂也可以用其它方法进行化学制备，如使用多肽同时合成方 法。参见，例如，Houghten Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：5131-5135；美 国专利号4,631,211。
IV.抗体
此外，用于本发明的本文所述的肽试剂可用来生产抗体。在某些实施方式 中，抗这些肽试剂而产生的抗体对致病性朊病毒具有特异性。在其它的实施方 式中，这些抗体既与致病形式结合，又与非致病形式结合。在其它实施方式中， 抗体对非致病异型具有特异性。任选地，本文所述抗体抑制非致病形式向致病 构象的转变。通常，将本文所述肽试剂(或编码这样的肽试剂的多核苷酸)施 用给动物来生产本发明的抗体。这些方法也可以包括从动物中分离抗体。
本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体制剂、单特异性抗血清、人 抗体，或者可以是杂交或嵌合抗体，如人化抗体、变化的抗体(Fab′)2片段、F(ab) 片段、Fv片段、单结构域抗体、二聚体或三聚体抗体片段或构建物、小型抗体 (minibody)、或它们中与靶抗原结合的功能片段。
生产抗体所使用的技术是本领域的技术人员所熟知的，这些技术揭示于， 例如，美国专利号4,011,308；4,722,890；4,016,043；3,876,504；3,770,380；以及 4,372,745。例如，用感兴趣的抗原(例如，本文所述的肽试剂)来免疫合适的 动物，如小鼠、大鼠、兔、绵羊、或山羊，来产生多克隆抗体。为了增强免疫 原性，可以在免疫之前将抗原连接到载体上。这样的载体是本领域的普通技术 人员所熟知的。通常在盐水中混合或乳化抗原，优选地在佐剂(如，弗氏完全 佐剂)中进行混合和乳化，并将混合物或乳化物经胃肠道外途径进行注射(通 常是皮下注射或肌肉内注射)来进行免疫。通常在2-6周以后，用盐水中的抗原 (优选地使用弗氏不完全佐剂)对动物再进行一次或多次抗原注射以增强免疫。也 可用本领域已知的方法，通过体外免疫的方法产生抗体。然后，从免疫动物身上获 得多克隆抗血清。
通常使用Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497的方法，或其改良方 法来制备单克隆抗体。通常，如上文所述免疫小鼠或大鼠。然而获取血清的方 法不是将动物放血，而是摘除脾脏(和任选的几个较大的淋巴结)并将其分离 成单细胞。如果需要，可以通过将细胞悬浮液加到抗原包被的板或孔上来筛选 脾脏细胞(在去除非特异性结合的细胞以后)。表达抗原特异性膜结合免疫球 蛋白的B细胞将会结合到板上，且不会与悬浮液的其它部分一起被淋洗掉。然 后，诱导所得的B细胞或所有分离的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合而产生杂交瘤， 并培养在选择性培养基中(例如，次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶培养基， “HAT”)。用有限稀释的方法将所得的杂交瘤铺板，并检测其产生的特异性 结合免疫抗原(而不与不相关抗原结合)的抗体。然后，对选择到的分泌单克 隆抗体的杂交瘤进行体外培养(例如，在组织培养瓶中或空心纤维反应器中) 或体内培养(例如，作为小鼠的腹水)。
人化和嵌合抗体也可应用于本发明。杂交(嵌合)抗体分子通常讨论于 Winter等(1991)Nature 349：293-299和美国专利号4,816,567中。人化抗体分子 通常讨论于Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyan等(1988) Science 239：1534-1536；和公开于1994年9月21日的英国专利公开号GB 2,276, 169)。一种工程化产生人化抗体的方法包括克隆重组DNA以此产生小鼠-人抗体 (一种人化抗体)，该重组DNA含有启动子、引导序列、和来自小鼠抗体基因的 可变区序列、以及来自人抗体基因恒定区的外显子，。通常参见，Kuby，《免疫 学》，第三版(Immunology)，W.H.Freeman和Company，纽约(1998)136页。
用于抗本文所述肽试剂的抗体(单克隆或多克隆抗体)在诊断和治疗应用 中尤为有用，例如，那些中和抗体可用于被动免疫治疗。尤其是单克隆抗体可 以用来生产抗独特型抗体。
抗独特型抗体是携带制剂中抗原的“内部图像”的免疫球蛋白，所需的保 护即是针对该抗原制剂的。产生抗独特型抗体的技术是本领域已知的。参见， 例如，Grzych(1985)，Nature 316：74；MacNamara等(1984)，Science 226：1325， Uytdehaag等(1985)，J.Immunol.134：1225。这些抗独特型抗体也可用于构象病 (conformational disease)的治疗和/或诊断。
抗体片段也包括在本发明的范围内。本领域已知很多包含抗原结合位点的 抗体片段，这些抗原结合位点能够表现出完整的抗体分子所具有的免疫结合特 性。例如，可以通过对来自抗体分子的恒定区(不对抗原结合起作用的区域) 的切割(使用，例如，胃蛋白酶)来生产F(ab′)2片段，从而生产功能性抗体片段。 这些片段含有两个抗原结合位点，但是缺乏来自各个重链的恒定区的一部分。 类似地，如果需要，可以生产含有单一抗原结合位点的Fab片段，例如，用木 瓜蛋白酶消化多克隆或单克隆抗体。也可以使用标准的技术，如重组体生产或 对免疫球蛋白分子的优选蛋白水解，来生产仅含有重链和轻链可变区的功能性 片段。这些片段称为Fv。参见，例如，Inbar等(1972)Proc.Nat.Acad.Sci USA 69： 2659-2662；Hochman等(1976)Biochem 15：2706-2710；和Ehrlich等(1980) Biochem 19：4091-4096.
单链Fv(″sFv″或scFv″)多肽是共价连接的VH-VL异源二聚体，其由包含VH- 和VL-编码基因的融合基因表达，VH-和VL-编码基因之间由编码肽的接头连接。 Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。已经描述了多种方 法来分辨和发展化学结构(接头)，该化合结构用来将天然聚集但化学分离的 来自抗体V区的重链和轻链多肽链转化成sFv分子，该分子会折叠成与抗原结合 位点的结构基本相似的三维结构。参见，例如，美国专利号5,091,513；5,132,405； 和4,946,778。可以使用本领域已述的方法生产sFv分子。参见，例如，Huston等 (1988)Proc.Nat.Acad.Sci USA 85：5879-5338；美国专利号5,091,513；5,132,405 和4,946,778。设计准则包括确定跨过一条链的C末端和另一条链的N末端的合 适长度，其中接头通常由不会卷曲或形成二级结构的小的亲水性氨基酸残基构 成。这些方法在本领域中已有描述。参见，例如，美国专利号5,091,513；5,132, 405和4,946,778。合适的接头通常含有由甘氨酸和丝氨酸残基的交替排列组形 成的多肽链，并可包括插入的谷氨酸和赖氨酸残基以增强溶解性。
“小型抗体”(Mini-antibodiesminibodies″)也可以用于本发明中。小型抗体 是在它们的C末端包含寡聚结构域的sFv多肽链，该寡聚结构域与sFv之间由铰 链区所分隔。Pack等，(1992)Biochem 31：1579-1584。寡聚结构域含有自聚集 (self-associating)的α螺旋，例如，亮氨酸拉链，其可以进一步通过其它二硫键 加以稳定。将寡聚结构域设计为与跨膜的向量折叠相匹配，该过程被认为有利 于体内多肽折叠成功能性结合蛋白。通常，使用本领域熟知的重组方法产生小 型抗体。参见，例如，Pack等，(1992)Biochem 31：1579-1584；Cumber等(1992) J.Immunology 149B：120-126。
也可以使用非常规的方法来生产及识别抗体。例如，可以筛选噬菌体展示 库以寻找与致病形式的结合强于与非致病形式结合(或相反情况)的抗体。通 常参见，Siegel，″重组单克隆抗体技术″(″Recombinant Monoclonal Antibody Technology″)，Transfus.Clin.Biol.(2002)9(1)：15-22；Sidhu，″药学生物技术中的 噬菌体展示″(″Phage Display in Pharmaceutical Biotechnology″)，Curr.Opin.Biotechnol.(2000)11(6)：610-616；Sharon，等，″重组多 克隆抗体库″(″Recombinant Polyclonal Antibody Libraries″)，Comb.Chem。高通 量筛选(High Throughput Screen)(2000)3(3)：185-196；和Schmitz等，″噬菌体展 示：生产抗体的分子工具-综述″(″Phage Display：A Molecular Tool for the Generation of Antibodies-Review″)，Placenta，(2000)21 SupplA：S 106-12。
如上所述，也可以将编码如本文所述的肽试剂的多核苷酸序列施用给动 物，以此来产生抗体。当肽在体内表达时，抗体即在体内产生。多核苷酸递送 的方法如下文所述。
可以如上文所述来检测本发明抗体的特异性，以用于肽试剂。如上所述， 具有致病构象的朊病毒通常对某些蛋白酶具有抗性，如蛋白酶K。相同的蛋白 酶可以降解非致病构象的朊病毒。一种测试本发明的抗体特异性的方法是，选 择同时含有致病性和非致病性朊病毒的生物样品。可以将样品分为两份相同的 体积。可以将本发明的抗体吸附到固相支持物上(如下文所做的进一步描述) 并用来获得与固相支持物上的抗体-朊病毒结合相互作用数量直接相关的数量 值。可以将蛋白酶加入第二份样品中，并进行相同的试验。由于第二份样品中 的蛋白酶会降解任何非致病性的朊病毒，所以第二份样品中的任何抗体-朊病毒 结合相互作用都可以归因于致病性的朊病毒。以及本领域已知的其它试验和变 化形式也可用来证实本发明抗体的特异性。
V.试验
