检测错折叠蛋白和朊病毒的方法
阅读：234发布：2020-05-16
专利汇可以提供检测错折叠蛋白和朊病毒的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了检测样品中构象改变的蛋白，如 朊病毒 或其它与 疾病 状态有关的蛋白的方法和 试剂 盒 。该方法包括选择性地从干扰对肽与构象改变的 蛋白质 的复合物进行检测的物质中捕获和分离肽与构象改变的蛋白质的复合物，以及优选通过加入第二双标记的肽来扩增检测 信号 。，下面是检测错折叠蛋白和朊病毒的方法专利的具体信息内容。
1.构象捕获肽在制造用于检测样品中错折叠蛋白的存在或量的试剂盒中的用途，所述方法包括：
(a)将(i)含有或怀疑含有错折叠蛋白的样品与(ii)构象捕获肽混合以产生混合物，其中所述构象捕获肽长度为15至45个残基，与错折叠蛋白的致病的错折叠形式相互作用，并在与错折叠蛋白结合后主要采取β片层构象，
所述错折叠蛋白是错折叠的A-β蛋白，
当所述错折叠蛋白为错折叠的A-β蛋白时，所述构象捕获肽为SEQ.ID.No 44-52的任一个氨基酸序列，
(b)温育混合物足够长的时间，以形成复合物，所述复合物包含至少一分子的样品中所存在的任何错折叠蛋白与至少一分子的构象捕获肽的结合，
(c)当复合物存在时，将混合物暴露于使复合物与混合物中至少一种其它物质分离、至少部分分离的条件下，以及
(d)检测构象捕获肽以及任何错折叠蛋白之间的任何结合是否存在。
2.根据权利要求1的用途，所述方法还包括当复合物存在时，在暴露步骤之后以及在检测步骤之前向复合物中加入至少一种双标记的肽的步骤。
3.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述温育和暴露步骤同时进行。
4.根据权利要求2的用途，其中所述至少一种双标记的肽选自由SEQ.ID.NO.2、3和
36-43组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中所述暴露步骤包含构象捕获肽、错折叠蛋白或其复合物与固相的结合。
6.根据权利要求5的用途，其中所述固相通过选自由下列组成的组的方式被修饰以增加暴露步骤中所期望的分离：表面糙化、极性诱导、酸或碱原位生成、磁感应、热处理、疏水性修饰以及将化学或生物活性涂覆层置于固体表面。
7.根据权利要求6的用途，其中所述固相包含用链霉抗生物素涂覆的磁珠。
8.根据权利要求7的用途，其中所述至少一种构象捕获肽包含生物素或生物素类似物。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中构象捕获蛋白与错折叠蛋白之间结合的存在被用来诊断与错折叠蛋白相关的疾病。
10.根据权利要求1-9中任一项的用途，其中所述样品是动物产品。
11.根据权利要求1-10中任一项的用途，其中所述样品选自由人血液产品、人组织和人器官组成的组。
12.根据权利要求1-11中任一项的用途，所述方法还包含至少在一个时间点监测致病的错折叠蛋白的除去。
13.根据权利要求1-12中任一项的用途，其中所述暴露步骤导致从混合物中除去存在于样品中的至少25％的致病的错折叠蛋白。
14.根据权利要求1-13中任一项的用途，其中所述暴露步骤导致从混合物中除去存在于样品中的至少50％的致病的错折叠蛋白。
15.根据权利要求1-14中任一项的用途，其中所述暴露步骤导致从混合物中除去存在于样品中的基本上所有致病的错折叠蛋白。
16.一种试剂盒，包含选自由SEQ ID NO.44-52组成的组的一种或多种肽。
17.根据权利要求16的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种构象捕获肽以及至
少一种双标记的检测肽，并且其中所述一种或多种构象捕获肽选自由SEQ.ID.NO.1、5-8、
11-19、21-29、和31-35组成的组，并且其中所述一种或多种双标记的检测肽选自由SEQ.ID.NO.2-3以及36-43组成的组。
18.根据权利要求17的试剂盒，其进一步包含固相，所述固相包含一种或多种选自由下列组成的组的物质：纤维素、修饰的纤维素、木质素纤维素生物质、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚交酯、聚丙烯酰胺、硅、橡胶、多糖、乳胶、聚氟乙烯、尼龙、聚氯乙烯、聚碳酸酯、淀粉、沙子、硅石、浮石、玻璃和金属。
19.根据权利要求18的试剂盒，其中所述多糖是葡聚糖、壳多糖或琼脂糖。
20.根据权利要求18的试剂盒，其中通过选自由下述组成的组的方式修饰固相以在暴露步骤中增加所期望的分离：表面糙化、极性诱导、酸或碱原位生成、磁感应、热处理、疏水性修饰以及将化学或生物活性涂覆层置于固体表面。
21.根据权利要求20的试剂盒，其中所述固相包含用链霉抗生物素涂覆的磁珠。
22.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述至少一种构象捕获肽用可检测的标记标记。
23.根据权利要求22的用途，其中至少一种构象捕获肽用可检测的标记在肽的每一端进行标记。
24.根据权利要求2的用途，其中所述双标记的肽优选与错折叠蛋白的致病的错折叠形式相互作用，并在与错折叠蛋白结合后主要采取β片层构象。
25.根据权利要求2的用途，其中所述构象捕获肽的氨基酸序列与所述双标记肽的氨基酸序列相同。
26.根据权利要求2的用途，其中所述构象捕获肽的氨基酸序列与所述双标记肽的氨基酸序列不同。
27.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述至少一种构象捕获肽或至少一种双标记肽包含选自由下列组成的组的部分：放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、荧光半导体纳米晶体、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金属溶胶和配体。
28.根据权利要求27的用途，其中至少一种构象捕获肽或至少一种双标记的肽，包含选自由下列组成的组的部分：嵌二萘丁酸盐/酯、琥珀酰亚胺基1-嵌二萘、核黄素、玫红酸、
4-乙酰胺基-4’-异硫代氰酰均二苯乙烯-2，2’-二磺酸，吖啶，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5二磺酸盐/酯、邻氨基苯甲酰胺、香豆素、焰红染料、4’，
6-diaminidino-2-苯基吲哚(DAPI)、二亚乙基三胺五乙酸盐/酯、4，4’-二异硫代氰酰-二氢-均二苯乙烯-2，2’-二磺酸、曙红、曙红异硫氰酸盐/酯、赤藓红、赤藓红B、异硫氰酸盐/酯、乙啡啶、荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、荧光素、异硫氰酸荧光素、fluorescarnine、硝基酪氨酸、副品红、酚红、B-藻红蛋白或邻-酞二醛。
29.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述暴露步骤包含使用大小排阻层析或过滤。
30.根据权利要求5的用途，其中所述固相包含一种或多种选自由下列组成的组的物质：纤维素、修饰的纤维素、木质素纤维素生物质、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚交酯、聚丙烯酰胺、硅、橡胶、多糖、乳胶、聚氟乙烯、尼龙、聚氯乙烯、聚碳酸酯、淀粉、沙子、硅石、浮石、玻璃和金属。
31.根据权利要求30的用途，其中所述多糖是葡聚糖、壳多糖或琼脂糖。
32.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述样品为获得自活的或一度存活的有机体的生物样品。
33.根据权利要求32的用途，其中所述生物样品选自由下列组成的组：器官、全血、血液级分、血液组分、血清、脑脊液、神经系统组织、肌肉组织、骨髓、尿液和泪液。
34.根据权利要求33的用途，其中所述血液组分是血浆或血小板。
35.根据权利要求33的用途，其中所述神经系统组织是脑组织。
36.一种或多种选自SEQ.ID.NO.44-52的肽在制备用于诊断与错折叠的蛋白相关的疾病的试剂盒中的用途，其中所述错折叠的蛋白是错折叠的A-β蛋白。
37.一种构象捕获肽在制备用于诊断与错折叠蛋白相关的疾病的试剂盒中的用途，其中所述错折叠蛋白是错折叠的A-β蛋白，并且其中所述构象捕获肽长度为15至45个残基，与所述错折叠蛋白的致病的错折叠形式相互作用，并在与错折叠蛋白结合后主要采取β片层构象，当所述错折叠蛋白为错折叠的A-β蛋白时，所述构象捕获肽为SEQ.ID.No
44-52的任一个氨基酸序列。
检测错折叠蛋白和朊病毒的方法
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0003] 发明背景
