特异性结合蛋白及其用途
阅读：377发布：2023-02-24
专利汇可以提供特异性结合蛋白及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及特异性结合成员，特别是 抗体 及其 片段 ，其与扩增的表皮生长因子受体（EGFR）和EGFR的de2-7 EGFR截短结合。特别地，由特异性结合成员特别是抗体及其片段识别的表位在异常翻译后修饰后是增强的或明显的。这些特异性结合成员在癌症诊断和 治疗 中是有用的。本发明的结合成员还可以与 化学治疗 或抗癌剂和/或与其他抗体或其片段组合在治疗中使用。，下面是特异性结合蛋白及其用途专利的具体信息内容。
1.能够结合EGFR的分离抗体，所述EGFR在包含EGFR基因扩增的肿瘤上，其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝，以及所述EGFR在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上，其中所述抗体不与由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的de2-7 EGFR连接肽结合，其中所述抗体与人野生型EGFR的残基287-302（SEQ ID NO:14）序列内的表位结合，并且其中所述抗体不包括具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链可变区序列且不包括具有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的轻链可变区序列。
2.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:129中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO:134中所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，所述区域具有与SEQ ID NOS:44、45和46中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
7.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，所述区域具有与SEQ ID NOS:49、50和51中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
8.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，所述区域具有与SEQ ID NOS:130、131和132中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
9.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，所述区域具有与SEQ ID NOS:135、136和137中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
10.根据权利要求1的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，所述区域具有与SEQ ID NOS:23、24和25中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
特异性结合蛋白及其用途
[0001] 本申请是国际申请日为2010年2月17日、国际申请号为PCT/US2010/024407、进入国家阶段的申请号为201080017279.4、发明名称为“特异性结合蛋白及其用途”的PCT申请的分案申请。
[0002] 相关申请数据
[0003] 本国际PCT专利申请要求于2009年2月18日提交的美国专利申请号12/388,504的优先权，其公开内容在此整体引入作为参考。本国际PCT专利申请还整体引入下述各自的公开内容作为参考：于2002年5月13日提交的美国专利申请号10/145,598(现在的美国专利号7,589,180，于2009年9月15日授权)；于2001年5月11日提交的美国临时专利申请号60/290,410；于2001年9月28日提交的美国临时专利申请号60/326,019；于2001年12月21日提交的美国临时专利申请号60/342,258；于2002年5月13日提交的国际PCT专利申请号PCT/US02/15185(于2002年11月21日作为WO 02/092771公开)；于2008年8月14日提交的国际PCT专利申请号PCT/US2008/009771(于2009年2月19日作为WO
2009/023265公开)；和于2007年8月14日提交的美国临时专利申请号60/964,715。
2009/023265公开)；和于2007年8月14日提交的美国临时专利申请号60/964,715。
技术领域
[0004] 本发明涉及特异性结合成员，特别是抗体及其片段，其与扩增的表皮生长因子受体(EGFR)和EGFR外显子2-7的框内缺失结合，所述缺失导致缺少来自细胞外结构域的267个氨基酸的截短的EGFR受体(de2-7EGFR)。特别地，由特异性结合成员特别是抗体及其片段识别的表位在异常翻译后修饰后是增强的或明显的。这些特异性结合成员在癌症诊断和治疗中是有用的。本发明的结合成员还可以与化学治疗或抗癌剂和/或与其他抗体或其片段组合在治疗中使用。
背景技术
[0005] 增殖性疾病特别是癌症通过化学治疗手段的治疗通常依赖于利用人或动物体内靶增殖细胞和其他正常细胞中的差异。例如，许多化学试剂设计为由快速复制DNA吸收，从而使得PCR复制和细胞分裂的过程被破坏。另一种方法是鉴定在肿瘤细胞或其他异常细胞表面上的抗原，其在发育人组织中通常不表达，例如肿瘤抗原或胚胎抗原。此类抗原可以由结合蛋白例如可以阻断或中和抗原的抗体靶向。此外，包括抗体及其片段的结合蛋白可以递送毒性试剂或能够直接或间接激活在肿瘤部位上的毒性试剂其他物质。
[0006] EGFR是用于肿瘤靶向抗体治疗的吸引人的靶，因为它在许多类型的上皮肿瘤中是超表达的(Voldborg等人(1997).Epidermal growth factor receptor(EGFR)and EGFR mutations，function and possible role in clinical trials.Ann Oncol.8，1197-206；den Eynde，B.和 Scott，A.M.Tumor Antigens.In：P.J.Delves 和I.M.Roitt( 编 辑 )，Encyclopedia of Immunology，第二版，第2424-31页.London：Academic Press(1998))。
此外，EGFR的表达与许多肿瘤类型中的不良预后相关，包括胃、结肠、膀胱、乳腺、前列腺、子宫内膜、肾和脑(例如神经胶质瘤)。因此，许多EGFR抗体已在文献中由几项正在进行的临床评估报道(Baselga等人(2000)Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin.J.Clin.Oncol.18，904；Faillot等人(1996)：A phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas.Neurosurgery.39，478-83；Seymour，L.(1999)Novel anti-cancer agents in development：exciting prospects and new challenges.Cancer Treat.Rev.25，
301-12))。
此外，EGFR的表达与许多肿瘤类型中的不良预后相关，包括胃、结肠、膀胱、乳腺、前列腺、子宫内膜、肾和脑(例如神经胶质瘤)。因此，许多EGFR抗体已在文献中由几项正在进行的临床评估报道(Baselga等人(2000)Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin.J.Clin.Oncol.18，904；Faillot等人(1996)：A phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas.Neurosurgery.39，478-83；Seymour，L.(1999)Novel anti-cancer agents in development：exciting prospects and new challenges.Cancer Treat.Rev.25，
301-12))。
[0007] 来自在具有头与颈癌、鳞状细胞肺癌、脑神经胶质瘤和恶性星形细胞瘤的患者中使用EGFR mAbs的研究的结果是鼓舞人心的。大多数EGFR抗体的抗瘤活性通过其阻断配体结合的能力得到增强(Sturgis等人(1994)Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cancer.Otolaryngol.Head Neck.Surg.111，633-43；Goldstein 等 人 (1995)Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumor xenograft model.Clin.Cancer Res.1，1311-8)。此类抗体可以通过细胞增殖和抗体依赖性免疫功能(例如补体激活)的调节介导其功效。然而，这些抗体的使用可以通过器官中的摄取受到限制，所述器官具有高内源水平的EGFR，例如肝脏和皮肤(Baselga等人，2000；Faillot等人，1996)。
[0008] 包含EGFR基因扩增(即EGFR基因的多个拷贝)的显著比例的肿瘤也共表达截短形式的受体(Wikstrand等人(1998)The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFR)：characterization and utilization as an immunotherapeutic target.J.Neurovirol.4，148-158)，其称为de2-7EGFR、ΔEGFR或Δ2-7(本文可互换使用的术语)(Olapade-Olaopa等人(2000)Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.Br.J.Cancer.82，186-94)。de2-7EGFR中可见的重排导致缺乏跨越外显子2-7的801个核苷酸的框内成熟mRNA(Wong等人(1992)Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas.Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，2965-9；Yamazaki等人(1990)A deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors.Jpn.J.Cancer Res.81，773-9；Yamazaki等人(1988)Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene(c-erbB)in human brain tumors.Mol.Cell Biol.8，1816-20；Sugawa等人(1990)Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，8602-6)。相应EGFR蛋白质具有包括细胞外结构域的残基6-273的267个氨基酸缺失和在融合连接处的新甘氨酸残基(Sugawa等人，1990)。这种缺失连同甘氨酸残基的插入一起在缺失界面上产生独特的连接肽(Sugawa等人，1990)。
[0009] de2-7EGFR已在许多肿瘤类型中得到报道，包括神经胶质瘤、乳腺、肺、卵巢和前 列 腺 (Wikstrand 等 人 (1997)Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor，EGFRvIII.Cancer Res.57，4130-40；Olapade-Olaopa等人(2000)Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.Br.J.Cancer.82，186-94；Wikstrand， 等 人 (1995)Monoclonal antibodies against EGFRvIII in are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.Cancer Res.55，3140-8；Garcia de Palazzo等人(1993)Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.Cancer Res.53，3217-20)。虽然这种截短受体不结合配体，但它具有低组成活性且对在裸鼠中作为肿瘤异种移植物生长的神经胶质瘤细胞赋予显著生长优势(Nishikawa等人 (1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，7727-31)，并且能够转化NIH3T3细胞(Batra等人(1995)Epidermal growth factor ligand independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6，1251-9)和MCF-7细胞。在神经胶质瘤细胞中由de2-7EGFR采用的细胞机制未完全限定，但据报道包括凋亡的减少(Nagane等人(1996)A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis.Cancer Res.56，5079-86)和增殖的小的增强(Nagane等人，1996)。
[0010] 因为这种截短受体的表达局限于肿瘤细胞，所以它代表用于抗体治疗的高度特异性靶。相应地，许多实验室已报道对于de2-7EGFR的独特肽特异的多克隆(Humphrey等 人 (1990)Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，4207-11)和单克隆(Wikstrand等人(1995)Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas；Okamoto等人(1996)Monoclonal antibody against the fusion junction of a deletion-mutant epidermal growth factor receptor.Br.J.Cancer.73，1366-72；Hills 等 人 (1995)Specific targeting of a mutant，activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.Int.J.Cancer.63，537-43)抗体。在用独特的de2-7肽免疫接种后分离的一系列小鼠mAbs全都显示对于截短受体的选择性和特异性，并且靶向在裸鼠中生长的de2-7EGFR阳性异种移植物(Wikstrand等人(1995)；Reist等人(1997)Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenografts after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.57，1510-5；Reist 等 人 (1995)Tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies：use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenografts.Cancer Res.55，4375-82)。
[0011] 然而，de2-7EGFR抗体的一个潜在缺点是仅部分显示EGFR基因扩增的肿瘤也表达de2-7EGFR(Ekstrand等人(1992)Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-and/or C-terminal tails.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，4309-13)。包含de2-7EGFR的肿瘤的确切百分比未完全确定，因为不同技术(即PCR与免疫组织化学比较)和各种抗体的使用已产生关于其存在频率的广泛范围的报道值。公开的数据指出约25-30％神经胶质瘤表达de2-7EGFR，其表达在间变性星形细胞瘤中最低，并且在多形性成胶质细胞瘤中最高(Wong等人(1992)；Wikstrand等人(1998)The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFR)：characterization and utilization as an immunotherapeutic target.J.Neurovirol.4，148-58；Moscatello等人(1995)Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.Cancer Res.55，5536-9)。已报道在de2-7EGFR表达胶质细胞瘤内的阳性细胞比例范围为37-86％(Wikstrand等人(1997))。发现27％乳腺癌和17％肺癌对于de2-7EGFR是阳性的(Wikstrand等人(1997)；Wikstrand等人(1995)；Wikstrand等人(1998)；和Hills等人，1995)。因此，de2-7EGFR特异性抗体将预期仅在一定百分数的EGFR阳性肿瘤中是有用的。
[0012] 因此，虽然EGFR抗体活性的现存证据是鼓舞人心的，但仍存在上文反映的在可应用性和功效范围上所观察到的局限性。相应地，将希望开发证实对于广泛范围肿瘤的功效的抗体和相似试剂，并且其针对本发明所涉及目的的实现。
[0013] 本文参考文献的引用不应解释为承认它们是本发明的现有技术。
发明内容
[0014] 本发明提供了识别EGFR表位的分离的特异性结合成员，特别是抗体或其片段，所述EGFR表位不证实来自野生型EGFR的任何氨基酸序列改变或置换，并且在肿瘤发生、过度增生或异常细胞中发现，并且在正常或野生型细胞中一般是不可检测的(如本文使用的，术语“野生型细胞”考虑表达内源EGFR但不是de 2-7EGFR的细胞，并且该术语特别地排除超表达EGFR基因的细胞；术语“野生型”指在正常细胞中而不是在异常或肿瘤发生细胞中存在的基因型或表型或其他特征)。在一个进一步方面，本发明提供了识别EGFR表位的特异性结合成员，特别是抗体或其片段，所述EGFR表位在肿瘤发生、过度增生或异常细胞中发现，并且在正常或野生型细胞中一般是不可检测的，其中所述表位在异常翻译后修饰或异常表达后是增强的或明显的。在本文提供的一个特别非限制性范例中，EGFR表位是增强的或明显的，其中翻译后修饰对于在野生型细胞中的EGFR正常表达可见的程度不是完全或充分的。在一个方面，EGFR表位在起始或简单碳水化合物修饰或早期糖基化特别是高甘露糖修饰后是增强的或明显的，并且在复杂碳水化合物修饰的存在下是减少的或并非明显的。
[0015] 在不存在异常表达的情况下和在正常EGFR翻译后修饰的存在下，可以是抗体或其片段例如其免疫原性片段的特异性结合成员基本上不结合或识别包含正常或野生型EGFR表位的正常或野生型细胞。
[0016] 更具体而言，本发明的特异性结合成员可以是抗体或其片段，其识别EGFR表位，所述表位在超表达EGFR(例如EGFR基因是扩增的)或表达de2-7EGFR的细胞中存在，特别是在异常翻译后修饰的存在下，并且在正常条件下在表达EGFR的细胞中一般是不可检测的，特别是在正常翻译后修饰的存在下。
[0017] 本发明人已开发了新单克隆抗体，在本文中通过指名为mAb806、ch806、hu806、mAb175、mAb124和mAb1133的抗体示例，这特异性识别异常表达的EGFR。特别地，本发明的抗体识别在肿瘤发生、过度增生或异常细胞中发现，并且在正常或野生型细胞中一般不可检测的EGFR表位，其中所述表位在异常翻译后修饰后是增强的或明显的。本发明的新抗体也识别扩增的野生型EGFR和de2-7EGFR，但与不同于de2-7EGFR突变的独特连接肽的表位结合。本发明的抗体特异性识别异常表达的EGFR，包括扩增的EGFR和突变型EGFR(在本文中通过de2-7突变示例)，特别是在异常翻译后修饰后。另外，虽然这些抗体不识别在表达正常量EGFR的神经胶质瘤细胞系的细胞表面上表达时的EGFR，但它们的确与ELISA板表面上固定的EGFR(sEGFR)的细胞外结构域结合，指示构象表位的识别。这些抗体与A431细胞的表面结合，其具有EGFR基因的扩增但不表达de2-7EGFR。重要的是，这些抗体不与正常组织例如肝脏和皮肤显著结合，肝脏和皮肤表达比大多数其他正常组织中更高水平的内源、野生型(wt)EGFR，但其中EGFR不是异常表达的或扩增的。
[0018] 本发明的抗体可以特异性分类EGFR肿瘤或肿瘤发生细胞的性质，其通过染色或以其他方式识别其中存在异常EGFR表达，包括EGFR扩增和/或EGFR突变，特别是de2-7EGFR的那些肿瘤或细胞进行。进一步地，本发明的抗体证实针对包含扩增的EGFR的肿瘤和针对de2-7EGFR阳性异种移植物的显著体内抗瘤活性。
[0019] 这些抗体与de2-7EGFR和扩增的EGFR但不与正常、野生型EGFR结合的独特特异性提供了诊断和治疗用途，以鉴定、表征和靶向许多肿瘤类型，例如头与颈、乳腺或前列腺瘤和神经胶质瘤，而无用先前已知的EGFR抗体可能见到的与正常组织摄取相关的问题。
[0020] 相应地，本发明提供了特异性结合蛋白，例如抗体，其在不同于连接肽的表位上与de2-7EGFR结合，但在不存在EGFR基因扩增的情况下基本上不与正常细胞上的EGFR结合。扩增意欲包括细胞包含EGFR基因的多个拷贝。
[0021] 优选地，通过本发明抗体识别的表位定位于包括成熟的正常或野生型EGFR序列的残基273-501的区域内，并且优选地包括成熟的正常或野生型EGFR序列的残基287-302(SEQ ID NO：14)。因此，还提供的是特异性结合蛋白例如抗体，其在定位于包括EGFR序列的残基273-501和/或287-302(SEQ ID NO：14)的区域内的表位上与de2-7EGFR结合。该表位可以通过本领域技术人员已知的任何常规表位作图技术进行测定。可替代地，可以消化编码残基273-501和/或287-302(SEQ ID NO：14)的DNA序列，并且在合适宿主中表达所得到的片段。抗体结合可以如上所述进行测定。
[0022] 在一个优选方面，抗体是具有本发明人已鉴定且表征的抗体特征、特别是识别异常表达的EGFR的抗体，如在扩增的EGFR和de2-7EGFR中发现的。
[0023] 在另一个方面，本发明提供了能够与本发明抗体竞争的抗体，竞争是在其中具有本发明抗体的VH和VL链序列的至少10％抗体通过在ELISA测定中与此类抗体竞争阻断与de2-7EGFR结合的条件下。特别地，在本文中考虑并且示例了抗独特型抗体。本文提供了抗独特型抗体LMH-11、LMH-12和LMH-13。
[0024] 抗体与其靶抗原的结合通过其重和轻链的互补决定区(CDRs)介导，其中CDR3的作用具有特别重要性。相应地，基于本发明抗体的重或轻链和优选地两者的CDR3区域的特异性结合成员将是用于体内治疗的有用的特异性结合成员。
[0025] 相应地，特异性结合蛋白，例如基于鉴定的本发明抗体的CDRs特别是CDR3区域的抗体，对于靶向具有扩增的EGFR的肿瘤将是有用的，不管其de2-7EGFR状态。因为本发明抗体不与正常、野生型受体显著结合，所以它们在正常组织中将不显著摄取，这是目前开发的EGFR抗体的局限性。
[0026] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体不与由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的de2-7EGFR连接肽结合，其中所述抗体与在人野生型EGFR的残基287-302(SEQ ID NO：14)的序列内的表位结合，并且其中所述抗体不包括具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的重链可变区序列，并且不包括具有SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的轻链可变区序列。
[0027] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，所述重链具有SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO：47中所示的氨基酸序列。
[0028] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，所述重链具有SEQ ID NO：129中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO：134中所示的氨基酸序列。
[0029] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，所述重链具有SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。
[0030] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，所述重链具有SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列。
[0031] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：44、45和46中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0032] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：49、50和51中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0033] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：130、131和132中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0034] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：135、136和137中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0035] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：23、24和25中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0036] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：28、29和30中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0037] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：33、34和35中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0038] 在另一个方面，提供了其中抗体包括重链和轻链的分离抗体，其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：38、39和40中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0039] 在另一个方面，提供了分离抗体，其中所述分离抗体是抗体F(ab′)2、scFv片段、双抗体、三抗体或四抗体的形式。
[0040] 在另一个方面，提供了进一步包括可检测或功能标记的分离抗体。
[0041] 在另一个方面，可检测或功能标记是共价附着的药物。
[0042] 在另一个方面，标记是放射性标记。
[0043] 在另一个方面，提供了分离抗体，其中所述分离抗体是加入聚乙二醇的。
[0044] 在另一个方面，提供了包括编码本文所述的分离抗体的序列的分离核酸。
[0045] 在另一个方面，提供了制备分离抗体的方法，其包括在引起抗体表达的条件下表达如上文和本文所述的核酸，并且回收抗体。
[0046] 在另一个方面，提供了治疗人患者中的肿瘤的方法，其包括给患者施用有效量的本文所述的分离抗体。
[0047] 在另一个方面，提供了用于诊断其中EGFR异常表达或其中EGFR以截短蛋白质形式表达的肿瘤的试剂盒，其包括本文所述的分离抗体。
[0049] 在另一个方面，提供了包括如本文所述的分离抗体的药物组合物。
[0050] 在另一个方面，药物组合物进一步包括药学上可接受的媒介物(vehicle)、载体(carrier)或稀释剂。
[0051] 在另一个方面，药物组合物进一步包括选自化学治疗剂、抗EGFR抗体、放射免疫治疗剂及其组合的抗癌剂。
[0053] 在另一个方面，酪氨酸激酶抑制剂选自AG1478、ZD1839、STI571、OSI-774、SU-6668及其组合。
[0054] 在另一个方面，抗EGFR抗体选自抗EGFR抗体528、225、SC-03、DR8.3、L8A4、Y10、ICR62、ABX-EGF及其组合。
[0056] 在另一个方面，提供了用于治疗在哺乳动物中产生异常表达的EGFR的脑驻留癌症(brain-resident cancers)的方法，其包括给哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物。
[0057] 在另一个方面，脑驻留癌症选自成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤(medulloblastomas)、脑膜瘤、赘生性星形细胞瘤(neoplastic astrocytomas)和赘生性动静脉畸形(neoplastic arteriovenous malformations)。
[0058] 在另一个方面，提供了用重组DNA分子转化的单细胞宿主，所述重组DNA分子编码本文所述的分离抗体。