本发明的肽试剂可以用在多种试验中来筛选样品(例如，生物样品，如血 液、脑、脊髓、CSF或器官样品)，例如，用来检测这些样品中致病形式的构 象病蛋白的存在与否。与很多目前已有的朊病毒诊断试剂不同，本文所述的肽 试剂可以在几乎任何类型的生物或非生物样品中进行诊断，包括血液样品、血 制品或活组织检查样品。
因此，本发明提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包 括：将怀疑含有致病性朊病毒的样品与本发明的一种肽试剂相接触，所处的条 件允许该肽试剂与致病性朊病毒蛋白相结合(如果有致病性朊病毒存在的话)； 并通过其与肽试剂的结合情况检测致病性朊病毒的存在情况(如果有致病性朊 病毒存在)。
为了用于本发明的方法中，样品可以是任何已知或怀疑含有致病性朊病毒 蛋白的样品。样品可以是生物样品(也就是从活体或曾经存活的生物体中制备 的样品)或非生物样品。合适的生物样品包括，但不仅限于，器官、全血、血 液部分(blood fraction)、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组 织、神经系统组织、肌肉组织、骨髓、尿、泪液、非神经系统组织、器官、和 /或活组织检查或尸体剖检。优选的生物样品包括全血、血液部分、血液组分、 血浆、血小板、和血清。
样品与本发明的一种或多种肽试剂相接触，所处的条件允许肽试剂与致病 性朊病毒蛋白相结合(如果其存在的话)。根据本文的公开，本领域的普通技术 人员完全有能力确定具体的条件。通常，将样品和肽试剂一起孵育在合适的缓 冲液中，该缓冲液的pH基本呈中性(例如，TBS缓冲液，pH7.5)、合适的温度条 件下(例如，约4℃)、孵育合适的时间(例如，约1小时至过夜)，以使它们发生结 合。
可以通过致病性朊病毒蛋白与肽试剂的结合来检测样品中致病性朊病毒 蛋白的存在情况。可以用多种方法使得致病性朊病毒蛋白与本发明的肽试剂结 合从而检测致病性朊病毒的存在情况。例如，可以通过本发明的肽试剂和致病 性朊病毒蛋白之间形成的第一复合物而使用肽试剂特异性地“捕获”致病性朊 病毒蛋白，该第一复合物可以从未结合的样品材料(包括任何存在于样品中的非 致病性朊病毒蛋白)中分离。然后，可以加入本发明的一种或多种肽试剂及与其 结合来检测致病性朊病毒蛋白，其中肽试剂已经添加了可检测标记(也就是， 标记的肽试剂)。在致病性朊病毒蛋白存在于第一复合物中时可以检测致病性 朊病毒蛋白，或者可以在添加本发明的标记肽试剂及其结合之前将致病性朊病 毒蛋白从第一复合物中解离出来。
或者，在用如上所述方法使用本发明的肽试剂捕获致病性朊病毒蛋白，并 将第一复合物从未结合的样品材料中分离出以后，可以在致病性朊病毒蛋白仍 存在于第一复合物之中时或是在致病性朊病毒蛋白从第一复合物解离出来之 后，使用携带可检测标记的朊病毒结合试剂来检测致病性朊病毒蛋白。“朊病 毒结合试剂”是与任何构象的朊病毒蛋白结合的试剂，通常朊病毒结合试剂会 与朊病毒蛋白的变性形式相结合。这样的试剂已经有所描述，包括，例如，抗 朊病毒抗体(尤其是描述于，Peretz等1997 J.Mol.Biol.273：614；Peretz等2001 Nature 412：739；Williamson等1998 J.Virol.72：9413；美国专利号6,765,088；美 国专利号6,537548，等等)、基序嫁接(motif-grafted)杂交多肽(参见， WO03/085086)、某些阳离子或阴离子聚合物(参见，WO03/073106)、某些作为″ 增殖催化剂″(propagation catalyst)肽(参见，WO02/0974444)和纤维蛋白溶酶原。 显而易见的是，如果所使用的特定朊病毒结合试剂与朊病毒的变性形式相结 合，那么在用朊病毒结合试剂检测之前应当先使“捕获的”致病性朊病毒蛋白 变性。
或者，可以使用朊病毒结合试剂来捕获存在于样品中的任何朊病毒(致病 性和非致病性的)，以形成第一复合物，并且可以使用一种或多种本发明的携 带可检测标记的肽试剂在第一复合物中或在致病性朊病毒从第一复合物上解 离以后检测致病性朊病毒。
或者，还可以直接将样品捕获到固相支持物上(也就是，不用任何朊病毒 结合试剂)，且如果致病性朊病毒蛋白存在的话，可以使用一种或多种本发明 的携带可检测标记的肽试剂检测出致病性朊病毒蛋白。
以上所述的捕获和检测步骤可以在溶液中、或在固相支持物中或上或用溶 液和固相的某种组合中进行。一些合适的溶液相形式包括，例如，荧光相关光 谱(参见，Giese等Arch.Virol.Suppl.2000 16：161；Bieschke等Proc.Natl Acad. Sci.USA 2000 97：55468)和荧光共振能量转移。通常，在这些溶液相形式中本 发明的肽试剂会被添加上可检测标记。优选地，肽试剂可被标记上两种或多种 可区分的可检测标记。通过在第一复合物中两种或多种可检测标记的重合来检 测致病性朊病毒蛋白的存在情况。本文中描述了合适的固相试验形式。通常， 对于固相形式，将捕获试剂(可以是本发明的一种或多种肽试剂，或一种或多 种朊病毒结合试剂)连接到或使其适于连接到固相支持物上。可以用本领域已 知的任何方法来使捕获试剂适于连接到固相支持物上，例如，捕获试剂和固相 支持物可以分别含有结合对的一个成员，这样当捕获试剂与固相支持物接触 时，捕获试剂就通过结合对成员之间的结合而连接到固相支持物上。例如，捕 获试剂可以含有生物素，而支持物可以含有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋 白。除了生物素-抗生物素蛋白和生物素-链霉抗生物素蛋白，其它适用于此实 施方式的结合对包括，例如，抗原-抗体、半抗原-抗体、拟肽-抗体、受体-激素、 受体-配体、激动剂-拮抗剂、植物凝集素-碳水化合物、蛋白A-抗体Fc。这样的 结合对是熟知的(参见，例如，美国专利号6,551,843和6,586,193)，本领域的普 通技术人员有能力选择合适的结合对并使其适用于本发明。当捕获试剂适于连 接到如上所述的支持物时，可以在捕获试剂连接到支持物之前或之后将样品与 捕获试剂相互接触。
因此，本发明提供了检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包 括：
(a)将怀疑含有致病性朊病毒的样品与第一肽试剂相接触，所处的条件 允许第一肽试剂结合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存 在)，以形成第一复合物；和
(b)通过致病性朊病毒与第一肽试剂的结合(如果样品中含有致病性朊 病毒)来检测样品中致病性朊病毒的存在情况。
肽试剂如本文所述，优选地，肽试剂衍生自具有SEQ ID NO：12-132序列的肽， 更优选地，衍生自具有以下一种SEQ ID NO：序列的肽：SEQ ID NO：66，67， 68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127，129， 130，131，132；或衍生自具有以下序列的肽，SEQ ID NO：14，35，36，37，40，50， 51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118或128；或衍生自 具有以下序列的肽，SEQ ID NO：56，57，65，82，或84。可以对肽试剂进行生物素 化。可以将肽试剂连接到固相支持物上。在某些实施方式中，可以给肽试剂添 加可检测标记。
本发明还提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包括：
(a)将怀疑含有致病性朊病毒的样品与第一肽试剂相接触，所处的条件 允许第一肽试剂结合到致病性朊病毒上(如果样品中存在致病性朊 病毒)，以形成第一复合物；
(b)将所述的第一复合物与第二肽试剂相接触，所处的条件允许第二肽 试剂结合到所述第一复合物中的致病性朊病毒上，其中所述的第二 肽试剂含有可检测标记；和
(c)通过致病性朊病毒与第二肽试剂的结合(如果存在致病性朊病毒) 来检测致病性朊病毒的存在情况。
当检测方法中利用第一肽试剂和第二肽试剂时，第一和第二肽试剂可以是 相同的或是不同的。“相同的”是指第一和第二肽试剂的区别仅是第二肽试剂 中含有可检测的标记。
第一肽试剂和第二肽试剂可以从朊病毒蛋白的相同区域的肽片段衍生而 来，或从朊病毒蛋白的不同区域的肽片段衍生而来。第一和第二肽试剂可以分 别选自具有以下序列的肽衍生而来的肽试剂，SEQ ID NO：12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、或132。
第一和第二肽试剂可以分别选自具有以下序列的肽衍生而来的肽试剂， SEQ ID NO：：66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、 122、123、124、125、126、127、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、 101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、 131、132、56、57、65、82、和84。
第一肽试剂可以选自具有以下序列的肽衍生而来的肽试剂，SEQ ID NO：66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、 124、125、126、或127，而第二肽试剂可以选自具有以下序列的肽衍生而来的 肽试剂，SEQID NO：14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、或 132，或者反之。第一肽试剂可以选自具有以下序列的肽衍生而来的肽试剂， SEQ ID NO：：66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、 122、123、124、125、126、或127，而第二肽试剂可以选自具有以下序列的肽 衍生而来的肽试剂，SEQ ID NO：56、57、65、82、和84，或者反之。第一肽试剂 可以选自具有以下序列的肽衍生而来的肽试剂，SEQ ID NO：14、35、36、37、 40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、128、129、130、131、或132，而第二肽试剂可以选自具有以下序 列的肽衍生而来的肽试剂，SEQ ID NO：56、57、65、82、和84，或者反之。