[0005] 已经确定或假定影响人类和动物的许多疾病和病症与错折叠的细胞蛋白有关。天然发生的正常细胞蛋白的错折叠被认为引起蛋白失去活性，或在很多情况下，行为失常。正常细胞蛋白的错折叠经常在受影响的细胞内引起高分子量沉积物或斑块的形成。已知的或被认为和正常细胞蛋白的此类错折叠有关的疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，(AD))，其中A-β蛋白(淀粉状蛋白β)与其有关；脑淀粉状血管病(cerebral amyloid angiopathy，(CAA))；帕金森病(Parkinson′s Disease)，其中Lewy小体中的α-触突核蛋白沉积物与其有关；皮克病(Pick′s Disease)和前颞痴呆(frontal temporaldementia)，其中τ蛋白与其有关；肌萎缩性脊髓侧索硬化症(AmylotrophicLateral Sclerosis，(AML))，其中超氧化物岐化酶与其有关；亨廷顿病(Huntington′s Disease)，其中亨廷顿蛋白与其有关；以及各种传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSE))，如克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD))，变体克雅病(variant Creutzfeldt-Jakobdisease，vCJD)，牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE；疯牛病)，其中朊病毒蛋白与其有关。
[0006] 与错折叠蛋白以及这些蛋白的相关沉积物及斑块有关的许多疾病和病症是中枢神经系统疾病和病症。的确，大多数疾病和病症本质上是神经变性性的，引起神经细胞功能降低或神经细胞死亡。由错折叠蛋白形成沉积物或斑 块的机制以及沉积物或斑块形成与和疾病有关的神经变性过程之间的关系并不是很清楚。
[0007] 形成斑块的蛋白中的一类蛋白是朊病毒蛋白。目前，朊病毒蛋白是研究的热点，因为其与农业动物和人类种群的神经变性疾病有关，以及它们明显的通过生物物质从一个动物或人传递到另一个动物或人，包括明显的跨物种传递。
[0008] 广泛认为朊病毒——其是神经变性疾病的感染媒介——其实完全是蛋白质的，并C且已推测朊病毒蛋白是已知作为朊病毒的实体。朊病毒蛋白是称为PrP27-30或PrP 的蛋白质。其为大约28 KD的疏水糖蛋白，当错折叠时，其聚集成感染的大脑中作为斑块或沉积物被发现的杆状丝。朊病毒通常作为无害的细胞蛋白存在。然而，朊病毒拥有变换其结构并且导致人和动物几种痴呆型致死性脑病的固有能力。占主导地位的假说是，和所有其它的感染性的病原体不同，感染是由朊病毒蛋白非正常构象引起的，该非正常构象充当模板并将正常的朊病毒构象变换为不正常的构象。
[0009] 已经克隆、测序并在转基因动物中表达了编码朊病毒蛋白的完整基因。PrPC由单拷贝的细胞基因编码，且通常发现于神经元的外表面，通过蛋白质C末端部分的糖脂部分附着于膜。已知发生蛋白从表面到内部的循环，但此循环的功能未被阐明。通过至今不清C Sc楚的翻译后过程，在一定条件下，从正常的PrP 形成PrP 。于是发生神经变性疾病，该过程在人类中可需要多达数十年才变得临床上明显。
[0010] 从神经变性疾病感染到显示临床症状在时间上的延迟是受到高度关注的原因，因为这种延迟能容许疾病从一个个体向其它个体发生不为人察觉的传播。例如，该延迟可使得感染朊病毒的动物遭到屠宰，并且使得潜在有传染性的产品从该动物进入动物或人类食物流。同样，该延迟可使得受感染的人将有传染性的物质通过血液或器官捐献传递给其它人。因此，监视动物或动物产品(如肉类)和监视获得自人类的医疗样品(例如血液捐献和器官捐献)以减少或排除朊病毒蛋白从受感染的个体向其它个体传递的可能性，对健康部门、农业生产以及普通公众都非常重要。
[0011] 通过许多方法可以区分正常的细胞蛋白(PrPC)与错折叠的有传染性的蛋白Sc(PrP )，最常见的是对蛋白酶如蛋白酶K降解的易感性或抵抗性，以及用针对一种形式或其它形式的蛋白产生的抗体在蛋白酶消化之前或之后检测。
[0012] 许多目前用于检测朊病毒相关的感染存在的技术依赖于脑中总的形态变化，或免疫化学技术，该技术通常仅在临床症状明显后应用，并且该技术要求活组织检查材料或死后取得的材料。当然，等到脑中总的形态变化明显时，一个人可能已经通过血液捐献或器官或组织捐献，将有传染性的颗粒传染至其它人。同样，等到动物组织的死后分析完成时，来自该动物的产品可能已经进入食物流，并潜在地感染了其它动物或甚至人类。
[0013] 研发或使用中的其它技术依赖于与神经变性疾病有关的细胞蛋白如朊病毒蛋白的错折叠形式的催化增殖。例如，公布的美国专利申请2005/0026165A1，其全部内容在此引入作为参考，公开了肽探针检测样品中小量错折叠蛋白的用途。在2005/0026165 A1中，将具有与错折叠蛋白结合的序列的肽与怀疑含有错折叠蛋白的样品接触。如果存在错折叠蛋白，则探针和错折叠蛋白结合。结合引起探针中构象变化，该变化使得该探针和其它的探针分子结合。其它探针分子与错折叠蛋白-探针复合物的结合引起新结合的探针的构象变化，其将新结合的探针分子转变为能与混合物中另一个探针分子结合的构象。当目标错折叠蛋白存在时，探针的设计允许产生可检测信号。
[0014] 尽管本领域存在许多检测错折叠蛋白如有传染性的朊病毒蛋白的技术，仍存有对快速、廉价、可靠、可重复、易于使用和/或提供改进的灵敏度的改进技术的需要。改进灵敏度实际上涉及所有其它的需求。而且，需要通过高通量试剂盒便利地实施这种技术。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明专注于本领域的需要，包括通过提供检测构象改变的蛋白如朊病毒的方法和试剂盒增加检测灵敏度，该病毒与神经变性疾病和病症的任一成员有关。构象依赖性肽，C SC TSE TSE如那些被设计来模拟将PrP 转变为PrP (也称为PrP ，并与PrP 同等使用)的折叠反应SC
的被标记肽，为针对错折叠蛋白如PrP 的高敏感诊断试验提供了基础。由于信号扩增获得高灵敏性，因为另外的肽，如被标记的肽，在目标富集的溶液中被募集，以经历类似的构象Sc
变化，使有效检测含有错折叠蛋白的动物和人类的血液或其它组织中的错折叠蛋白如PrPSC
成为可能，例如那些感染了某些与PrP 有关的疾病或患有阿尔茨海默病的动物或人类。
的被标记肽，为针对错折叠蛋白如PrP 的高敏感诊断试验提供了基础。由于信号扩增获得高灵敏性，因为另外的肽，如被标记的肽，在目标富集的溶液中被募集，以经历类似的构象Sc
变化，使有效检测含有错折叠蛋白的动物和人类的血液或其它组织中的错折叠蛋白如PrPSC
成为可能，例如那些感染了某些与PrP 有关的疾病或患有阿尔茨海默病的动物或人类。
[0017] 在本发明的许多用途中，该方法和试剂盒可用于从人类或动物中筛选存 在错折叠蛋白的样品。另外，该方法和试剂盒可用于诊断目的，如诊断具有与错折叠蛋白如朊病毒蛋白有关的疾病或病症的动物或人类。该方法和试剂盒可进一步用于监视随时间的个体内错折叠蛋白的量。通常，该方法和试剂盒可与任一探针或一套探针一起使用，该探针允许包含错折叠蛋白的样品中错折叠蛋白构象的催化增殖。因此，该方法和试剂盒广泛应用于许多疾病和病症的检测，特别是那些性质上为神经变性的疾病和病症。附图说明
[0018] 图1一般性地描绘了依据本发明所用的催化增殖试验。
[0019] 图2描绘了本发明所用的标准催化增殖试验的结果。
[0020] 图3描绘了依据本发明的方法层析分离探针和错折叠朊病毒蛋白复合物的结果。
[0022] 图5描绘了用人类血浆样品进行的本发明的选择性捕获实施例的结果。
[0023] 图6描绘了选择性捕获错折叠蛋白诊断学(MPD)的方案剂量反应。
[0024] 图7描绘了用绵羊血清样品进行的选择性捕获结果。
[0025] 图8描绘了从包含磁珠的固相连续洗涤捕获的sCJD底物的效果。
[0026] 发明详述
[0027] 本公开描述了检测样品中错折叠蛋白的方法和试剂盒。除非另有说明，在此所用的所有术语具有生物技术、蛋白质生物化学、以及医学诊断学领域内通常的意义。
[0028] 如在此所用的，且与科学文献中的用法一致，术语“朊病毒”以及“朊病毒蛋白”交互使用以表示引起动物和人类神经变性疾病状态的蛋白质性物质。朊病毒和朊病毒蛋白交互使用以表示蛋白质的正常细胞构象和有传染性的或引起疾病的构象。为了有助于清楚说C Sc明，使用特别的形式：用PrP 表示正常的细胞构象，用PrP 表示引起疾病的构象。
[0029] 术语“朊病毒”、“朊病毒蛋白”、和“PrPSc蛋白”及其类似物在此交互使用，以指PrPSc Sc蛋白的易传染的PrP 形式。微粒主要包含，如果不是唯一包含，PrP基因编码的PrP 分子组成的。朊病毒与细菌、病毒和类病毒不同。 已知的朊病毒感染动物并引起绵羊瘙痒病(Scrapie)，一种可传染的绵羊和山羊神经系统变性性疾病，还引起牛海绵状脑病(BSE)或“疯牛病”，以及引起猫的猫科动物海绵状脑病。四种已知的感染人类的朊病毒是(1)库鲁症(kuru)、(2)克雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)(CJD)、(3)GSS综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker-Disease，GSS)以及(4)致死性家族失眠症(fatalfamilial insomnia，FFI)。如在此所用的，“朊病毒”包括在任何动物特别是人类以及驯养的农业动物中引起所有或任何这些疾病或其它疾病的朊病毒的所有形式。