[0059] 在另一个方面，单细胞宿主选自在组织培养中的大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母，CHO、YB/20、NSO、SP2/O、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10细胞，植物细胞、昆虫细胞和人细胞。
[0060] 在另一个方面，提供了用于检测扩增的EGFR、de2-7EGFR或具有高甘露糖糖基化的EGFR的存在的方法，其中所述EGFR通过下述进行测量：(a)在允许EGFR与分离抗体的结合发生的条件下，使来自其中怀疑存在扩增的EGFR、de2-7EGFR或具有高甘露糖糖基化的EGFR的哺乳动物的生物样品与权利要求1的分离抗体接触；和(b)检测在来自样品的EGFR和分离抗体之间的结合是否已发生；其中结合的检测指示样品中EGFR的存在或活性。
[0061] 在检测扩增的EGFR、de2-7EGFR或具有高甘露糖糖基化的EGFR的存在的方法的另一个方面，EGFR的存在的检测指示哺乳动物中肿瘤或癌症的存在。
[0062] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，并且所述轻链具有与SEQ ID NO：47中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
[0063] 在另一个方面，抗体的重链包括SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列，并且其中抗体的轻链包括SEQ ID NO：47中所示的氨基酸序列。
[0064] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：44、45和46中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列，并且其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：49、50和51中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0065] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO：129中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，并且所述轻链具有与SEQ ID NO：134中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
[0066] 在另一个方面，抗体的重链包括SEQ ID NO：129中所示的氨基酸序列，并且其中抗体的轻链包括SEQ 1D NO：134中所示的氨基酸序列。
[0067] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：130、131和132中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列，并且其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：135、136和137中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0068] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，并且所述轻链具有与SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
[0069] 在另一个方面，抗体的重链包括SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列，并且其中抗体的轻链包括SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。
[0070] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：23、24和25中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列，并且其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：28、29和30中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0071] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，并且所述轻链具有与SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
[0072] 在另一个方面，抗体的重链包括SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列，并且其中抗体的轻链包括SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列。
[0073] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：33、34和35中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列，并且其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：38、39和40中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
[0074] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体不与由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的de2-7EGFR连接肽结合，其中所述抗体与在人野生型EGFR的残基287-302的序列内的表位结合，所述抗体包括轻链和重链，其中所述轻链的可变区包括第一个多肽结合结构域区域，其具有与式I中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0075] HSSQDIXaa1SNIG (I)，
[0077] 第二个多肽结合结构域区域，其具有与式II中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0078] HGTNLXaa2D (II)，
[0079] 其中Xaa2是具有荷电极性R基团的氨基酸残基(SEQ ID NO：152)；
[0080] 和第三个多肽结合结构域区域，其具有与式III中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0081] VQYXaa3QFPWT (III)，
[0082] 其中Xaa3选自A、G和对于A或G是保守置换的氨基酸残基(SEQ ID NO：153)；和[0083] 其中所述重链的可变区包括第一个多肽结合结构域区域，其具有与式IV中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0084] SDXaa4AWN (IV)，
[0085] 其中Xaa4选自F、Y和对于F或Y是保守置换的氨基酸残基(SEQ ID NO：154)；
[0086] 第二个多肽结合结构域区域，其具有与式V、式VI或式VII中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0087] YISYSGNTRYXaa5PSLKS (V)，
[0088] 其中Xaa5是具有不荷电极性R基团的氨基酸残基(SEQ ID NO：155)，
[0089] YISYSXaa6NTRYNPSLKS (VI)，
[0090] 其中Xaa6选自G、A和对于G或A是保守置换的氨基酸残基(SEQ ID NO：156)，[0091] YISYSGNTRYNPSLXaa7S (VII)，
[0092] 并且Xaa7是碱性氨基酸残基(SEQ ID NO：157)；和
[0093] 第三个多肽结合结构域区域，其具有与式VIII中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0094] Xaa8TAGRGFPY (VIII)，
[0095] 其中Xaa8选自V、A和对于V或A是保守置换的氨基酸残基(SEQ ID NO：158)，[0096] 并且其中抗体不包括具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的重链可变区序列，并且不包括具有SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的轻链可变区序列。
[0097] 在另一个方面，Xaa1是N；Xaa2是D；Xaa3是A；Xaa4是F；Xaa5是具有不荷电极性R基团的氨基酸残基；Xaa6是G；Xaa7是K；并且Xaa8是V。
[0098] 在另一个方面，Xaa5是N或Q。
[0099] 在另一个方面，Xaa1是N或S。
[0100] 在另一个方面，Xaa2是D或E。
[0101] 在另一个方面，Xaa3是A或G。
[0102] 在另一个方面，Xaa4是F或Y。
[0103] 在另一个方面，Xaa5是N或Q。
[0104] 在另一个方面，Xaa6是G或A，并且Xaa7独立地是K或R。
[0105] 在另一个方面，Xaa8是V或A。
[0106] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体不与由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的de2-7EGFR连接肽结合，其中所述抗体与在人野生型EGFR的残基273-501的序列内的表位结合，
[0107] 所述抗体包括轻链和重链，其中所述轻链的可变区包括具有氨基酸序列HSSQDINSNIG(SEQ ID NO：18)的第一个多肽结合结构域区域；具有氨基酸序列HGTNLDD(SEQ ID NO：19)的第二个多肽结合结构域区域；和具有氨基酸序列VQYAQFPWT(SEQ ID NO：20)的第三个多肽结合结构域区域，
[0108] 其中所述重链的可变区包括具有氨基酸序列SDFAWN(SEQ ID NO：15)的第一个多肽结合结构域区域；第二个多肽结合结构域区域，其具有与式IX中所示的氨基酸序列对应的氨基酸序列：
[0109] YISYSGNTRYXaa9PSLKS (IX)
[0110] 其中Xaa9是具有不荷电极性R基团的氨基酸残基(SEQ ID NO：159)；和
[0111] 具有氨基酸序列VTAGRGFPY(SEQ ID NO：17)的第三个多肽结合结构域区域。
[0112] 在另一个方面，抗体与在人野生型EGFR的残基287-302(SEQ ID NO：14)的序列内的表位结合。
[0113] 在另一个方面，Xaa9是N或Q。
[0114] 在另一个方面，结合结构域区域由人抗体构架携带。
[0115] 在另一个方面，人抗体构架是人IgG1抗体构架。
[0116] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，并且所述轻链具有与SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
[0117] 在另一个方面，抗体的重链包括SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，并且其中抗体的轻链包括SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。
[0118] 在另一个方面，提供了能够结合在包含EGFR基因扩增的肿瘤(其中所述肿瘤的细胞包含EGFR基因的多个拷贝)和在表达截短形式的EGFR受体de2-7的肿瘤上的EGFR的分离抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ ID NOS：15、16和17中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列，并且其中所述轻链的可变区包括多肽结合结构域区域，其具有与SEQ IDNOS：18、19和20中所示的氨基酸序列高度同源的氨基酸序列。
附图说明
[0120] 图1呈现了神经胶质瘤细胞系的流式细胞术分析结果。U87MG(浅灰色直方图)和U87MG.Δ2-7(深灰色直方图)细胞如所示的用无关IgG2b抗体(空心直方图)、DH8.3(对于de2-7EGFR特异)、mAb806或528(结合野生型和de2-7EGFR)进行染色。
[0121] 图2A-D代表mAb806、mAbDH8.3和mAb528的ELISA结果。(A)增加浓度的mAb806(▲)DH8.3(●)或528(■)抗体与sEGFR包被的ELISA板的结合。(B)mAb806和mAb528与sEGFR包被的ELISA板的结合通过溶液中增加浓度的可溶性EGFR(sEGFR)的抑制。(C)增加浓度的DH8.3与de2-7连接肽的结合举例说明了关于mAb806和mAb528与固定的野生型sEGFR的结合曲线(D)。
[0122] 图2E和2F图解呈现了使用C末端生物素化的肽的BIAcore结合研究结果，且包括本发明的单克隆抗体，连同其他已知抗体和对照，在所述其他已知抗体中有识别de2-7EGFR突变体的连接肽的L8A4抗体。
[0123] 图3描述了mAb806和the DH8.3抗体的内化。将U87MG.Δ2-7细胞与mAb806(▲)或DH8.3(●)在4℃预温育，转移至37℃，并且通过FACS测定内化。数据代表3(DH8.3)或4(mAb806)次分开实验在每个时间点的平均内化±SE。
[0124] 图4A和4B举例说明了在荷有U87MG和U87MG.Δ2-7异种移植物的裸鼠中放射性125 131
标记的(a) I-mAb806和(b) I-DH8.3的生物分布(％ID/g肿瘤组织)。除其中n＝4的
1小时外，每个点代表5只小鼠的平均值±SE。
标记的(a) I-mAb806和(b) I-DH8.3的生物分布(％ID/g肿瘤组织)。除其中n＝4的
1小时外，每个点代表5只小鼠的平均值±SE。
[0125] 图5A和5B举例说明了在荷有U87MG.Δ2-7异种移植物的裸鼠中表示为(a)肿125 131
瘤∶血液或(b)肿瘤∶肝脏比的放射性标记的 I-mAb806(空心条)和 I-DH8.3(实心条)抗体的生物分布。除其中n＝4的1小时外，每个条代表5只小鼠的平均值±SE。
瘤∶血液或(b)肿瘤∶肝脏比的放射性标记的 I-mAb806(空心条)和 I-DH8.3(实心条)抗体的生物分布。除其中n＝4的1小时外，每个条代表5只小鼠的平均值±SE。
[0126] 图6A-C举例说明了包含EGFR基因扩增的细胞系的流式细胞术分析。A431细胞用mAb806、DH8.3或528(黑色直方图)进行染色，并且与无关IgG2b抗体(空心直方图)比较。
[0127] 图7A和7B举例说明了在荷有U87MG.Δ2-7和A431异种移植物的裸鼠中放射性125 131
标记的(a) I-mAb806和(b) I-528的生物分布(％ID/g肿瘤组织)。
标记的(a) I-mAb806和(b) I-528的生物分布(％ID/g肿瘤组织)。
[0128] 图8A-D举例说明了在荷有(A，C)U87MG.Δ2-7和(B，D)A431异种移植物的裸鼠125
中表示为(A，B)肿瘤∶血液或(C，D)肿瘤∶肝脏比的放射性标记的 I-mAb806(空心条)
131
和 I-528(实心条)和抗体的生物分布。
中表示为(A，B)肿瘤∶血液或(C，D)肿瘤∶肝脏比的放射性标记的 I-mAb806(空心条)
131
和 I-528(实心条)和抗体的生物分布。
[0129] 图9A和9B举例说明了在预防模型中mAb806对(A)U87MG和(B)U87MG.Δ2-7异6
种移植物生长率的抗瘤作用。在第0天时将3×10U87MG或U87MG.Δ2-7细胞皮下(s.c.)注射到4-6周龄BALB/c裸鼠(n＝5)的双侧胁腹内。从肿瘤细胞接种前1天开始，小鼠用
1mg mAb806(●)；0.1mg mAb806(▲)；或媒介物(○)腹膜内(i.p.)注射。注射每周给予3次，进行2周，如由箭头指出的。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
种移植物生长率的抗瘤作用。在第0天时将3×10U87MG或U87MG.Δ2-7细胞皮下(s.c.)注射到4-6周龄BALB/c裸鼠(n＝5)的双侧胁腹内。从肿瘤细胞接种前1天开始，小鼠用
1mg mAb806(●)；0.1mg mAb806(▲)；或媒介物(○)腹膜内(i.p.)注射。注射每周给予3次，进行2周，如由箭头指出的。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
[0130] 图10A、1OB和10C举例说明了在建立的模型中mAb806对(A)U87MG、(B)U87MG.6
Δ2-7和(C)U87MG.wtEGFR异种移植物的抗瘤作用。将3×10U87MG、U87MG.Δ2-7或
U87MG.wtEGFR细胞皮下注射到4-6周龄BALB/c裸鼠(n＝5)的双侧胁腹内。在肿瘤已达
3
到65-80mm的平均肿瘤体积时开始用1mg剂量的mAb806(●)；0.1mg剂量的mAb806(▲)；
或媒介物(○)腹膜内注射小鼠。注射每周给予3次，进行2周，如由箭头指出的。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
Δ2-7和(C)U87MG.wtEGFR异种移植物的抗瘤作用。将3×10U87MG、U87MG.Δ2-7或
U87MG.wtEGFR细胞皮下注射到4-6周龄BALB/c裸鼠(n＝5)的双侧胁腹内。在肿瘤已达
3
到65-80mm的平均肿瘤体积时开始用1mg剂量的mAb806(●)；0.1mg剂量的mAb806(▲)；
或媒介物(○)腹膜内注射小鼠。注射每周给予3次，进行2周，如由箭头指出的。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
[0131] 图11A和11B举例说明了在(A)预防和(B)建立的模型中mAb806对A431异种移6
植物的抗瘤作用。将3×10A431细胞皮下注射到4-6周龄BALB/c裸鼠(n＝5)的双侧胁
3
腹内。在预防模型中从肿瘤细胞接种前1天开始，或当肿瘤已达到200mm的平均肿瘤体积时，对小鼠用1mg剂量的mAb806(●)或媒介物(○)腹膜内注射。注射每周给予3次，进行2周，如由箭头指出的。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
植物的抗瘤作用。将3×10A431细胞皮下注射到4-6周龄BALB/c裸鼠(n＝5)的双侧胁
3
腹内。在预防模型中从肿瘤细胞接种前1天开始，或当肿瘤已达到200mm的平均肿瘤体积时，对小鼠用1mg剂量的mAb806(●)或媒介物(○)腹膜内注射。注射每周给予3次，进行2周，如由箭头指出的。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
[0132] 图12举例说明了在预防模型中与用AG1478的处理组合的用mAb806的处理对A431异种移植物的抗瘤作用。数据表示为平均肿瘤体积±S.E。
[0133] 图13描述了在增加浓度的AG1478(0.5μM和5μM)的存在下，mAb806与A431细胞的结合。
[0134] 图14A和14B举例说明了806VH链基因的(A)核酸序列及(B)其氨基酸翻译(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。
[0135] 图15A和15B举例说明了806VL链基因的(A)核酸序列及(B)其氨基酸翻译(分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。
[0136] 图16显示了根据Kabat编号的VH链序列(SEQ ID NO：2)，其中CDRs(SEQ ID NOS：15、16和17)是有下划线的。VH链序列(SEQ ID NO：2)的关键残基是24、37、48、67和78。
[0137] 图17显示了根据Kabat编号的VL链序列(SEQ ID NO：4)，其中CDRs(SEQ ID NOS：18、19和20)是有下划线的。VL链序列(SEQ ID NO：4)的关键残基是36、46、57和71。
[0138] 图18A-18D显示了设计为测定组合抗体治疗、特别是mAb806和528抗体的疗效的体内研究结果。小鼠接受U87MG.D2-7(A和B)、U87MG.DK(C)或A431(D)细胞的接种。
[0139] 图19A-D显示了通过电子显微镜术的内化分析。将U87MG.Δ2-7细胞与mAb806或DH8.3、随后为金缀合的抗小鼠IgG在4℃预温育，转移至37℃，并且通过电子显微镜术在各个时间点检查内化。(A)在5分钟后DH8.3抗体定位至有被小窝(箭头)；(B)在2分钟后mAb806通过大胞饮内化(箭头)；(C)在20分钟后DH8.3定位至溶酶体(箭头)；(D)在30分钟后mAb806定位至溶酶体(箭头)。关于所有图像的起初放大率是X30,000。
[0140] 图20显示了在125I-mAb806注射后8小时收集的U87MG.Δ2-7异种移植物切片的放射自显影术。
[0141] 图21显示了包含EGFR基因扩增的细胞系的流式细胞术分析。HN5和MDA-468细胞用无关IgG2b抗体(具有虚线的空心直方图)、mAb806(黑色直方图)或528(具有封闭线的空心直方图)进行染色。DH8.3抗体对于2个细胞系都是完全阴性的(数据未显示)。
[0142] 图22显示了来自细胞系的EGFR的免疫沉淀。来自35S标记的U87MG.Δ2-7或A431细胞的EGFR由mAb806、sc-03抗体或IgG2b同种型对照免疫沉淀。在侧部的箭头指示de2-7和wt EGFR的位置。在3次独立实验中获得等同带型。
[0143] 图23显示了在125I-mAb806注射后24小时收集的A431异种移植物切片的放射自显影术，指示了定位至活组织的区域(箭头)。
[0144] 图24A和24B显示了应用全身性mAb806处理的荷有颅内U87MG.ΔEGFR(A)和5
LN-Z308.ΔEGFR(B)异种移植物的裸鼠的延长存活。将U87MG.EGFR细胞(1×10)或
5
LN-Z308.ΔEGFR细胞(5×10)植入裸鼠脑内，并且从植入后第0天到14天，用mAb806、PBS或同种型IgG处理动物。
LN-Z308.ΔEGFR(B)异种移植物的裸鼠的延长存活。将U87MG.EGFR细胞(1×10)或
5
LN-Z308.ΔEGFR细胞(5×10)植入裸鼠脑内，并且从植入后第0天到14天，用mAb806、PBS或同种型IgG处理动物。
[0145] 图24C和24D显示了颅内肿瘤通过mAb806处理的生长抑制。用mAb806或同种型IgG对照处理的裸鼠(5只/组)对于U87MG.EGFR(C)在第9天时并且对于LN-Z308.ΔEGFR(D)在第15天时实施安乐死，并且收获其脑，固定且切片。通过将对照的肿瘤体积作为100％计算数据。值是平均值±SD。***，P＜0.001；对照与mAb806比较。箭头，肿瘤组织。
[0146] 图24E显示了应用肿瘤内mAb806处理的荷有颅内U87MG.ΔEGFR异种移植物的裸鼠的延长存活。U87MG.ΔEGFR细胞如所述地植入。在5μl体积中的10mg mAb806或同种型IgG对照从第1天时开始每隔一日在肿瘤注射部位注射，进行5次。
[0147] 图25A、25B和25C显示了mAb806延长具有U87MG.wtEGFR脑瘤而不是U87MG.DK.或U87MG脑瘤的小鼠的存活。将U87MG(A)、U87MG.DK(B)、或U87MG.wtEGFR(C)细胞5
(5×10)植入裸鼠脑内，并且从植入后第0天到第14天用mAb806处理动物，随后为在治疗中断后的观察。
(5×10)植入裸鼠脑内，并且从植入后第0天到第14天用mAb806处理动物，随后为在治疗中断后的观察。
[0148] 图26A显示了mAb806与U87MG细胞系的反应性的FACS分析。U87MG、U87MG.ΔEGFR、U87MG.DK和U87MG.wtEGFR细胞用抗EGFR mAbs 528、EGFR.1和抗ΔEGFR抗体mAb806进行染色。单克隆EGFR.1抗体专一地识别wtEGFR，并且单克隆528抗体与wtEGFR和ΔEGFR都反应。mAb806与U87MG.ΔEGFR和U87MG.DK强反应，并且与U87MG.wtEGFR弱反应。在横坐标上的条，在不存在初次抗体的情况下最大细胞染色。结果在3次独立实验中再现。
[0149] 图26B显示了EGFR形式的mAb806免疫沉淀。突变体和wtEGFR从(泳道1)U87MG、(泳道2)U87Δ.EGFR、(泳道3)U87MG.DK和(泳道4)U87MG.wtEGFR细胞用抗EGFR抗体528、EGFR.1或抗ΔEGFR抗体mAb806免疫分离，并且随后通过蛋白质印迹用抗泛EGFR抗体C13检测。
[0150] 图27A和27B显示了用mAb806的全身性处理降低U87MG.ΔEGFR脑瘤中ΔEGFR的磷酸化和Bel-XL表达。U87MG.ΔEGFR肿瘤在mAb806处理的第9天时切除，在液氮中速冻，并且在肿瘤裂解物制备前贮存于-80℃。
[0151] (A)ΔEGFR表达和自磷酸化程度的蛋白质印迹分析。对30μg肿瘤裂解物实施SDS-聚丙烯酰胺凝胶，转移至硝酸纤维素膜，并且用抗磷酸酪氨酸mAb探测，随后剥离且用抗EGFR抗体C13重新探测。
[0152] (B)通过使用与(A)中相同的肿瘤裂解物的Bcl-XL蛋白质印迹。膜用抗人Bcl-X多克隆抗体探测。泳道1和2，用同种型对照处理的U87MG.ΔEGFR脑瘤；泳道3和4，用mAb806处理的U87MG.ΔEGFR脑瘤。
[0153] 图28显示了mAb806处理导致生长和血管发生的减少，并且导致U87MG.ΔEGFR肿瘤中的凋亡和累积巨噬细胞的增加。肿瘤切片对于Ki-67进行染色。通过来自每个组4只小鼠的颅内肿瘤中来自4个随机选择的高倍视野(X400)的为Ki-67阳性的总细胞百分率评价细胞增殖指数。数据是平均值±SE。凋亡细胞通过TUNEL测定进行检测。凋亡指数通过TUNEL阳性细胞比进行评价：来自每个组4只小鼠的颅内肿瘤中来自4个随机选择的高倍视野(X400)的总细胞数目。数据是平均值±SE。肿瘤切片用抗CD31抗体进行免疫染色。通过来自每个组4只小鼠的颅内肿瘤中来自4个随机选择的视野(X200)的计算机化图像分析来分析MVAs。在mAb806-处理的U87MG.ΔEGFR肿瘤中巨噬细胞的肿瘤旁浸润。肿瘤切片用抗F4/80抗体进行染色。
[0154] 图29显示了亲代和转染的U87MG神经胶质瘤细胞系的流式细胞术分析。细胞如所述的用无关IgG2b抗体(空心直方图)或528抗体或mAb806(实心直方图)进行染色。
[0155] 图30显示了来自细胞系的EGFR的免疫沉淀。来自35S标记的U87MG.wtEGFR、U87MG.Δ2-7和A431细胞的EGFR由mAb806(806)、sc-03抗体(c-term)或IgG2b同种型对照(con)进行免疫沉淀。箭头，de2-7和wt EGFR的位置。
[0156] 图31显示了U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物的代表性H&E染色的石蜡切片。从如上图10中所述处理的小鼠中切除U87MG.Δ2-7(在肿瘤接种后24天收集)和U87MG.wtEGFR(在肿瘤接种后42天收集)异种移植物，并且用H&E进行染色。媒介物处理的U87MG.Δ2-7(在肿瘤接种后18天收集)和U87MG.wtEGFR(在肿瘤接种后37天收集)异种移植物显示出极少区域的坏死(左图)，而在用mAb806处理的U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物中观察到广泛坏死(箭头)(右图)。
[0157] 图32显示了在衍生自U87MG、U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物的冷冻切片中EGFR表达的免疫组织化学分析。切片在上图31中所述的时间点收集。异种移植物切片用528抗体(左图)和mAb806(右图)进行免疫染色。在用mAb806处理的异种移植物中未观察到对于wtEGFR、扩增的EGFR或de2-7EGFR的免疫反应性减少。与体外数据一致，亲本U87MG异种移植物对于528抗体是阳性的，但对于mAb806染色是阴性的。
[0158] 图33显示了所生成的双顺反子表达构建体的图示。嵌合抗体链的转录通过延伸因子-1启动子起始，并且通过强人工终止序列终止。将IRES序列引入轻链和NeoR以及重链和dhfr基因的编码区之间。
[0159] 图34A和34B显示了在荷有U87MG-de2-7异种移植物肿瘤的BALB/c裸鼠中执行125 111
用(A) I或(B) In放射性标记的ch806的生物分布分析。小鼠用5μg放射性标记的抗体且以4只小鼠/时间点的组注射，在8、28、48或74小时处死。收集器官，称重且在γ计数器中测量放射性。
用(A) I或(B) In放射性标记的ch806的生物分布分析。小鼠用5μg放射性标记的抗体且以4只小鼠/时间点的组注射，在8、28、48或74小时处死。收集器官，称重且在γ计数器中测量放射性。
[0160] 图35A和35B描述了(A)％ID克肿瘤组织和(B)肿瘤与血液比。铟-111抗体显示了约30％ID/克组织和4.0的肿瘤与血液比。
[0161] 图36描述了在建立的肿瘤模型中嵌合抗体ch806的治疗效果。将在100μl PBS6
中的3×10U87MG.Δ2-7细胞皮下接种到4-6周龄雌性裸鼠的双侧胁腹内。包括mAb806作
3
为阳性对照。当肿瘤已达到50mm的平均体积时起始处理，并且处理由在所示天数时腹膜内给予的1mg ch806或mAb806共5次注射组成。数据表示为对于每个处理组的平均肿瘤体积±S.E.。
中的3×10U87MG.Δ2-7细胞皮下接种到4-6周龄雌性裸鼠的双侧胁腹内。包括mAb806作
3
为阳性对照。当肿瘤已达到50mm的平均体积时起始处理，并且处理由在所示天数时腹膜内给予的1mg ch806或mAb806共5次注射组成。数据表示为对于每个处理组的平均肿瘤体积±S.E.。
[0162] 图37显示了关于抗EGFR嵌合IgGI抗体ch806和对照cG250对靶(A)U87MG.de2-7和(B)A431细胞的CDC活性。呈现了一式三份测定的平均(条；±SD)细胞毒性百分比。