第一肽试剂可以生物素化，可以连接到固相支持物上。
本发明还提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包括：
(a)将怀疑含有致病性朊病毒的样品与第一肽试剂接触，所处的条件允 许第一肽试剂结合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)， 以形成第一复合物；
(b)去除未结合的样品材料；
(c)将所述致病性朊病毒从所述第一复合物上解离下来；
(d)将所述解离的致病性朊病毒与第二肽试剂接触，所处的条件允许第 二肽试剂结合到致病性朊病毒上，其中所述的第二肽试剂含有可检 测标记；以及
(e)通过致病性朊病毒与第二肽试剂的结合(如果有致病性朊病毒存 在)来检测样品中致病性朊病毒的存在情况。第一和第二肽试剂可 以相同或不同。
本发明还提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包括：
(a)将怀疑含有致病性朊病毒的样品与第一肽试剂接触，所处的条件允 许第一肽试剂结合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)，以形成 第一复合物；
(b)去除未结合的样品材料；
(c)将所述致病性朊病毒从所述第一复合物上解离下来；
(d)将所述解离的致病性朊病毒与朊病毒结合试剂接触，所处的条件允 许朊病毒结合试剂结合到致病性朊病毒上，其中所述的朊病毒结合试剂含 有可检测标记；以及
(e)通过致病性朊病毒与朊病毒结合试剂的结合(如果有致病性朊病毒 存在)来检测样品中致病性朊病毒的存在情况。朊病毒结合试剂可以是抗朊病 毒抗体、基序嫁接杂交多肽、阳离子或阴离子聚合物、增殖催化剂和纤维蛋白 溶酶原，或其它任何已知与朊病毒蛋白结合的部分。
本发明还提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包括：
(a)将怀疑含有致病性朊病毒的样品与朊病毒结合试剂接触，所处的条件允 许朊病毒结合试剂结合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)，以 形成第一复合物；
(b)去除未结合的样品材料；
(c)将所述第一复合物与肽试剂接触，所处的条件允许肽试剂结合到致病性 朊病毒上，其中所述肽试剂含有可检测标记；
(d)通过致病性朊病毒与肽试剂的结合(如果有致病性朊病毒存在)来检测 样品中致病性朊病毒的存在情况。
本发明还提供了检测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包括：
(a)提供含有第一肽试剂的固相支持物；
(b)将样品与固相支持物接触，所处的条件允许致病性朊病毒(在存在于 样品中时)，结合到第一肽试剂上；
(c)将固相支持物与携带可检测标记的第二肽试剂接触，所处的条件允 许第二肽试剂结合到致病性朊病毒上，该致病性朊病毒结合在第一肽试剂 上；以及，
(d)检测由第一肽试剂、来自样品的致病性朊病毒和第二肽试剂形成的 复合物，以此检测样品中致病性朊病毒的存在情况。
或者，可以提供在固相支持物上的朊病毒结合试剂。本发明因此提供了检 测样品中致病性朊病毒存在情况的方法，该方法包括：
(a)提供含有朊病毒结合试剂的固相支持物；
(b)将样品与固相支持物接触，所处的条件允许致病性朊病毒(在存在于 样品中时)，结合到朊病毒结合试剂上；
(c)将固相支持物与携带可检测标记的第二肽试剂接触；以及，
(d)检测由朊病毒结合试剂、来自样品的致病性朊病毒和第二肽试剂形 成的复合物。
试验可以比较的形式进行；因此，本发明提供了检测样品中致病性朊病毒 存在情况的方法，该方法包括：
(a)提供了含有第一肽试剂的固相支持物；
(b)将固相支持物与携带可检测标记的第一配体混合，其中第一肽试剂 与带有可检测标记的第一配体的结合亲和力弱于第一肽试剂与致病 性朊病毒的结合亲和力；
(c)将样品与固相支持物相混合，所处的条件允许在样品中存在致病性 朊病毒的情况下，致病性朊病毒与第一肽试剂结合并取代第一配体；
(d)检测由第一肽试剂和来自样品的致病性朊病毒之间形成的复合物。
通常，如本文所述的肽试剂用于结合样品中的朊病毒蛋白(例如，用做捕 获试剂)和/或检测朊病毒蛋白的存在情况(例如，用做检测试剂)。捕获试剂 和检测试剂可以是不同的分子，或者一种分子可以兼具捕获和检测的功能。在 某些实施方式中，捕获和/或检测试剂是本文所述的肽试剂，其优先与致病性朊 病毒发生相互作用(也就是，致病性朊病毒特异性)。在其它实施方式中，捕 获试剂对于致病性朊病毒具有特异性，而检测试剂则既与致病形式结合又与非 致病形式结合，例如结合朊病毒蛋白的抗体。这样的朊病毒结合试剂在本文中 已有描述。或者，在其它实施方式中，捕获试剂对致病性朊病毒不具备特异性， 而检测试剂则对致病性朊病毒具特异性。
然后，可以使用任何合适的检测方法来识别如本文所述的肽试剂和朊病毒 蛋白之间的结合。例如，如本文所述的试验可以包括经标记的肽试剂或抗体的 使用。适用于本发明的可检测标记包括任何能够检测的分子，包括，但不仅限 于，放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、发色团、荧光半导体纳米晶体、 酶、酶的底物、酶的辅助因子、酶的抑制剂、发色团，染料、金属离子、金属 溶胶、配体(例如，生物素、链霉抗生物素蛋白或半抗原)等等。其它的标记 包括，但不仅限于，那些使用荧光的标记，包括那些能够在可检测的范围内显 现出荧光的物质或其部分。可以用于本发明的标记的具体实例包括，但不仅限 于，辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、二甲氨基萘磺酰、伞形 花内酯、二甲基吖啶酯(DMAE)、得克萨斯红(Texas red)、鲁米诺、NADPH和 β-半乳糖苷酶。此外，可检测标记可以包括寡核苷酸标记物(tag)，这样的标记 物可以用本领域已知的任何核酸检测方法加以检测，包括PCR、TMA、b-DNA、 NASBA，等等。
除了使用标记的检测试剂(如上文所述)以外，可以使用免疫沉淀来分离 出结合到朊病毒蛋白(例如，致病性朊病毒)上的肽试剂。优选地，可以添加沉 淀促进剂以利于免疫沉淀。沉淀促进剂包括，能够促进或增加结合到致病性朊 病毒上的肽试剂沉淀的部分，包括聚乙二醇(PEG)、G蛋白、A蛋白，等等。在 使用G蛋白或A蛋白作为沉淀促进剂时，可以任选地将蛋白质连接到珠上，优选 地为磁珠。可以通过使用离心或使用磁力而进一步促进沉淀。这些沉淀促进剂 的使用是本领域已知的。
对来自检测试剂的信号放大试验也是已知的。这样的实例包括利用生物素 或抗生物素蛋白的试验，以及酶标记和介导的免疫测定，如ELISA试验。
可以在溶液(例如，液体培养基)中或在固相支持物上实施本文所述的试 验的一个或多个步骤。用于本发明目的的固相支持物可以是任何不溶性基质材 料，可以具有刚性的或半刚性的表面，感兴趣的分子(例如，本发明的肽试剂、 朊病毒蛋白、抗体，等等)可以连接或附着在该表面上。典型的固相支持物包 括，但不仅限于，诸如硝化纤维素、聚氯乙烯这样的基材；聚丙烯、聚苯乙烯、 乳胶、聚碳酸酯、尼龙、葡聚糖、几丁质、砂、硅石、浮石、琼脂糖、纤维素、 玻璃、金属、聚丙烯酰胺、硅、橡胶、多糖，聚氟乙烯；重氮化纸；活化珠； 磁感应珠，和任何常用于固相合成、亲和分离、纯化、杂交反应、免疫试验和 其它此类应用的材料。支持物可以是颗粒状的，或者可以是连续的平面形式， 包括，膜、网格、板、丸、片、盘、毛细管、空心毛细管、针、钉、小片、固 体纤维、凝胶(例如硅胶)和珠，(例如，带孔玻璃珠、硅胶、任选与二乙烯 基苯交联的聚苯乙烯珠、，移植的共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳胶珠、任选与N-N′- 双-丙烯酰乙二胺交联的二甲基丙烯酰胺珠、、氧化铁磁珠、和包被了疏水性聚 合物的玻璃颗粒)。
可以使用标准技术将如本文所述的肽试剂方便地结合到固相支持物上。可 以先将肽试剂结合到蛋白质上(例如，当蛋白质具有更好的固相结合特性时) 来增强对支持物的固定化。合适的结合蛋白包括，但不仅限于，大分子，如血 清白蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、锁眼形血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺 球蛋白、卵清蛋白、及其它本领域的技术人员所熟知的蛋白质。可用于将分子 结合到支持物上的其它试剂，包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨 基酸共聚物，等等。这些分子以及将这些分子结合到蛋白质上的方法是本领域普通 技术人员所熟知的。参见，例如，Brinkley，M.A.，(1992)Bioconjugate Chem.，3： 2-13；Hashida等(1984)J.Appl.Biochem.，6：56-63；以及Anjaneyulu和Staros (1987)Intemational J.of Peptide and Protein Res.30：117-124。
如果需要，可以很方便地对要添加到固相支持物上的分子进行功能化以产 生苯乙烯或丙烯酸酯部分，这样就能将分子整合到聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或其 它聚合物中去，如聚酰亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚乙烯基、聚丁二炔，聚 亚苯基-乙烯、多肽、多糖、多吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、环氧树脂、硅玻 璃、硅胶、硅氧烷、多聚磷酸、水凝胶、琼脂糖、纤维素，等等。