[0030] “蛋白质”指两个或多个单个氨基酸(无论是否天然存在的)经由肽键连接的的任何聚合物，且当连接于一个氨基酸(或氨基酸残基)的α碳原子的羧酸基的羧基碳原子与和相邻氨基酸的α-碳原子连接的氨基的氨基氮原子共价连接时出现。这些肽键以及包含它们的原子(即α-碳原子、羧基碳原子(和它们的取代氧原子)以及氨基氮原子(和它们的取代氢原子))形成蛋白质的多肽骨架。
[0031] 术语“蛋白质”在其涵义内可以理解为包括术语“多肽”以及“肽”(其在此可交互使用)。另外，包含多种多肽亚单位或其它组分(例如RNA分子，如在端粒末端转移酶中出现的)的蛋白质也可以理解为包括于在此所用的“蛋白质”的含义内。同样，蛋白质和多肽片段也在本发明范围内，且可在此称为“蛋白质”。
[0032] “构象”指特殊的蛋白构象，如，α-螺旋、平行及反平行β-链、亮氨酸拉链、锌指等。另外，构象限制可包括没有其他结构信息的氨基酸序列信息。“构象改变”是从一种构象到另一种构象的变化。
[0033] “构象改变的蛋白质”是所有具有单一的初级氨基酸序列、但在个体内或体外既以正常的三维构象又以与疾病有关的三维构象存在的蛋白质。构象改变的蛋白质以任何可检测方式与疾病有关。例如，它可引起疾病，可以是疾病症状的因子，或存在于生物样品中或体内作为引起疾病的其它物质的结果，或是疾病的结果。构象改变的蛋白质既具有正常构象又具有各种错折叠构象。
[0034] 还不清楚蛋白序列编码正确折叠的确切机制。为了获得折叠所编码的天然状态，蛋白质分子必须转变为选自许多供选择的可能性的唯一构象。功能性蛋白通常是可溶的，且可采用多种结构，包括卷曲以及有序元件。有序元 件包括α-螺旋，其在如肌红蛋白和血红蛋白等蛋白质中占主导地位。在人类老化过程中，在一些蛋白中，可溶性结构(如α-螺旋区)构象改变成β-片层结构，该β-片层结构发生与功能丧失有关的聚合。
[0035] “构象探针”是具有与目标错折叠蛋白中出现的序列足够相似的氨基酸序列、以允许探针和目标蛋白(通过任何已知的方式，如疏水相互作用或范德瓦耳斯相互作用)结合的肽。构象探针与错折叠蛋白的结合引起探针(或存在的探针分子的一部分)从一种构象改变为另一种构象，该构象与当探针与错折叠蛋白接触时所处的构象不同。尽管非必须，但构象探针在与错折叠蛋白结合时可主要采用β-片层构象。构象探针可以，但非必须，用可检测标记物如荧光部分进行标记。
[0036] “标记物”指能检测的分子，包括放射性同位素、荧光剂、发光剂(luminescers)、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体如生物素以及其类似物。术语“荧光剂”指在可检测范围内能显示荧光的物质或其一部分。可用于本发明的标记的具体实例包括，但不限于，荧光素、罗丹明、丹酰基(dansyl)、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、acradimum esters、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、碱性磷酸酶以及脲酶。标记也可以为表位标签(如His-His标签)、抗体或可检测的寡核苷酸。
[0037] 至少有20种当采用构象改变的状态时与人类疾病有关的蛋白质。朊病毒蛋白C Sc(PrP)的正常野生型的形式优选单体状态，然而异常的引起疾病的形式(PrP )更易于采取多聚体状态。本发明虽然集中于朊病毒检测，但也同样适用于所有与采用构象改变状态的蛋白质有关的疾病和病症。
[0038] 蛋白质结构可以通过多种试验或计算的方式测定，其中的几个在下文描述。蛋白质结构可以用实验的方式通过任何能产生至少低分辨率结构的方法评价。目前这样的方法包括X-射线衍射晶体分析法以及核磁共振(NMR)光谱学。NMR使生物分子的溶液构象(而不是晶体结构)的测定成为可能。通常，通过NMR光谱学测定的生物分子结构与通过晶体学测定的相比具有适度的分辨率。在研究生物分子结构中，其它的有用的技术包括圆二色性(circulardichroism，CD)、荧光以及紫外可视吸收光谱。这些技术的详细描述请参阅，例如弗里曼公司出版的《Physical Biochemistry：Application to Biochemistry andMolecular Biology》(W.H.Freeman & Co.，1982，Physical Biochemistry： ndApplication to Biochemistry and Molecular Biology.2 .New York，NY)。依据本发明，可以使用任何适合的技术。
[0039] “等同物”指在序列上与待分析的蛋白质的氨基酸序列相似，但具有至少一个、但少于五个不同、替换、添加或缺失的氨基酸序列。因此，在一个给定的序列中不实质改变氨基酸基本功能的一个或多个氨基酸替换对描述本发明的目的而言是等同的。
[0040] “同源性”、“与......同源”、“同源物”、“同一性”以及“相似性”指两个肽之间的序列相似性，其中同一性为更严格的比较。可通过比较可为了比较的目的而进行排列的每一序列中的位置而确定同源性和同一性。当被比序列中的位置被相同的氨基酸占据时，那么分子在该位置是相同的。氨基酸序列同一性的程度是在氨基酸序列共有的位置上相同氨基酸的数量的函数。氨基酸序列同源性或相似性的程度是氨基酸数量的函数，即，在氨基酸序列共有的位置上结构上相关的。“非同源性的”序列与本发明所用序列之一具有不到40％同一性，尽管优选不到25％的同一性。相关的序列具有多于40％的同一性，优选至少约50％的同一性，更优选至少约70％的同一性，再更优选至少90％的同一性，以及最优选至少99％的同一性。
[0041] 术语“百分之......相同”指两个氨基酸序列之间的序列同一性。可通过比较可为了比较的目的而进行排列的每一序列中的位置而确定同源性和同一性。当被比序列中的等同位置被相同氨基酸占据时，分子在该位置是相同的；当等同位置为相同或相似的氨基酸残基(例如在立体和/或电子特性上相似)占据时，那么分子在该位置上可以称为同源的(相似的)。同源性、相似性或同一性百分比的表述指在为被比序列共有的位置上相同或相似氨基酸数量的函数。可以使用各种排列运算法则和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA以及BLAST可以作为GCG序列分析软件包(University of Wisconsin，Madison，WI)的一部分获得，且可以使用，例如缺省设置。ENTREZ可通过National Center for Biotechnology Information， National Library of Medicine，National Institutes of Health，Bethesda，MD获得。
[0042] 如在此所用的术语“相互作用”和“结合”意指分子间可检测的相互作用(如生物化学的相互作用)，例如，本质上为蛋白质-蛋白质之间、蛋白质-核酸之间、核酸-核酸之间以及蛋白质-小分子之间或核酸-小分子之间的相互作用。
[0043] 除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术内化学、生物化学、分子生物学、免疫学、医学以及药物学的常规方法。可通过参考当前的文献理解此类技术，如Methods in Enzymology Vol.278：Fluorescence Spectroscopy(L.Brand and M.L.Johnson，Eds.，Academic Press，Inc.，1997)、Methods inEnzymology Vol.309：Amyloid，Prions and Other Protein Aggregates(R.Wetzel，Ed.Academic Press，Inc.，1999)、Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Balckwell，Eds.，1986，Blackwell ScientificPublications) 以 及 Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi，K.S.，Ed.CRC Press，1997)。