[0163] 图38显示了在50∶1的效应子/靶细胞比下，通过ch806和同种型对照cG250(0-10μg/ml)介导的对靶(A)U87MG.de2-7和(B)A431细胞的ADCC。结果表示为一式三份测定的平均(条；±SD)细胞毒性百分比。
[0164] 图39显示了在一系列效应子/靶细胞比内通过1μg/ml亲本mAb806和ch806介导的对靶U87MG.de2-7细胞的ADCC。呈现了一式三份测定的平均值(条；±SD)。
[0165] 图40显示了最初选择产生结合ch806但不是huIgG的抗体的25个杂交瘤。随后通过有限稀释对于来自单细胞的克隆扩增追踪具有高亲和力结合的这些抗ch806杂交瘤中的4个(克隆3E3、5B8、9D6和4D8)，且分别指名为Ludwig Institute for Cancer Research Melbourne Hybridoma(LMH)-11、-12、-13和-14。此外，还克隆产生对于huIgG特异的mAbs的2个杂交瘤，并且对其进一步表征：克隆2C10(LMH-15)和2B8(LMH-16)。
[0166] 图41A、41B和41C显示了在克隆扩增后，针对中和ch806或mAb806抗原与sEGFR621的结合活性的能力，通过ELISA一式三份地检查杂交瘤培养上清液。平均值(±SD)结果证实抗独特型mAbs LMH-11、-12、-13和-14具有在ch806和鼠mAb806的溶液中阻断与由sEGFR包被的板结合的拮抗活性(LMH-14未显示)。
[0167] 图42A、42B和42C显示了由10μg/ml纯化的(A)LMH-11、(B)LMH-12和(C)LMH-13包被的微量滴定板。3个纯化的克隆就其在血清或1％FCS/培养基中捕获ch806或mAb806的能力进行比较，并且随后检查结合的ch806或mAb806。除用于二次缀合物抗生物素蛋白-HRP的对照和ABTS底物外，在血清和1％FCS/培养基中还包括同种型对照抗体hu3S 193和m3S 193。结果呈现为一式三份样品的平均值(±SD)，其使用生物素化的LMH-12(10μg/ml)用于检测，并且指示用于捕获和检测的LMH-12对于在血清中的ch806(3ng/ml)具有最高灵敏度，具有可忽略不计的本底结合。
[0168] 图43显示分别使用1μg/ml抗独特型LMH-12和1μg/ml生物素化的LMH-12用于捕获和检测的最佳药代动力学ELISA条件的验证。一式四份地执行3次分开的ELISAs，以测量在来自3个健康供体的供体血清(●)或1％BSA/培养基(■)中的ch806与在血清(▲)或1％BSA/培养基( )中的同种型对照hu3S193。对于每次ELISA，还包括用于二次缀合物抗生物素蛋白-HRP(◆)的对照和单独的ABTS底物(六角形)。平均值(±SD)结果证实用于测量在血清中的ch806(2μg/ml-1.6ng/ml)的可高度再现性结合曲线，具有3ng/ml的检测极限。(n＝12；1-100ng/ml，变异系数＜25％；100ng/ml-5μg/ml，变异系数＜15％)。对于测试的3种血清中的任何，本底结合都不是明显的，并且对于同种型对照hu3S193，观察到可忽略不计的结合。
[0169] 图44描述了用mAb806印迹的，在CHO细胞中表达的重组sEGFR的免疫印迹。重组sEGFR用PNGaseF处理，以去除N联糖基化(去糖基化)，或未经处理(未经处理)，蛋白质在SDS-PAGE上运行，转移至膜且用mAb806免疫印迹。
[0170] 图45描述了来自35S标记的细胞系(U87MG.Δ2-7、U87MG-wtEGFR和A431)的EGFR由不同抗体(SC-03、806和528抗体)的免疫沉淀。
[0171] 图46描述了在用35S甲硫氨酸/半胱氨酸脉冲标记后，在不同时间点(时间0到240分钟)来自不同细胞(A431和U87MG.Δ2-7)的EGFR的免疫沉淀。抗体528和806用于免疫沉淀。
[0172] 图47描述了在不存在Endo H消化的情况下(-)和在去除高甘露糖型碳水化合物的Endo H消化后(+)，来自不同细胞系(U87MGΔ2-7、U87MG-wtEGFR和A431)的EGFR由各种抗体(SC-03、806和528)的免疫沉淀。
[0173] 图48描述了A431和U87MG.Δ2-7细胞系的细胞表面碘化，随后为由806抗体的免疫沉淀，且伴随或不伴随Endo H消化，证实在A431细胞的细胞表面上由mAb806结合的EGFR是EndoH敏感型。
[0174] 图49显示了pREN ch806LC Neo载体(SEQ ID NO：7)。
[0175] 图50显示了pREN ch806HC DHFR载体(SEQ ID NO：8)。
[0176] 图51A-D显示了mAb124VH和VL链核酸序列(分别为SEQ ID NOS：21和26)和氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS：22和27)。
[0177] 图52A-D显示了mAb1133VH和VL链核酸序列(分别为SEQ ID NOS：31和36)和氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS：32和37)。
[0178] 图53显示了组合的双重基因Lonza质粒的DNA质粒图，所述Lonza质粒包括包含hu806H(VH+CH)表达盒(expression cartridge)的pEE12.4和包含hu806L(VL+CL)表达盒的pEE6.4。
[0179] 图54显示了在图53中所述的组合Lonza质粒的DNA序列(SEQ ID NO：41；互补体SEQ ID NO：162)。这种序列还显示了与hu806抗体有关的所有翻译(SEQ ID NOS：42-51和163-166)。质粒已得到序列验证，并且检查编码序列和翻译。已遮蔽序列的节段，以鉴定目的区域；遮蔽区域对应于实际剪接点。颜色编码如下：
[0180] (灰色)：信号区，在重和轻链可变区发现的起始编码序列；
[0181] (淡紫色)：hu806VH链，镶嵌的(veneered)重链可变区；
[0182] (粉色)：hu806CH链，密码子优化的重链恒定区；
[0183] (绿色)：hu806VL链，镶嵌的轻链可变区；和
[0184] (黄色)：hu806CL链，密码子优化的轻链恒定区。
[0185] 图55A和55B显示了hu806翻译的氨基酸序列(VH和VL链SEQ ID NOS：164和166，及其分别的信号肽SEQ ID NOS：163和165；CH和CL链SEQ ID NOS：43和48)，并且对于VH和VL链给出Kabat编号(分别为SEQ ID NOS：164和165)，其中CDRs(SEQ ID NOS：
44-46和49-51)是有下划线的。
44-46和49-51)是有下划线的。
[0186] 图56A、56B、56C、57A、57B和57C显示了在镶嵌设计中的起始步骤，在mAb806序列(VH链SEQ ID NO：167和VL链SEQ ID NO：12)中关于表面暴露的氨基酸残基分级。级别以每个残基上的星号(*)数目给出，其中最暴露的残基具有3个星号。这些图包括指出起始寡核苷酸(VH链：图56C以及SEQ ID NOS：52和169-177；VL链：图57C以及SEQ ID NOS：62、66、68和181-187)如何重叠以形成第一种镶嵌产物(VH链SEQ ID NO：168和VL链SEQ ID NO：180)的设计。
[0187] 图58显示了密码子优化的huIgG1重链DNA序列(SEQ ID NO：80；互补体SEQ ID NO：178)和氨基酸翻译(SEQ ID NO：43)的图。
[0188] 图59显示了比较hu806VH+CH氨基酸序列(8C65AAG hu806VH+CH；SEQ ID NO：81)与关于mAb806VH链(SEQ ID NO：167)的原始参考文件的蛋白质比对。突出显示的区域指出VH链中的保守氨基酸序列。CDRs是有下划线的。星号反映在起始镶嵌过程中计划和执行的改变。编号位点是随后修饰的参考。
[0189] 图60显示了关于hu806VL+CL氨基酸序列(8C65AAG hu806信号+VL+CL；SEQ ID NO：83)与关于mAb806VL链(SEQ ID NO：179)的原始参考文件的相应比对。它包含另外文件(r2vk1hu806信号+VL+CL；SEQ ID NO：82)、前体构建体，其被包括以举例说明在修饰#7上做出的改变。
[0190] 图61显示了hu806信号+VL和CL序列(8C65AAG hu806Vl+Cl；SEQ ID NOS：190和188)与相应ch806序列(pREN ch806LC Neo；LICR；SEQ ID NO：189)的核苷酸和氨基酸比对。它已如图62中所述进行修饰且注释。
[0191] 图62显示了hu806信号+VH序列(8C65AAG hu806VH链；SEQ ID NO：192)与相应mAb806序列[在密码子改变(cc)和镶嵌(ven)前的mAb806VH；SEQ ID NO：191]的核苷酸比对。举例说明了在图59和60的氨基酸改变后的核苷酸改变，以及显示不导致氨基酸中的改变的保守核酸改变。已去除在hu806中的信号和VH链之间的内含子用于更容易观察。信号序列和CDRs是有下划线的。相应氨基酸序列(SEQ ID NO：42)已在比对上叠加。
[0192] 图63显示了如通过Biacore测定的，得自瞬时转染293细胞的纯化hu806抗体与重组EGFR-ECD的结合。用纯化的对照人IgGl抗体未观察到与EGFR-ECD的结合。
[0193] 图64显示了编码IgG1hu806的质粒8C65AAG的序列(SEQ ID NO：41)的GenBank格式化文本文件和注释。
[0194] 图65显示了关于来自mAb806(SEQ ID NOS：15-18、20和193)和mAb175(SEQ ID NOS：130-132、135和194-195)的CDRs的氨基酸序列比对。2种抗体之间的序列差异是粗体的。
[0195] 图66A和66B显示了细胞系和正常人肝脏由mAb175的免疫组织化学染色。(A)生物素化的mAb175用于染色由块制备的切片，所述块包含A431细胞(超表达wtEGFR)、U87MG.Δ2-7细胞(表达Δ2-7EGFR)和U87MG细胞(以适度水平表达wtEGFR)。(B)正常人肝脏(400x)由mAb175(左图)、同种型对照(中图)和二次抗体对照(右图)的染色。未观察到特异性肝窦或肝细胞染色。
[0196] 图67A、67B和67C显示了mAb806和mAb175与在酵母上展示的EGFR片段的反应性。(A)代表性流式细胞术直方图，描述酵母展示EGFR片段的mAb175和mAb806标记的平均荧光信号。对于酵母展示，部分细胞在其表面上不表达蛋白质，导致2个直方图峰。9E10抗体用作阳性对照，因为所有片段包含线性C末端c-myc标记。(B)抗体与各种EGFR片段结合的概括。(C)EGFR片段通过使酵母团块加热至800℃30分钟得到变性。c-myc标记在所有情况下仍由9E10抗myc抗体识别，证实热处理不损害酵母表面展示的蛋白质。构象敏感的EGFR抗体mAb225用于证实变性。
[0197] 图68A、68B、68C和68D显示了mAb175对脑和前列腺癌异种移植物的抗瘤作用。3
(A)当起始肿瘤体积是100mm时，在第6、8、10、13、15和17天时，荷有U87MG.Δ2-7异种移植物的小鼠(n＝5)用PBS、1mg mAb175或mAb806(阳性对照)腹膜内注射，每周3次，进行2周。数据表示为平均肿瘤体积±SE。(B)细胞用2种无关抗体(蓝色，实心，和绿色，空心)、用于总EGFR的mAb 528(粉色，实心)、mAb806(浅蓝色，空心)和mAb175(橙色，空心)染色，且随后通过FACS分析。(C)使DU145细胞裂解，实施用mAb 528、mAb806、mAb175
3
或2种独立的无关抗体的IP，并且随后对于EGFR免疫印迹。(D)当起始肿瘤体积是85mm时，在第18-22、25-29和39-43天时，荷有DU145异种移植物的小鼠(n＝5)用PBS、1mg mAb175或mAb806腹膜内注射，每天1次。数据表示为平均肿瘤体积±SE。
(A)当起始肿瘤体积是100mm时，在第6、8、10、13、15和17天时，荷有U87MG.Δ2-7异种移植物的小鼠(n＝5)用PBS、1mg mAb175或mAb806(阳性对照)腹膜内注射，每周3次，进行2周。数据表示为平均肿瘤体积±SE。(B)细胞用2种无关抗体(蓝色，实心，和绿色，空心)、用于总EGFR的mAb 528(粉色，实心)、mAb806(浅蓝色，空心)和mAb175(橙色，空心)染色，且随后通过FACS分析。(C)使DU145细胞裂解，实施用mAb 528、mAb806、mAb175
3
或2种独立的无关抗体的IP，并且随后对于EGFR免疫印迹。(D)当起始肿瘤体积是85mm时，在第18-22、25-29和39-43天时，荷有DU145异种移植物的小鼠(n＝5)用PBS、1mg mAb175或mAb806腹膜内注射，每天1次。数据表示为平均肿瘤体积±SE。
[0198] 图69A、69B、69C、69D、69E和69F显示了与Fab片段结合的EGFR肽287-302的晶体结构。(A)Fab 806的草图(Cartoon)，其中轻链为红色；重链为蓝色；结合肽为黄色；和来自EGFR的叠加EGFR287-302为紫色。(B)Fab 175的草图，其中轻链为黄色；重链为绿色；结合肽为浅紫色；和来自EGFR(DI-3)的EGFR287-302为紫色。(C)来自(B)的细节，显示在受体中的EGFR287-302和与FAb 175结合的肽的相似性。肽主链显示为Cα痕量，并且相互作用侧链显示为棍(sticks)。O原子是彩色的红色；N为蓝色；S为橙色，并且C与主链一样。(D)EGFR与Fab175：肽复合物的叠加，其显示空间重叠。着色与(C)中一样，其中EGFR187-286的表面是彩色的青绿色。(E)关于(D)的垂直视图，其中EGFR187-286以不透明蓝色显示，并且轻(橙色)和重(绿色)链的表面是透明的。(F)观察抗原结合位点的175Fab复合物的详细立体视图。着色与(C)中一样，并且侧链氢键以黑色打点。在复合物形成后埋入的水分子显示为红色球形。
[0199] 图70A、70B、70C和70D显示了271-283半胱氨酸键对mAb806与EGFR结合的影响。(A)用wtEGFR、EGFR-C271A、EGFR-C283A或C271A/C283A突变体转染的细胞用mAb528(实心粉色直方图)、mAb806(蓝线)或仅二次抗体(紫色)进行染色，并随后通过FACS进行分析。使用类别匹配的无关抗体设置增益。(B)如所述的在MTT测定中就其对EGF的应答检查表达EGFR-C271A或C271/283A EGFR的BaF3细胞。使用数据点的Bolzman拟合得到EC50S。
数据代表一式三份测量的平均值和sd。(C)表达野生型或EGFR-C271A/C283A的BaF3细胞是IL-3和血清饥饿的，随后暴露于EGF或媒介物对照。全细胞裂解物通过SDS-PAGE分离，并且用抗磷酸酪氨酸抗体(上图)或抗EGFR抗体(下图)免疫印迹。(D)在无抗体(空心符号)、都为10μg/ml的mAb 528(灰色圆圈)或mAb806(黑色三角)的存在下，用增加浓度的EGF刺激表达野生型(左图)或C271A/C283A(右图)EGFR的BaF3细胞。数据表示为一式三份测量的平均值和sd。
数据代表一式三份测量的平均值和sd。(C)表达野生型或EGFR-C271A/C283A的BaF3细胞是IL-3和血清饥饿的，随后暴露于EGF或媒介物对照。全细胞裂解物通过SDS-PAGE分离，并且用抗磷酸酪氨酸抗体(上图)或抗EGFR抗体(下图)免疫印迹。(D)在无抗体(空心符号)、都为10μg/ml的mAb 528(灰色圆圈)或mAb806(黑色三角)的存在下，用增加浓度的EGF刺激表达野生型(左图)或C271A/C283A(右图)EGFR的BaF3细胞。数据表示为一式三份测量的平均值和sd。
[0200] 图71A、71B和71C显示了：(A)在具有声带的转移性鳞状细胞癌的患者中111In ch806的生物分布的全身γ照相机图像，显示在右颈中在肿瘤中的定量高摄取(箭头)。还111
可见在肝脏中血池活性和游离 In的较小分解代谢。(B)这个患者颈部的单光子计算机体
111
层摄影(SPECT)图像，显示在存活肿瘤中 In-ch806的摄取(箭头)，其中减少的中心摄取指示坏死。(C)颈部的相应CT扫描证实具有中心性坏死的右颈大肿瘤团块(箭头)。
可见在肝脏中血池活性和游离 In的较小分解代谢。(B)这个患者颈部的单光子计算机体
111
层摄影(SPECT)图像，显示在存活肿瘤中 In-ch806的摄取(箭头)，其中减少的中心摄取指示坏死。(C)颈部的相应CT扫描证实具有中心性坏死的右颈大肿瘤团块(箭头)。
[0201] 图72A和72B显示了未栓系(untethered)EGFRl-621结构的立体模型。受体主链以蓝色跟踪，并且配体TGF-α以红色跟踪。mAb806/175表位以青绿色描绘，并且二硫键以黄色描绘。使表位系回到受体内的二硫键的原子以空间充填形式显示。在其配体的存在下，通过将来自栓系构象的EGFR-ECD CR2结构域对接到未栓系EGFR单体的结构上构建模型。
[0202] 图73显示了mAb806与EGFR片段的反应性。来自用载体转染的293T细胞的裂解物通过SDS-PAGE分辨，所述载体表达可溶性1-501 EGFR片段或GH/EGFR片段融合蛋白(GH-274-501、GH-282-501、GH-290-501和GH-298-501)，转移至膜并且用mAb806(左图)或抗myc抗体9B11(右图)免疫印迹。
[0203] 图74A和74B分别显示了mAb175VH链核酸序列(SEQ ID NO：128)和氨基酸序列[[s]](SEQ ID NO：129)。
[0204] 图75A和75B分别显示了mAb175VL链核酸序列(SEQ ID NO：133)和氨基酸序列[[s]](SEQ ID NO：134)。
[0205] 图76A、76B和76C显示了：在小规模(100mL)摇瓶培养中GS-CHO(14D8、15B2和40A10)和GS-NS0(36)hu806转染子的(A)容积产物浓度和(B)活细胞浓度。产物浓度通过ELISA进行评估，其使用806抗独特型作为包被抗体和ch806临床批次：J06024作为标准；
(C)在15L搅拌槽生物反应器中的GS-CHO 40A10转染子细胞生长和容积产量。活细胞密度
5 ▲
(◆x10细胞/mL)、细胞生活力(■)和产量( mg/L)。
(C)在15L搅拌槽生物反应器中的GS-CHO 40A10转染子细胞生长和容积产量。活细胞密度
5 ▲
(◆x10细胞/mL)、细胞生活力(■)和产量( mg/L)。
[0206] 图77A、77B、77C、77D和77E显示了通过小规模培养产生的蛋白质A纯化的hu806抗体构建体以及对照ch806和mAb 806的尺寸排阻层析(Biosep SEC-S3000)分析。在A214nm的层析谱在每个图的上图中呈现，并且在A280nm的层析谱在下图中呈现。
[0207] 图78显示了在大规模生产和蛋白质A纯化后，蛋白质A纯化的hu806抗体构建体40A10的尺寸排阻层析(Biosep SEC-S3000)分析。呈现了在A214nm的层析谱，其指示98.8％纯度，和存在1.2％聚集体。
[0208] 图79显示了在还原条件下在标准SDS-PAGE条件下，使用来自Novex，USA的预制4-20％Tris/甘氨酸凝胶，以分析纯化的转染子hu806制剂(5μg)GS CHO(14D8、15B2和
40A10)和GS-NS0(36)hu806。蛋白质通过考马斯蓝染色进行检测。
40A10)和GS-NS0(36)hu806。蛋白质通过考马斯蓝染色进行检测。
[0209] 图80显示了在非还原条件下在标准SDS-PAGE条件下，使用预制4-20％Tris/甘氨酸凝胶，以分析纯化的转染子hu806制剂(5μg)GSCHO(14D8、15B2和40A10)和GS-NS0(36)。蛋白质通过考马斯蓝染色进行检测。
[0210] 图81显示了在大规模生产后在标准SDS-PAGE条件下，使用预制4-20％Tris/甘氨酸凝胶，以分析纯化的转染子hu806GS CHO 40A10(5μg)。蛋白质通过考马斯蓝染色进行检测。
[0211] 图82显示了在15L生产后纯化的转染子hu806GS CHO 40A10(5μg)的等电聚焦凝胶分析。蛋白质通过考马斯蓝染色进行检测。泳道1，pI标记；泳道2，hu806(3种亚型，pI 8.66至8.82)；泳道3，pI标记。
[0212] 图83显示了与A431细胞的结合：蛋白质A纯化的hu806抗体制剂(20μg/ml)和同种型对照huA33(20μg/ml)的流式细胞术分析。对照包括单独的二次抗体(绿色)和ch806(红色)。hu806构建体通过小规模培养产生。
[0213] 图84显示了与A431细胞的结合：如所示的结合在细胞表面上的～10％野生型EGFR的纯化的mAb806、ch806和hu80640A10抗体制剂(20μg/ml)，528(结合野生型和de2-7EGFR)和无关对照抗体(20μg/ml)的流式细胞术分析。
[0214] 图85显示了与U87MG.de2-7神经胶质瘤细胞的结合。纯化的mAb806、ch806和hu80640A10抗体制剂(20μg/ml)以及528抗EGFR和无关对照抗体(20μg/ml)的流式细胞术分析。
[0215] 图86显示了125I放射性标记的806抗体构建体与(A)U87MG.de2-7神经胶质瘤细胞和(B)A431癌细胞的特异性结合。
[0216] 图87显示了Scatchard分析：与U87MG.de2-7细胞结合的125I放射性标记的(A)ch806和(B)hu806抗体构建体。
[0217] 图88显示了Scatchard分析：与A431细胞结合的125I放射性标记的(A)ch806和(B)hu806抗体构建体。
[0218] 图89A和图89B显示了通过经过以增加浓度50nM、100nM、150nM、200nM、250nM和300nM的固定肽的(A)hu806和(B)ch806与287-302EGFR 806肽表位的结合的BIAcore分析。
[0219] 图90A和图90B显示了(A)在一系列效应子与靶细胞比内(E∶T＝0.78∶1至100∶1)以1μg/ml每种抗体；(B)在每种抗体的浓度范围内(3.15ng/ml-10μg/ml)以E∶T＝50∶1测定的对靶A431细胞的ch806-和hu806-介导的抗体依赖性细胞毒性。
[0220] 图91显示了在BALB/c裸鼠中建立的A431异种移植物的处理。如所示的(箭头)，在2周抗体治疗中，5只小鼠的组接受6×1mg剂量。呈现了平均值±SEM肿瘤体积，直至研究终止。
[0221] 图92显示了在BALB/c裸鼠中建立的U87MG.de2-7异种移植物的处理。如所示的(箭头)，在2周抗体治疗中，5只小鼠的组接受6×1mg剂量。呈现了平均值±SEM肿瘤体积，直至研究终止。
[0222] 图93显示了对于mAb806肽(A)N、(B)HN和(C)HA的来自随机螺旋化学位移值的偏差。在包含5％2H2O、70mM NaCl和50mM NaPO4，pH 6.8的H2O溶液中制备肽。用于序列分配的所有谱在298K在Bruker Avance500上获得。
[0223] 图94A、94B、94C、94D、94E和94F显示了在111In-ch806输注后第5天，患者7的全111
身γ照相机图像，A)前和B)后。在肺中(箭头)在转移病灶中 In-ch806的高摄取是明显的。C)和D)显示了在CT扫描上的转移病灶(箭头)。E)胸部的3D SPECT图像，和F)
111
SPECT和CT的共登记横断面图像显示在转移病灶中 In-ch806的特异性摄取。
身γ照相机图像，A)前和B)后。在肺中(箭头)在转移病灶中 In-ch806的高摄取是明显的。C)和D)显示了在CT扫描上的转移病灶(箭头)。E)胸部的3D SPECT图像，和F)
111
SPECT和CT的共登记横断面图像显示在转移病灶中 In-ch806的特异性摄取。
[0224] 图95A、95B、95C、95D、95E和95F显示了在111In-ch806输注后A)第0天、B)第3天和C)第7天获得的，患者8的头与颈的平面图像。在第0天时可见起始血池活性，并在111
右额叶中在间变性星形细胞瘤中 In-ch806的摄取到第3天时是明显的(箭头)，并且到
111
第7天时增加。 In-ch806的特异性摄取在D)脑的SPECT图像(箭头)中加以证实，在
18
E) F-FDG PET和F)MRI中在肿瘤部位(箭头)是明显的。
右额叶中在间变性星形细胞瘤中 In-ch806的摄取到第3天时是明显的(箭头)，并且到
111
第7天时增加。 In-ch806的特异性摄取在D)脑的SPECT图像(箭头)中加以证实，在
18
E) F-FDG PET和F)MRI中在肿瘤部位(箭头)是明显的。
[0225] 图96A、96B、96C和96D显示了尽管在筛选的肿瘤样品中在806抗原表达中有差异，但与患者4比较，在患者3中在肿瘤中111In-ch806的相似摄取是明显的。A)在患者111
4中在SPECT横断面图像上在肺转移(箭头)中的 In-ch806定位，其中心脏血池(blood pool)活性(B)是明显的。B)相应CT扫描。存档的肿瘤显示对于806表达具有＜10％阳
111
性。C)在患者3中在肺转移(箭头)中的 In-ch806定位，其中心脏血池活性(B)是明显的。D)相应CT扫描。存档的肿瘤显示对于806表达具有50-75％阳性。
4中在SPECT横断面图像上在肺转移(箭头)中的 In-ch806定位，其中心脏血池(blood pool)活性(B)是明显的。B)相应CT扫描。存档的肿瘤显示对于806表达具有＜10％阳
111
性。C)在患者3中在肺转移(箭头)中的 In-ch806定位，其中心脏血池活性(B)是明显的。D)相应CT扫描。存档的肿瘤显示对于806表达具有50-75％阳性。
[0226] 图97显示了通过ELISA测量的ch806蛋白质的合并群体药代动力学。所观察到和预测的ch806(％ID/L)与输注后时间(小时)比较。
[0227] 图98A和98B显示了关于在5mg/m2(■)、10mg/m2(Δ)、20mg/m2( )和40mg/2 111
m(◆)剂量水平，In-ch806的A)标准化全身清除和B)肝清除的个别患者结果。在每个
2 2
图中指示了关于数据集的线性回归[A)r＝0.9595；B)r ＝0.9415]。
m(◆)剂量水平，In-ch806的A)标准化全身清除和B)肝清除的个别患者结果。在每个
2 2
图中指示了关于数据集的线性回归[A)r＝0.9595；B)r ＝0.9415]。
具体实施方式
[0228] 依照本发明，可以采用在领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中充分解释。参见例如，Sambrook等人，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″Volumes I-E[Ausubel，R.M.，编 辑 (1994)]； ″ Cell Biology：A Laboratory Handbook ″第I-III 卷[J.E.Celis，编 辑 (1994))]；″Current Protocols in Immunology ″第I-III 卷[Coligan，J.E.，编 辑(1994)]；″ Oligonucleotide Synthesis ″ (M.J.Gait编 辑1984)；″ Nucleic Acid Hybridization″[B.D.Hames&S.J.Higgins 编辑(1985)]；″Transcription And Translation ″ [B.D.Hames&S.J.Higgins，编 辑(1984)]；″Animal Cell Culture″[R.I.Freshney，编辑(1986)]；″Immobilized Cells And Enzymes″[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，″A Practical Guide To Molecular Cloning″(1984)。
[0229] 如本文使用的，下述术语视为非限制性地具有所提供的定义。
[0230] 术语“特异性结合成员”描述了对于彼此具有结合特异性的一对分子的成员。特异性结合对的成员可以是天然衍生的或完全或部分合成产生的。分子对的一个成员在其表面上具有区域或腔，该区域或腔与分子对的另一个成员特异性结合，并且因此与其特定空间和极性结构互补。因此，对的成员具有与彼此特异性结合的性质。特异性结合对的类型的例子是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本申请与抗原-抗体型反应相关。
[0231] 术语“异常表达”以其各种语法形式可以意指且包括由任何方式引起的在组织中蛋白质的任何增强或改变的表达或超表达，例如在蛋白质量中的增加，所述任何方式包括增强的表达或翻译，蛋白质的启动子或调节子的调节，关于蛋白质的基因的扩增，或增强的半衰期或稳定性，从而与非超表达的状态对比更多蛋白质出现或可以在任何一个时间检测。异常表达包括且考虑任何情况或改变，其中细胞中的蛋白质表达或翻译后修饰机制受重压(taxed)或以其他方式被破坏，这是由于蛋白质的表达增强或水平或量增加，包括其中表达改变的蛋白质，如在由于序列改变、缺失或插入的突变蛋白质或变体中，或改变的折叠。
[0232] 重要的是应当理解术语“异常表达”在本文中已特异性选择，以包含其中呈现异常(通常增加的)数量/水平的蛋白质的状态，这与异常数量或水平的直接原因无关。因此，异常数量的蛋白质可以起因于在不存在基因扩增的情况下蛋白质的超表达，这是例如在得自具有癌症受试者的头与颈的许多细胞/组织样品中的情况，而其他样品显示出可归于基因扩增的异常蛋白质水平。
[0233] 在这后一种联系中，本文呈现了本发明人的一些工作，以举例说明本发明包括其中一些显示出起因于EGFR扩增的异常蛋白质水平的样品分析。这因此解释了其中提及扩增的本文实验发现的呈现和术语“扩增/扩增的”等在描述EGFR的异常水平中的使用。然而，这是蛋白质的异常数量或水平的观察，这限定其中考虑如通过采用本发明的结合成员的临床干涉的环境或情况，并且为此，本说明书认为术语“异常表达”更广泛地获得产生EGFR水平中的相应异常的原因环境。
[0234] 相应地，虽然术语“超表达”和“扩增”以其各种语法形式应理解为具有独特技术含义，但它们被视为彼此等价，只要它们代表其中异常EGFR蛋白质水平存在于本发明的背景中的状态。相应地，已选择了术语“异常表达”，因为认为为了本文目的它在其范围内包含术语“超表达”和“扩增”，从而使得如本文使用的，所有术语可以视为彼此等价。