可以通过结合对分子的相互作用将肽试剂粘附到固相支持物上。这样的结 合在本领域中是已知的，并在本文的其它地方已有描述。结合对中的一个成员 用上文所述技术结合到固相支持物上，而结合对的另一成员则连接到肽试剂上 (于合成之前，中间或以后)。可以将这样修饰的肽试剂与样品接触，并与致 病性朊病毒的相互作用就会在溶液中发生(如果存在致病性朊病毒的话)，，此 后可以将固相支持物与肽试剂(或肽-朊病毒复合物)接触。用于此实施方式的 优选结合对包括生物素和抗生物素蛋白、以及生物素和链霉抗生物素蛋白。
也可以在本发明的试验中使用合适的对照。例如，可以在试验中使用PrPC 的阴性对照。也可以在试验中使用PrPSc(或PrPres)的阳性对照。这样的对照可任 选地含有可检测的标记。
使用本发明的肽试剂的多种变化形式和组合也可以应用到本发明的试验 中。以下非限制性实例的描述用于说明。
在某些实施方式中，描述了检测生物样品中致病性朊病毒的试验。在这样 的方法中，本发明的肽试剂可以用做生物或非生物样品中的致病性朊病毒捕获 试剂。在一个这样的实施方式中，先将固相支持物(例如，磁珠)与本文所述 肽试剂发生反应，该肽试剂优先与致病性朊病毒相互作用，这样肽试剂就被充 分地固定到支持物上。然后，将固相支持物与怀疑含有致病性朊病毒的样品相 接触，所处的条件优选可使肽试剂结合到致病性朊病毒上。去除未结合的样品 材料后，结合的致病性朊病毒可以从肽试剂上解离下来，并使用任何已知的检 测机制进行检测，包括，但不仅限于，Western印迹法和ELISA，例如，如下文 实施例和本文引用的参考资料中所述。或者，可以在致病性朊病毒不从肽试剂 上解离的情况下检测结合的致病性朊病毒。
或者，可以在结合到固相支持物之前，将本发明的肽试剂与怀疑含有致病 性朊病毒的样品相接触，然后将肽试剂结合到固相支持物上(例如，可以对肽 试剂生物素化，而固相支持物则含有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)。去 除未结合的样品材料以后，致病性朊病毒可以从肽试剂上解离下来，并使用任 何已知的检测机制进行检测，包括，但不仅限于，Western印迹法和ELISA，例 如，如下文实施例和本文引用的参考资料中所述。或者，在检测之前致病性朊 病毒可以不需要从肽试剂上解离下来。
可以使用如本文所述的优先与致病形式相互作用的肽试剂来检测样品中 的致病性朊病毒。或者，可以用非特异性的检测试剂(例如，与所有PrP结合的 肽或抗体)来检测致病性朊病毒。在某些实施方式中，在将捕获的致病性朊病 毒从固相支持物上解离以后，在检测前先使捕获的致病性朊病毒变性，这样就 能使用非特异性的检测试剂以便于检测。或者，如果，例如，修饰肽试剂以使 其含有可激活的反应基团(例如，光反应基团)，该反应基团可用于在肽试剂 和致病性朊病毒之间建立共价连接，则可以在捕获的致病性朊病毒未从肽试剂 上解离的情况下就使其变性。
可以使用如Ryou等(2003)Lab Invest.83(6)：837-43中所述的ELISA等方案 来对从固相支持物上洗脱下来的致病性朊病毒进行计量。(参见，实施例)。 简言之，用从固相支持物上解离(洗脱)下来的致病性朊病毒覆盖微量滴定板 的孔。可以洗涤板以去除未结合的部分，并加入携带可检测标记的结合分子， 如抗朊病毒抗体或本发明的肽试剂(可以与用于捕获的试剂相同或不同)。允许 该结合分子与任何捕获的样品朊病毒结合，洗涤滴定板，并用本领域所熟知的 方法检测标记抗体和/或标记肽试剂的存在情况。结合分子不需要对致病性朊病 毒形式具有特异性，而是与两种异构体或变性的PrP都可以结合，只要捕获试剂 对致病性朊病毒形式具有特异性即可。
在另一些典型试验中，捕获试剂和朊病毒在检测前并不解离。例如，将固 相支持物(例如，微量滴定板的孔)与第一致病性朊病毒特异性的分子(肽试 剂)相连接。然后，将含有或怀疑含有致病性朊病毒的生物样品加入固相支持 物。孵育一段时间后，该时间足以使任何致病性朊病毒结合到第一种分子上， 可以洗涤固相支持物以去除未结合的部分，然后加入携带可检测标记的如上所 述的第二结合分子，如第二种抗-PrP抗体或朊病毒特异性的肽试剂。或者，可 以将与致病形式和非致病形式结合的分子(例如，非特异性的捕获试剂)结合 到固相支持物上(例如，包被到微量滴定板的孔上)，然后使用致病性朊病毒 特异性的检测试剂(例如，本文所述肽试剂)进行检测。
另一个示例性的试验是“二肽三明治”试验，其可以用来检测朊病毒(例 如，致病性朊病毒)。在该技术中，固相支持物与本文所述的本发明的一种或 多种第一肽试剂发生反应，洗涤以去除未反应的第一肽试剂，然后将其暴露在 怀疑含有致病性朊病毒蛋白的待测样品中(例如，生物样品)，所处的条件允 许第一肽试剂与任何存在于样品中的致病性朊病毒蛋白之间发生相互作用。去 除未反应的样品组分，并加入一种或多种本发明的第二肽试剂，所处的条件允 许第二肽试剂与任何存在的致病性朊病毒蛋白之间发生相互作用。可以用本领 域已知的任何方法检测第一肽试剂-朊病毒蛋白-第二肽试剂之间发生的相互作 用。通常，第二肽试剂含有可检测的标记。用于该试验，第一肽试剂和/或第二 肽试剂优先与致病性朊病毒蛋白发生相互作用。
在某些实施方式中，使用抗-PrP抗体来检测朊病毒蛋白。与朊病毒结合， 尤其是与PrPC或与变性的PrP结合的抗体、经修饰的抗体和其它试剂已在本文中 做了描述，其中的一些是可以购买到的。(参见，例如，Peretz等1997 J.Mol. Biol.273：614；Peretz等2001 Nature 412：739；Williamson等1998 J.Virol.72： 9413；美国专利号6,765,088中所描述的抗朊病毒抗体)。其中的一些及其它一些 可以购自，特别是，InPro Biotechnology，南圣弗兰西斯科，CA，Cayman Chemicals， Ann Arbor MI；Prionics AG，Zurich等；也可以参见，WO03/085086中有关经修 饰的抗体的描述)。
本发明的肽试剂也可以用在竞争试验中。当与PrPSc弱结合的配体由本文所 述的PrPSc特异性肽试剂取代时，可以使用检测方法加以识别。例如，可以将怀 疑含有PrPSc的样品吸附到固相支持物上。此后，使固相支持物与携带可检测标 记的与PrPSc结合的配体相混合(例如，纤维蛋白溶酶原、层粘连蛋白受体和硫 酸乙酰肝素)，所处的条件允许携带可检测标记的配体与PrPSc相结合。检测配 体-PrPSc复合物。然后，加入如本文所述的PrPSc结合肽试剂。携带可检测标记 的配体对致病性朊病毒的结合亲和力弱于肽试剂对致病性朊病毒的结合亲和 力。这样，PrPSc-结合肽试剂就会取代携带标记的配体，标记配体数量的降低指 示了肽试剂和来自生物样品的朊病毒致病形式之间复合物的形成。
上述试验试剂，包括本文所述的肽试剂，可以在附带合适的指导及其它所 需试剂的试剂盒中提供，从而用以实施如上所述的检测试验。在肽试剂吸附到 固相支持物上时，该试剂盒还可以额外含有或任选含有吸附到一种或多种固相 支持物上的肽试剂。该试剂盒可进一步含有合适的阳性对照和阴性对照(如上文 所述)。根据所使用的具体检测试验，试剂盒也可以含有合适的标记和其它包装 的试剂和材料(也就是，洗涤缓冲液等等)。
在其它实施方式中，本发明涉及含有致病性朊病毒特异性肽试剂的固相支 持物。也提供了生产这些固相支持物的方法，例如，通过(a)提供固相支持物； 和(b)在其上结合一种或多种致病性朊病毒特异性的肽试剂。
也可以使用亲和性支持物利用朊病毒特异性的肽试剂来分离致病性朊病 毒蛋白。可以将肽试剂采用，例如，吸附、共价连接等等方法，粘附到固相支 持物上，从而使得肽试剂保留其朊病毒选择性结合活性。任选地，可以包括间 隔基团，例如以使肽试剂的结合位点仍旧保留其可接近性。然后，可以使用固 定化的分子结合来自生物样品的致病性朊病毒蛋白，这样的生物样品如，血液、 血浆、脑、脊髓、其它组织。可以用例如，pH的改变，从支持物上回收结合的 肽试剂或复合物，或者可以将致病性朊病毒从复合物上解离下来。
可以根据本发明检测的样品包括任何可以使用抗体试验进行检测的样品， 包括来自神经系统组织(例如，脑、脊髓、CSF，等等)的样品、血液和/或来 自活体或死亡对象的其它组织样品。如上所述，在优选实施方式中，样品是血 液、血制品或来自活体对象的组织样品。
VI.其它应用
A.检测
如上所述，本文所述的肽试剂也可用于诊断对象中的朊病毒疾病。此外， 上文所述的肽试剂也可用于检测血液和/或食物供给中的致病性朊病毒污染。因 此，可用制备基本上不含有致病性朊病毒的供血，其方法是使用任何本文所述 的检测试验筛选采集自个体的样品或集中在一起的样品库。弃去受到致病性朊 病毒污染的样品或样品库，再合并其余样品。这样，就可以提供基本上不含有 致病性朊病毒污染的供血。“基本上不含有致病性朊病毒”是指使用任何本文 所述的试验都不能检测到致病性朊病毒的存在。重要的是，已经证实本文所述 的肽试剂能在用正常组织稀释了106倍的脑组织中检测到致病性蛋白形式，且本 文所述的肽试剂是唯一已经证实能在血液中检测到致病性朊病毒的试剂。
因此，本发明提供了制备基本上不含有致病性朊病毒的供血的方法，所述 供血包括全血、血红细胞、血浆、血小板或血清，所述的方法包括：
(a)用本文所提供的用以检测致病性朊病毒的任何一种检测方法筛选从采 集的血液样品中得到的全血、血红细胞、血浆、血小板或血清的部分；
(b)弃去任何其中检测到致病性朊病毒的样品；并
(c)合并其中未检测到致病性朊病毒的样品，以提供基本上不含有致病性 朊病毒的供血。
类似地，可以筛选食物供给以检测致病性朊病毒的存在情况，用以提供基 本上不含有致病性朊病毒的食物供给。因此，使用任何本文所述的方法可对打 算作为人或动物食物消耗的活的生物体获得的样品进行筛选，以检测致病性朊 病毒的存在情况。也可以筛选从打算进入食物供给的食物制品采集到的样品。 鉴定在其中检测到致病性朊病毒的样品，并将检测到致病性朊病毒的样品所对 应的打算进入食物供给的活的生物体或食物从食物供给中去除。这样，就可以 提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供给。
因此，本发明提供了制备基本上不含有致病性朊病毒的食物供给的方法， 所述方法包括：
(a)用本文所述的任何一种检测致病性朊病毒的检测方法筛选从将要进入 食物供给的活的生物体或从打算进入食物供给的食物采集到的样品；