[0044] 在本发明的第一方面中，提供了检测样品中错折叠蛋白的存在和/或量的方法。通常，该方法包括提供包含或怀疑包含错折叠蛋白，如朊病毒的样品；提供至少一种构象探针；将样品和构象探针混合以产生混合物；温育混合物足够长的时间，以使得至少一分子错折叠蛋白以及至少一分子探针相结合，以形成复合物；将混合物暴露于使复合物与混合物中至少一种其它物质分离、至少部分分离的条件下；检测至少一种探针和错折叠蛋白之间的联系是否存在，其中所说的检测优选通过加入第二种构象探针以扩大分析信号而得以加强。当然，在本方面的各种实施例中，这些步骤可以以不同顺序进行以获得所期望的目标。
[0045] 依据本发明的方法，提供可以是任何导致包含或怀疑包含错折叠蛋白、或包含存在且可以用于本方法的构象探针的样品的活性。因此，提供可以包括从个体中移除组织、器官、身体部分或液体。同样它可包括从获得样品的个人、企业或政府机构获得生物样品，例如血液或肉类。另外，它也包括取得获得自个体样品，并以某种方式加工该样品，如除去一种或多种生物物质或其它物质。尽管本发明包括在样品和探针结合前就对样品进行加工，但在一些实施例中，并不进行此类加工。至于提供至少一种构象探针，此种提供可包含用任何适合的技术合成一种或多种构象探针，获得通过另一技术合成的一种或多种探针，以及获得两种或多种探针的混合物、或至少一种探针和污染物，接着至少在某一程度上从污染物中纯化探针。
[0046] 样品可以为包含或怀疑包含错折叠蛋白的任何样品。怀疑包含错折叠蛋白的样品可以是取自存在与错折叠蛋白有关的疾病或病症的任何动物或人的样品。因此，怀疑的程度不需要很高；只要知道或者怀疑样品所来自的个体 处于遭受与错折叠蛋白有关的疾病或病症风险的种群中就足够了。样品的实例包括但不限于，血液或血液产品或血液副产品；神经组织，包括但不限于脑组织，肉类或肉类副产品；皮肤或皮肤产物(包括粘膜)；肠衣(intestinecasings)；奶；以及尿液。
[0047] 在某些实施例中，与检测错折叠蛋白的方法同时进行一个或多个对照反应。在这些实施例中，对照反应被认为是本方法的一部分，尽管它们可以但非必须在单独的反应容器中进行。对照反应可以是阳性对照，也可以是阴性对照。可进行任何数量的对照以鉴定或者监视用于本发明方法中的任何步骤或任何组分的进行。在某些阳性对照中，已知提供的样品具有至少一种错折叠蛋白，因此被用于监视反应的成功，以及在适当时用于监视反应的灵敏性。在某些阴性对照中，已知样品不包含错折叠蛋白(例如蒸馏水或基于水的缓冲液)。而且，在某些实施例中，进行一系列的对照反应以获得标准曲线，将目的样品与其进行比较。正如本领域对于检测样品中物质的其它试验所已知的，可在检测错折叠蛋白方法之前、与检测错折叠蛋白方法同时或在检测错折叠蛋白方法之后进行对照反应。
[0048] 构象探针可以为任何满足上述标准的构象探针。各种适宜的示例性探针公开于公布的美国专利申请2005/0026165 A1中，其全部内容在此引入作为参考。优选的构象探针在此将在下文描述。构象探针可以作为单一探针提供(即相同肽的集合，其都具有相同的氨基酸序列)或可包括多个不同的探针(即两个或多个具有不同氨基酸序列的肽的集合，每一个肽以多拷贝出现)。在优选的实施例中，将一个或多个构象探针用可检测的部分标记。可检测标记的实例包括但不限于，发光标记、荧光标记、放射性标记以及免疫原性标记。
[0049] 可以任何形式提供探针，包括但不限于，在水中的纯溶液、干粉、或水或有机液体中的分散体。因此，它们可以以组合物提供，所述组合物仅包含纯化的探针、不同序列的纯化的探针的混合物、或未纯化的探针、或探针与一种或多种非探针物质(如缓冲液、液体或检测试剂)的混合物。探针可以包含单个标记或多个标记。在某些实施例中，每个探针上提供两个或多个标记。例如，本发明的一个探针可包含附着于探针的每一末端(N-末端以及C-末端)的标记。在一些实施例中，探针在与目标错折叠蛋白结合后构象的变化导致两个标记变得紧密接近，与标记没有紧密接近时产生的信号相比，探针产生的信号加强了。
[0050] 依据本方法，混合(combining)可以是引起样品的至少一部分与包含一种或多种探针的组合物的至少一部分形成单一组合物的任何作用。如在本方法所用的，这个单一的组合物称为混合物；然而，任何包含两种组分的单一组合物也包含于术语内。因此，混合可包含向样品中加入一种或多种探针的液体组合物，或反之亦然。同样，也包包含向样品中加入一种或多种探针的干组合物，或反之亦然。可将由此形成的混合物置于引起两种组合物彼此充分混合(例如离心、振荡、或抽吸)的条件下，或者，仅仅将两种组合物彼此加入并允许通过简单扩散、溶化等混合。样品和一种或多种探针如何混合并不重要，只要允许两者彼此接触以便至少一种探针能接触至少一种错折叠蛋白，如果该蛋白存在的话。
[0051] 该方法包括温育一种或多种探针及样品足够长的时间，以使得至少一分子错折叠蛋白与至少一分子探针结合以形成复合物。基于已知的物理特性如一种或多种探针和/或错折叠蛋白的浓度、温度、抑制或促进蛋白质和肽相互作用的物质是否存在等，温育的时间可以变化。本领域普通技术人员可以进行常规的试验，实施本发明，以便理解各种体系参数对温育时间的影响。
[0052] 本发明的方法包括将样品和一种或多种探针的混合物暴露于使探针和错折叠蛋白的复合物(如果复合物存在的话)与混合物中的至少一种其它物质分离、至少部分分离的条件下。这个分离步骤可以在温育步骤后进行、与温育步骤同时进行或部分地与温育步骤同时进行。
[0053] 在温育和分离同时进行的实施例中，可带来某些益处。当探针和目标蛋白发生结合时进行分离，从而减少检测错折叠蛋白的存在所需的时间，并消除检测错折叠蛋白的存在所需的步骤和试剂。快速检测探针和目标错折叠蛋白的复合物是可能的，因为探针和目标错折叠蛋白的复合物通常为具有独特的与众不同的特性(典型地归因于高水平的β-折叠结构的存在)的高分子量实体。可用快速、良好表征的技术如大小排阻层析或过滤使复合物与样品中的其它物质分离，至少部分分离。
[0054] 而且，同时进行温育和分离允许得到高灵敏性。也就是说，因为在检测前将混合物分离成两个或更多级分，并且所用的分离技术优选基于除去干扰信号产生或检测的物质的特性而加以选择，所以包含探针-错折叠蛋白复合物的级分相对于最初混合物具有改善的信噪比。由于包含探针-错折叠蛋白复合物的级分不含或者基本上不含干扰物质，检测复合物存在所需的信号量将低 于混合物自身所需的信号量。
[0055] 依据本发明的方法，可以通过任何适宜的技术实现分离。探针和错折叠蛋白复合物的一个方便的物理特征就是它们典型地具有大质量。因此，分离的适宜技术将利用复合物的大小，并可包括过滤或大小排阻层析。其它可利用的物理特征对本领域技术人员来说是显而易见的，包括在各种条件下的溶解性或疏水性，或例如对特定静止相的亲和力。在某些实施例中，分离可包含探针、目标多肽或者复合物与固体支持体如磁珠的结合，并依靠，至少部分依靠，固体支持体的特性以获得分离。
[0056] 本发明的方法包括检测与错折叠蛋白结合的探针的存在。检测可以通过本领域检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何已知的方式完成。在某些实施例中，标记探针，并通过检测与错折叠蛋白结合的探针所产生的信号的方式检测。在某些实施例中，探针包括两个产生信号的部分，当它们变得紧密接近时候，它们的信号得以增强。在这些实施例中，设计探针的氨基酸序列，以便探针与错折叠蛋白的结合使两个产生信号的部分得以紧密接近。
[0057] 本发明通常包括优先与错折叠蛋白的致病形式相互作用的肽。在某些实施例中，与朊病毒非致病形式相比，在此所述的肽优先与朊病毒的致病形式相互作用。用本发明优选的实施例可获得高灵敏性。获得高灵敏性的适宜的肽的实例包括在此所述的那些肽。在C Sc某些实施例中，与PrP 相比，肽优先与PrP 相互作用。肽可以特异于来自单一物种或多个Sc
物种的PrP 。
物种的PrP 。
[0058] 在优选的实施例中，加入本发明的一种或多种末端标记的肽，以便通过在一种或多种肽与致病的错折叠蛋白或朊病毒之间形成复合物来捕获致病的朊病毒。接着通过固相的方式在样品中富集复合物，所述固相包含一种或多种赋予使复合物与样品的至少一种其它组分、优选不与固相结合的样品的基本上所有剩余部分分离、至少部分分离的能力的特性。接着用包含溶剂的组合物如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，将固相(该固相包含至少一些目标复合物)富集(下拉)，并且所述组合物优选包含另外的可检测的双标记肽，所述另外的可检测的双标记肽有时在此称为检测扩增肽，以将信号扩大至某一程度，且为整个检测方法增加至少某些额外的灵敏性。例如，用离心步骤或者在固相是磁珠的情况下通过使用磁体，从样品富集(下拉)至少包含某些目标复合物的固相。一旦固定的目标复合物从样品富集，可以用标准的微量移液管除去剩余样品造成的干扰。接着，可以用标准的洗涤缓冲液如磷酸盐缓冲盐水 (PBS)洗涤固定的目标复合物，以进一步除去存在于最初的样品中的污染或干扰性物质。接着将包含目标肽以及捕获肽的固定的目标复合物在蒸馏水和/或PBS中重悬浮，并加入检测-扩增双标记肽以增加整体检测方法的特异性。