[0235] 术语“抗体”描述无论是天然还是部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖具有结合结构域的任何多肽或蛋白质，所述结合结构域是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源。该术语还考虑了CDR移植抗体。
[0236] 因为抗体可以以许多方式进行修饰，所以术语“抗体”应解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，这个术语涵盖抗体片段、衍生物、功能等价物和抗体的同系物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然还是部分或全部合成的。因此包括包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及美国专利号4,816,397和4,8l6,567中描述。
[0237] 已显示全抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL、VH、CL和CHl结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人(1989)Nature 341，544-546)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，即包括2个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许2个结构域结合，以形成抗原结合位点(Bird等人(1988)Science.242,423-426；Huston等人(1988)PNAS USA.85，5879-5883)；(viii)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson(2000)J.Immunol.Methods 242，
193-204)，(ix)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(x)“双抗体”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(W094/13804；P.Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,6444-6448)。
193-204)，(ix)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(x)“双抗体”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(W094/13804；P.Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,6444-6448)。
[0238] “抗体结合部位”是包含特异性结合抗原的轻链或重和轻链可变和高变区的抗体分子的结构部分。
[0239] 如本文使用的，短语“抗体分子”以其各种语法形式考虑完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。
[0240] 示例性抗体分子是完整免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和包含互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域称为Fab、Fab′、F(ab′)Z和F(v)的那些部分，所述部分优选用于在本文描述的治疗方法中使用。
[0241] 抗体还可以是双特异性的，其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员，并且另一个结合结构域具有不同特异性，例如以召募效应子功能等。本发明的双特异性抗体包括其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员包括其片段，并且另一个结合结构域是不同抗体或其片段，包括不同抗EGFR抗体的那种，例如抗体528(美国专利号4,943,533)、嵌合和人源化225抗体(美国专利号4,943,533和WO/9640210)、抗de2-7抗体例如DH8.3(Hills，D.等人(1995)Int.J.Cancer.63(4)，537-543)、抗体L8A4和Y10(Reist，CJ等人(1995)Cancer Res.55(19)：4375-4382；Foulon CF等 人(2000)Cancer Res.60(16)：44534460)、ICR62(Moditahedi H等人(1993)Cell Biophys.Jan-Jun；22(1-3)：129-46；Modjtahedi等人(2002)P.A.A.C.R.55(14)：3140-3148、或Wikstrand等人的抗体(Wikstrand C.等人(1995)Cancer Res.55(14)：3140-3148)。其他结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如在神经或神经胶质细胞特异性抗体中。在本发明的双特异性抗体中，本发明的抗体的一个结合结构域可以与其他结合结构域或分子组合，所述其他结合结构域或分子识别特定细胞受体和/或以特定方式调节细胞，如例如免疫调节剂(例如一种或多种白细胞介素)、生长调节剂或细胞因子(例如肿瘤坏死因子(TNF)和特别地在整体引入本文的于2002年2月13日提交的U.S.S.N.60/355,838中证实的TNF双特异性模式)或毒素(例如蓖麻毒蛋白)或抗有丝分裂或凋亡试剂或因子。
[0242] 抗体分子的Fab和F(ab′)2部分可以经由众所周知的方法通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别对基本上完整抗体分子的蛋白水解反应进行制备。参见例如，给予Theofilopolous等人的美国专利号4,342,566。Fab′抗体分子部分也是众所周知的，并且由F(ab′)2部分产生，随后为如同用巯基乙醇的连接2个重链部分的二硫键的还原，并且随后为所得到的蛋白质硫醇用试剂例如碘乙酰胺的烷基化。包含完整抗体分子的抗体在本文中是优选的。
[0243] 短语“单克隆抗体”以其各种语法形式指仅具有能够与特定抗原免疫反应的一个种类的抗体结合部位的抗体。单克隆抗体因此一般展示出对于它与之免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体还可以包含具有多个抗体结合部位的抗体分子，所述部位各自对于不同抗原是免疫特异性的；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。
[0244] 术语“抗原结合结构域”描述包含与抗原的部分或全部特异性结合且与之互补的区域的抗体部分。当抗原大时，抗体可以仅与抗原的特定部分结合，所述部分被称为表位。抗原结合结构域可以通过一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
[0245] “翻译后修饰”可以包含一种或多种修饰中的任何一种或组合，包括共价修饰，蛋白质在翻译完成后并且在从核糖体中释放后或对新生多肽共翻译地经历所述修饰。翻译后修饰包括但不限于磷酸化、十四烷基化、泛素化、糖基化、辅酶附着、甲基化和乙酰化。翻译后修饰可以调节或影响蛋白质的活性，其细胞内或细胞外目标，其稳定性或半衰期和/或其由配体、受体或其他蛋白质的识别。翻译后修饰可以在细胞细胞器、细胞核或细胞质中或在细胞外发生。
[0246] 术语“特异性”可以用于指其中特异性结合对的一个成员将不显示与除其一个或多个特异性结合配偶体外的分子的任何显著结合的情况。当例如抗原结合结构域对于由许多抗原携带的特定表位特异时，该术语也可应用，在所述情况下携带抗原结合结构域的特异性结合成员将能够与携带表位的多种抗原结合。
[0247] 术语“包含”一般以包括的含义使用，即允许一个或多个特征或组分的存在。
[0248] 术语“基本上由......组成”指产物，特别是并非与较大产物共价附着的限定数目残基的肽序列。然而，在上文提及的本发明肽的情况下，本领域技术人员应当理解可以考虑对于肽的N或C末端的较小修饰，例如末端的化学修饰，以加入保护基团等，例如C末端的酰胺化。
[0249] 术语“分离的”指依照本发明其中本发明的特异性结合成员或编码此类结合成员的核酸将处于的状态。成员和核酸将不含或基本上不含它们与之天然结合的材料，例如它们与之一起在其天然环境或它们在其中制备的环境(例如细胞培养)中发现的其他多肽或核酸，当此类制备通过重组DNA技术在体外或在体内实践时。成员和核酸可以用稀释剂或佐剂进行配制，并对于实践目的仍是分离的，例如如果用于包被微量滴定板用于在免疫测定中使用，那么成员将通常与明胶或其他载体混合，或当在诊断或治疗中使用时，将与药学上可接受的载体或稀释剂混合。特异性结合成员可以是天然地或通过异源真核细胞的系统糖基化的，或它们可以是(例如如果通过在原核细胞中表达产生)非糖基化的。
[0250] 此外，如本文使用的，术语“糖基化”和“糖基化的”包括且包含称为糖蛋白的蛋白质通过寡糖添加的翻译后修饰。寡糖在糖蛋白的糖基化位点上添加，特别包括N联寡糖和O联寡糖。N联寡糖加入Asn残基中，特别是其中Asn残基在序列N-X-S/T中，其中X不能是Pro或Asp，并且是糖蛋白中最通常发现的那种。在N联糖蛋白的生物合成中，高甘露糖型寡糖(一般包含多萜醇、N-乙酰葡糖胺、甘露糖和葡萄糖，首先在内质网(ER)中形成。高甘露糖型糖蛋白随后从ER转运到高尔基体，在其中发生寡糖的进一步加工和修饰。O联寡糖加入Ser或Thr残基的羟基基团中。在O联寡糖中，N-乙酰葡糖胺首先在ER中通过N-乙酰葡糖胺转移酶转移至Ser或Thr残基。蛋白质随后移动到高尔基体，在其中发生进一步修饰和链延长。O联修饰可以在那些Ser或Thr位点上由OGlcNAc单糖单独的简单添加发生，其在不同条件下也可以是磷酸化的而不是糖基化的。
[0251] 如本文使用的，“pg”意指皮克，“ng”意指纳克，“ug”或“μg”意指微克，“mg”意指毫克，“ul″或“μl”意指微升，“ml”意指毫升，“l”意指升。
[0252] 术语“806抗体”、“mAb806”、“ch806”和未具体列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如本申请和权利要求自始至终使用的指蛋白质材料，包括单一或多个蛋白质，并且延伸至具有在本文中描述且在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中呈现的氨基酸序列数据的那些蛋白质，以及掺入且构成SEQ ID NO：7和8的部分的嵌合抗体ch806，以及在本文和权利要求中所述的活性概况。相应地，同样考虑了展示基本上等价或改变活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或可以是偶然的，例如通过为复合物的生产者的宿主中的突变获得的那些或其命名的亚单位。此外，术语“806抗体”、“mAb806”和“ch806”在其范围内意欲包括本文具体叙述的蛋白质以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
[0253] 术语“人源化806抗体”、“hu806”和“镶嵌806抗体”和未具体列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如本申请和权利要求自始至终使用的指蛋白质材料，包括单一或多个蛋白质，并且延伸至具有在本文中描述且在SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：47中呈现的氨基酸序列数据的那些蛋白质，以及在本文和权利要求中所述的活性概况。相应地，同样考虑了展示基本上等价或改变活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或可以是偶然的，例如通过为复合物的生产者的宿主中的突变获得的那些或其命名的亚单位。此外，术语“人源化806抗体”、“hu806”和“镶嵌806抗体”在其范围内意欲包括本文具体叙述的蛋白质以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
[0254] 术语“175抗体”和“mAb175”和未具体列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如本申请和权利要求自始至终使用的指蛋白质材料，包括单一或多个蛋白质，并且延伸至具有在本文中描述且在SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：134中呈现的氨基酸序列数据的那些蛋白质，以及在本文和权利要求中所述的活性概况。相应地，同样考虑了展示基本上等价或改变活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或可以是偶然的，例如通过为复合物的生产者的宿主中的突变获得的那些或其命名的亚单位。此外，术语“175抗体”和“mAb175”在其范围内意欲包括本文具体叙述的蛋白质以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
[0255] 术语“124抗体”和“mAb124”和未具体列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如本申请和权利要求自始至终使用的指蛋白质材料，包括单一或多个蛋白质，并且延伸至具有在本文中描述且在SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：27中呈现的氨基酸序列数据的那些蛋白质，以及在本文和权利要求中所述的活性概况。相应地，同样考虑了展示基本上等价或改变活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或可以是偶然的，例如通过为复合物的生产者的宿主中的突变获得的那些或其命名的亚单位。此外，术语“124抗体”和“mAb124”在其范围内意欲包括本文具体叙述的蛋白质以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
[0256] 术语“1133抗体”和“mAb1133”和未具体列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如本申请和权利要求自始至终使用的指蛋白质材料，包括单一或多个蛋白质，并且延伸至具有在本文中描述且在SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：37中呈现的氨基酸序列数据的那些蛋白质，以及在本文和权利要求中所述的活性概况。相应地，同样考虑了展示基本上等价或改变活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或可以是偶然的，例如通过为复合物的生产者的宿主中的突变获得的那些或其命名的亚单位。此外，术语“11133抗体”和“mAb1133”在其范围内意欲包括本文具体叙述的蛋白质以及所有基本上同源的类似物和等位基因变异。
[0257] 本文描述的氨基酸残基优选是“L”异构形式。然而，为“D”异构形式的残基可以置换任何L-氨基酸残基，只要所需免疫球蛋白结合的功能性质由多肽保留。NH2指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与标准多肽命名法J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)相一致，关于氨基酸残基的缩写显示于下述对应表中：
[0258] 对应表
[0259]
[0260]
[0261] 应当指出，所有氨基酸残基序列在本文中通过其左和右定向是氨基末端到羧基末端的常规方向的式子表示。此外，应当指出，在氨基酸残基序列的开始或末端的破折号指示与一个或多个氨基酸残基的进一步序列的肽键。呈现上表以使在本文中可以可替代地出现的三字母和单字母符号关联。
[0262] “复制子”是充当体内DNA复制的自主单位的任何遗传元件(例如质粒、染色体、病毒)；即能够在其自身控制下复制。
[0263] “载体”是另一个DNA区段可以与之附着以便引起所附着区段的复制的复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒。
[0264] “DNA分子”指为其单链形式或双链螺旋的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。这个术语仅指分子的一级和二级结构，并且不使其限制于任何特定三级形式。因此，这个术语包括尤其在线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构中，序列在本文中可以根据标准常规描述，即仅给出沿着DNA的非转录链(即具有与mRNA同源的序列的链)以5′到3′方向的序列。
[0265] “复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。
[0266] DNA“编码序列”是双链DNA序列，当置于合适调节序列的控制下时，其在体内转录且翻译成多肽。编码序列的边界通过在5′(氨基)末端的起始密码子和在3′(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、和甚至合成DNA序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将定位于编码序列的3′。
[0267] 转录和翻译控制序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等，其为编码序列在宿主细胞中的表达作准备。
[0268] “启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶且起始下游(3′方向)编码序列转录的DNA调节区。为了限定本发明的目的，启动子序列在其3′末端由转录起始位点结合，且向上游(5′方向)延长以包括起始超过本底可检测水平下转录所需的最低数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(方便地通过用核酸酶S 1作图限定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子将通常但不一定包含“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除-10和-35共有序列外还包含Shine Dalgarno序列。
[0269] “表达控制序列”是控制且调节另一种DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列在细胞中的转录和翻译控制序列的“控制下”，mRNA随后翻译成由编码序列编码的蛋白质。
[0270] 在编码序列之前可以包括“信号序列”。这个序列编码多肽N末端的信号肽，其与宿主细胞通讯，以将多肽导向细胞表面或将多肽分泌到培养基内，并且这种信号肽在蛋白质离开细胞前通过宿主细胞修剪掉(clipped off)。可以发现对于原核和真核生物天然的与多种蛋白质结合的信号序列。
[0271] 如本文使用的，在提及本发明的探针中的术语“寡核苷酸”定义为由2个或更多个优选超过3个核糖核苷酸组成的分子。它的确切大小将取决于多种因素，所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。
[0272] 如本文使用的，术语“引物”指如在纯化的限制性消化中天然存在或合成产生的寡核苷酸，当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时，即在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下且在合适温度和pH下，所述寡核苷酸能够充当合成起始点。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长，以在诱导剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多种因素，包括温度、引物来源和方法的用途。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般包含15-25个或更多个核苷酸，尽管它可以包含更少的核苷酸。
[0273] 引物在本文中选择为与特定靶DNA序列的不同链“基本上”互补。这意指引物必须足够互补，以与其各自链杂交。因此，引物序列无需反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可以与引物的5′末端附着，而引物序列的其余部分与链互补。可替代地，非互补碱基或较长序列可以散布在引物内，条件是引物序列和与之杂交的链的序列具有足够互补性，并且从而构成用于合成延伸产物的模板。
[0274] 如本文使用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”指细菌酶，其各自在特定核苷酸序列或附近切割双链DNA。
[0275] 当外源或异源DNA已引入细胞内时，细胞已通过此类DNA“转化”。转化DNA可以整合或未整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA内。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以维持在附加型元件例如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是其中转化DNA已变得整合到染色体内的那种，从而使得它通过染色体复制由子代细胞继承。这种稳定性通过真核细胞建立由包含转化DNA的子代细胞群体组成的细胞系或克隆的能力加以证实。“克隆”是通过有丝分裂衍生自单细胞或共同祖先的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆。
[0276] 当至少约75％(优选至少约80％、且最优选至少约90％或95％)的核苷酸在限定长度的DNA序列上匹配时，2个DNA序列是“基本上同源的”。基本上同源的序列可以使用序列数据库中可获得的标准软件通过比较序列进行鉴定，或在DNA杂交实验中在例如如对于那个具体系统限定的严格条件下鉴定。限定合适杂交条件在本领域的技术内。参见例如，Maniatis等人，同上；DNA Cloning，第I&II卷，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
[0277] 应当理解，编码本发明的特异性结合成员(抗体)的DNA序列也在本发明的范围内，所述DNA序列编码具有所公开序列的抗体但为此类序列的简并。“简并”意指不同的三字母密码子用于指定特定氨基酸。本领域众所周知下述密码子可以可互换地用于编码每个特定氨基酸：
[0278]
[0279] 应当理解，上文指定的密码子用于RNA序列。关于DNA的相应密码子具有代替U的T。
[0280] 可以在例如本发明抗体的所公开序列中进行突变，从而使得特定密码子改变成编码不同氨基酸的密码子。此类突变一般通过做出可能的最少核苷酸改变进行。可以进行这类置换突变，以非保守方式(即通过使密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变成属于另一个分组的氨基酸)或保守方式(即通过使密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变成属于相同分组的氨基酸)改变所得到的蛋白质中的氨基酸。此类保守改变一般导致所得到的蛋白质的结构和功能中的较少改变。非保守改变更可能改变所得到的蛋白质的结构、活性或功能。本发明应视为包括包含保守改变的序列，所述保守改变基本上不改变所得到的蛋白质的活性或结合特征。
[0281] 下述是氨基酸的各种分组的一个例子：
[0282] 具有非极性R基团的氨基酸
[0283] 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸[0284] 具有不荷电极性R基团的氨基酸
[0285] 甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺
[0286] 具有荷电极性R基团的氨基酸(在Ph 6.0带负电)
[0287] 天冬氨酸、谷氨酸
[0288] 碱性氨基酸(在pH 6.0带正电)
[0289] 赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH 6.0)。
[0290] 另一种分组可以是具有苯基基团的那些氨基酸：
[0291] 苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。
[0292] 另一种分组可以根据分子量(即R基团的大小)：
[0293]
[0294]
[0295] 特别优选的置换是：
[0296] -Lys置换Arg，并且反之亦然，从而使得正电荷可以得到维持；
[0297] -Glu置换Asp，并且反之亦然，从而使得负电荷可以得到维持；
[0298] -Ser置换Thr，从而使得游离-OH可以得到维持；和
[0299] -Gin置换Asn，从而使得游离NH2可以得到维持。
[0300] 还可以引入氨基酸置换，以置换具有特别优选性质的氨基酸。例如，Cys可以引入用于与另一个Cys的二硫桥的潜在位点。His可以作为特别地“催化”位点引入(即His可以充当酸或碱，并且是生物化学催化中的最常见氨基酸)。Pro可以由于其特别地平面结构而引入，这诱导蛋白质的结构中的(3-转角。
[0301] 当至少约70％的氨基酸残基(优选至少约80％、且最优选至少约90％或95％)相同或代表保守置换时，2个氨基酸序列是“基本上同源的”。
[0302] DNA构建体的“异源”区域是在较大DNA分子内可鉴定的DNA区段，其在自然界中未发现与较大分子相关。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，该基因通常侧面为在来源生物的基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA。异源编码序列的另一个例子是其中编码序列自身在自然界中未发现的构建体(例如其中基因组编码序列包含内含子的cDNA，或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不引起如本文定义的DNA的异源区域。
[0303] 短语“药学上可接受的”指分子实体和组合物，其是生理学上可耐受的，并且当施用于人时，一般不产生变应性或相似的不利反应，例如胃不适、眩晕等。
[0304] 短语“治疗有效量”在本文中用于指足以预防且优选使靶细胞团块、癌细胞集合或肿瘤的生长或进展或有丝分裂活性，或其他病理学特征中的临床显著改变减少至少约30％、优选至少50％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％的量。例如，可以减少EGFR激活程度，或EGFR阳性细胞特别是抗体或结合成员反应或阳性细胞的活性或量或数目。
[0305] 当表达控制序列控制且调节DNA序列的转录和翻译时，那个DNA序列与表达控制序列是“可操作地连接的”。术语“可操作地连接的”包括在待表达的DNA序列前具有合适起始信号(例如ATG)，且维持正确阅读框以允许在表达控制序列控制下的DNA序列的表达和由DNA序列编码的所需产物的产生。如果希望插入重组DNA分子内的基因不包含合适起始信号，那么此类起始信号可以插入基因前。
[0306] 术语“标准杂交条件”指对于杂交和洗涤基本上等价于5xSSC和65℃的盐和温度条件。然而，本领域技术人员应当理解此类“标准杂交条件”取决于具体条件，包括缓冲液中的钠和镁浓度、核苷酸序列长度和浓度、错配百分比、甲酰胺百分比等。在“标准杂交条件”的决定中还重要的是杂交的2个序列是RNA-RNA、DNA-DNA还是RNA-DNA。此类标准杂交条件由本领域技术人员根据众所周知的公式容易地决定，其中杂交一般比预测或测定的Tm低10-20℃，需要时，伴随较高严格性的洗涤。
[0307] 本发明提供了识别EGFR表位的新特异性结合成员，特别是抗体或其片段，包括免疫原性片段，所述EGFR表位在肿瘤发生、过度增生或异常细胞中发现，其中所述表位在异常翻译后修饰后是增强的或明显的，并且在正常或野生型细胞中是不可检测的。在一个特定但非限制性实施方案中，结合成员例如抗体识别EGFR表位，所述EGFR表位在简单碳水化合物修饰或早期糖基化后是增强的或明显的，并且在复杂碳水化合物修饰或糖基化的存在下是减少的或并非明显的。在不存在超表达的情况下和在正常EGFR翻译后修饰的存在下，特异性结合成员例如抗体或其片段不结合或识别包含正常或野生型EGFR表位的正常或野生型细胞。
[0308] 本发明进一步提供了新抗体806、175、124、1133、ch806和hu806及其片段，包括免疫原性片段，其识别在肿瘤发生、过度增生或异常细胞中暴露的EGFR表位，特别是EGFR肽(287CGADSYEMEEDGVRKC302(SEQ ID NO：14))，其中表位是增强的、显露的或明显的，并且在正常或野生型细胞中是不可检测的。在一个特定但非限制性实施方案中，抗体识别EGFR表位，所述EGFR表位在简单碳水化合物修饰或早期糖基化后是增强的或明显的，并且在复杂碳水化合物修饰或糖基化的存在下是减少的或并非明显的。在不存在超表达、扩增或肿瘤发生事件的情况下，抗体或其片段不结合或识别包含正常或野生型EGFR表位的正常或野生型细胞。
[0309] 在本发明的一个特定方面且如上所述，本发明人已发现了新单克隆抗体806、175、124、1133、ch806和hu806，其特异性识别扩增的野生型EGFR和de2-7EGFR，但与不同于de2-7EGFR突变的独特连接肽的表位结合。另外，虽然mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806不识别在神经胶质瘤细胞的细胞表面上表达的正常、野生型EGFR，但它们的确与ELISA板表面上固定的EGFR的细胞外结构域结合，指示具有多肽外观的构象表位。