(b)清除其中检测到致病性致病性朊病毒的样品；并
(c)合并其中未检测到致病性朊病毒的样品，以提供基本上不含有致病性 朊病毒的食物供给。
B.纯化
为了达到分离致病性朊病毒的目的(例如，为了在检测之前浓缩朊病毒蛋 白)，以及为了达到从样品中清除致病性朊病毒的目的(例如，作为提供基本 上不含有致病性朊病毒的样品的一种手段)，本发明的肽也可用于从样品中去 除致病性朊病毒。在这些方法中，肽试剂通常提供在供血支持物上。将含有肽 试剂的固相支持物与含有致病性朊病毒的样品相接触，所处的条件允许朊病毒 结合到肽试剂上。如果目的是分离朊病毒蛋白，则弃去未结合的样品并收集含 有朊病毒的供血支持物；如果目的是从样品中清除朊病毒，则收集未结合的样 品。
因此，本发明提供了从样品中分离致病性朊病毒的方法，该方法包括：
(a)提供含有本发明所述的肽试剂的固相支持物；
(b)将所述样品与所述固相支持物相接触，所处的条件为在所述样品中存 在致病性朊病毒的情况下，允许致病性朊病毒蛋白与所述第一肽试剂结合，以 形成第一复合物；以及
(c)去除未结合的样品材料。
在另一个实施方式中，可以将所述致病性朊病毒从所述第一复合物中解离 下来。可以用蛋白质纯化领域所熟知的技术来达到解离目的。
本发明还提供了从样品中清除致病性朊病毒的方法，该方法包括：
(a)提供含有本发明的肽试剂的固相支持物；
(b)将所述固相支持物与怀疑含有致病性朊病毒的样品相接触，所处的条 件允许致病性朊病毒与肽试剂的结合(如果有致病性朊病毒存在)；并
(c)回收未结合的样品材料。
C.组合物
本发明进一步涉及含有本文所述肽试剂和/或抗体(以及编码这些肽试剂和 /或抗体的多核苷酸)的组合物，本发明还涉及将这些组合物用在治疗或预防性 组合物中，用于治疗或预防朊病毒相关疾病。此外，也可将抗体、肽试剂(和 编码这些抗体和/或肽试剂的多核苷酸)单独或以组合形式用于组合物中，用于 预防目的(即，预防疾病发生)或治疗目的(即，在感染后治疗疾病)。
本文所述组合物能够治疗或预防疾病的精确机制并非决定性的。不希望被 一种理论所束缚，本文所述组合物能够治疗或预防构象病可能出于以下的一种 或多种机制：在对象中诱导免疫反应，然后所诱导的免疫反应可治疗或预防疾 病状态；与非致病形式的蛋白发生相互作用(例如，结合)，这可能会防止非 致病形式的转化；与致病形式结合，这可能会预防其造成致病性的后果；和/ 或与致病形式结合，这可能会防止该致病形式将更多的非致病形式转化为疾病 形式。(参见，例如，Peretz等(2001)Nature 412：739-743，测试某些Fab抑制 朊病毒增殖的能力)。
组合物可以含有一种或多种肽试剂、抗体和/或寡核苷酸的混合物。这些分 子可以有多种来源，例如，重组产生的蛋白质、人工合成的蛋白质，等等。组 合物也可以和其它分子一起施用，例如，抗原和免疫调节剂，如免疫球蛋白、 细胞因子、淋巴因子、和趋化因子，包括，但不仅限于，IL-2、经修饰的 IL-2(cys125-ser125)、GM-CSF、IL-12、α-或γ-干扰素、IP-10、MIP1和RANTES。 组合物可以有多种施用形式，作为多肽、或者作为裸露核酸(例如，DNA)、使 用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒 载体)、或者使用非病毒载体(例如，脂质体、包被核酸或蛋白质的颗粒)。
组合物也可以含有肽试剂和核酸的混合物，其可以使用相同或不同的形式 和/或载体。相同或不同的组合物可以施用多次(例如，施用“首剂”施用以后 再施用一次或多次“增强剂”)，以达到所需的效果。相同的组合物可以作为 首剂以及作为一次或多次增强剂施用。或者，可以使用不同的组合物作为首剂 和增强剂。
本发明的组合物优选地为药学可接受制剂以及药理学可接受制剂。具体而 言，组合物优选地不会在生物或其它方面造成不良影响，也就是可以将该物质 以制剂或组合物的形式施用给个体而不会引起任何不希望得到的生物学效应 或与组合物中含有的任何组分以有害的方式发生相互作用。
如本文所述的组合物通常按需要含有治疗有效量的分子(肽试剂)或编码 其的核苷酸序列、针对这些分子的抗体以及上述任何其它组分。“治疗有效量” 是指能够在未感染、感染或未暴露的施药对象中诱导出保护性和/或治疗性应答 的用量。“治疗有效量”落在相对较宽的范围内，其可通过常规试验加以确定。 确切的所需计量会根据所治疗的对象、所治疗个体的年龄和总体状况、个体免 疫系统合成抗体的能力、所需达到的保护程度、治疗的病症严重性、所选择的 具体组合物及其给药模式，等等因素而有所不同。
在某些实施方式中，肽试剂具有免疫原性，而本发明的方法包括给动物施 用含有如本文所述的肽试剂、对致病性朊病毒特异性的抗体和/或编码这些肽试 剂或抗体的多核苷酸的免疫原性组合物。用于本发明的免疫原性组合物优选地 含有这些组分的免疫学有效量。“免疫学有效量”是指足以使哺乳动物对朊病 毒蛋白(优选地，致病性朊病毒)激发出免疫应答的用量。该免疫应答通常在 对象中引发分泌的、细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，这样的免疫应答包 括，但不仅限于以下的一种或多种效应：从任何免疫类型产生抗体，如免疫球 蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞的增殖；给免疫细胞提供活化、生长和 分化信号；辅助性T淋巴细胞、抑制性T淋巴细胞、和/或细胞毒T细胞的扩增。 产生的抗体数量会随多种不同的因素而发生改变，这些因素包括所使用的动 物、佐剂的存在，等等。
本发明的组合物可进一步包含一种或多种佐剂。适用于本发明的佐剂包括 以下的一种或多种：
-大肠杆菌热不稳定性肠毒素(″LT″)，或其去毒突变体，如K63或R72突变 体；
-霍乱毒素(″CT″)，或其去毒突变体；
-微粒体(即，直径在～100nm至～150μm的颗粒，更优选地，直径在～ 200nm至～30μm的颗粒，最优选地，直径在～500nm至～10μm的颗粒)，形成 微粒体的材料是生物可降解的且无毒的(例如，聚(α-羟基酸)、聚羟丁酸、聚 原酸酯、聚酐、聚己酸内酯，等)；
-聚氧乙烯酯或聚氧乙烯醚(参见，国际专利申请WO 99/52549)；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯昔醇的组合(参见，国际专利 申请WO01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它的非离 子表面活性剂(如辛苯昔醇(octoxynol))的组合(参见国际专利申请 WO01/21152)；
-壳聚糖(例如，国际专利申请WO 99/27960)
-免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)和皂甙(参见国际专利申请 WO00/62800)
-免疫刺激双链RNA。
-铝化合物(例如，氢氧化铝、磷酸铝、磷酸氢氧化铝、氢氧化物、正磷酸 盐、硫酸盐，等等(例如，参见疫苗设计(“Vaccine design”)的第8和9章：亚 单位和佐剂途径(the subunit and adjuvant approach)，Powell & Newman编， Plenum Press 1995(ISBN 0-306-44867-X)(下文中称为“疫苗设计”)，或不同铝 化合物的混合物，各种化合物可以具有任何合适的形式(例如，凝胶、结晶、无 定型态，等等)，优选的是吸附的形式；
-MF59(5％角鲨烷、0.5％吐温80、和0.5％司盘85，使用微流化装置制成 亚微粒)(参见疫苗设计第10章；也可以参见国际专利申请WO90/14837)；
-脂质体(参见疫苗设计第13和14章)；
-ISCOM(参见疫苗设计第23章)；
-SAF，它含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普鲁兰尼克嵌段同聚物L121、 和thr-MDP，或者通过微流化制成为亚微粒乳剂，或涡旋振荡以产生更大粒径 的乳剂(参见疫苗设计第12章)；
-RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，含有2％角鲨烷、0.2％吐温 80、和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分：单磷酸脂A(MPL)、海藻糖二霉 菌酸酯(trehalose dimyxolate，TDM)，以及细胞壁骨架(CWS)，优选地是MPL+ CWS(DetoxTM)；
-皂甙佐剂，如QuilA或QS21(参见疫苗设计第22章)，也称为StimulonTM；
-ISCOM，去可能不含有其它的去污剂(国际专利申请WO00/07621)；
-完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；
-细胞因子，如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-12，等等)、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因 子，等等(参见疫苗设计第27和28章)；
-单磷酸脂A(MPL)或3-O-脱酰化MPL(3dMPL)(例如，疫苗设计第21章)；
-3dMPL与例如，QS21和/或水包油乳剂的组合(欧洲专利申请0835318、 0735898和0761231)；
-含有CpG基序的寡核苷酸(参见，Krieg(2000)疫苗(Vaccine)，19：618-622； Krieg(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.，2001，3：15-24；WO96/02555，WO98/16247， WO98/18810，WO98/40100，WO98/55495，WO98/37919和WO98/52581，等等)， 也就是至少含有一个CG二核苷酸
-聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(国际专利申请WO99/52549)；
-聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯昔醇的组合(参见，国际专利 申请WO01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它的非离 子表面活性剂(如辛苯昔醇)的组合(参见国际专利申请WO01/21152)；
-免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)和皂甙(参见国际专利申请 WO00/62800)；
-免疫刺激剂和金属盐颗粒(国际专利申请WO00/23105)；
-皂甙和水包油乳剂(国际专利申请WO99/11241)；以及
-皂甙(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)(国际专利申请WO 98/57659)。
胞壁酰肽包括，但不仅限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺 (thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP、N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酰-2-(1′-2′-二软脂酰-sn-甘油-3-羟基磷酸基 氧)-乙胺(MTP-PE)，等等。
也可以获得其它适用于粘膜或胃肠道外给药的佐剂(参见，例如疫苗设计 第7章：亚单位和佐剂途径“the subunit and adjuvant approach”，Powell & Newman编，Plenum Press 1995(ISBN 0-306-44867-X)。
LT的突变体是优选的佐剂(例如，粘膜佐剂)，尤其是″K63″和″R72″突变 体(例如，参见国际专利申请WO98/18928)，因为这些能导致免疫应答的增强。
也可以使用微粒体，优选地，这些微粒体由以下物质衍生而来：聚(α-羟 基酸)，尤其是从聚(丙交酯)(″PLA″)衍生而来、D，L-丙交酯和乙交酯或羟乙酸的 共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(″PLG″或″PLGA″)，或D，L-丙交酯与己 酰内酯的共聚物。微粒体可以衍生自多种具有不同分子量的聚合起始材料的任 何一种，在共聚物(如PLG)的情况下，丙交酯∶乙交酯的各种比例也都可以应 用，其选择大多是选择的问题。朊病毒、本发明的抗体和/或聚核苷酸可以包裹 在微粒体中，或可以吸附到微粒体上。优选的是将其包裹在PLG微粒体中。PLG 微粒体在以下文献中有更详细的描述：Morris等，(1994)，疫苗(Vaccine)，12： 5-11，在粘膜疫苗(Mucosal Vaccine)的第13章，Kiyono等编，Academic Press 1996(ISBN 012410587)，以及在疫苗设计的第16和18章：亚单位和佐剂途径 “the subunit and adjuvant approach”，Powell & Newman编，Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)。
可以将LT突变体有利地与微粒体包裹的抗原联合使用，以达到显著增强免 疫应答的效果。
铝化合物和MF59是胃肠道外使用的优选佐剂。
通常，将组合物制备成可注射的制剂，液体溶液或悬浮液均可；也可以制 备合适的固体形式，其在注射前可以在液相载体中形成溶液或悬浮液。也可以 将制剂乳化或包裹在脂质体中，以增强佐剂的效果，如上所述。
药学可接受的盐也可以用于本发明的组合物中，例如，矿物盐，如盐酸盐、 氢溴酸盐、磷酸盐、或硫酸盐，以及有机酸的盐，如醋酸盐、丙酸盐(proprionate)、 丙二酸盐、或苯甲酸盐。尤其有用的蛋白质底物是血清白蛋白、锁眼型血蓝蛋 白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素，以及其它本 领域技术人员所熟知的蛋白质。
本发明的组合物也可以含有脂类或赋形剂，如水、盐水、甘油、葡聚糖、 乙醇，等等，单独使用或联合使用，以及其它物质，如湿润剂、乳化剂、或pH 缓冲剂。可任选存在载体，载体是指其本身不会诱导产生对接受组合物的个体 有害的抗体的分子。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、 多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂类聚集体(如油 滴或脂质体)，以及非活性病毒颗粒。这些载体是本领域的普通技术人员所熟 知的。此外，可以将组合物中的一种或多种多肽接合到细菌类毒素上，如来自 白喉、破伤风、霍乱等的毒素。
D.递送
本发明的组合物可以以单一剂量施用，或作为治疗方案中的一部分。可以 用任何合适的形式施用核酸和/或肽，形式包括但不仅限于，肌肉内、粘膜内、 皮下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服和/或静脉内。剂量方案可以包括首 剂和增强剂，这些可以通过粘膜、胃肠道外形式给药，或其各种组合形式给药。
在某些实施方式中，组合物的一种或多种组分通过胃肠道外或粘膜给药。 合适的胃肠道外给药途径包括肌肉内(IM)、皮下、静脉内、腹腔内、皮内、经 皮肤、和透皮途径(参见，例如国际专利申请WO98/20734)，以及递送至组织间 隙空间。合适的粘膜给药途径包括，口服、鼻内、胃内、肺部、肠道、直肠、 眼部和阴道给药途径。可以使组合物适用于粘膜给药。例如，当组合物用于口 服给药时，其可以是片剂或胶囊的形式，任选地，通过经肠溶包衣、液态、转 基因植物，等等形式。当组合物用于鼻内给药时，其可以是鼻喷雾、鼻滴剂、 凝胶或粉末。剂量治疗可以是单一剂量方案或多剂量方案。
也可以将组合物(或其组分)包裹在颗粒载体中、吸附到颗粒载体上、或 与颗粒载体相连接。这样的载体可向免疫系统呈递所选择抗原的多个拷贝，并 促进抗原在局部淋巴结的捕获和滞留。颗粒可以被巨噬细胞吞噬，并可通过细 胞因子的释放而促进抗原递呈。颗粒载体的实例包括从聚甲基丙烯酸甲酯聚合 物衍生而来的物质，以及由聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)衍生而来的微粒 体，称为PLG。参见，例如，Jeffery等，Phann.Res.(1993)10：362-368；McGee JP， 等，J Microencapsul.14(2)：197-210，1997；O′Hagan DT，等，疫苗11(2)： 149-54，1993。也可在带电荷去污剂(如阳离子或阴离子去污剂)存在的情况下 生产合适的微粒体，以产生表面携带净负电荷或净正电荷的微粒体。例如，在 阳离子去污剂(如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB))存在的情况下制备的微粒体， 即CTAB-PLG微粒体，可以吸附带负电的大分子，如DNA。(参见，例如，国际 申请号PCT/US99/17308)。
此外，也可以使用其它颗粒系统和聚合物来进行体内或离体递送。例如， 聚合物，如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、精脒，以及这些分子的接 合物可以用于转移感兴趣的核酸。类似地，DEAE葡聚糖介导的转染、磷酸钙 沉淀或使用其它不溶性无机盐进行的沉淀，如磷酸锶、硅酸铝盐(包括皂土和 高岭土)、氧化铬、硅酸镁、滑石等等，也可以用在本方法中。参见，例如， Felgner，P.L.，Advanced Drug Delivery Reviews(1990)5：163-187，有关在基因 转移中有用的递送系统的综述。拟肽(Zuckerman，R.N.，等，提交于1998年11月3 日的美国专利号5,831,005，引入本文作为参考)也可用于本发明构建体的递送。
如上所述，也可用编码肽(或抗体)的核酸来递送这些肽(或抗体)。将 所需序列插入单顺反子或多顺反子载体中，该载体含有经选择的控制元件(例 如，启动子、增强子，等等)。一旦完成，可以使用标准的基因递送方案来递 送该构建体，例如，用传统的注射器(例如，美国专利号5,399,346,5、580,859、 5,589,466)，或基因枪，如Accell基因递送系统(PowderJect Technologies，Inc.， 牛津，英国)进行注射；使用基于病毒的系统，如逆转录病毒系统(如美国专利 号5,219,740所述)、腺病毒系统(Barr等，Gene Therapy(1994)1：51-58；Berkner， K.L.BioTechniques(1988)6：616-629；和Rich等，Human Gene Therapy(1993)4： 461-476)、腺相关病毒(AAV)系统(美国专利号5,173,414和5,139,941)、痘病毒 系统、牛痘病毒递送系统(参见，例如，国际公开号WO94/26911)、禽痘病毒系 统(如家禽痘病毒和金丝雀痘病毒)、甲病毒递送系统(美国专利号5,843,723； 5,789,245；6,342,372；6,329,201)以及其它病毒系统；非病毒系统如带电荷和不 带电荷的脂质体(参见，例如，Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)1097： 1-17；Straubinger等，在酶学方法(Methods of Enzymology)中(1983)，第101卷， 512-527页；Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：7413-7416))；和/ 或螺旋形脂类组合物，类似于Papahadjopoulos等，Biochem.Bioplys.Acta.(1975) 394：483-491所述的组合物。也可用参见，美国专利号4,663,161和4,871,488。 可以将多核苷酸直接递送到脊椎动物对象中，或者离体递送到来源于对象的细 胞中，并将细胞重新移植入对象中。
本发明的方法进一步包含通过给动物施用含有本发明抗体有效量的组合 物治疗或预防朊病毒相关疾病。