[0059] 在某些优选的实施例中，样品为血浆或血清。捕获肽为生物素末端标记的朊病毒探针(biotin end-labeled prion probe)：
[0060] Biotin-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV(SEQ.ID.NO.1)。
[0061] 固相为链霉抗生物素涂覆的磁珠，其能有效富集样品中肽-错折叠蛋白复合物的浓度。检测-扩增肽以嵌二萘(Pyrene)在两端都标记：
[0062] 嵌二萘-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-嵌二萘(SEQ.ID.NO.2)。
[0063] 外部荧光剂如嵌二萘可以允许使用普通的荧光检测技术检测构象变化。任选地，肽的一个末端存在额外的赖氨酸残基以增加嵌二萘标记的有效性：
[0064] 嵌二萘-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVVK-嵌二萘(SEQ.ID.NO.3)。
[0065] 朊病毒捕获肽的有效实施例包括至少以下序列：
[0066] 生物素-KPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.4)
[0067] 生物素-GGGKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.5)
[0068] 生物素-PPPKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.6)
[0069] 生物素-RRRKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.7)
[0070] 生物素-KKKKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.8)
[0071] H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVV-生物素(SEQ.ID.NO.9)
[0072] H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVGGG-生物素(SEQ.ID.NO.10)
[0073] H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVPPP-生物素(SEQ.ID.NO.11)
[0074] H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVRRR-生物素(SEQ.ID.NO.12)
[0075] H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVKKK-生物素(SEQ.ID.NO.13)
[0076] 生物素-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-OH
[0077] (SEQ.ID.NO.14)
[0078] 生物素-GGGVVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-OH
[0079] (SEQ.ID.NO.15)
[0080] 生物素-PPPVVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-OH
[0081] (SEQ.ID.NO.16)
[0082] 生物素-RRRVVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-OH
[0083] (SEQ.ID.NO.17)
[0084] 生物素-KKKVVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-OH
[0085] (SEQ.ID.NO.18)
[0086] 生物素-DVVDAGAADAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAADAAGADVVK
[0087] -OH (SEQ.ID.NO.19)
[0088] 生物素-KPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.20)
[0089] 生物素-GGGKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.21)
[0090] 生物素-PPPKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.22)
[0091] 生物素-RRRKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.23)
[0092] 生物素-KKKKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ.ID.NO.24)
[0093] H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVV-生物素(SEQ.ID.NO.25)
[0094] H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGG-生物素(SEQ.ID.NO.26)
[0095] H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVPPP-生物素(SEQ.ID.NO.27)
[0096] H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVRRR-生物素(SEQ.ID.NO.28)
[0097] H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVKKK-生物素(SEQ.ID.NO.29)
[0098] 生物素-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH
[0099] (SEQ.ID.NO.30)
[0100] 生物素-GGGVVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH
[0101] (SEQ.ID.NO.31)
[0102] 生物素-PPPVVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH
[0103] (SEQ.ID.NO.32)
[0104] 生物素-RRRVVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH
[0105] (SEQ.ID.NO.33)
[0106] 生物素-KKKVVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH
[0107] (SEQ.ID.NO.34)
[0108] 生物素-DVVDAGAADAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAADAAGADVVK-OH
[0109] (SEQ.ID.NO.35)
[0110] 用于朊病毒的检测扩增肽的有效实施例至少包括以下序列：
[0111] Pyr-DVVDAGAADAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAADAAGADVV-Pyr
[0112] (SEQ.ID.NO.36)
[0113] Pyr-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-Pyr
[0114] (SEQ.ID.NO.37)
[0115] Pyr-DVVDAGAADAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAADAAGADVV-Pyr
[0116] (SEQ.ID.NO.38)
[0117] Pyr-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-Pyr
[0118] (SEQ.ID.NO.39)
[0119] Pyr-DVVDAGAADAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAADAAGADVVK-Pyr
[0120] (SEQ.ID.NO.40)
[0121] Pyr-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVVK-Pyr
[0122] (SEQ.ID.NO.41)
[0123] Pyr-DVVDAGAADAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAADAAGADVVK-Pyr