[0310] 重要的是，mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133、ch806和hu806不与正常组织例如肝脏和皮肤显著结合，它们表达比大多数其他正常组织中更高水平的内源wtEGFR，但其中EGFR不是超表达的或扩增的。因此，mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806证实新型和有用的特异性，识别de2-7EGFR和扩增的EGFR，同时不识别正常、野生型EGFR或其为de2-7EGFR特征的独特连接肽。在一个优选方面，本发明的mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806分别包括图14B和15B；74B和75B；51B和51D；52B和52D；以及55A和55B中所述的VH和VL链CDR结构域氨基酸序列(分别地SEQ ID NOS：2和4；129和134；
22和27；32和37；以及42和47；SEQ ID NO：42包括分别地SEQ ID NOS：163和164的hu806VH链信号肽和VH链序列，并且SEQ ID NO：47包括分别地SEQ ID NOS：165和166的hu806VL链信号肽和VL链序列)。
22和27；32和37；以及42和47；SEQ ID NO：42包括分别地SEQ ID NOS：163和164的hu806VH链信号肽和VH链序列，并且SEQ ID NO：47包括分别地SEQ ID NOS：165和166的hu806VL链信号肽和VL链序列)。
[0311] 在另一个方面，本发明提供了能够与175抗体竞争的抗体，在其中具有175抗体的VH和VL链序列(分别为SEQ ID NOS：129和134)的至少10％抗体通过在ELISA测定中与此类抗体竞争阻断与de2-7EGFR结合的条件下进行。如上所述，在本文中考虑了抗独特型抗体。
[0312] 本发明涉及识别EGFR表位的特异性结合成员，特别是抗体或其片段，所述EGFR表位存在于表达扩增的EGFR或表达de2-7EGFR的细胞中，并且在表达正常或野生型EGFR的细胞中是不可检测的，特别是在正常翻译后修饰的存在下。
[0313] 进一步指出且在本文中证实本发明抗体的另外非限制性观察或特征是其在高甘露糖基团的存在下识别其表位，所述高甘露糖基团是早期糖基化或简单碳水化合物修饰的特征。因此，改变或异常的糖基化促进抗体表位的存在和/或识别或包括抗体表位的部分。
[0314] 糖基化包括且包含称为糖蛋白的蛋白质通过寡糖添加的翻译后修饰。寡糖在糖蛋白的糖基化位点上添加，特别包括N联寡糖和O联寡糖。N联寡糖加入Asn残基中，特别是其中Asn残基在序列N-X-S/T中，其中X不能是Pro或Asp，并且是糖蛋白中最通常发现的那种。在N联糖蛋白的生物合成中，高甘露糖型寡糖(一般包含多萜醇、N-乙酰葡糖胺、甘露糖和葡萄糖，首先在内质网(ER)中形成。高甘露糖型糖蛋白随后从ER转运到高尔基体，在其中通常发生寡糖的进一步加工和修饰。O联寡糖加入Ser或Thr残基的羟基基团中。在O联寡糖中，N-乙酰葡糖胺首先在ER中通过N-乙酰葡糖胺转移酶转移至Ser或Thr残基。蛋白质随后移动到高尔基体，在其中发生进一步修饰和链延长。
[0315] 在本发明的一个特定方面且如上所述，本发明人已发现了新单克隆抗体，在本文中通过指名为mAb806(及其嵌合ch806)mAb175、mAb124、mAb1133和hu806的抗体示例，其特异性识别扩增的野生型EGFR和de2-7 EGFR，但与不同于de2-7 EGFR突变的独特连接肽的表位结合。本发明的抗体特异性识别超表达的EGFR，包括扩增的EGFR和突变型EGFR(在本文中通过de2-7突变示例)，特别是在异常翻译后修饰后。另外，虽然这些抗体不识别在神经胶质瘤细胞的细胞表面上表达的正常、野生型EGFR，但它们的确与ELISA板表面上固定的EGFR的细胞外结构域结合，指示具有多肽外观的构象表位。重要的是，这些抗体不与正常组织例如肝脏和皮肤显著结合，它们表达比大多数其他正常组织中更高水平的内源wtEGFR，但其中EGFR不是超表达的或扩增的。因此，这些抗体证实新型和有用的特异性，识别de2-7 EGFR和扩增的EGFR，同时不识别正常、野生型EGFR或其为de2-7 EGFR特征的独特连接肽。
[0316] 在一个优选方面，抗体是具有本发明人已鉴定且表征的抗体特征，特别是识别扩增的EGFR和de2-7EGFR的那些。在特别优选的方面，抗体是mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806或其活性片段。在一个进一步优选的方面，本发明的抗体分别包含图16和17；74B和75B；51B和51D；52B和52D；以及55A和55B所述的VH和VL链氨基酸序列。
[0317] 优选地，特异性结合成员或抗体的表位定位于包括成熟的正常或野生型EGFR序列的残基273-501的区域内，并且优选地，表位包括成熟的正常或野生型EGFR序列的残基287-302(SEQ ID NO：14)。因此，还提供的是特异性结合蛋白例如抗体，其在定位于包括EGFR序列的残基273-501并且包括EGFR序列的残基287-302(SEQ ID NO：14)的区域内的表位上与de2-7 EGFR结合。该表位可以通过本领域技术人员已知的任何常规表位作图技术进行测定。可替代地，可以消化编码残基273-501和287-302(SEQ ID NO：14)的DNA序列，并且在合适宿主中表达所得到的片段。抗体结合可以如上所述进行测定。
[0318] 特别地，成员将与包括成熟的正常或野生型EGFR的残基273-501且更具体而言包括残基287-302(SEQ ID NO：14)的表位结合。然而，显示相同或基本上相似的反应模式的其他抗体也构成本发明的方面。这可以通过比较此类成员与分别包括SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；以及42和47中所示的VH和VL链结构域的抗体进行测定。
比较一般将使用蛋白质印迹进行，其中结合成员与由细胞的核制备物制备的一式两份印迹结合，从而使得可以直接比较结合模式。
比较一般将使用蛋白质印迹进行，其中结合成员与由细胞的核制备物制备的一式两份印迹结合，从而使得可以直接比较结合模式。
[0319] 在另一个方面，本发明提供了能够与mAb806竞争的抗体，在其中具有此类抗体之一的VH和VL链序列的至少10％抗体通过在ELISA测定中与此类抗体竞争阻断与de2-7EGFR结合的条件下进行。如上所述，在本文中考虑且举例说明了抗独特型抗体。
[0320] 在另一个方面，本发明提供了能够与mAb175、mAb124和/或mAb1133竞争的抗体，在其中具有此类抗体之一的VH和VL链序列的至少10％抗体通过在ELISA测定中与此类抗体竞争阻断与de2-7EGFR结合的条件下进行。如上所述，在本文中考虑且举例说明了抗独特型抗体。
[0321] 在另一个方面，本发明提供了能够与mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和/或hu806竞争的抗体，在其中具有此类抗体之一的VH和VL链序列的至少10％抗体通过在ELISA测定中与此类抗体竞争阻断与de2-7EGFR结合的条件下进行。如上所述，在本文中考虑且举例说明了抗独特型抗体。
[0322] 基本上由包括成熟的野生型EGFR的残基273-501且更具体而言包括残基287-302(SEQ ID NO：14)的表位组成的分离多肽构成本发明的另一个方面。本发明的肽在诊断测定或试剂盒中以及在治疗或预防上是特别有用的，包括作为抗瘤或抗癌疫苗。因此，本发明的肽的组合物包括药物组合物和免疫原性组合物。
[0323] 诊断和治疗用途
[0324] 本发明的特异性结合成员特别是抗体或其片段的独特特异性提供了诊断和治疗用途，由此一种或多种结合成员识别EGFR表位，其在肿瘤发生、过度增生或异常细胞中发现，并且在正常或野生型细胞中是不可检测的，并且其中所述表位在异常翻译后修饰后是增强的或明显的，并且其中所述一种或多种成员与de2-7 EGFR和扩增的EGFR但不与wtEGFR结合，以鉴定、表征、靶向且治疗、减少或消除许多肿瘤发生细胞类型和肿瘤类型，例如头与颈、乳腺、肺、膀胱或前列腺瘤和神经胶质瘤，而无用先前已知的EGFR抗体可能见到的与正常组织摄取相关的问题。因此，超表达EGFR(例如通过突变体或变体EGFR的扩增或表达)的细胞，特别是证实异常翻译后修饰的那些，可以利用本发明的一种或多种结合成员特别是一种或多种抗体或其片段识别、分离、表征、靶向且治疗或消除。
[0325] 在本发明的一个进一步方面，提供了治疗肿瘤、癌性状况、癌前状况、和涉及或起因于过度增生细胞生长的任何状况的方法，其包括mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和/或hu806的施用。
[0326] 因此，本发明的抗体可以特异性分类EGFR肿瘤或肿瘤发生细胞的性质，其通过染色或以其他方式识别其中存在EGFR超表达特别是扩增和/或EGFR突变特别是de2-7 EGFR的那些肿瘤或细胞进行。进一步地，本发明的抗体如由mAb806(和嵌合抗体ch806)、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806示例的，证实针对包含扩增的EGFR的肿瘤和针对de2-7 EGFR阳性异种移植物的显著体内抗瘤活性。
[0327] 如上文概述的，本发明人已发现本发明的特异性结合成员识别EGFR的肿瘤相关形式(de2-7 EGFR和扩增的EGFR)，而不是当在正常细胞中表达时的正常、野生型受体。认为抗体识别取决于在显示EGFR基因超表达的细胞中表达的EGFR的异常翻译后修饰(例如独特糖基化、乙酰化或磷酸化变体)。
[0328] 如下文描述的，本发明的抗体已用于治疗研究中，且显示抑制超表达(例如扩增的)EGFR异种移植物和人肿瘤的人de2-7 EGFR表达异种移植物的生长，且在此类肿瘤内诱导显著坏死。
[0329] 此外，本发明的抗体在预防模型中抑制颅内肿瘤的生长。这种模型涉及将表达de2-7 EGFR的神经胶质瘤细胞注射到裸鼠内，并且随后在同一天或在1-3天内颅内注射抗体，任选使用重复剂量。抗体剂量适当地是约10μg。将用抗体注射的小鼠与对照比较，并且已发现经处理的小鼠的存活得到显著增加。
[0330] 因此，在本发明的一个进一步方面，提供了治疗肿瘤、癌性状况、癌前状况、和涉及或起因于过度增生细胞生长的任何状况的方法，其包括本发明的特异性结合成员的施用。
[0331] 本发明的抗体设计为在人或动物受试者中的肿瘤特别是上皮肿瘤的诊断和治疗方法中使用。这些肿瘤可以是任何类型的原发性或继发性实体瘤，包括但不限于神经胶质瘤、乳腺、肺、前列腺、头或颈肿瘤。
[0332] 结合成员和抗体生成
[0333] 用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。永生的抗体产生细胞系也可以通过除融合外的技术产生，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染。参见例如，M.Schreier等人，″Hybridoma Techniques″(1980)；Hammering等 人， ″ Monoclonal Antibodies And T cell Hybridomas ″ (1981)；Kennett 等人，″Monoclonal Antibodies″(1980)；还参见美国专利号4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。
[0334] 针对EGFR产生的单克隆抗体的组可以就多种性质进行筛选；即同种型、表位、亲和力等。特别有利的是模拟EGFR或其亚单位活性的单克隆抗体。此类单克隆可以在特异性结合成员活性测定中容易地鉴定。当天然或重组特异性结合成员的免疫亲和纯化为可能时，高亲和力抗体也是有用的。
[0335] 用于产生多克隆抗EGFR抗体的方法是本领域众所周知的。参见给予Nestor等人的美国专利号4,493,795。一般包含有用抗体分子的Fab和/或F(ab′)2部分的单克隆抗体可以使用Antibodies-A Laboratory Manual，Harlow和Lane，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)中所述的杂交瘤技术进行制备，其引入本文作为参考。简言之，为了形成由其产生单克隆抗体组合物的杂交瘤，使骨髓瘤或其他自身永续细胞系与得自用合适EGFR超免疫的哺乳动物脾的淋巴细胞融合。
[0336] 一般使用聚乙二醇(PEG)6000使脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合的杂交物通过其对于HAT的敏感性进行选择。通过其与呈现抗体或结合成员免疫反应的能力及其抑制靶细胞中的特定肿瘤发生或过度增生活性的能力，鉴定产生在实践本发明中有用的单克隆抗体的杂交瘤。
[0337] 在实践本发明中有用的单克隆抗体可以通过起始包括包含杂交瘤的营养培养基的单克隆杂交瘤培养产生，所述杂交瘤分泌具有合适抗原特异性的抗体分子。使培养物在对于杂交瘤将抗体分子分泌到培养基内足够的条件和时间段下维持。随后收集含抗体培养基。抗体分子随后可以通过众所周知的技术进一步分离。
[0338] 对于这些组合物制备有用的培养基是本领域众所周知和商购可得的，并且包括合成培养基、近交小鼠等。示例性合成培养基是补充有4.5gm/1葡萄糖、20mm谷氨酰胺和20％胎牛血清的达尔贝科最低必需培养基(DMEM；Dulbecco等人，Virol.8：396(1959))。示例性近交小鼠品系是Balb/c。
[0339] 用于产生单克隆抗EGFR抗体的方法也是本领域众所周知的。参见Niman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4949-4953(1983)。一般地，使用单独或与免疫原性载体缀合的EGFR或肽类似物，作为在先前描述的用于产生抗EGFR单克隆抗体的程序中的免疫原。就产生与在肿瘤发生、异常或过度增生细胞中存在的EGFR免疫反应的抗体的能力筛选杂交瘤。其他抗EGFR抗体包括但不限于来自Genmab/Medarex的HuMAX-EGFr抗体、108抗体(ATCC HB9764)和美国专利号6,217,866、和来自Schering AG(美国专利号5,942,602)的抗体14E1。
[0340] 重组结合成员、嵌合体、双特异性和片段
[0341] 一般而言，包括基本上如分别作为SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；以及42和47的CDR1区所示的氨基酸序列的CDR1区，将在允许CDR1区与肿瘤抗原结合的结构中携带。例如，在SEQ ID NO：4的CDR1区的情况下，这优选由SEQ ID NO：4的VL链区域携带(并且类似地用于其他所述序列)。
[0342] 一般而言，包括基本上如分别作为SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；以及42和47的CDR2区所示的氨基酸序列的CDR2区，将在允许CDR2区与肿瘤抗原结合的结构中携带。例如，在SEQ ID NO：4的CDR2区的情况下，这优选由SEQ ID NO：4的VL链区域携带(并且类似地用于其他所述序列)。
[0343] 一般而言，包括基本上如分别作为SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；以及42和47的CDR3区所示的氨基酸序列的CDR3区，将在允许CDR3区与肿瘤抗原结合的结构中携带。例如，在SEQ ID NO：4的CDR3区的情况下，这优选由SEQ ID NO：4的VL链区域携带(并且类似地用于其他所述序列)。
[0344] “基本上如所示的”意指本发明的CDR区例如CDR3区将分别与SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；以及42和47的指定区域等同或高度同源。“高度同源”考虑了可以在一个或多个CDRs中做出仅少数置换，优选1-8个、优选1-5个、优选1-4个、或1-3个或1或2个置换。还考虑到此类术语包括对于CDRs的截短，只要所得到的抗体显示出本文讨论的抗体类别的独特性质，如由mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806显示的。
[0345] 用于携带本发明的CDRs特别是CDR3的结构一般将是抗体重或轻链序列或其基本部分，其中CDR区定位于对应于由重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL链抗体可变结构域的CDR区的位置。通过参考目前在因特网(http：//immuno.bme.nwu.edu))上可获得的Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版US Department of Health and Human Services.1987及其更新，可以测定免疫球蛋白可变结构域的结构和定位。此外，如本领域技术人员已知的，CDR测定可以以各种方式进行。例如，可以使用Kabat、Chothia和组合结构域测定分析。在这点上，参见例如http：//www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid。
[0346] 优选地，基本上如作为本发明抗体中的VH链CDR残基所示的氨基酸序列在人重链可变结构域或其基本部分中，并且基本上如作为本发明抗体中的VL链CDR残基所示的氨基酸序列在人轻链可变结构域或其基本部分中。
[0347] 可变结构域可以衍生自任何种系或重排的人可变结构域，或可以是基于已知人可变结构域的共有序列的合成可变结构域。使用重组DNA技术，可将例如如先前段落中限定的本发明的CDR3衍生序列引入缺乏CDR3区的可变结构域储库(repertoire)内。
[0348] 例如，Marks等人(Bio/Technology，1992，10：779-783)描述了产生抗体可变结构域储库的方法，其中针对或邻近可变结构域区域的5′末端的共有引物与针对人VH基因的第三个构架区的共有引物结合使用，以提供缺乏CDR3的VH可变结构域储库。Marks等人进一步描述了这个储库如何可以与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，本发明的CDR3衍生序列可以与缺乏CDR3的VH或VL结构域储库改组，并且改组的完全VH或VL结构域与同族VL或VH结构域组合，以提供本发明的特异性结合成员。储库随后可以在合适宿主系统例如W092/01047的噬菌体展示系统中展示，从而使得可以选择合适的特异性结合成员。储4 6 8 10
库可以由从10个别成员以上的任何组成，例如10 -10或10 成员。
库可以由从10个别成员以上的任何组成，例如10 -10或10 成员。
[0349] 类似改组或组合技术也由Stemmer(Nature，1994，370：389-391)公开，其描述了与p-内酰胺酶基因相关的技术，但观察到该方法可以用于抗体生成。
[0350] 进一步的可替代方案是生成携带本发明的CDR3衍生序列的新VH或VL区，其使用例如mAb806VH或VL基因的随机诱变，以生成在整个可变结构域内的突变。此类技术由Gram等人(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：3576-3580)描述，其使用易错PCR。
[0351] 可以使用的另一种方法是将诱变导向VH或VL基因的CDR区。此类技术由Barbas等人，(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813)和Schier等人(1996，J.Mol.Biol.263：551-567)公开。
[0352] 所有上述技术是本领域像这样已知的，并且自身不构成本发明的部分。使用本领域的常规方法，技术人员将能够使用此类技术以提供本发明的特异性结合成员。
[0353] 免疫球蛋白可变结构域的基本部分将包括至少3个CDR区，连同其间插构架区。优选地，部分还将包括第一个和第四个构架区中任一或两者的至少约50％，50％是第一个构架区的C末端50％和第四个构架区的N末端50％。在可变结构域的基本部分的N末端或C末端的另外残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区域结合的那些。例如，通过重组DNA技术进行的本发明的特异性结合成员的构建可以导致由所引入接头编码的N或C末端残基的引入，以促进克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括接头的引入，以连接本发明的可变结构域与进一步的蛋白质序列，包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在双抗体的产生中)或蛋白质标记，如下文更详细地讨论的。
[0354] 尽管在本发明的优选方面，包括一对结合结构域的特异性结合成员是优选的，所述结合结构域基于基本上分别在SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；以及42和47中所示的序列，但基于这些序列的单一结合结构域构成本发明的进一步方面。在基于基本上在VH链中所示的序列的结合结构域的情况下，此类结合结构域可以用作靶向试剂用于肿瘤抗原，因为已知免疫球蛋白VH结构域能够以特异性方式结合靶抗原。
[0355] 在单链特异性结合结构域中的任一的情况下，这些结构域可以用于筛选能够形成双结构域特异性结合成员的互补结构域，其具有与本文公开的mAb806、ch806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806抗体一样好或相等的体内性质。
[0356] 这可以通过噬菌体展示筛选方法来达到，其使用如美国专利5,969,108中公开的所谓的分层双重组合方法，其中包含H或L链克隆的个别集落用于感染编码另一条链(L或H)的克隆的完全文库，并且所得到的双链特异性结合成员依照噬菌体展示技术进行选择，例如那个参考文献中描述的那些。这种技术还公开于Marks等人，同前中。
[0357] 本发明的特异性结合成员可以进一步包括抗体恒定区或其部分。例如，基于VL链序列的特异性结合成员可以在其C末端与抗体轻链恒定结构域附着，包括人Ck或Cλ链，优选Cλ链。类似地，基于VH链序列的特异性结合成员可以在其C末端与衍生自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)和任何同种型亚类(特别是IgG1、IgG2b和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分附着。IgG1是优选的。
[0358] 25年前单克隆抗体(mAb)技术的出现已提供了有用研究试剂的庞大储库，且制造了使用抗体作为在癌症治疗、自身免疫病症、移植排斥、抗病毒预防中的批准药物试剂和作为抗血栓形成剂的机会(Glennie和Johnson，2000)。改造为将鼠mAbs转换成嵌合mAbs(小鼠V区，人C区)和人源化试剂的分子应用对于mAb治疗的临床成功是关键的，在所述人源化试剂中仅mAb互补决定区(CDR)具有鼠起源。经改造的mAbs具有显著减少或不存在的免疫原性，增加的血清半衰期，并且mAb的人Fc部分增加召募补体的免疫效应子和细胞毒性细胞的潜力(Clark2000)。深入对于临床施用的mAbs的生物分布、药代动力学和免疫应答的任何诱导的研究要求开发区分药物和内源蛋白质的分析。
[0359] 抗体或其任何片段还可以与任何细胞毒素、细菌或其他例如假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白或白喉毒素缀合或重组融合。所使用的毒素部分可以是完整毒素，或毒素的任何特定结构域。此类抗体-毒素分子已成功地用于不同种类癌症的靶向和治疗，参见例如，Pastan，Biochim Biophys Acta.1997 Oct 24；1333(2)：C1-6；Kreitman等 人，N.Engl.J.Med.2001Jul 26；345(4)：241-7；Schnell 等 人，Leukemia.2000 Jan；14(1)：129-35；Ghetie等人，Mol.Biotechnol.2001 Jul；18(3)：251-68。
[0360] 双和三特异性多聚体可以通过不同scFv分子的结合形成，并且已设计为交联试剂用于T细胞召募到肿瘤内(免疫治疗)、病毒重新靶向(基因治疗)和作为红血细胞凝集试剂(免疫诊断学)，参见例如Todorovska等人，J.Immunol.Methods.2001 Feb 1；248(1-2)：47-66；Tomlinson等 人，Methods Enzymol.2000；326：461-79；McCall 等 人，J.Immunol.2001May 15；166(10)：6112-7。
[0361] 全人抗体可以通过免疫接种携带大部分人免疫球蛋白重和轻链的转基因小鼠进TM行制备。这些小鼠是本领域众所周知的，此类小鼠的例子是Xenomouse (Abgenix、Inc.)TM
(美国专利号6,075,181和6,150,584)、HuMAb-Mouse (Medarex、Inc./GenPharm)(美国专利5,545,806和5,569,825)、TransChromo Mouse(Kirin)和KM Mouse(Medarex/Kirin)。
(美国专利号6,075,181和6,150,584)、HuMAb-Mouse (Medarex、Inc./GenPharm)(美国专利5,545,806和5,569,825)、TransChromo Mouse(Kirin)和KM Mouse(Medarex/Kirin)。
[0362] 抗体随后可以通过例如标准杂交瘤技术或通过噬菌体展示进行制备。这些抗体随后将仅包含全人氨基酸序列。
[0363] 全人抗体还可以使用噬菌体展示由人文库生成。噬菌体展示可以使用本领域技术人员众所周知的方法执行，如在Hoogenboom等人和Marks等人(Hoogenboom HR和Winter G.(1992)J.Mol.Biol.227(2)：381-8；Marks JD等人(1991)J.Mol.Biol.222(3)：581-97；以及也在美国专利5,885,793和5,969,108)中。
[0364] 治疗抗体和用途
[0365] 本发明的特异性结合成员的体内性质，特别是关于肿瘤：血液比和清除，将至少与mAb806相当。在施用于人或动物受试者后，此类特异性结合成员将显示＞1∶1的峰肿瘤血液比。优选地，以此比值，特异性结合成员还将具有大于1∶1、优选地大于2∶1、更优选大于5∶1的肿瘤器官比。优选地，以此比值，特异性结合成员在远离肿瘤部位的器官中还将具有＜1∶1的器官血液比。这些比排除所施用的特异性结合成员的分解代谢和排泄器官。因此，在scFvs和Fabs的情况下(如伴随实施例中所示)，结合成员经由肾分泌，并且此处有比其他器官更多的存在。在完整IgGs的情况下，清除将至少部分经由肝脏。完整抗体的峰定位比将通常在特异性结合成员施用后10-200小时达到。更特别地，可以在无胸腺裸鼠的一侧胁腹中皮下形成的约0.2-1.0g肿瘤异种移植物中测量比值。
[0366] 本发明的抗体可以由可检测或功能标记进行标记。可检测标记包括但不限于放射3 14 32 35 36 51 57 58 59 90 121 124 125 131 111 211
性标记例如同位素 H、C、p、S、Cl、Cr、Co、Co、Fe、Y、I、 I、I、 I、In、 At、
198 67 225 213 99 186
Au、CU、 Ac、Bi、Tc和 Re，其可以使用抗体成像领域已知的常规化学与本发明的抗体附着。标记还包括荧光标记和本领域常规用于MRI-CT成像的标记。它们还包括酶标记例如辣根过氧化物酶。标记进一步包括化学部分例如生物素，其可以经由与特异性同族可检测部分例如标记的抗生物素蛋白结合进行检测。
性标记例如同位素 H、C、p、S、Cl、Cr、Co、Co、Fe、Y、I、 I、I、 I、In、 At、
198 67 225 213 99 186
Au、CU、 Ac、Bi、Tc和 Re，其可以使用抗体成像领域已知的常规化学与本发明的抗体附着。标记还包括荧光标记和本领域常规用于MRI-CT成像的标记。它们还包括酶标记例如辣根过氧化物酶。标记进一步包括化学部分例如生物素，其可以经由与特异性同族可检测部分例如标记的抗生物素蛋白结合进行检测。
[0367] 功能标记包括设计为靶向肿瘤部位的物质，以引起肿瘤组织的破坏。此类功能标记包括细胞毒药物例如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒蛋白，和酶例如细菌羧肽酶或硝基还原酶，其能够将药物前体在肿瘤部位转换成活性药物。
[0368] 此外，包括多克隆和单克隆抗体的抗体，和调节特异性结合成员、抗体和/或其亚单位的产生或活性的药物可以具有特定诊断应用，并且可以例如用于检测和/或测量状况的目的，所述状况例如癌症、癌前病变、和涉及或起因于过度增生细胞生长的状况等。例如，特异性结合成员、抗体或其亚单位可以在多种细胞培养基中用于产生针对自身的多克隆和单克隆抗体，这通过已知技术例如杂交瘤技术，利用例如融合的小鼠脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行。同样地，可以发现或合成模拟或拮抗本发明的特异性结合成员的一种或多种活性的小分子，并且可以将其用于诊断和/或治疗方案中。
[0369] 放射性标记的特异性结合成员特别是抗体及其片段在体外诊断技术和体内放射成像技术和放射免疫治疗中有用。在体内成像的情况下，本发明的特异性结合成员可以与成像剂而不是一种或多种放射性同位素缀合，包括但不限于磁共振成像增强剂，其中例如抗体分子通过螯合基装载有大量顺磁离子。螯合基的例子包括EDTA、卟啉、聚胺冠醚和聚肟(polyoximes)。顺磁离子的例子包括钆、铁、锰、铼、铕、镧(lanthanium)、钬和铒。在本发明的一个进一步方面，放射性标记的特异性结合成员、特别是抗体及其片段、特别是放射免疫缀合物在放射免疫治疗中有用，特别是作为放射性标记的抗体用于癌症治疗。在一个再进一步的方面，放射性标记的特异性结合成员、特别是抗体及其片段在放射免疫导向手术技术中有用，其中在去除此类细胞的手术之前、之中或之后，它们可以鉴定且指示癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增生细胞的存在和/或定位。
[0370] 本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白进一步包括但不限于与化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒剂、化学治疗剂或药物缀合的结合成员，其中本发明的特异性结合成员、特别是抗体及其片段与其他分子或试剂缀合或附着。
[0371] 使用多种抗体免疫缀合物的放射免疫治疗(RAIT)已进入临床并且证实功效。131