治疗方法可以结合本文所述的任何组合物，例如，含有肽的组合物和/或抗 体组合物。各种组分可以一起施用或分别施用。
适用于本发明方法的动物包括人和其它灵长类动物，包括非人灵长类动 物，如黑猩猩、以及其它猿和猴种类；农业动物如牛、绵羊、猪、山羊和马， 家畜如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；鸟， 包括家养的、野生的和猎鸟，如小鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟、鸭、鹅，等等。 适用于本发明的动物可以是任何年龄的动物，包括成年的和新生的。转基因动 物也可用于本发明中。通常参见，Prusiner在“朊病毒”(Prions)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(1998)95：13363-13383中有关目前用于研究朊病毒相关疾病的转基因 动物的讨论。
本发明的组合物可以用来治疗或预防朊病毒相关疾病。这样的朊病毒相关 疾病包括完全或部分由致病性朊病毒蛋白(PrPSc)引起的疾病。朊病毒相关疾病 包括羊瘙痒病、牛海绵样脑病(BSE)、疯牛病、猫海绵样脑病、库鲁病、克-雅 病(CJD)、Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)、和致命性家族性失眠症(FFI)。
实施例
以下是实施本发明的具体实施方式的实例。提供实施例仅出于说明目的， 而不在任何方面限制本发明的范围。
我们已经努力确保所使用数据的准确性(例如，数量、温度，等等)，但 是应当允许存在某些实验误差和偏差。
实施例1：肽试剂的生产
使用标准的肽合成技术化学合成朊病毒蛋白的肽片段，基本上如以下文献 中所述：Merrifield(1969)Advan.Enzymol.32：221以及Holm和Medal(1989)，多 柱肽合成(Multiple column peptide synthesis)，p.208E，Bayer和G.Jung(编)， Peptides 1988，Walter de Gruyter & Co.Berlin-N.Y.。用HPLC纯化肽，并用质谱 检验合成的序列。
在某些情况下，合成的肽在N或C末端含有额外的残基，例如GGG残基， 和/或与野生型序列相比含有一个或多个氨基酸取代。
A.拟肽的取代
也对以下所示的肽进行拟肽取代：SEQ ID NO：14(QWNKPSKPKTN，对 应于SEQ ID NO：2的97至107残基)，SEQ ID NO：67(KKRPKPGGWNTGG，对 应于SEQ ID NO：2的23-36残基)以及SEQ ID NO：68(KKRPKPGG，对应于 SEQ ID NO：2的23-30残基)。具体而言，用各种N-取代拟肽来取代这些肽中的 一个或多个脯氨酸残基。参见图3，有关可用于取代任何脯氨酸的拟肽。用如 美国专利号5,877,278和6,033,631(两者都全文引入本文作为参考)和Simon等 (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367中所述的方法来制备和合成拟肽。
B.多聚体化(multimerization)
某些肽试剂也制备成多聚体，例如，通过制备串联重复(通过接头，如GGG， 连接肽的多个拷贝)、多抗原性肽(MAPS)和/或线性连接的肽。
具体而言，使用标准的技术制备MAPS，基本上如Wu等(2001)J Am Chem Soc.2001 123(28)：6778-84；Spetzler等(1995)Int J Pept Protein Res.45(1)： 78-85中所述。
也可使用聚乙二醇(PEG)接头采用标准的技术制备线性和分支的肽(例 如，PEG接头多聚体化)。具体而言，用以下结构来产生分支的多聚肽PEG支 架：生物素-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys(不含有肽的对照)和 生物素-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys (肽)。此外，肽和Lys的连接的制备是：Lys-ε-NH-CO-(CH2)3-Mal-S-Cys-肽。 参见，图5。
C.生物素化
在合成和纯化后，使用标准的技术对肽进行生物素化。将生物素添加到肽 的N-或C-末端。
实施例2：结合试验
A.下拉(pull-down)
使用磁珠分离试验测试本文所述的肽试剂与朊病毒蛋白特异性结合的能 力。对于本试验，用生物素标记肽试剂，这就允许其粘附到链霉抗生物素蛋白 包被的磁珠上。
从RMLPrPSc+和PrPc+Balb-c小鼠中制备脑匀浆。简言之，将5mL TBS缓 冲液(50mMTris-HCl pH7.5和37.5mM NaCl)以及1％TW20和1％triton 100加到 称重为～0.5g的脑组织中，以产生10％的匀浆。对脑浆进行匀浆直至大颗粒消 失。取200μl的匀浆，以缓冲液1∶1稀释，加入预冷的微量离心管中，对样品超 声数次，每次几秒钟。样品在500x条件下离心10-15分钟，并除去上清液。
为了检测蛋白酶K消化的效果，将一部分上清液分成两份样品，在一份样 品中加入4μl蛋白酶K并在37℃条件下振荡1小时。往蛋白酶K试管中加入8微升 的PMSF，以终止消化，并将试管在4℃条件下孵育至少1小时。
将匀浆储存在4℃条件下直至再次使用，如果需要的话可以再次用如上所 述方法进行超声。将10％w/v放入PrPc+或PrPSc+脑匀浆制备物在4℃条件下与生 物素标记的肽试剂一起孵育过夜，如下所述。准备含有400μl缓冲液、50μl提 取物和5μl生物素标记肽试剂的试管(10mM的原料)。将试管置于室温中至少孵 育2小时，或在4℃条件下在平板振荡器中孵育过夜。
孵育后，加入50μl的SA-珠(Dynal M280 Streptavidin 112.06)，并用涡旋振 荡试管进行混合。在振荡情况下(VWR，Rocking platform，Model 100)孵育试管， 室温下1小时或4℃条件下过夜。
从振荡器中取出样品，置于磁场中收集附着了肽试剂和朊病毒的磁珠，并 用1ml的试验缓冲液洗涤5-6次。可以立即使用样品，或储存在-20℃条件下直 到进行Western印迹或ELISA，如下文所述。
B.Western印迹
Western印迹分析以如下所述方式进行。将如上文所述沉淀的珠-肽-朊病毒 复合物，在最后一次洗涤以后，通过向每支试管中加入25-30μl的SDS缓冲液 (Novex Tris-Glycine SDS-Sample Buffer 2X)，使其变性。用涡旋振荡使试管混 合，直至所有的珠子都悬浮起来。煮沸试管，直至顶部开始弹开(come open)， 在标准的SDS-PAGE凝胶中跑样，并转移到固相膜上用于WB分析。
在室温条件下，在5％牛奶/TBS-T[50ml 1M Tris pH7.5；37.5ml 4M NaCl， 1-10mL吐温，加入牛奶使总体积达到1L]中对膜封闭30分钟。如国际申请号 PCT/US03/31057所述(该申请提交于2003年9月30日，名为“朊病毒嵌合体及 其用途”“Prion Chimeras and Uses Thereof”)，向膜加入10-15ml以1∶50比 例稀释的抗朊病毒多克隆抗体，并在室温条件下孵育1小时。在TBS-T中多次洗 膜。洗涤后，加入以1∶1000比例稀释(在TBS-T中)的接合有碱性磷酸酶(AP) 的二抗(羊抗兔IgG(H+L)抗体(Pierce))，并在室温条件下孵育20分钟。在TBS-T 中多次洗膜。加入碱性磷酸酶沉淀剂(1-步NBT/BCIP(Pierce))，并显影直至背景 出现或信号明显。
C.ELISA
最后一次洗涤以后，用胍硫氰酸盐使上文所述的珠-肽复合物变性，并对变 性的蛋白质实施ELISA，方法如先前Ryou等(2003)Lab I7svest.83(6)：837-43中 所描述的。高于空白对照的O.D.值(在.172-.259之间)被认为是阳性结果。
D.结果
表2中归纳了Western印迹和ELISA结合试验的结果。简言之，要检测如本 文所述的肽试剂与PrPSc的特异性结合，蛋白酶K消化脑匀浆步骤并不是必需的。 如图4中所示，从未观察到肽试剂与野生型脑匀浆的结合，这就表明肽试剂特 异性地结合PrPSc。此外，上文所述的Western印迹分析在高于4个对数级稀释 的样品中仍能检测到PrPSc，而ELISA则比Western印迹至少灵敏10倍。
表2
肽试剂(在N-或C-末端用生物素进行 标记 Seq Id：  Western  印迹1    ELISA    A405nm 3CGG5WGQGGGTHNQWNKPSKPKT NLKHV3C    35   +     0.687 3GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLK V    36   +     ND GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNL KHV3    37   +     ND C5GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTN LKHV3C    40   +     ND RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR4    44   -     ND 4RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR5C    76   -     ND 5C4RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR4 C2    46   +     ND QWNKPSKPKTN4    50   +     0.932 QWNKPSKPKTN    14   +++     0.775 QWNKPSKPKTN4QWNKPSKPKTN    51   +++     .923 QWNKPSKPKTNLKHV4    77   ++     0.839 GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTN    53   +     0.254 GGTHNQWNKPSKPKTN    54   +     0.253 4AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM    78   不可溶     0.259 4AGAAAAGAVVGGLGG    56   不可溶     0.313 6AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM    57   +     0.901 6AGAAAAGAVVGGLGG    65   ++     0.635 4KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGS    66   +     0.533 4KKRPKPGGWNTGG    67   ++     0.451