[0124] (SEQ.ID.NO.42)
[0125] Pyr-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVVK-Pyr
[0126] (SEQ.ID.NO.43)
[0127] 其中Pyr为嵌二萘。
[0128] 当目标蛋白质为A-β时，捕获肽的有效实施例至少包括以下序列：
[0129] 生物素-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH(SEQ.ID.NO.44)
[0130] 生物素-GGGKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH(SEQ.ID.NO.45)
[0131] 生物素-PPPKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH(SEQ.ID.NO.46)
[0132] 生物素-RRRKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH(SEQ.ID.NO.47)
[0133] 生物素-KKKKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH(SEQ.ID.NO.48)
[0134] H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKGGG-生物素(SEQ.ID.NO.49)
[0135] H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKPPP-生物素(SEQ.ID.NO.50)
[0136] H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKRRR-生物素(SEQ.ID.NO.51)
[0137] H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKKKK-生物素(SEQ.ID.NO.52)
[0138] 虽然在此所述的实施例为优选的，对于探针组合物、捕获肽的标记、检测-扩增肽的标记、固相组合物及活性、以及样品来源和类型也存在同样有效的实施例。本领域技术人员可以理解基于所用的特定的分析技术，可以使用多种标记和固相。
[0139] 只要肽基本上保留所期望的活性，肽的衍生物也可包括对天然序列的修饰，如缺失、添加以及替换。这些修饰可以是故意的，如通过相应基因序列的定点诱变；也可以是偶然的，如通过产生该蛋白的宿主的突变，或者通过由于PCR扩增产生的错误。而且，可以产生具有如下一个或多个效果的修饰：降低毒性、增加对朊病毒的亲和力和/或特异性、促进细胞加工，以及促进向B-细胞和/或T-细胞的呈递。在此所描述的多肽可根据本领域多种方式制备，包括重组技术、合成、从自然来源或组织培养物中纯化。
[0140] 本发明的捕获肽以及检测-扩增肽可以为约10到约100个残基长度、优选约10-50个残基、更优选约15-约45个残基之间的任何长度。例如，它们可以为15-35个残基、20-35个残基、20-30个残基、25-35个残基、30-50个残基、至少具有10个残基的任何残基数目或范围、以及具有不多于100个残基的任何残基数目或范围。本领域技术人员能理解本发明也包含这些范围内任何具体的残基长度。
[0141] 也可以使用标记的类似物。为了举例说明，检测扩增肽可用嵌二萘以外的不同荧光部分双标记，例如嵌二萘丁酸盐/酯(Pyrene butyrate)、琥珀酰亚胺基1-嵌二萘(succinimidyl 1-pyrene)、核黄素、玫红酸、4-乙酰胺基-4’-异硫代氰酰均二苯乙烯-2，2’-二 磺 酸(4-acetamido-4 ′-isothiocyanatostilbene-2，2 ′ -disulfonic acid)、吖啶(acridine)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5二磺酸盐/酯(4-amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphtha-alimide-3，5 disulfonate)、邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)、香豆素(coumarin)、焰红染料(cyanosine)、4’，6-diaminidino-2-苯基吲哚(4’，6-diaminidino-2-phenyllindole，DAPI)、二亚乙基三胺五乙酸盐/酯(diethylenetriamine pentaacetate)、4，4’-二异硫代氰酰-二氢- 均 二 苯 乙 烯-2，2’- 二 磺 酸 (4，4’-diisothiocyanatodi-hydro-stilbene-2，
2’-disulfonic acid)、曙红(eosin)、曙红异硫氰酸盐/酯(eosin isothiocyanate)、赤藓红(erythrosine)、赤藓红B(erythrosin B)、异硫氰酸盐/酯(isothiocyanate)、乙啡啶(ethidium)、荧光素、5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein，FAM)、荧光素、荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate)、fluorescarnine、硝化酪氨酸(nitrotyrosine)、副品红(pararosaniline)、酚红(Phenol Red)、B-藻红蛋白(B-phycoerythrin)或邻-酞二醛(o-phthaldialdehyde)。优选的标记将形成受激子(excimer)的状态，使便利的信号检测成为可能。
2’-disulfonic acid)、曙红(eosin)、曙红异硫氰酸盐/酯(eosin isothiocyanate)、赤藓红(erythrosine)、赤藓红B(erythrosin B)、异硫氰酸盐/酯(isothiocyanate)、乙啡啶(ethidium)、荧光素、5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein，FAM)、荧光素、荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate)、fluorescarnine、硝化酪氨酸(nitrotyrosine)、副品红(pararosaniline)、酚红(Phenol Red)、B-藻红蛋白(B-phycoerythrin)或邻-酞二醛(o-phthaldialdehyde)。优选的标记将形成受激子(excimer)的状态，使便利的信号检测成为可能。
[0142] 在使用在此所述的固相的任何方法中，固相可为纤维素、修饰的纤维素中的一种或多种，或衍生自木质素纤维素生物质、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚交酯、聚丙烯酰胺、硅、橡胶、多糖、乳胶、聚氟乙烯、尼龙、聚氯乙烯、聚碳酸酯、淀粉、葡聚糖、壳多糖、沙子、硅石、浮石、琼脂糖、玻璃、金属的其他物质，以及以任何形式(如颗粒状、小珠、平面、杆状等)且具有任何表面或整体修饰或激活作用的任何此类物质，所述修饰选自由下列组成的组：表面糙化(surface roughening)、极性诱导(polarity induction)、酸性或碱性原位生成(acid or base site generation)、磁感应(magnetic induction)、热处理、疏水性修饰以及各种类型的涂覆。固相可以为微粒或以连续表面的形式，且包括膜、网、板、丸、载玻片、圆盘、毛细管、中空纤维、针、大头针、芯片、固体纤维、凝胶以及小珠。具体的固相可包括在此讨论的许多元件，例如链霉抗生物素涂覆的磁珠，或疏水多聚体涂覆的玻璃微粒。
[0143] 捕获肽优选以生物素标记(在肽的任一端或两端单标记)，并且固相优选包含链霉抗生物素涂覆的磁珠。链霉抗生物素是固相的优选涂覆蛋白质；然而，本领域技术人员会认识到其并非是可以利用的唯一蛋白质。例如，可以修饰链霉抗生物素以改变其配体结合特异性，包括它的生物素结合特异性，以对任何特定目的配体来说更高或更低。可使用的生物素类似物至少包括2-亚氨基生物素(2-iminobiotin)以及二氨基生物素(diaminobiotin)。
[0144] 尽管生物素-链霉抗生物素结合对特别有效，许多其它结合对也是可操作的。为了举例说明，但并非限制本发明的范围，其它适合的结合对至少包括：生物素-抗生物素蛋白、抗原-抗体、半抗原-抗体、模拟表位(mimetope)-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗物、凝集素-糖类、酶-底物或酶-底物类似物以及蛋白A-抗体Fc。