1标记的人源化抗癌胚抗原(抗CEA)抗体hMN-14已在结肠直肠癌中评估(Behr TM等
人(2002)Cancer 94(4Suppl)：1373-81)，并且具有90Y标记的相同抗体已在甲状腺髓样癌中评价(Stein R等人(2002)Cancer 94(1)：51-61)。使用单克隆抗体的放射免疫治疗已得到评价，并且对于非何杰金氏淋巴瘤和胰腺癌进行报道(Goldenberg DM(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39(1-2)：195-201；Gold DV 等 人 (2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39(1-2)147-54)。用特定抗体的放射免疫治疗方法也在美国专利号6,306,393和6,331,175中描述。放射免疫导向手术(RIGS)也已进入临床且证实功效和有用性，包括使用抗CEA抗体和针对肿瘤相关抗原的抗体(Kim JC等人(2002)Jut.J.Cancer 97(4)：
542-7；Schneebaum，S.等人(2001)World J.Surg.25(12)：1495-8；Avital，S.等人(2000)Cancer 89(8)：1692-8；McIntosh DG 等 人 (1997)Cancer Biother.Radiopharm.12(4)：
287-94)。
1标记的人源化抗癌胚抗原(抗CEA)抗体hMN-14已在结肠直肠癌中评估(Behr TM等
人(2002)Cancer 94(4Suppl)：1373-81)，并且具有90Y标记的相同抗体已在甲状腺髓样癌中评价(Stein R等人(2002)Cancer 94(1)：51-61)。使用单克隆抗体的放射免疫治疗已得到评价，并且对于非何杰金氏淋巴瘤和胰腺癌进行报道(Goldenberg DM(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39(1-2)：195-201；Gold DV 等 人 (2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39(1-2)147-54)。用特定抗体的放射免疫治疗方法也在美国专利号6,306,393和6,331,175中描述。放射免疫导向手术(RIGS)也已进入临床且证实功效和有用性，包括使用抗CEA抗体和针对肿瘤相关抗原的抗体(Kim JC等人(2002)Jut.J.Cancer 97(4)：
542-7；Schneebaum，S.等人(2001)World J.Surg.25(12)：1495-8；Avital，S.等人(2000)Cancer 89(8)：1692-8；McIntosh DG 等 人 (1997)Cancer Biother.Radiopharm.12(4)：
287-94)。
[0372] 本发明的抗体可以经由任何合适途径施用于需要治疗的患者，通常通过注射到血流或CSF内，或直接进入肿瘤部位内。精确剂量将取决于多种因素，包括抗体是用于诊断还是用于治疗、肿瘤大小和定位、抗体的精确性质(不管完整抗体、片段、双抗体等)、和与抗体附着的可检测或功能标记的性质。当放射性核素(radionuclia)用于治疗时，合适2 2
最大单次剂量是约45mCi/m到最大约250mCi/m 。优选剂量在15-40mCi的范围中，具有
20-30mCi或10-30mCi的进一步优选剂量范围。此类治疗可以要求骨髓或干细胞替换。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的一般抗体剂量将在0.5-40mg的范围中，优选1-4mg以F(ab′)2形式的抗体。裸抗体优选以20-1000mg蛋白质/剂量、或20-500mg蛋白质/剂量、或20-100mg蛋白质/剂量施用。这是用于成人患者的单一治疗的剂量，其可以对于儿童和婴儿按比例调整，并且还对于其他抗体形式与分子量成比例调整。治疗可以在医生的判断下以每天一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复。
最大单次剂量是约45mCi/m到最大约250mCi/m 。优选剂量在15-40mCi的范围中，具有
20-30mCi或10-30mCi的进一步优选剂量范围。此类治疗可以要求骨髓或干细胞替换。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的一般抗体剂量将在0.5-40mg的范围中，优选1-4mg以F(ab′)2形式的抗体。裸抗体优选以20-1000mg蛋白质/剂量、或20-500mg蛋白质/剂量、或20-100mg蛋白质/剂量施用。这是用于成人患者的单一治疗的剂量，其可以对于儿童和婴儿按比例调整，并且还对于其他抗体形式与分子量成比例调整。治疗可以在医生的判断下以每天一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复。
[0373] 这些制剂可以包括第二种结合蛋白，例如同上描述的EGFR结合蛋白。以特别优选的形式，这个第二种结合蛋白是单克隆抗体例如下文讨论的528或225。
[0374] 药物和治疗组合物
[0375] 本发明的特异性结合成员将通常以药物组合物的形式施用，其可以包括除特异性结合成员外的至少一种组分。
[0376] 因此，根据本发明和用于依照本发明使用的药物组合物，除活性成分外还可以包括本领域技术人员众所周知的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他材料。此类材料应是无毒的且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径，其可以是经口的或通过注射例如静脉内。
[0377] 用于经口施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0378] 对于静脉内注射或在痛苦部位的注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无致热原的且具有合适pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员使用例如等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液完全能够制备合适溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0379] 取决于待治疗的状况，组合物可以单独或与其他处理、治疗剂或试剂组合同时或顺次施用。此外，本发明考虑且包括组合物，其包含本文描述的结合成员特别是抗体或其片段，和其他试剂或治疗剂例如抗癌剂或治疗剂、激素、抗EGFR试剂或抗体、或免疫调节剂。更一般地，这些抗癌剂可以是酪氨酸激酶抑制剂或磷酸化级联抑制剂、翻译后调节剂、细胞生长或分裂抑制剂(例如抗有丝分裂剂)或信号转导抑制剂。其他处理或治疗剂可以包括合适剂量的疼痛缓解药物的施用，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片类例如吗啡或止吐药。组合物可以与下述组合(顺次(即之前或之后)或同时)施用：酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于AG1478和ZD1839、STI571、OSI-774、SU-6668)、多柔比星、替莫唑胺、顺铂、卡铂、亚硝基脲、丙卡巴肼、长春新碱、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡莫司汀、罗莫司汀和/或其他化学治疗剂。因此，这些试剂可以是抗EGFR特异性试剂，或酪氨酸激酶抑制剂例如AG1478、ZD1839、STI571、OSI-774或SU-6668，或可以是更一般的抗癌剂和抗瘤试剂，例如多柔比星、顺铂、替莫唑胺、亚硝基脲、丙卡巴肼、长春新碱、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡莫司汀或罗莫司汀。此外，组合物可以与下述施用：激素例如地塞米松、免疫调节剂例如白细胞介素、肿瘤坏死因子(TNF)或其他生长因子或细胞因子，其刺激免疫应答和癌细胞或肿瘤的减少或消除。
[0380] 免疫调节剂例如TNF可以与双特异性抗体形式的本发明的成员组合在一起，所述双特异性抗体识别由本发明抗体识别的EGFR表位以及与TNF受体结合。组合物还可以与其他抗EGFR抗体一起施用，或可以包括连同其他抗EGFR抗体的组合，包括但不限于抗EGFR抗体528、225、SC-03、DR8.3、L8A4、Y10、ICR62和ABX-EGF。
[0381] 先前与抗EGFR抗体结合的试剂例如多柔比星和顺铂的使用已产生增强的抗瘤活性(Fan等人，1993；Baselga等人，1993)。多柔比星和mAb 528的组合导致建立的A431异种移植物的总根除，而用任一试剂单独的处理仅引起暂时的体内生长抑制(Baselga等人，1993)。同样地，顺铂和mAb528或225的组合也导致完全建立的A431异种移植物的根除，这在使用由任一试剂的处理时未观察到(Fan等人，1993)。
[0383] 此外，本发明考虑且包括治疗组合物，用于与常规放射治疗组合使用结合成员。已指出用靶向EGF受体的抗体的处理可以增强常规放射治疗的作用(Milas等人，Clin.Cancer Res.2000 Feb：6(2)：701，Huang等人，Clin.Cancer Res.2000 Jun：6(6)：2166)。
[0384] 如本文证实的，本发明的结合成员特别是抗体或其片段(优选是mAb806、ch806、mAb175、mAb124、mAb1133或hu806或其片段)和抗癌治疗剂(特别是抗EGFR治疗剂，包括其他抗EGFR抗体)的组合证实针对异种移植肿瘤的有效治疗和特别地协同作用。在实施例中，证实与用任一试剂单独的处理比较，例如AG1478和mAb806的组合导致A431异种移植物肿瘤体积显著增强的减少。AG1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)是EGF受体激酶的有效和选择性抑制剂，并且在整体引入本文作为参考的美国专利号5,457,105中特别描述(还参见Liu，W.等人(1999)J.Cell Sci.112：2409；Eguchi，S.等人(1998)J.Biol.Chem.273：8890；Levitsky，A.和Gazit，A.(1995)Science 267：1782)。说明书实施例进一步证实本发明的抗体与其他抗EGFR抗体特别是与528抗EGFR抗体的治疗协同作用。
[0385] 本发明进一步考虑在实践本发明的治疗方法中有用的治疗组合物。主题治疗组合物在混合物中包括药学上可接受的赋形剂(载体)和如本文描述的一种或多种特异性结合成员，其多肽类似物或其片段作为活性成分。在一个优选实施方案中，组合物包括能够调节本发明结合成员/抗体与靶细胞的特异性结合的抗原。
[0386] 包含多肽、类似物或活性片段作为活性成分的治疗组合物的制备是本领域充分了解的。一般地，此类组合物制备为可注射剂，例如作为液体溶液或悬浮液。然而，还可以制备适合于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制剂还可以是乳化的。活性治疗成分通常与药学上可接受且与活性成分相容的赋形剂混合。合适赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等或其组合。此外，需要时，组合物可以包含微量辅助物质例如湿润或乳化剂、pH缓冲剂，它们增强活性成分的有效性。
[0387] 多肽、类似物或活性片段可以配制成作为中和的药学上可接受的盐形式的治疗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由多肽或抗体分子的游离氨基基团形成)和由无机酸如例如盐酸或磷酸，或此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的那种。由游离羧基基团形成的盐还可以衍生自无机碱如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和此类有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
[0388] 含治疗多肽、类似物或活性片段的组合物常规地静脉内施用，例如作为通过单位剂量的注射。当提及本发明的治疗组合物使用时，术语“单位剂量”指作为用于人的单元剂量合适的物理上不连续单位，每个单位包含计算为与所需稀释剂(即载体或媒介物)结合产生所需疗效的预定数量活性材料。
[0389] 组合物以与剂量制剂相容的方式且以治疗有效量施用。待施用的数量取决于待治疗的受试者，受试者的免疫系统利用活性成分的能力，和所需EGFR结合容量的程度。待施用的所需活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且对于每个个体是特有的。然而，合适剂量可以范围为约0.1-20、优选约0.5-约10、且更优选1-数毫克活性成分/千克个体体重/天，并且取决于施用途径。用于起始施用和加强注射的合适方案也是可变的，但典型为起始施用、随后为通过后续注射或其他施用以一个或多个小时间隔的重复剂量。可替代地，考虑了足以维持血液中10纳摩尔-10微摩尔浓度的连续静脉内输注。
[0390] 用于经口施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0391] 对于静脉内注射或在痛苦部位的注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无致热原的且具有合适pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0392] 诊断测定
[0393] 本发明还涉及各种诊断应用，包括用于检测刺激例如异常表达的EGFR存在的方法，其通过参考其由本发明特异性结合成员识别的能力进行。如较早提及的，EGFR可以用于通过多种已知技术产生针对自身的抗体，并且此类抗体随后可以分离且用在怀疑靶细胞中特定EGFR活性的存在的测试中。
[0394] 本发明的特异性结合成员特别是抗体及其片段的诊断应用包括对于本领域技术人员众所周知和标准的且基于本说明书的体外和体内应用。用于EGFR状态、特别就EGFR的异常表达而言的体外评价和评估的诊断测定和试剂盒可以用于诊断、评估和监控患者样品，包括已知具有或怀疑具有癌症、癌前状况、涉及过度增生细胞生长的状况或来自肿瘤样品的那些。EGFR状态的评价和评估在测定患者对于药物的临床试验或对于与不同试剂或结合成员比较施用特定化学治疗剂或本发明的特异性结合成员特别是抗体包括其组合的合适性中也是有用的。这类诊断监控和评价已在乳腺癌中利用针对HER2蛋白质的抗体实践(Hercep Test，Dako Corporation)，其中该测定还用于对于使用赫赛汀的抗体治疗评估患者。体内应用包括肿瘤的成像或评价个体的癌症状态，包括放射性成像。
[0395] 如先前暗示的，本发明的诊断方法包括借助于测定检查细胞样品或培养基，所述测定包括有效量的针对EGFR/蛋白质的拮抗剂，例如抗EGFR抗体，优选亲和纯化的多克隆抗体，和更优选地mAb。此外，对于本文使用的抗EGFR抗体分子，Fab、Fab′、F(ab′)2或F(v)部分或完整抗体分子的形式是优选的。如先前讨论的，能够获益于这种方法的患者包括患有癌症、癌前病变、病毒感染、涉及或起因于过度增生细胞生长的病理状况或其他类似病理学紊乱的那些。用于分离EGFR和诱导抗EGFR抗体以及用于测定且优化抗EGFR抗体帮助检查靶细胞的能力的方法是本领域众所周知的。
[0396] 优选地，在本发明的诊断方法中使用的抗EGFR抗体是亲和纯化的单克隆抗体。更优选地，抗体是单克隆抗体(mAb)。此外，在本文中使用的抗EGFR抗体分子可以是完整抗体分子的Fab、Fab′、F(ab′)2或F(v)部分的形式。
[0397] 如上文详细描述的，针对EGFR的一种或多种抗体可以通过标准方法产生且分离，包括众所周知的杂交瘤技术。为了方便起见，针对EGFR的一种或多种抗体在本文中被称为Ab1，并且在另一个物种中产生的一种或多种抗体被称为Ab2。
[0398] EGFR在细胞中的存在可以通过可应用于此类测定的通常的体外或体内免疫学程序进行确定。许多有用程序是已知的。特别有用的3个此类程序利用由可检测标记标记的EGFR、由可检测标记标记的抗体Ab、或由可检测标记标记的抗体Ab2。程序可以通过下述等式概括，其中星号指示粒子是标记的，并且“R”代表EGFR：
[0399] A.R*+Ab1＝R*Ab1，
[0400] B.R+Ab*＝RAb1*，
[0401] C.R+Ab1+Ab2*＝RAb1Ab2*。
[0402] 程序及其应用是本领域技术人员都熟悉的，并且相应地可以在本发明的范围内利用。“竞争”程序——程序A在美国专利号3,654,090和3,850,752中描述。程序C——“夹心”程序在美国专利号RE 31,006和4,016,043中描述。另外其他程序是已知的，例如“双重抗体”或“DASP”程序。
[0403] 在上述每种情况下，EGFR与一种或多种抗体或结合配偶体构成复合物，并且复合物的一个成员由可检测标记进行标记。复合物已形成的事实和需要时其量可以通过可应用于标记检测的已知方法进行测定。
[0404] 由上文可见，Ab2的特有性质是它将与Ab1反应。这是因为在一个哺乳动物物种中产生的Ab1已在另一个物种中用作抗原，以产生抗体Ab2。例如，Ab2可以使用兔抗体作为抗原在山羊中产生。因此，Ab2将是在山羊中产生的抗兔抗体。为了本说明书和权利要求的目的，Ab1将被称为初次或抗EGFR抗体，并且Ab2将被称为二次或抗Ab1抗体。
[0405] 最通常用于这些研究的标记是放射性元素、酶、在暴露于紫外线时发荧光的化学品及其他。
[0406] 许多荧光材料是已知的且可以用作标记。这些包括例如荧光素、罗丹明、金胺、Texas Red、AMCA蓝和Lucifer Yellow。特定检测材料是在山羊中制备且通过异硫氰酸盐与荧光素缀合的抗兔抗体。
[0407] EGFR或其一种或多种结合配偶体例如本发明特异性结合成员还可以用放射性元素或酶进行标记。放射性标记可以通过目前可用的计数程序中的任何进行检测。优选同位3 14 32 35 36 51 57 58 59 90 121 124 125 131 111 211 198
素可以选自 H、C、P、S、Cl、Cr、Co、Co、Fe、Y、 I、I、 I、I、 In、At、 Au、
67 225 213 99 186
Cu Ac、 Bi、Tc和 Re。
素可以选自 H、C、P、S、Cl、Cr、Co、Co、Fe、Y、 I、I、 I、I、 In、At、 Au、
67 225 213 99 186
Cu Ac、 Bi、Tc和 Re。
[0408] 酶标记同样是有用的，并且可以通过目前利用的比色法、分光光度测量、荧光分光光度计测量、安培计或气体定量技术进行检测。酶通过与桥接分子反应与所选择的颗粒缀合，所述桥接分子例如碳二亚胺、二异硫氰酸盐、戊二醛等。可以在这些程序中使用的许多酶是已知且可以利用的。优选的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和碱性磷酸酶。美国专利号3,654,090；3,850,752；和4,016,043由于其替代标记材料和方法的公开内容作为例子提及。
[0409] 依照本发明可以有利地利用的特定测定系统被称为受体测定。在受体测定中，适当地标记待测定的材料例如特异性结合成员，且随后用一定数量的标记和未标记材料接种特定细胞测试集落，这之后进行结合研究，以测定标记材料与细胞受体结合的程度。以这种方式，可以确定在材料之间的亲和力中的差异。
[0410] 相应地，纯化数量的特异性结合成员可以是放射性标记的，并且例如与抗体或对于其的其他抑制剂组合，这之后将进行结合研究。随后制备包含各种数量的标记和未标记未组合特异性结合成员的溶液，并且随后接种细胞样品且其后温育。随后洗涤所得到的细胞单层，溶解且随后在γ计数器中计数足以获得＜5％标准误的时间长度。随后对这些数据实施Scatchard分析，这之后可以获得关于材料活性的观察和结论。虽然前述是示例性的，但它举例说明在其中所测定材料的细胞结合能力可以充当区分特征的情况下其中可以执行且利用受体测定的方式。
[0411] 依照本发明有用且考虑的测定被称为“顺式/反式”测定。简言之，这种测定采用2种遗传构建体，其中之一通常是当转染到合适细胞系内时连续表达特定目的受体的质粒，并且其中第二种是在受体/配体复合物的控制下表达报道分子例如萤光素酶的质粒。因此，例如，如果希望评估作为关于特定受体的配体的化合物，那么质粒之一将是导致受体在所选择的细胞系中表达的构建体，而第二种质粒将具有与萤光素酶基因连接的启动子，在其中插入对于特定受体的应答元件。如果在测试下的化合物是关于受体的激动剂，那么配体将与受体复合，并且所得到的复合物将结合应答元件且起始萤光素酶基因的转录。随后光度计测量所产生的化学发光，并且获得剂量应答曲线且与已知配体的那些比较。前述方案在美国专利号4,981,784和PCT国际公开号WO 88/03168中详细描述，用于技术人员参考的目的。
[0412] 在本发明的一个进一步实施方案中，可以制备适合于由医学专家使用的商业测试试剂盒，以测定在怀疑靶细胞中EGFR的异常表达的存在或不存在，包括但不限于扩增的EGFR和/或EGFR突变。依照上文讨论的测试技术，一类此类试剂盒将包含至少标记的EGFR或其结合配偶体，例如对于其特异的抗体，和当然取决于所选择的方法的说明书，例如“竞争”、“夹心”、“DASP”等。试剂盒还可以包含次要试剂例如缓冲剂、稳定剂等。
[0413] 相应地，可以制备测试试剂盒用于证实细胞关于EGFR的异常表达或翻译后修饰的存在或能力，其包括：
[0414] (a)预定量的通过本发明特异性结合成员或对于其的特异性结合配偶体与可检测标记直接或间接附着获得的至少一种标记的免疫化学反应组分；
[0415] (b)其他试剂；和
[0416] (c)所述试剂盒的使用说明书。
[0417] 更具体而言，诊断测试试剂盒可以包括：
[0419] (b)需要时，其他试剂；和
[0420] (c)所述测试试剂盒的使用说明书。
[0421] 在进一步变动中，可以制备测试试剂盒且用于上述目的，这根据预定方案操作(例如“竞争”、“夹心”、“双重抗体”等)且包括：
[0422] (a)通过使特异性结合成员与可检测标记偶联已获得的标记组分；
[0423] (b)其中至少一种试剂是配体或固定配体的一种或多种另外免疫化学试剂，所述配体选自：
[0424] (i)能够与标记组分(a)结合的配体；
[0425] (ii)能够与标记组分(a)的结合配偶体结合的配体；
[0426] (iii)能够与待测定的一种或多种组分中的至少一种结合的配体；和
[0427] (iv)能够与待测定的一种或多种组分中的至少一种的结合配偶体中的至少一种结合的配体；和
[0428] (c)用于执行用于检测和/或测定EGFR、特异性结合成员和对于其的特异性结合配偶体之间的免疫化学反应的一种或多种组分的方案的说明书。
[0429] 依照上文，可以制备测定系统用于筛选对于调节EGFR活性、EGFR的异常表达或翻译后修饰、和/或特异性结合成员的活性或结合有效的潜在药物。受体或结合成员可以引入测试系统内，并且有希望的药物也可以引入所得到的细胞培养物内，并且其后检查培养物以观察细胞S期活性中的任何改变，所述改变是由于有希望的药物单独的添加，或由于所加入数量的一种或多种已知试剂的作用。
[0430] 核酸
[0431] 本发明进一步提供了编码本发明的特异性结合成员的分离核酸。核酸包括DNA和RNA。在一个优选方面，本发明提供了编码如上定义的本发明多肽的核酸，包括如作为本发明抗体的VH和VL链的CDR残基所示的多肽。
[0432] 本发明还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包括如上的至少一种多核苷酸。
[0433] 本发明还提供了包括如上的一种或多种构建体的重组宿主细胞。编码如提供的任何特异性结合成员的核酸自身构成本发明的一个方面，如特异性结合成员的生产方法一样，所述方法包括来自因之编码核酸的表达。通过在合适条件下培养包含核酸的重组宿主细胞，可以方便地实现表达。在通过表达产生后，可以使用任何合适技术分离和/或纯化特异性结合成员，随后适当地使用。
[0434] 根据本发明的特异性结合成员和编码核酸分子和载体可以如下提供：例如从其天然环境中分离和/或纯化，以基本上纯或同质的形式，或在核酸的情况下，不含或基本上不含除编码具有所需功能的多肽的序列外的核酸或基因起源。根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分合成的。
[0435] 用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞及许多其他。常见的优选细菌宿主是大肠杆菌。
[0436] 抗体和抗体片段在原核细胞例如大肠杆菌中的表达是本领域充分确定的。关于综述，参见例如Pluckthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。作为用于产生特异性结合成员的选择，在培养中的真核细胞中的表达对于本领域技术人员也是可获得的，关于近期综述，参见例如Raff，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.等人(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。
[0437] 可以选择且构建包含合适调节序列的合适载体，所述合适调节序列包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和适当的其他序列。适当时，载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。关于进一步细节，参见例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第2版，Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于核酸操作例如在核酸构建体的制备、诱变、测序、DNA引入细胞内和基因表达及蛋白质分析中的许多已知技术和方案在Short Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人，编辑，John Wiley&Sons，1992中详细描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公开内容引入本文作为参考。
[0438] 因此，本发明的一个进一步方面提供了包含如本文公开的核酸的宿主细胞。一个再进一步的方面提供了包括将此类核酸引入宿主细胞的方法。引入可以采用任何可获得的技术。对于真核细胞，合适技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘或对于昆虫细胞而言杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
[0439] 引入可以随后为引起或允许来自核酸的表达，例如通过在用于基因表达的条件下培养宿主细胞。
[0440] 在一个实施方案中，将本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)内。依照标准技术，通过包括促进与基因组重组的序列可以促进整合。
[0441] 本发明还提供了包括在表达系统中使用如上所述的构建体的方法，以便表达如上的特异性结合成员或多肽。
[0442] 如上所述，本发明还涉及重组DNA分子或克隆基因或其简并变体，其编码特异性结合成员特别是抗体或其片段，其具有SEQ ID NOS：2和4；129和134；22和27；32和37；和/或42和47中所示的氨基酸序列，优选地，编码结合成员或抗体的核酸分子、特别是重组DNA分子或克隆基因具有核苷酸序列或与编码此类序列之一的DNA序列互补。
[0443] 本发明的另一个特征是本文公开的DNA序列的表达。如本领域众所周知的，DNA序列可以这样进行表达，通过使其与表达控制序列在合适表达载体中可操作地连接，且采用该表达载体以转化合适的单细胞宿主。
[0444] 本发明的DNA序列与表达控制序列的此类可操作连接当然包括在DNA序列上游的正确阅读框中起始密码子ATG的提供，如果其并非已是DNA序列的部分。
[0445] 广泛多样的宿主/表达载体组合可以在表达本发明的DNA序列中采用。有用的表达载体例如可以由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。合适载体包括SV40的衍生物和已知细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col El、pCRl、pBR322、pMB9及其衍生物，质粒例如RP4；噬菌体DNAs例如噬菌体X的众多衍生物例如NM989，及其他噬菌体DNA例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒例如2u质粒或其衍生物；在真核细胞中有用的载体，例如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；衍生自质粒和噬菌体DNAs组合的载体，例如已修饰为采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。
[0446] 广泛多样的表达控制序列——控制与其可操作地连接的DNA序列表达的序列——中的任何可以在这些载体中用于表达本发明的DNA序列。此类有用的表达控制序列包括例如SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区、用于3-磷酸甘油磷酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母交配因子(yeast-mating factor)的启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列、及其各种组合。
[0447] 广泛多样的单细胞宿主细胞在表达本发明的DNA序列中也是有用的。这些宿主可以包括众所周知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属的菌株，真菌例如酵母，和动物细胞例如CHO、YB/20、NSO、SP2/0、R1.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS 1、COS 7、BSC 1、BSC40和BMT10)，昆虫细胞(例如Sf9)，以及在组织培养中的人细胞和植物细胞。