4KKRPKPGG     68     +++     0.765 PHGGGWGQPHGGSWGQPHGGSWG Q     69     -     0.282 PHGGGWGQPHGGSWGQ     70     -     0.241 PHGGGWGQ     71     -     0.263 4GPKRKGPK     73     +     1.0621 4WNKPSKPKT     75     -     0.247 4NKPSKPK     79     -     0.24 4KPSKPK     80     -     0.225 4KKRPKPGGGKKRPKPGG     72     +     0.522 4KKRPKPGGGQWNKPSKPKTN     81     +     1.247 KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGS AMDDD     82     -     0.340 DDDAGAAAAGAVVGGLGGYMLGS AM     83     -     0.237 KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGS AMKKK     84     +     0.268 4KKKKKKKK     85     +3     0.530 DDDAGAAAAGAVVGGLGGYMLGS AMDDD     86     -     0.227 4NNKQSPWPTKK     87     -     0.277 DKDKGGVGALAGAAVAAGGDKDK     88     -     0.282 4QANKPSKPKTN     89     +     0.245 4QWNKASKPKTN     90     -     0.283 4QWNKPSKAKTN     91     -     0.256 4QWNAPSKPKTN     92     -     0.230 4QWNKPSAPKTN     93     -     0.250 4QWNKPSKPATN     94     -     0.260 4QWNKASKAKTN     95     -     0.241 4KKRAKPGG     96     +     2.19 4KKRPKAGG     97     +     1.24 4KKRAKAGG     98     +     1.46
1：目测评估的相对信号强度
2：环化的
3：在所示位置加入/插入GGGG残基
4：在所示位置加入/插入GGG残基
5：在所示位置加入/插入GG残基
6：在所示位置加入/插入KKK残基
ND＝没有测定
也实施了丙氨酸扫描以鉴定参与结合的残基。
结果显示于表3中。
表3
肽试剂(在N-或C-末端 用生物素进行标记) SEQ ID NO   Western   印迹   ELISA   A405nm QWNKPSKPKTN     14 +++     0.775 QANKPSKPKTN     89 +++     0.245 QWNAPSKPKTN     92 +     0.283 QWNKPSAPKTN     93 +     0.256 QWNKPSKPATN     94 +     0.230 QWNKASKPKTN     99 +/-     0.250 QWNKPSKAKTN     91 +     0.260 QWNKASKAKTN     95 -     0.241 QWAKPSKPKTN     100 ND     0.376 QWNKPAKPKTN     101 ND     0.356 QWNKPSKPKAN     102 ND     0.234 QWNKPSKPKTA     103 ND     0.262 KKRPKPGG     68 +++     0.765 AKRPKPGG     104 +     0.273 KARPKPGG     105 +     0.256 KKAPKPGG     106 +     0.268 KKRPAPGG     107 +     0.578 KKRAKPGG     96 ++     2.19 KKRPKAGG     97 ++     1.24 KKAPKAGG     108 +     1.46
此外，如表4所示，具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68 的肽试剂，在其脯氨酸残基被多个N-取代甘氨酸(拟肽)替换后，其与PrPSc的结 合进一步增强。
表4
 Western  印迹   ELISA   A405nm *在(GGG)′QWNKPSK*KTN中(SEQ ID NO：14) 脯氨酸 +++ 0.775 N-(S)-(1-苯乙基)甘氨酸(如图3A中圈出的拟肽) ++ 0.865
(SEQ ID NO：109) N-(4-羟苯基)甘氨酸(如图3B中圈出的拟肽) (SEQ ID NO：110) -  0.934 N-(环丙基甲基)甘氨酸(如图3C中圈出的拟肽) (SEQ ID NO：111) +++++  1.141 N-(异丙基)甘氨酸(如图3D中圈出的拟肽) (SEQ ID NO：112) ND  0.974 N-(3，5-二甲氧基苯基)甘氨酸(如图3E中圈出的拟肽) (SEQ ID NO：113) +++  2.045 N-丁基甘氨酸(如图3F中圈出的拟肽) (SEQ ID NO：114) ++++  0.776 *在(GGG)′QWNK*SKPKTN中(SEQ ID NO：14) N-(环丙基甲基)甘氨酸(SEQ ID NO：115) ND  0.498 N-(异丙基)甘氨酸(SEQ ID NO：116) ND  1.57 N-(3，5-二甲氧基苯基)甘氨酸(SEQ ID NO：117) ND  0.823 N-丁基甘氨酸(SEQ ID NO：118) ND  0.619 *在(GGG)′KKRPK*GG中(SEQ ID NO：68) 脯氨酸 ND  0.765 N-丁基甘氨酸(SEQ ID NO：119) ND  0.61 N-(3，5-二甲氧基苯基)甘氨酸(SEQ ID NO：120) ND  0.631 N-(异丙基)甘氨酸(SEQ ID NO：121) ND  0.509 N-(环丙基甲基)甘氨酸(SEQ ID NO：122) ND  0.503 *在(GGG)′KKRPK*GGWNTGG中(SEQ ID NO：67) 脯氨酸 ND  0.451 N-丁基甘氨酸(SEQ ID NO：123) ND  0.503 N-(3，5-二甲氧基苯基)甘氨酸(SEQ ID NO：124) ND  0.464
N-(异丙基)甘氨酸(SEQ ID NO：125) ND  0.555 N-(环丙基甲基)甘氨酸(SEQ ID NO：126) ND  0.344 (GGG)1QWNKX1SKX2KTN 在X1位置为N-(环丙基甲基)甘氨酸；在X2位置为N- (环丙基甲基)甘氨酸；(SEQ ID NO：129) ND  ND 在X1位置为N-(环丙基甲基)甘氨酸；在X2位置为N- (3，5-二甲氧基苯基)甘氨酸(SEQ ID NO：130) ND  ND 在X1位置为N-(环丙基甲基)甘氨酸；在X2位置为N- 丁基甘氨酸(SEQ ID NO：131) ND  ND 在X1位置为N-(异丙基)甘氨酸；在X2位置为N-(环丙 基甲基)甘氨酸(SEQ ID NO：132) ND  ND
1在该表所示实验中，任选的GGG接头并未存在于肽试剂中。
此外，PrPSc-结合肽试剂的多聚体化也能改善其与PrPSc的亲和性。具体而 言，串联重复比单拷贝给出更强的信号(如Western印迹分析中所测定的)。在 某些情况下，珠上的预衍生MAP形式可将结合提高至2倍。然而，MAP形式会 在溶液中引起肽的沉淀。同样检测了线性连接的肽在不引发沉淀的情况下增强 结合的能力。
实施例3：抗体生产
以下提供的实施例可以用来生产抗本发明肽试剂的抗体。
用含有如本文所述肽试剂(例如，SEQ ID NO：12-108中的任一种，优选 地，SEQ ID NO：14、35、50、51、56、57、65、66、67、68、72、73、 77、81、82中的任一种)的组合物对小鼠进行免疫，在第0天进行IM(肌肉内) 或IP(腹腔内)免疫，随后施用2-5剂增强剂，其施用间隔不超过每两周一次的频 度。在第一次免疫前以及每次施用增强剂后的7天采集血液，以监测对抗原的 体液反应。对每只动物采集6次眼窝血液(每只眼睛3次)，每次采集的血液约 为0.2ml，或更少。最后一剂增强剂采用IV(静脉内)注射。施用最后一剂增强剂 后的三天，通过将小鼠暴露在CO2或异荧烷(isofluorane)中而对其实施安乐死， 随后进行脱颈椎。然后，采集脾脏用于产生杂交瘤。
使用完全弗氏佐剂作为第一次注射的佐剂，而对其余的注射则使用不完全 弗氏佐剂(除了IV注射)。IV注射液在盐水中制备。
尽管已经对本发明的优选实施方式做了具体描述，可以理解的是，可以在 不脱离如本文所述的本发明的精神和范围的前提下对其进行明显的变化。