[0145] 对于使用捕获肽和检测-扩增肽的实施例，第一个肽和第二个肽可以基本上相同或不同。“基本上相同”意指第一个肽试剂和第二个肽试剂的不同仅在于第二个肽试剂包含可检测的标记。捕获肽和检测-扩增肽可以衍生自朊病毒相同区域的肽片段或朊病毒不同区域的肽片段。第一个肽试剂和第二个肽试剂可以每个各自独立地选择。
[0146] 在本发明中可以使用任何适宜的检测方式。在包含涉及使用标记肽的试验的实施例中，适宜用于本发明的可检测标记包括任何能检测的分子，包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、荧光半导体纳米晶体(fluorescentsemiconductor nanocrystals)、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染 料、金属离子、金属溶胶、配体(如生物素、链霉抗生物素或半抗原)及其类似物。另外的标记包括但不限于使用荧光的那些标记，以及包括那些在可检测的范围能显示荧光的物质及其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、若丹明、丹酰(dansyl)、伞形酮、dimethylacridinium ester(DMAE)、德克萨斯红、鲁米那、NADPH以及β-半乳糖苷酶。另外，可检测标记可包括寡核苷酸标签，其能用任何已知的核酸检测方法，包括PCR、TMA、b-DNA以及NASBA检测。
[0147] 所述部分或化学实体可以复合于或共价结合于肽的氨基或羧基端或其附近，该氨基或羧基端优选用短的疏水肽序列末端加帽。在本发明优选的方面，探针肽的氨基端或羧基端都用大小范围约为1-5个氨基酸的小疏水肽加帽。这些肽可以为天然的或合成的，但优选天然的(即衍生自目标蛋白质的β-片层形成区域)。荧光团优选附着于探针的氨基和/或羧基末端(优选两者)或其附近，并可以为例如嵌二萘、色氨酸、荧光素或若丹明。优选荧光团当位于正确的几何取向时形成受激子。
[0148] “受激子(excimer)”为并非必须是共价的加合物，且在受光子激发的分子实体以及相同的未受激发的分子实体之间形成。加合物实际上是暂时的，并且只存在到其通过发射光子发出荧光时。通过在比通常的发射光谱宽的波长下产生新的荧光波段，有可能辨认受激子(或受激子的形成)。受激子可与荧光共振能量转移区别开，因为激发光谱与单体相同。受激子的形成依赖于荧光团的几何排列，并且很大程度上受它们之间距离的影响。
[0149] 通过测量可以分析受激子形成的条件下的荧光光谱，可实现与被分析靶标相互作用后优选的构象转变。通常，以嵌二萘作为示范性的荧光团，激发波长可为约350nm，观察波长365-600nm。单体嵌二萘激发后的正常发射(简单荧光)记录为最大波长约370-385nm。
[0150] 本发明的方法可以定性、半定性或定量。当半定量或定量地实施本方法时，所述方法可进一步产生目的样品中错折叠蛋白浓度的一个或多个标准曲线，接着将从测试样品中获得的结果与一个或多个标准曲线做比较。通过参考此处教导以及标准的试验方法学，取决于测定特定目的样品的需要，本领域技术人员能理解如何基本上定性、基本上定量或半定量地实施本发明。
[0151] 在本发明的另一方面，检测方法可以与诊断人或非人类动物受试者的朊病毒有关Sc疾病的方法一起使用；确保基本上无PrP 的血液供给、血液产品供 给或食物供给；分析用于移植的器官和组织样品；以及监视医疗设备的净化。该方法包括通过在此所述任何方法从收集的血液样品检测血液样品(如全血、血浆、血小板或血清)中的朊病毒的步骤；除去检测出致病的朊病毒的任何样品；以及对未检测到致病的朊病毒的样品进行组合以提供基本上无致病的朊病毒的血液供给。在实施例中，该方法可通过仅仅将错折叠蛋白与探针结合以及除去探针-错折叠蛋白复合物，可以省略检测步骤本身。作为一般性问题，除去的蛋白的量可以以多种方式表示，如利用除去的百分比、除去的对数单位、或除去的相对量(例如倍数减少)。例如，当实施于TSE蛋白或颗粒时，该方法能获得一定对数单位的除去的感染性，如至少或约3个对数单位的除去的感染性，至少或约2个对数单位的除去的感染性，或至少或约1个对数单位的除去的感染性。当实施于加料样品(spiked sample)时，该方法优选使感染性至少减少3个对数单位。可选地，在地方性(endemic)样品中，该方法优选导致样品感染性低于2个对数单位，更优选感染性低于1个对数单位。另一个表示除去的目标物质量的方式是参考除去百分比。在实施例中，该方法可除去至少25％的目标蛋白、至少40％目标蛋白、至少50％目标蛋白、至少60％目标蛋白、至少65％目标蛋白、至少75％目标蛋白、至少80％目标蛋白、至少85％目标蛋白、至少90％目标蛋白、至少95％目标蛋白、至少98％目标蛋白或至少99％或更多目标蛋白，如至少99.5％、99.9％、以及99.99％的目标蛋白。
[0152] 在其它的方面，本发明包括制备基本上不含致病的朊病毒的食物供给品的方法，包括下列步骤：用任何在此所述的检测方法，检测朊病毒、样品收集自将进入食物供给的活的或死的有机体，或样品收集自预计进入食物供给的食物；鉴定检测到致病性朊病毒的样品；以及在检测了致病朊病毒的样品中，从食物供给中除去任何活的或死的有机体或预计进入食物供给的食物。这样的食物供应基本上不含致病的朊病毒。
[0153] 在其它的方面，本发明提供从样品中基本上除去致病的错折叠蛋白和朊病毒的方法。这个方法包括提供本发明的捕获肽、本发明的固相以及本发明的一种或多种检测-扩增肽。怀疑含有错折叠蛋白或朊病毒的蛋白与能产生高捕获率的优选肽一起温育，接着与优选的固相接触一段时间，借此，捕获肽与错折叠蛋白或朊病毒之间形成的复合物(如果存在的话)从样品中富集。可优化该技术以获得错折叠蛋白或朊病毒期望的除去效率，而通过向下拉相 中加入优选的双标记肽而可以方便地监测效率，使得分析技术可监测错折叠蛋白或朊病毒浓度随时间的降低。
[0154] 在此所述的任何方法中，样品可以为生物样品，所述生物样品获得或衍生自活的或一度存活的有机体，如器官、全血、血液级分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、骨髓、尿液、泪液、非神经系统组织、器官和/或活组织检查或尸体剖检。在优选的实施例中，生物样品包含血液、血液级分或血液组分。
[0155] 在另一方面，本方面提供了实施本发明方法的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒为诊断样品中至少一种错折叠蛋白存在、以及由此诊断与至少一种错折叠蛋白有关的疾病或病症的诊断试剂盒。在其它的实施例中，试剂盒为筛选人类医疗产品如血液、器官或组织中与疾病或病症有关的错折叠蛋白的存在的检测试剂盒。在其它的实施例中，试剂盒为监测与错折叠蛋白有关的疾病或病症的进展的检测试剂盒。
[0156] 通常，本发明的试剂盒包含实施本发明的一个或多个实施所必需的一些或所有组分。因此，本发明的试剂盒包含至少一种构象探针，如捕获肽和/或检测-扩增肽，其与预先确定的错折叠蛋白结合。一个或多个探针和其它组分可以于试剂盒中的一个或多个适合的容器内提供。试剂盒也可包含温育和/或分离一种或多种探针和一种或多种样品或探针-错折叠蛋白复合物所需要的一些或所有的缓冲液、试剂以及供给品。试剂盒可包含足够的组分以一次或多次进行本发明的方法。
[0157] 试剂盒的容器可以为任何适于容纳本发明的一种或多种物质的材料，如小瓶或安瓿。容器可由如玻璃、塑料、金属、纸、或纸产品的材料制作。在某些实施例中，容器为玻璃安瓿或塑料安瓿或可用如塞子、带螺纹的密封塞(stopper and crimp seal)或塑料帽或金属帽如螺口帽密封的小瓶。通常，容器与封口由能用热(干或湿)、辐射或与化学药品接触而灭菌的材料制成。
[0158] 在某些实施例中，容器包含足够量的肽以实施依据本发明的至少一种方法的至少一个实施例。因此，试剂盒可以是诊断试剂盒、分离试剂盒、测试试剂盒或对照试剂盒及其它。在某些实施例中，容器作为更大试剂盒的组分而提供，其包括适宜的包装以及任选地用法说明和其它的有关肽的使用的信息。通常，试剂盒包含一些或所有供给品和试剂以实施一个或多个对照反应，以确保试剂盒正确运行以及提供测试样品可与之比较的基线结果。
[0159] 在试剂盒的某些配置中，试剂盒包含多个容器，每一个容器可以包含肽(构象探针，即捕获肽和/或检测-扩增肽)以及其它的有益于进行本发明方法的一个或多个实施例的物质。在试剂盒包含另外的组分或物质的实施例中，它们可以与肽和/或组合物容纳于相同的或一个或多个不同的容器中。当试剂盒包含多个容器或一个容器和其它组分时，容器和组分被认为处于试剂盒内的包装组合中。当有多个容器时，每一个容器包含足够实施本发明的单个方法，如诊断样品中的错折叠蛋白的肽。
[0160] 本发明的试剂盒可包含有益于研究肽和错折叠蛋白的物质。此类研究包括如下试验：检测和/或研究各种肽的特性、功能以及效力；校准仪器；从样品中分离错折叠蛋白；研究肽和(各种阶段的和活性的)微粒之间的相互作用；校准肽的大小；校准分离技术；检查各种配体和蛋白质的相互作用；以及研究表面介导的反应。