[0448] 应当理解并非所有载体、表达控制序列和宿主会同样良好地起作用，以表达本发明的DNA序列。也并非所有宿主会对于相同表达系统同样良好地起作用。然而，本领域技术人员将能够无需过度实验而选择合适载体、表达控制序列和宿主，以完成所需表达而不背离本发明的范围。例如，在选择载体中，必须考虑宿主，因为载体必须在其中起作用。还将考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和由载体编码的任何其他蛋白质例如抗生素标记的表达。
[0449] 在选择表达控制序列中，通常将考虑多种因素。这些包括例如系统的相对强度、其可控性及其与待表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别是关于潜在二级结构。合适的单细胞宿主将通过考虑下述进行选择：例如其与所选载体的相容性、其分泌特征、其正确折叠蛋白质的能力及其发酵要求、以及由待表达的DNA序列编码的产物对于宿主的毒性、和表达产物的纯化容易性。
[0450] 考虑这些及其他因素，本领域技术人员将能够构建多种载体/表达控制序列/宿主组合，该组合将在发酵或大规模动物培养中表达本发明的DNA序列。
[0451] 进一步意图由在本发明的范围内衍生的蛋白质复合物/亚单位的核苷酸序列，可以制备特异性结合成员类似物。例如通过特异性结合成员材料的胃蛋白酶消化，可以产生类似物例如片段。通过特异性结合成员编码序列的标准定点诱变，可以产生其他类似物例如突变蛋白。通过已知体内和/或体外测定可以鉴定显示“特异性结合成员活性”的类似物，例如小分子，无论是充当启动子还是抑制剂。
[0452] 如上文提及的，可以合成制备而不是克隆编码特异性结合成员的DNA序列。可以设计具有用于特异性结合成员氨基酸序列的合适密码子的DNA序列。一般而言，如果序列将用于表达，那么将选择用于意图宿主的优选密码子。由通过标准方法制备且装配成完整编码序列的重叠寡核苷酸装配全序列。参见例如，Edge，Nature，292：756(1981)；Nambair等人，Science，223：1299(1984)；Jay等人，J.Biol.Chem.，259：6311(1984)。
[0453] 合成DNA序列允许基因的方便构建，所述基因将表达特异性结合成员类似物或“突变蛋白”。可替代地，通过天然特异性结合成员基因或cDNAs的定点诱变，可以制备编码突变蛋白的DNA，并且可以使用常规多肽合成直接制备突变蛋白。
[0454] 用于非天然氨基酸定点掺入蛋白质内的一般方法在Christopher J.Noren，Spencer J.Anthony-Cahill，Michael C.Griffith，Peter G.Schultz，Science，244：182-188(1989年4月)中描述。这种方法可以用于制备具有非天然氨基酸的类似物。
[0455] 本发明延伸至反义寡核苷酸和核酶的制备，它们可以用于在翻译水平干扰EGFR表达。这种方法利用反义核酸和核酶或是通过用反义核酸遮蔽mRNA或是用核酶切割mRNA来阻断特异性mRNA的翻译。
[0456] 反义核酸是与特异性mRNA分子的至少部分互补的DNA或RNA分子(参见Weintraub，1990；Marcus-Sekura，1988.)。在细胞中，它们与该mRNA杂交，形成双链分子。
细胞不翻译这种双链形式的mRNA。因此，反义核酸干扰mRNA表达成蛋白质。约15个核苷酸的寡聚物和与AUG起始密码子杂交的分子将是特别有效的，因为它们易于合成，并且当将其引入生产细胞内时，可能造成比较大分子少的问题。反义方法已用于在体外抑制许多基因的表达(Marcus-Sekura，1988；Hambor等人，1988)。
细胞不翻译这种双链形式的mRNA。因此，反义核酸干扰mRNA表达成蛋白质。约15个核苷酸的寡聚物和与AUG起始密码子杂交的分子将是特别有效的，因为它们易于合成，并且当将其引入生产细胞内时，可能造成比较大分子少的问题。反义方法已用于在体外抑制许多基因的表达(Marcus-Sekura，1988；Hambor等人，1988)。
[0457] 核酶是具有以略微类似于DNA限制性内切核酸酶的方式特异性切割其他单链RNA分子的能力的RNA分子。根据特定mRNAs具有切割其自身内含子的能力的观察发现核酶。通过修饰这些RNAs的核苷酸序列，研究者已能够改造识别RNA分子中的特异性核苷酸序列且切割其的分子(Cech，1988.)。因为它们是序列特异性的，所以仅具有特定序列的mRNAs被灭活。
[0458] 研究者已鉴定2类核酶，四膜虫(Tetrahymena)型和“锤头”型(Hasselhoff和Gerlach，1988)。四膜虫型核酶识别4碱基序列，而“锤头”型识别11-18个碱基序列。识别序列越长，它越可能在靶mRNA种类中专一地发生。因此，锤头型核酶比四膜虫型核酶优选用于灭活特异性mRNA种类，并且18碱基识别序列比更短的识别序列优选。
[0459] 本文描述的DNA序列因此可以用于制备针对EGFRs及其配体的mRNA的反义分子，和切割关于EGFRs及其配体的mRNAs的核酶。
[0460] 通过参考下述非限制性实施例可以更好地理解本发明，所述实施例作为本发明的示例提供。呈现下述实施例，以便更充分地举例说明本发明的优选实施方案，然而，其决不应解释为限制本发明的广泛范围。
[0461] 实施例1
[0462] 抗体的生成和分离
[0463] 细胞系
[0464] 对于免疫接种和特异性分析，使用天然或用正常、野生型或“wtEGFR”基因或携带Δ2-7缺失突变的ΔEGFR基因转染的几个细胞系：鼠成纤维细胞细胞系NR6、NR6ΔEGFR(用ΔEGFR转染)和NR6wtEGFR(用wtEGFR转染)、人成胶质细胞瘤细胞系U87MG(表达低水平的内源wtEGFR)、U87MGwtEGFR(用wtEGFR转染)、U87MGΔEGFR(用ΔEGFR转染)和人鳞状细胞癌细胞系A431(表达高水平的wtEGFR)。
[0465] 对于免疫接种和特异性分析，使用天然或用正常、野生型或“wtEGFR”基因或携带de2-7或Δ2-7缺失突变的ΔEGFR基因转染的几个细胞系：鼠成纤维细胞细胞系NR6、NR6ΔEGFR(用ΔEGFR转染)和NR6wtEGFR(用wtEGFR转染)、人成胶质细胞瘤细胞系U87MG(表达低水平的内源wtEGFR)、U87MGwtEGFR或“U87MG.wtEGFR”(用wtEGFR转染)、U87MGΔEGFR或“U87MG.Δ2-7”(用ΔEGFR转染)和人鳞状细胞癌细胞系A431(表达高水平的wtEGFR)。NR6、NR6ΔEGFR和NR6wtEGFR细胞系先前得到描述(Batra等人(1995)Epidermal Growth Factor Ligand-independent，Unregulated，Cell-Transforming Potential of a Naturally Occurring Human Mutant EGFRvIII Gene.Cell Growth Differ.6(10)：1251-1259)。NR6细胞系缺乏正常内源EGFR。(Batra等人，1995)。U87MG细胞系和转染先前得到描述(Nishikawa等人(1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，
7727-7731)。
7727-7731)。
[0466] 用包含de2-7 EGFR的逆转录病毒感染内源表达低水平的wtEGFR的U87MG星形细胞瘤细胞系(Ponten，J.和Macintyre，E.H.(1968)Long term culture of normal and neoplastic human glia.Acta.Pathol.Microbiol.Scand.74，465-86)，以产生U87MG.Δ2-7细胞系(Nishikawa等人，1994)。经转染的细胞系U87MG.wtEGFR如Nagane等5
人(1996)Cancer Res.56，5079-5086中所述产生。虽然U87MG细胞表达约1x10 EGFR，
6
但U87MG.wtEGFR细胞表达约1x10 EGFR，并且因此模拟由基因扩增可见的情况。还用de2-7 EGFR转染不表达任何已知EGFR相关分子的鼠前B细胞系BaF/3，导致BaF/3.Δ2-7细胞系(Luwor等人(2004)The tumor-specific de2-7 epidermal growth factor receptor(EGFR)promotes cells survival and heterodimerizes with the wild-type EGFR，Oncogene 23：6095-6104)。人鳞状癌A431细胞得自ATCC(Rockville，MD)。表皮样癌细胞系A431先前已得到描述(Sato等人(1987)Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors.Methods Enzymol.146，63-81)。
人(1996)Cancer Res.56，5079-5086中所述产生。虽然U87MG细胞表达约1x10 EGFR，
6
但U87MG.wtEGFR细胞表达约1x10 EGFR，并且因此模拟由基因扩增可见的情况。还用de2-7 EGFR转染不表达任何已知EGFR相关分子的鼠前B细胞系BaF/3，导致BaF/3.Δ2-7细胞系(Luwor等人(2004)The tumor-specific de2-7 epidermal growth factor receptor(EGFR)promotes cells survival and heterodimerizes with the wild-type EGFR，Oncogene 23：6095-6104)。人鳞状癌A431细胞得自ATCC(Rockville，MD)。表皮样癌细胞系A431先前已得到描述(Sato等人(1987)Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors.Methods Enzymol.146，63-81)。
[0467] 所 有 细 胞 系 在 具 有GlutaMAXTM的DMEM/F-12(Life Technologies，Inc.，Melbourne，澳大利亚和Grand Island，NY)中培养，其补充有10％FCS(CSL，Melbourne，澳大利亚)；2mM谷氨酰胺(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、和青霉素/链霉素(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)。此外，U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR细胞系维持在400mg/ml遗传霉素(Life Technologies，Inc.，Melbourne，Victoria，澳大利亚)中。细胞系在37℃在5％CO2的未修饰气氛中生长。
[0468] 试剂
[0469] de2-7 EGFR独特连接肽具有氨基酸序列：LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO：13)。通过标准Fmoc化学合成来自de2-7 EGFR的生物素化的独特连接肽(生物素-LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO：5)和LEEKKGNYVVTDH-生物素(SEQ ID NO：6))，并且通过反相HPLC和质谱分析(Auspep，Melbourne，澳大利亚)测定纯度(＞96％)。
[0470] 在研究中使用的抗体
[0471] 为了比较我们的发现与其他试剂，在我们的研究中包括另外mAbs。这些试剂是针对wtEGFR的mAb528(Sato等人(1983)Mol.Biol.Med.1(5)，511-529)，和针对跨越Δ2-7 EGFR缺失突变的连接序列的合成肽生成的DH8.3。对于de2-7 EGFR特异性的DH8.3抗体(IgG1)先前已得到描述(Hills等人(1995)Specific targeting of a mutant，activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.Int.J.Cancer.63，537-43，1995)，并且在用在de2-7 EGFR中发现的独特连接肽免疫接种小鼠后获得(Hills等人，1995)。
[0472] 识别de2-7和野生型EGFR的528抗体先前已得到描述(Masui等人(1984)Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.Cancer Res.44，1002-7)，并且在Biological Production Facility，Ludwig Institute for Cancer Research(Melbourne，澳大利亚)，使用得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)的杂交瘤(ATCC HB-8509)产生。多克隆抗体SC-03是针对EGFR的羧基末端肽产生的亲和纯化的兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.)。
[0473] 抗体生成
[0474] 将鼠成纤维细胞系NR6ΔEGFR用作免疫原。通过用在佐剂中的5×105-2×106细胞以2-3周间隔皮下免疫接种BALB/c小鼠5次生成小鼠杂交瘤。完全弗氏佐剂用于第一次注TM射。其后，使用不完全弗氏佐剂(Difco ，Voigt Global Distribution，Lawrence，KS)。使来自免疫接种小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合(Shulman等人(1978)Nature
276：269-270)。在血细胞吸附测定中就与细胞系NR6、NR6wtEGFR和NR6ΔEGFR的反应性筛选新近生成的克隆的上清液，并且随后通过血细胞吸附测定用人成胶质细胞瘤细胞系U87MG、U87MGwtEGFR和U87ΔEGFR进行分析。所选择的杂交瘤上清液随后通过蛋白质印迹进行测试，并且通过免疫组织化学进一步分析。纯化显示预期反应性模式的新近生成的mAbs。
276：269-270)。在血细胞吸附测定中就与细胞系NR6、NR6wtEGFR和NR6ΔEGFR的反应性筛选新近生成的克隆的上清液，并且随后通过血细胞吸附测定用人成胶质细胞瘤细胞系U87MG、U87MGwtEGFR和U87ΔEGFR进行分析。所选择的杂交瘤上清液随后通过蛋白质印迹进行测试，并且通过免疫组织化学进一步分析。纯化显示预期反应性模式的新近生成的mAbs。
[0475] 建立了5个杂交瘤，并且基于在玫瑰花结血凝测定中与NR6ΔEGFR的高滴度(1∶2500)以及在NR6和NR6wtEGFR细胞上的低本底，最初选择了3个克隆124(IgG2a)、806(IgG2b)和1133(IgG2a)用于进一步表征。随后进一步表征第四个克隆175(IgG2a)，并且在下文实施例23中对其单独讨论。在后续血凝分析中，这些抗体未显示与天然人成胶质细胞瘤细胞系U87MG和U87MGwtEGFR的反应性(未稀释上清液≤10％)，但与U87MGΔEGFR强烈反应；用A431可见较少反应性。相比之下，在FACS分析中，806与天然U87MG和强烈染色的U87MGΔEGFR不反应，并且与U87MGwtEGFR反应至较少程度，指示806与ΔEGFR和wtEGFR的结合(参见下文)。
[0476] 在蛋白质印迹测定中，随后就与wtEGFR和ΔEGFR的反应性分析mAb124、mAb806和mAb1133。从NR6ΔEGFR、U87MGΔEGFR以及A431中提取去污剂裂解物。所有3种mAbs显示与染色wtEGFR(170kDa)和ΔEGFR蛋白质(140kDa)的细胞裂解物的相似反应性模式。作为参考试剂，使用已知与wtEGFR反应的mAbR.I.(Waterfield等人(1982)J.Cell Biochem.20(2)，149-161)，代替已知在蛋白质印迹分析中不反应的mAb528。mAbR.I.显示与野生型和ΔEGFR的反应性。所有3个新近生成的克隆都显示与ΔEGFR的反应性，并且对于wtEGFR较不强烈。DH8.3在U87MGΔEGFR和NR6ΔEGFR的裂解物中是唯一阳性的。
[0477] 克隆124、806和1133以及mAb528和mAbDH8.3对异种移植物肿瘤U87MG、U87MGΔEGFR和A431的免疫组织化学分析显示于表1中。所有mAbs都显示异种移植物U87MGΔEGFR的强烈染色。仅mAb528显示在天然U87MG异种移植物中的弱反应性。在A431异种移植物中，mAb528显示强同质反应性。mAb124、mAb806和mAb1133揭示与A431的鳞状细胞癌的大多数基底定位细胞的反应性，并且不与上层细胞层或角化组分反应。DH8.3在A431异种移植物中是阴性的。
[0478] 表1
[0479] 抗体528、DH8.3以及124、806和1133的免疫组织化学分析
[0480]
[0481] 由于内源小鼠抗体检测的较少基质染色。
[0482] 测序
[0483] 测序mAb806、mAb124和mAb1133的可变重(VH)和可变轻(VL)链，并且如下鉴定其互补决定区(CDRs)：
[0484] mAb806
[0485] mAb806 VH链：核酸序列(SEQ ID NO：1)和具有信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)分别显示于图14A和14B中(信号肽在图14B中是有下划线的)。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：15、16和17)由图16中的下划线指示。不含其信号肽的mAb806 VH链氨基酸序列(SEQ ID NO：11)显示于图16中。
[0486] mAb806 VL链：核酸序列(SEQ ID NO：3)和具有信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)分别显示于图15A和15B中(信号肽在图15B中是有下划线的)。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：18、19和20)由图17中的下划线指示。不含其信号肽的mAb806 VL链氨基酸序列(SEQ ID NO：12)显示于图17中。
[0487] mAb124
[0488] mAb124 VH链：核酸(SEQ ID NO：21)和氨基酸(SEQ ID NO：22)序列分别显示于图51A和51B中。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：23、24和25)由下划线指示。
[0489] mAb124 VL链：核酸(SEQ ID NO：26)和氨基酸(SEQ ID NO：27)序列分别显示于图51C和51D中。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：28、29和30)由下划线指示。
[0490] mAb1133
[0491] mAb1113 VH链：核酸(SEQ ID NO：31)和氨基酸(SEQ ID NO：32)序列分别显示于图52A和52B中。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：33、34和35)由下划线指示。
[0492] mAb1133 VL链：核酸(SEQ ID NO：36)和氨基酸(SEQ ID NO：37)序列分别显示于图52C和52D中。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：38、39和40)由下划线指示。
[0493] 实施例2
[0494] 通过FACS抗体与细胞系的结合
[0495] 最初选择mAb806用于进一步表征，如本文和下述实施例中所示。还选择mAb124和mAb1133用于进一步表征，如下文实施例26中讨论的，并且发现其具有与本文讨论的mAb806的独特性质对应的性质。
[0496] 为了测定mAb806的特异性，通过流式激活细胞分选(FACS)分析其与U87MG、U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR细胞的结合。简言之，如先前描述的(Nishikawa等人，1994)，用相关抗体(10μg/ml)随后为荧光素缀合的山羊抗小鼠IgG(1∶100稀释度；Calbiochem San Diego，CA，USA；Becton-Dickinson PharMingen，San Diego，CA，US)标记细胞。通过观察最低5,000个事件在Coulter Epics Elite ESP上获得FACS数据，且使用用于Windows的EXPO(版本2)分析。包括无关IgG2b作为用于mAb806的同种型对照，并且包括528抗体，因为它识别de2-7和wtEGFR。
[0497] 仅528抗体能够染色亲本U87MG细胞系(图1)，这与证实这些细胞表达wtEGFR的先前报道一致(Nishikawa等人，1994)。mAb806和DH8.3具有类似于对照抗体的结合水平，这明确证实它们不能结合野生型受体(图1)。同种型对照抗体与U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR细胞的结合类似于对于U87MG细胞观察到的那种。
[0498] mAb806染色U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR细胞，指示mAb806特异性识别de2-7 EGFR和扩增的EGFR(图1)。DH8.3抗体染色U87MG.Δ2-7细胞，证实DH8.3抗体特异性识别de2-7 EGFR(图1)。如预期的，528抗体染色U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR细胞系(图1)。如预期的，528抗体以比亲本细胞更高的强度染色U87MG.Δ2-7，因为它结合在这些细胞中共表达的de2-7和野生型受体(图1)。使用蛋白A混合血吸附反应获得类似结果，这通过用人红细胞(O型)包被的蛋白A的出现检测与靶细胞表面结合的IgG。单克隆抗体
806与U87MG.Δ2-7细胞反应，但未显示与表达野生型EGFR的U87MG的显著反应性(未稀释上清液小于10％)。重要的是，mAb806还结合BaF/3.Δ2-7细胞系，证实wtEGFR的共表达不是mAb806反应性的要求(图1)。
806与U87MG.Δ2-7细胞反应，但未显示与表达野生型EGFR的U87MG的显著反应性(未稀释上清液小于10％)。重要的是，mAb806还结合BaF/3.Δ2-7细胞系，证实wtEGFR的共表达不是mAb806反应性的要求(图1)。
[0499] 实施例3
[0500] 抗体在测定中的结合
[0501] 为了进一步表征mAb806和DH8.3抗体的特异性，通过ELISA检查其结合。2类ELISA用于测定抗体的特异性。在第一种测定中，板用sEGFR(在0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.2中10μg/ml)包被2小时，并且随后用在PBS中的2％人血清白蛋白(HSA)封闭。sEGFR是野生型EGFR的重组细胞外结构域(氨基酸1-621)，并且如先前所述产生(Domagala等人(2000)Stoichiometry，kinetic and binding analysis of the interaction between Epidermal Growth Factor(EGF)and the Extracellular Domain of the EGF receptor.Growth Factors.18，11-29)。抗体在磷酸缓冲盐水(PBS)中的2％HAS中以增加浓度一式三份地加入孔中。使用ABTS(Sigma，Sydney，澳大利亚)作为底物，通过辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠(Silenus，Melbourne，澳大利亚)检测结合抗体，并且在405nm测量吸光度。
[0502] mAb806和528抗体都展示与固定的野生型sEGFR的剂量依赖性和饱和结合曲线(图2A)。因为在de2-7 EGFR中发现的独特连接肽不包含在sEGFR内，所以mAb806必须与定位于野生型EGFR序列内的表位结合。528抗体的结合低于对于mAb806观察到的那种，这可能是因为它识别构象决定簇。如预期的，DH8.3抗体即使在高达10μg/ml的浓度也不结合野生型sEGFR(图2A)。尽管在溶液中的sEGFR以剂量依赖性方式抑制528抗体与固定的sEGFR的结合，但它不能抑制mAb806的结合(图2B)。这暗示mAb806仅可以结合固定在ELISA板上之后的野生型EGFR，所述固定是可能诱导构象改变的过程。使用BIAcore观察到类似结果，由此mAb806结合固定的sEGFR，但固定的mAb806不能结合溶液中的sEGFR(图2C)。
[0503] 通过于95℃加热10分钟变性后，在溶液中的sEGFR能够抑制mAb806与固定sEGFR的结合(图2C)，证实mAb806在特定条件下可以结合野生型EGFR。令人感兴趣的是，变性sEGFR不能抑制528抗体的结合(图2C)，证实这种抗体识别构象表位。DH8.3抗体显示与独特的de2-7 EGFR肽的剂量依赖性和可饱和结合(图2D)。即使在高于用于获得DH8.3的饱和结合的那些的浓度，mAb806和528抗体也都不与肽结合，进一步指示mAb806不识别在该肽内的表位决定簇。
[0504] 在第二种测定中，生物素化的de2-7特异性肽(生物素-LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO：5))与由链霉亲和素预包被的ELISA板(Pierce，Rockford，Illinois)结合。抗体如在第一种测定中结合且检测。即使在高于用于获得DH8.3的饱和结合的那些的浓度，mAb806和528抗体也都不与肽结合，进一步指示mAb806不识别在该肽内的表位决定簇。
[0505] 为了进一步证实mAb806识别不同于连接肽的表位，执行另外实验。在研究中利用C末端生物素化的de2-7肽(LEEKKGNYVVTDH-生物素(SEQ ID NO：6))连同针对de2-7肽生成的mAb806和mAbL8A4(Reist等人(1995)Cancer Res.55(19)，4375-4382；Foulon等人(2000)Cancer Res.60(16)，4453-4460)。
[0506] 在肽研究中使用的试剂
[0507] 连接肽：LEEKKGNYVVTDH-OH(Biosource，Camarillo，CA)；
[0508] 肽C：LEEKKGNYVVTDH(K-Biot)-OH(Biosource，Camarillo，CA)；
[0509] sEGFR：CHO细胞衍生的野生型EGFR的重组可溶性细胞外结构域(氨基酸1-621)(LICR Melbourre)；
[0510] mAb806：小鼠单克隆抗体，IgG2b(LICR NYB)；
[0511] mAbL8A4：小鼠单克隆抗体，IgG1(Duke University)；
[0512] IgG1同种型对照mAb；
[0513] IgG2b同种型对照mAb。
[0515] mAbL8A4即使以低抗体浓度(6.25nM)也显示与肽C的强反应性(图2E)。mAb806直到100nM的抗体浓度(测试的最高浓度)也不显示与肽C的可检测特异性反应性(图2E和2F)。预期mAbL8A4将与肽C反应，因为该肽在mAbL8A4的生成中用作免疫原。连接肽(非生物素化的，50μg/ml)的添加完全阻断mAbL8A4与肽C的反应性，证实抗体对于连接肽表位的特异性。
[0516] 在第二组BIAcore实验中，sEGFR以～4000RU的表面密度固定在CM微传感器芯片上。mAbs的连续稀释物就与sEGFR的反应性进行测试。
[0517] mAb806与变性sEGFR强烈反应，而mAbL8A4不与变性sEGFR反应。mAb806与变性sEGFR的反应性随着抗体浓度降低而降低。预期mAbL8A4不与sEGFR反应，因为mAbL8A4使用连接肽作为免疫原生成，并且sEGFR不包含连接肽。
[0518] 还执行斑点印迹免疫染色实验。将肽的连续稀释物以0.5μl点在PVDF或硝酸纤维素膜上。膜用在PBS中的2％BSA封闭，并且随后用806、L8A4、DH8.3和对照抗体探测。抗体L8A4和DH8.3与在膜上的肽结合(数据未显示)。mAb806在其中L8A4明确显示结合的浓度下不结合肽(数据未显示)。对照抗体对于肽结合也是阴性的。
[0519] mAb806在免疫印迹后与细胞裂解物中的wtEGFR结合(结果未显示)。这不同于用DH8.3抗体获得的结果，所述DH8.3抗体与de2-7 EGFR而不是wtEGFR反应。因此，mAb806可以识别变性后的wtEGFR而不是受体在细胞表面上处于其天然状态时。
[0520] 实施例4
[0521] Scatchard分析
[0522] 在免疫反应性校正后执行使用U87MG.Δ2-7细胞的Scatchard分析，以便测125
定每种抗体的相对亲和力。通过氯胺T法用 I(Amrad，Melbourne，澳大利亚)标记抗体，并且通过Lindmo测定来测定免疫反应性(Lindmo等人(1984)Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.J.Immunol.Methods.72，
77-89)。
定每种抗体的相对亲和力。通过氯胺T法用 I(Amrad，Melbourne，澳大利亚)标记抗体，并且通过Lindmo测定来测定免疫反应性(Lindmo等人(1984)Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.J.Immunol.Methods.72，
77-89)。
[0523] 所有结合测定在4℃伴随轻轻旋转在1％HSA/PBS中对1-2×106活U87MG.Δ2-7或A431细胞执行90分钟。在增加浓度的合适未标记抗体的存在下，使用设定浓度10ng/125 125
ml I的标记的抗体。在10,000倍过量的未标记抗体的存在下，测定非特异性结合。 I放射性标记的mAb806和DH8.3抗体都不与亲本U87MG细胞结合。在温育完成后，洗涤细胞且使用COBRA IIγ计数器(Packard Instrument Company，Meriden，CT，USA)计数结合的
125
I标记的抗体。