[0161] 在某些实施例中，容器作为试剂盒的组分提供，该试剂盒包含适宜的包装以及任选地说明书和/或有关试剂盒内含物的其它信息。试剂盒通常是由结实的材料所制成，如纸板或塑料，以及包含直接印刷在上面的说明书或其它信息。本领域技术人员将立刻意识到通过本发明可想象到许多不同的容器尺寸和内容物的配置，因此并非所有的改变都需要详细地在此叙述。
[0162] 实施例
[0163] 在以下实施例中，将对本发明进一步描述，这些实施例对本发明的优选实施方式作出说明，并不能认为是以任何方式对本发明所做的限制。
[0164] 实施例1：检测生物样品中的朊病毒蛋白
[0165] 基本上按公开的美国专利申请2005/0026265 A1的描述，进行鼠脑样品中朊病毒蛋白的构象增殖试验，如图1所示。用如下所述的两端用嵌二萘标签进行标记的鼠特异性回文结构33-mer探针(SEQ.ID.NO.49)进行试验。下文提供其它的人类/仓鼠以及绵羊/牛朊病毒探针并且用于检测那些种类的朊病毒。
[0166] H2N-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-COOH
[0167] (鼠序列；SEQ.ID.NO.53)
[0168] H2N-VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVV-COOH
[0169] (人类/仓鼠序列；SEQ.ID.NO.54)
[0170] H2N-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-COOH
[0171] (绵羊/牛序列；SEQ.ID.NO.55)
[0172] 为了改进标记，已对上述序列进行了修饰使其在C-末端包含另外的赖氨酸(K)残基以允许加入嵌二萘标签(SEQ.ID.NO.56-58)。
[0173] H2N-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVVK-COOH
[0174] (SEQ.ID.NO.56)
[0175] H2N-VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVVK-COOH
[0176] (SEQ.ID.NO.57)
[0177] H2N-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVVK-COOH
[0178] (SEQ.ID.NO.58)
[0179] 实施例2：用鼠脑组织证明错折叠蛋白诊断学(Misfolded ProteinDiagnostics，MPD)试验的动力学组分
[0180] 获得绵羊瘙痒病感染动物以及健康动物的鼠脑组织，并在蔗糖梯度上分级。进行实施例1的MPD试验，用磷钨酸作为沉淀剂，随后加入鼠特异性肽探针。按照显示于图2 X-轴上的时程，让混合物在Tris∶TFE(50∶50)混合物中反应。结果显示在样品中适宜地检测朊病毒蛋白，其高于正常脑组织的背景水平。
[0181] 实施例3：依据本发明对含朊病毒的样品进行分级分离
[0182] 获得绵羊血清，并与绵羊特异性肽探针(参见上述序列)混合，并温育混合物足够长的时间，以使探针与血清中任何朊病毒蛋白结合。将混合物直接施加于琼脂糖4B柱，并收集级分。通过在发光平板读数计上在350nm激发并从350-600nm扫描，分析级分的荧光。在图3中描绘了来自健康和被感染的血清中每一级分的发光。这一数据为反应性级分从柱子中的洗脱提供了直观描绘。如所看到的，使用本发明的方法，不但可将有传染性的血清与健康的血清区分开，而且可以实时发生。因为在分级前将肽和样品一起温育，所以针对错折叠蛋白的试验在分级过程中进行。
[0183] 实施例4：未分级的绵羊血清样品的MPD试验
[0184] 按如下方式进行MPD试验。获得正常的绵羊血清以及朊病毒感染的绵羊血清，并直接施用于琼脂糖4B柱，收集级分。PBS也在琼脂糖4B柱上层析，作为阴性对照。本质上，该过程与图3中所描述的一致，例外的是在通过琼脂糖4B柱分级之前未将探针加入至血清中。
[0185] 对于每种样品(感染的、未感染的、PBS)，将从实施例3中确定的含有最高信噪比的级分独立地与绵羊特异的探针结合，并评价。来自被感染样品的显示受激子对单体的最高比例的级分被选择用于在此显示的动力学试验数据。对于健康的以及PBS对照也选择相同的级分数量。对于时程(动力学)试验，提供足够的时间以使探针与样品中任何朊病毒蛋白结合，使用典型的50∶50三氟乙醇溶剂条件进行MPD试验。然后在荧光扫描平板读数计上测试混合物的荧光，获得的数据显示于图4中。数据显示，以与图2中显示的数据相似的方式，在分级的绵羊血清中清楚可见该测定的成功动力学。
[0186] 实施例5：用人类血浆样品进行选择性捕获MPD
[0187] 将200μl人类血浆样品(所述人类血浆样品或者为sCJD，或者为汇集的正常的)用生物素标记的肽温育过夜。以25∶100、25∶200、50∶100或0∶100的生物素肽与珠的比例加入被覆链霉抗生物素的Dynal磁珠。用磁铁从血浆样品中除去富集的目标物质。洗涤和重悬浮后，加入双标记(嵌二萘)的荧光团肽，并在温育后，捕获发射扫描。图5显示了sCJD血浆样品和汇集的正常人血浆(NHP)之间成功的信号分离。
[0188] 实施例6：选择性捕获MPD试验剂量反应
[0189] 采用与实施例5相同的方案，不同之处在于sCJD85-137样品用正常人血浆以1∶2、1∶4以及1∶8稀释(图6)。将纯的人sCJD血浆用正常血浆稀释导致荧光信号成比例地、并且如同期望的在选择性捕获MPD试验中以剂量反应的方式减少。尽管起TSE
始sCJD85-137样品中存在的PrP 的实际水平未知，作为临床样本，期望的最高水平为
30-30IU/ml。用这一近似值，以及200μl的测试体积，纯样品可能含有4-6 IU，1∶2、1∶4以及1∶8两倍连续稀释将分别含有2-3 IU、1-1.5 IU以及0.5-0.75 IU。这些结果反映了LOD(检测水平)接近1IU。
始sCJD85-137样品中存在的PrP 的实际水平未知，作为临床样本，期望的最高水平为
30-30IU/ml。用这一近似值，以及200μl的测试体积，纯样品可能含有4-6 IU，1∶2、1∶4以及1∶8两倍连续稀释将分别含有2-3 IU、1-1.5 IU以及0.5-0.75 IU。这些结果反映了LOD(检测水平)接近1IU。
[0190] 实施例7：用绵羊血清样品的选择性捕获MPD方案
[0191] 采用与实施例5相同的方案，不同之处在于测试的样品为两个不同的绵羊瘙痒病绵羊血清样品以及两个正常的健康的绵羊血清样品(图7)。对绵羊血清样品来说，选择性Sc TSE捕获MPD方案是成功的。在正常的绵羊血清和受感染的绵羊瘙痒病(PrP 或PrP )绵羊血清之间，信噪比极好。
[0192] 实施例8：从磁珠上顺序洗涤捕获的sCJD底物的效果
[0193] 图8显示了PrPTSE(sCJD 85-137)底物与生物素标记的捕获肽相结合，以及与固相TSE(磁珠)有效相互作用的直接证据。在PBS中重复洗涤引起PrP 脱离。这个试验证明双标记的荧光团肽的相互作用取决于什么与磁珠上的“下拉(pull-down)”物质结合。生物素TSE
标记的肽捕获目标(PrP )物质，而生物素标记的肽自身与覆盖磁珠表面的链霉抗生物素结合。这一物质可以通过连续的PBS洗涤洗掉。图8显示当洗涤的次数增加时，对于sCJD样品，与荧光团标记的检测肽的受激子峰，即430-500nm有关的信号显著减少，但对于汇集的正常人血浆样品则不是这样。特别地，图8A以及图8B显示两个样品中受激子对单体的比例(图8A)以及显示两个未洗涤样品的峰值发射的荧光扫描(图8B)，而图8C和图8D显示样品洗涤三次后来自相同测试的数据，而图8E以及图8F显示样品洗涤5次后来自相同测试的数据。
标记的肽捕获目标(PrP )物质，而生物素标记的肽自身与覆盖磁珠表面的链霉抗生物素结合。这一物质可以通过连续的PBS洗涤洗掉。图8显示当洗涤的次数增加时，对于sCJD样品，与荧光团标记的检测肽的受激子峰，即430-500nm有关的信号显著减少，但对于汇集的正常人血浆样品则不是这样。特别地，图8A以及图8B显示两个样品中受激子对单体的比例(图8A)以及显示两个未洗涤样品的峰值发射的荧光扫描(图8B)，而图8C和图8D显示样品洗涤三次后来自相同测试的数据，而图8E以及图8F显示样品洗涤5次后来自相同测试的数据。
[0194] 对本领域技术人员而言，在本发明实施过程中做各种的修饰和变化而未偏离本发明范围或精神是显而易见的。考虑到本发明的说明书以及实施，本发明其它的实施例对本领域技术人员而言是显而易见的。说明书以及实施例仅意欲作为示例性，而本发明真正的范围和精神在随后的权利要求书中指明。
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