ml I的标记的抗体。在10,000倍过量的未标记抗体的存在下，测定非特异性结合。 I放射性标记的mAb806和DH8.3抗体都不与亲本U87MG细胞结合。在温育完成后，洗涤细胞且使用COBRA IIγ计数器(Packard Instrument Company，Meriden，CT，USA)计数结合的
125
I标记的抗体。
[0524] 在碘化时mAb806和DH8.3抗体都保留高免疫反应性，并且对于mAb806一般高于9 -1
90％并且对于DH8.3抗体是45-50％。mAb806对于de2-7 EGFR受体具有1.1×10M 的
8 -1
亲和力，而DH8.3的亲和力略微低10倍，为1.0×10M 。无一碘化抗体与U87MG亲本细
5 5
胞结合。mAb806识别平均2.4×10结合位点/细胞，而DH8.3抗体结合平均5.2×10 位
5
点。因此，在抗体之间在受体数目中不仅存在良好一致，还与显示2.5×10de2-7受体/细胞的先前报道一致，如通过不同de2-7 EGFR特异性抗体对相同细胞系测量的(Reist等人(1997)Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenografts after labeling using N-succinimidyl
5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.57，1510-5)。
90％并且对于DH8.3抗体是45-50％。mAb806对于de2-7 EGFR受体具有1.1×10M 的
8 -1
亲和力，而DH8.3的亲和力略微低10倍，为1.0×10M 。无一碘化抗体与U87MG亲本细
5 5
胞结合。mAb806识别平均2.4×10结合位点/细胞，而DH8.3抗体结合平均5.2×10 位
5
点。因此，在抗体之间在受体数目中不仅存在良好一致，还与显示2.5×10de2-7受体/细胞的先前报道一致，如通过不同de2-7 EGFR特异性抗体对相同细胞系测量的(Reist等人(1997)Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenografts after labeling using N-succinimidyl
5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.57，1510-5)。
[0525] 实施例5
[0526] 抗体通过U87MG.Δ2-7细胞的内化
[0527] 在与靶细胞结合后的抗体内化率影响其肿瘤靶向性质和治疗选项。因此，本发明人通过FACS检查了在与U87MG.Δ2-7细胞结合后mAb806和DH8.3抗体的内化。U87MG.Δ2-7细胞与mAb806或DH8.3抗体(10μg/ml)在DMEM中在4℃温育1小时。在洗涤后，将细胞转移至预加温至37℃的DMEM，并且在37℃温育后的各个时间点获得等分试样。通过在冰冷的洗涤缓冲液(1％HSA/PBS)中立即洗涤等分试样来终止内化。在时程完成时，细胞如上所述通过FACS进行染色。使用下式通过比较在各个时间点与零时间的表面抗体染色计算内化百分率：内化的抗体百分比＝(在时间x的平均荧光-本底荧光)/(在时间 0的平均荧光-本底荧光)×100。这种方法在使用碘化抗体(mAb806)的一个测定中加以验证，以如先前描述的测量内化(Huang等人(1997)The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor conmon in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.J.Biol.Chem.272，2927-35)。使用斯氏t检验比较在不同时间点在内化率中的差异。在整个研究中，除通过Wilcoxon分析进行分析的体内存活测定外，通过斯氏t检验分析数据的显著性。
[0528] 2种抗体显示相对快速的内化，对于mAb806在10分钟时和对于DH8.3在30分钟时达到稳态水平(图3)。DH8.3的内化在率(在10分钟时80.5％DH8.3内化，与对于mAb806的36.8％比较，p＜0.01)和在60分钟时内化的总量(93.5％与30.4％比较，p＜0.001)方面明显更高。在执行的所有4种测定中，与20分钟比较，mAb806在30和60分钟时显示略微更低水平的内化(图3)。这个结果还使用基于碘化mAb806的内化测定加以证实(数据未显示)。
[0529] 实施例6
[0530] 抗体内化的电子显微镜术分析
[0531] 考虑到上文指出的在抗体之间在内化率中的差异，使用电子显微镜术执行抗体细胞内运输的详细分析。
[0532] U87MG.Δ2-7细胞在明胶包被的腔室载玻片(Nunc，Naperville，IL)上生长至80％汇合，并且随后用冰冷的DMEM洗涤。细胞随后与mAb806或DH8.3抗体在DMEM中在
4℃温育45分钟。在洗涤后，细胞与金缀合的(20nm粒子)抗小鼠IgG(BBlnternational，Cardiff，UK)在4℃进一步温育30分钟。在进一步洗涤后，将预加温的DMEM/10％PCS加入细胞中，其在37℃温育从1到60分钟的不同时间。抗体的内化通过冰冷的培养基得到终止，并且细胞用在PBS/0.1％HSA中的2.5％戊二醛固定，并且随后在2.5％四氧化锇中后固定。在通过梯度系列的丙酮脱水后，样品在Epon/Araldite树脂中包埋，用Reichert Ultracut-超薄切片机(Leica)切割为超薄切片，并且在镍格栅上收集。在80kV在Philips CM12透射电子显微镜上观察前，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色切片。使用卡方检验执行在有被小窝内包含的金粒的统计分析。
4℃温育45分钟。在洗涤后，细胞与金缀合的(20nm粒子)抗小鼠IgG(BBlnternational，Cardiff，UK)在4℃进一步温育30分钟。在进一步洗涤后，将预加温的DMEM/10％PCS加入细胞中，其在37℃温育从1到60分钟的不同时间。抗体的内化通过冰冷的培养基得到终止，并且细胞用在PBS/0.1％HSA中的2.5％戊二醛固定，并且随后在2.5％四氧化锇中后固定。在通过梯度系列的丙酮脱水后，样品在Epon/Araldite树脂中包埋，用Reichert Ultracut-超薄切片机(Leica)切割为超薄切片，并且在镍格栅上收集。在80kV在Philips CM12透射电子显微镜上观察前，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色切片。使用卡方检验执行在有被小窝内包含的金粒的统计分析。
[0533] 虽然DH8.3抗体占优势地经由有被小窝内化，但mAb806看起来通过大胞饮内化(图19)。事实上，在与mAb806温育的细胞中形成的32个有被小窝的详细分析揭示其中无一包含抗体。相比之下，来自与DH8.3温育细胞的所有有被小窝的约20％对于抗体是阳性的，其中许多包含多个金粒。在有被小窝内包含的金粒总数目的统计分析发现差异是高度显著的(p＜0.01)。在20-30分钟后，2种抗体在形态学上类似溶酶体的结构中可见(图19C)。在这些结构内细胞碎片的存在也与其溶酶体性质一致。
[0534] 实施例7
[0535] 抗体在荷瘤裸鼠中的生物分布
[0536] 在一侧上包含U87MG异种移植物和另一侧上包含U87MG.Δ2-7异种移植物的裸鼠中比较mAb806和DH8.3抗体的生物分布。对于这个研究选择相对短的时间段，因为先前报道证实DH8.3抗体显示在4-24小时之间的肿瘤靶向的峰水平(Hills等人(1995)Specific targeting of a mutant，activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.Int.J.Cancer.63，537-43)。
[0537] 通过3×106U87MG、U87MG.Δ2-7或A431细胞的皮下注射在裸BALB/c小鼠中建立肿瘤异种移植物。在U87MG.Δ2-7异种移植物中的de2-7 EGFR表达在生物分布期间自始至终保持稳定，如通过在各个时间点的免疫组织化学测量的(数据未显示)。如通过免疫组织化学测定的，当作为肿瘤异种移植物生长时，A431细胞保留其mAb806反应性。在另一侧上注射U87MG.Δ2-7细胞前7-10天，在一侧上注射U87MG或A431细胞，因为对于de2-7 EGFR表达异种移植物观察到更快的生长速率。抗体如上所述进行放射性标记且就免疫反应性进行评价，并且当肿瘤重量是100-200mg时，通过眶后途径注射到小鼠内。每只小鼠接受2种125 131
不同抗体(2μg/抗体)：2μCi I标记的mAb806和2μCi I标记的DH8.3或528。除非说明，否则在注射后的各个时间点处死5只小鼠的组，并且通过心脏穿刺获得血液。通过解剖
125 131
获得肿瘤、肝脏、脾、肾和肺。对所有组织进行称重，并且使用双通道计数窗就 I和 I活性进行测定。对于每种抗体，数据表示为通过与注射的剂量标准比较测定的％ID/g肿瘤，或转换成肿瘤血液/肝脏比(即％ID/g肿瘤除以％ID/g血液或肝脏)。通过斯氏t检验分析在组之间的差异。在放射性标记的mAb806注射后，将某些肿瘤在福尔马林中固定，在石蜡中包埋，切割成5，μm切片，并且随后暴露于X射线胶片(AGFA，Mortsel，比利时)，以通过放射自显影术测定抗体定位。
不同抗体(2μg/抗体)：2μCi I标记的mAb806和2μCi I标记的DH8.3或528。除非说明，否则在注射后的各个时间点处死5只小鼠的组，并且通过心脏穿刺获得血液。通过解剖
125 131
获得肿瘤、肝脏、脾、肾和肺。对所有组织进行称重，并且使用双通道计数窗就 I和 I活性进行测定。对于每种抗体，数据表示为通过与注射的剂量标准比较测定的％ID/g肿瘤，或转换成肿瘤血液/肝脏比(即％ID/g肿瘤除以％ID/g血液或肝脏)。通过斯氏t检验分析在组之间的差异。在放射性标记的mAb806注射后，将某些肿瘤在福尔马林中固定，在石蜡中包埋，切割成5，μm切片，并且随后暴露于X射线胶片(AGFA，Mortsel，比利时)，以通过放射自显影术测定抗体定位。
[0538] 根据％ID/g肿瘤，mAb806在U87MG.Δ2-7异种移植物中在8小时达到其18.6％m/g肿瘤的峰水平(图4A)，这明显高于除血液外的任何其他组织。虽然DH8.3在8小时也显示峰肿瘤水平，但与mAb806比较，水平在统计上(p＜0.001)较低，8.8％m/g肿瘤(图125
4B)。2种抗体的水平在24小时和48小时缓慢下降。在用单独的 I标记的mAb806注射后8小时收集的U87MG.Δ2-7异种移植物组织切片的放射自显影明确举例说明了抗体对于活肿瘤的定位(图20)。无一抗体显示U87MG亲本异种移植物的特异性靶向(图4A和4B)。
就肿瘤与血液/肝脏比而言，mAb806显示在24小时对于血液(1.3的比)和肝脏(6.1的比)的最高比(图5A和5B)。DH8.3抗体在8小时在血液中(0.38的比)和在24小时在
肝脏中(1.5的比)具有其最高比(图5A和5B)，这两者都明显低于对于mAb806获得的值。
4B)。2种抗体的水平在24小时和48小时缓慢下降。在用单独的 I标记的mAb806注射后8小时收集的U87MG.Δ2-7异种移植物组织切片的放射自显影明确举例说明了抗体对于活肿瘤的定位(图20)。无一抗体显示U87MG亲本异种移植物的特异性靶向(图4A和4B)。
就肿瘤与血液/肝脏比而言，mAb806显示在24小时对于血液(1.3的比)和肝脏(6.1的比)的最高比(图5A和5B)。DH8.3抗体在8小时在血液中(0.38的比)和在24小时在
肝脏中(1.5的比)具有其最高比(图5A和5B)，这两者都明显低于对于mAb806获得的值。
[0539] 如上所述，在肿瘤中的mAb806水平在8小时达到峰值。虽然这个峰与许多肿瘤靶向抗体比较相对较早，但它与使用de2-7 EGFR特异性抗体的其他研究完全一致，当使用相似剂量的抗体时，所述de2-7 EGFR特异性抗体都显示在注射后4-24小时的峰(Hills等人，1995；Reist等人，1997；Reist等人 (1996)Radioiodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.56，4970-7)。事实上，与较早报道不同，8小时时间点包括在抗体靶向将快速达到峰值的假设上。用mAb806可见的％ID/g肿瘤类似于当使用标准碘化技术时对于其他de2-7 EGFR特异性抗体的报道的那种(Hills等人，1995；Huang等人，1997；Reist等人(1995)Tumor-specific抗epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies：use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenografts.Cancer Res.55，4375-82)。
[0540] 关于早期峰的原因可能是双重的。首先，表达de2-7 EGFR的肿瘤、包括经转染的U87MG细胞非常快速地生长为肿瘤异种移植物。因此，即使在这些生物分布研究中使用的相对短时间段过程中，肿瘤大小也增加至这样的程度(在4天内在团块中的5-10倍增加)，从而使得％ID/g肿瘤与缓慢生长的肿瘤比较是减少的。其次，虽然mAb806的内化与DH8.3比较相对缓慢，但它对于许多其他肿瘤抗体/抗原系统仍是快速的。内化抗体经历快速蛋白水解，其中降解产物从细胞中排出(Press等人(1990)Inhibition of catabolism of radiolabeled antibodies by tumor cells using lysosomotropic amines and carboxylic ionophores.Cancer Res.50，1243-50)。这个内化、降解和排出过程减少在细胞内保留的碘化抗体的量。因此，内化抗体展示比其非内化配对物更低水平的靶向。本文报道的电子显微镜术数据证实内化的mAb806快速转运至溶酶体，推测在其中发生快速降解。这个观察与碘从细胞中的迅速排出一致。
[0541] 先前描述的针对de2-7 EGFR中发现的独特连接肽的L8A4单克隆抗体以与mAb806相似的方式表现(Reist等人(1997)In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody：comparison with its murine parent.Nucl.Med.Biol.24，639-47)。使用由de2-7 EGFR转染的U87MG细胞，这种抗体具有相似的内化率(在1小时35％，与对于mAb806在1小时的30％比较)，且当使用由de2-7 EGFR转染的3T3成纤维细胞时展示相似的体内靶向(在24小时24％ID/g肿瘤的峰，与对于mAb806在8小时18％ID/g肿瘤比较)(Reist等人(1997)Improved targeting of an抗epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenografts after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.57，1510-5)。
[0542] 令人感兴趣的是，当用N-琥珀酰亚胺基5-碘-3吡啶羧酸盐标记时，这种抗体在肿瘤异种移植物中的体内保留得到增强(Reist等人，1997)。这种标记的
辅基在溶酶体pH是带正电的，并且因此具有增强的细胞保留(Reist等人(1996)
Radiciodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl
5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.56，4970-7)。当考虑抗体用于放射免疫治疗时，增强的保留是潜在有用的，并且这种方法可以用于改善碘化mAb806或其片段的保留。
辅基在溶酶体pH是带正电的，并且因此具有增强的细胞保留(Reist等人(1996)
Radiciodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl
5-iodo-3-pyridinecarboxylate.Cancer Res.56，4970-7)。当考虑抗体用于放射免疫治疗时，增强的保留是潜在有用的，并且这种方法可以用于改善碘化mAb806或其片段的保留。
[0543] 实施例8
[0544] mAb806与包含扩增的EGFR的细胞的结合
[0545] 为了检查mAb806是否能够识别在包含扩增的受体基因的细胞中表达的EGFR，分析其与A431细胞的结合。如先前描述的，A431细胞是人鳞状癌细胞，并且表达高水平的wtEGFR。通过FACS分析观察到mAb806与A431细胞的低但可高度再现的结合(图6)。DH8.3抗体不结合A431细胞，指示mAb806的结合不是低水平de2-7 EGFR表达的结果(图
6)。如预期的，抗EGFR 528抗体显示A431细胞的强染色(图6)。考虑到这个结果，通过Scatchard分析表征mAb806与A431的结合。虽然碘化mAb806的结合是相当低的，但有可
5
能获得一致数据用于Scatchard。3个此类实验的平均值对于2.4×10受体/细胞给出
7 -1
9.5×10M 的亲和力值。因此，对于该受体的亲和力比对于de2-7 EGFR的亲和力略微低10倍。此外，mAb806看起来仅识别在A431细胞的表面上发现的小部分EGFR。528抗体测量
6
约2×10受体/细胞，这与众多其他研究一致(Santon等人(1986)Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice.Cancer Res.46，4701-5)。
6)。如预期的，抗EGFR 528抗体显示A431细胞的强染色(图6)。考虑到这个结果，通过Scatchard分析表征mAb806与A431的结合。虽然碘化mAb806的结合是相当低的，但有可
5
能获得一致数据用于Scatchard。3个此类实验的平均值对于2.4×10受体/细胞给出
7 -1
9.5×10M 的亲和力值。因此，对于该受体的亲和力比对于de2-7 EGFR的亲和力略微低10倍。此外，mAb806看起来仅识别在A431细胞的表面上发现的小部分EGFR。528抗体测量
6
约2×10受体/细胞，这与众多其他研究一致(Santon等人(1986)Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice.Cancer Res.46，4701-5)。
[0546] 为了确保这些结果不只局限于A431细胞系，在显示EGFR基因扩增的2种其他细胞系中检查mAb806反应性。已报道HN5头与颈细胞系(Kwok TT和Sutherland RM(1991)Differences in EGF related radiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and low numbers of EGF receptors.Br.J.Cancer.64，251-4)和MDA-468乳腺癌细胞系(Filmus等人(1985)MDA-468，a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor(EGF)receptors，has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF.Biochem.Biophys.Res.Commun.128，898-905)包含EGFR基因的多个拷贝。与这些报道一致，528抗体展示2种细胞系的强染色(图21)。如同A431细胞系一样，mAb806明确染色2种细胞系，但是以低于用528抗体观察到的那种的水平(图21)。因此，mAb806结合不只局限于A431细胞，而看起来是对于包含EGFR基因扩增的细胞的一般观察。
[0547] 野生型sEGFR通过mAb806的识别明确要求受体的某些变性，以便暴露表位。所需变性程度仅是轻微的，因为即使野生型sEGFR在塑料表面上的吸附也在ELISA测定中诱导mAb806的强结合。因为mAb806仅结合在A431细胞表面上的约10％EGFR，所以促使推测这个受体亚型可能具有类似于由de2-7 EGFR截短诱导的那种的改变构象。事实上，由A431细胞中的基因扩增介导的EGFR的极高表达可引起某些受体被不正确加工，导致改变构象。令人感兴趣的是，在SDS-PAGE和蛋白质转移后，A431细胞裂解物用mAb806的半定量免疫印迹显示它可以识别大多数A431EGF受体。这个结果进一步支持mAb806与A431细胞的表面上具有改变构象的受体亚型结合的观点。A431细胞中的这些观察与证实mAb806结合包含EGFR基因扩增的神经胶质瘤的免疫组织化学数据一致。因为mAb806结合在亲本U87MG细胞上是完全阴性的，所以看起来这种现象可能局限于包含扩增的EGFR的细胞，尽管在U87MG细胞的表面上的“变性”受体水平可能低于检测水平。然而，这似乎是不可能的，因为碘化
7
mAb806不与包含高达1×10细胞的U87MG细胞团块结合。
7
mAb806不与包含高达1×10细胞的U87MG细胞团块结合。
[0548] 实施例9
[0549] A431细胞通过mAb806的体内靶向
[0550] 用mAb806执行第二种生物分布研究，以测定它是否可以靶向A431肿瘤异种移植物。研究在较长时程中执行，以便获得关于通过mAb806的U87MG.Δ2-7异种移植物靶向的更多信息，这包括在所有小鼠中作为阳性对照。此外，包括抗EGFR 528抗体作为用于A431异种移植物的阳性对照，因为先前研究证实这种抗体对于在裸鼠中生长的A431细胞低但显著的靶向(Masui等人(1984)Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by抗epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.Cancer Res.44，1002-7)。
[0551] 在前48小时过程中，mAb806展示与在起始实验中观察到的那些几乎等同的靶向性质(图7A与图4A比较)。根据％ID/g肿瘤，在U87MG.Δ2-7异种移植物中的mAb806水平在24小时后缓慢下降，但总是保持高于在正常组织中检测到的水平。在A431异种移植物中的摄取是相当低的，然而，在前24小时过程中存在％ID/g肿瘤中的小增加，这在正常组织例如肝脏、脾、肾和肺中未观察到(图7A)。当表示为％ID/g肿瘤时(图7B)，528抗体125
的摄取在2种异种移植物中极低，其部分是由于这种抗体从血液中的更快速清除。在用 I标记的mAb806单独注射后24小时收集的A431异种移植物组织切片的放射自显影术明确举例说明了抗体对于肿瘤外周附近的活肿瘤而不是坏死中心区域的定位(图23)。就肿瘤血液比而言，mAb806对于U87MG.Δ2-7异种移植物在72小时达到峰值，并且对于A431异种移植物在100小时达到峰值(图8A，B)。虽然就A431肿瘤而言对于mAb806的肿瘤血液比从未超过1.0，但它在整个时间过程自始至终的确增加(图8B)，并且高于检查的所有其他组织(数据未显示)，指示低水平的靶向。
的摄取在2种异种移植物中极低，其部分是由于这种抗体从血液中的更快速清除。在用 I标记的mAb806单独注射后24小时收集的A431异种移植物组织切片的放射自显影术明确举例说明了抗体对于肿瘤外周附近的活肿瘤而不是坏死中心区域的定位(图23)。就肿瘤血液比而言，mAb806对于U87MG.Δ2-7异种移植物在72小时达到峰值，并且对于A431异种移植物在100小时达到峰值(图8A，B)。虽然就A431肿瘤而言对于mAb806的肿瘤血液比从未超过1.0，但它在整个时间过程自始至终的确增加(图8B)，并且高于检查的所有其他组织(数据未显示)，指示低水平的靶向。
[0552] 对于528抗体的肿瘤血液比显示与mAb806相似的概况，尽管在A431异种移植物中注意到更高水平(图8A，B)。mAb806在U87MG.Δ2-7异种移植物中在72小时具有7.6的峰肿瘤肝脏比，明确证实与正常组织比较在这些肿瘤中的优先摄取(图8C)。对于mAb806的其他肿瘤器官比类似于在肝脏中观察到的那些(数据未显示)。在A431异种移植物中对于mAb806的峰肿瘤肝脏比在100小时是2.0，再次指出与正常组织比较在肿瘤中的轻微优先摄取(图8D)。
[0553] 实施例10
[0554] 治疗研究
[0555] 在疾病预防模型和建立的肿瘤模型的2种异种移植物模型中评价mAb806的作用。
[0556] 异种移植物模型
[0557] 与先 前 报 道 一致 (Nishikawa等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91(16)，7727-7731)，用de2-7 EGFR转染的U87MG细胞比亲本细胞和用wtEGFR转染的U87MG细胞更快速地生长。因此，在同一小鼠中生长2种细胞类型是不可能的。
[0558] 将在100ml PBS中的肿瘤细胞(3×106)皮下接种到4-6周龄雌性裸鼠(Animal Research Centre，Western Australia，澳大利亚)的双侧胁腹内。在预防和建立的肿瘤模型中研究mAb806的治疗功效。在预防模型中，从肿瘤细胞接种前1天开始，具有2个异种移植物的5只小鼠各自用1或0.1mg的mAb806或媒介物(PBS)进行腹膜内处理。处理3
继续共6个剂量，3次/周，共2周。在建立的模型中，在肿瘤已达到65±6.42mm(U87MG.
3 3
Δ2-7)、84±9.07mm3(U87MG)、73±7.5mm(U87MG.wtEGFR)或201±19.09mm(A431肿瘤)
2 3
的平均体积时开始处理。使用公式(长度×宽度 )/2测定以mm表示的肿瘤体积，其中长度是最长轴，并且宽度是与长度成直角的测量(Clark等人(2000)Therapeutic efficacy of anti-Lewis(y)humanized 3S 193 radioimmunotherapy in a breast cancer model：
enhanced activity when combined with Taxol chemotherapy.Clin.Cancer Res.6，
3621-3628)。对于每个处理组，数据表示为平均肿瘤体积±S.E.。使用斯氏t检验在给定
3
时间点执行统计分析。当异种移植物达到1.5cm的近似体积时，对动物实施安乐死，并且切除肿瘤用于组织学检查。这个研究计划得到Animal Ethics Committee of the Austin and Repatriation Medical Centre批准。
继续共6个剂量，3次/周，共2周。在建立的模型中，在肿瘤已达到65±6.42mm(U87MG.
3 3
Δ2-7)、84±9.07mm3(U87MG)、73±7.5mm(U87MG.wtEGFR)或201±19.09mm(A431肿瘤)
2 3
的平均体积时开始处理。使用公式(长度×宽度 )/2测定以mm表示的肿瘤体积，其中长度是最长轴，并且宽度是与长度成直角的测量(Clark等人(2000)Therapeutic efficacy of anti-Lewis(y)humanized 3S 193 radioimmunotherapy in a breast cancer model：
enhanced activity when combined with Taxol chemotherapy.Clin.Cancer Res.6，
3621-3628)。对于每个处理组，数据表示为平均肿瘤体积±S.E.。使用斯氏t检验在给定
3
时间点执行统计分析。当异种移植物达到1.5cm的近似体积时，对动物实施安乐死，并且切除肿瘤用于组织学检查。这个研究计划得到Animal Ethics Committee of the Austin and Repatriation Medical Centre批准。
[0559] 肿瘤异种移植物的组织学检查
[0560] 对异种移植物进行切除且平分。一半在石蜡中包埋前在10％福尔马林/PBS中固定。随后切割4微米切片，且用苏木精和伊红(H&E)染色用于常规组织学检查。另一半在Tissue OCT化合物(Sakura Finetek，Torrance，CA)中包埋，在液氮中冷冻并且贮存于-80℃。切割薄(5微米)冷冻切片，并且在冰冷的丙酮中固定10分钟，随后进一步风干10分钟。切片在蛋白质封闭试剂(Lipshaw Immunon，Pittsburgh U.S.A.)中封闭10分钟，并且随后与生物素化的初次抗体(1mg/ml)在室温(RT)温育30分钟。根据制造商的说明书，所有抗体使用ECL蛋白质生物素化模块(Amersham，Baulkham Hills，澳大利亚)进行生物素化。在用PBS清洗后，切片与链霉亲和素辣根过氧化物酶复合物进一步温育30分钟(Silenus，Melbourne，澳大利亚)。在最后PBS洗涤后，将在过氧化氢的存在下使切片暴露于3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物(0.1M乙酸、0.1M乙酸钠、0.02M AEC(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO))30分钟。切片用水清洗，并且用苏木精复染5分钟且固定。
[0561] mAb806在预防模型中的功效
[0562] 在预防性异种移植物模型中检查mAb806针对U87MG和U87MG.Δ2-7肿瘤的功效。在肿瘤接种前一天腹膜内施用抗体或媒介物，并且每周给予3次，进行2周。以1mg/注射的剂量，mAb806对表达wtEGFR的亲本U87MG异种移植物的生长没有作用(图9A)。相比之下，mAb806以剂量依赖性方式显著抑制U87MG.Δ2-7异种移植物的生长(图9B)。
在第20天时，当对照动物被处死时，平均肿瘤体积对于对照组是1637±178.98mm3，对于0.1mg/注射组是统计上更小的526±94.74mm3(p＜0.0001)，并且对于1mg注射组是
197±42.06mm3(p＜0.0001)。处理组在第24天时被处死，在这时平均肿瘤体积对于0.1mg处理组是1287±243.03mm3，并且对于1mg组是492±100.8mm3。
在第20天时，当对照动物被处死时，平均肿瘤体积对于对照组是1637±178.98mm3，对于0.1mg/注射组是统计上更小的526±94.74mm3(p＜0.0001)，并且对于1mg注射组是
197±42.06mm3(p＜0.0001)。处理组在第24天时被处死，在这时平均肿瘤体积对于0.1mg处理组是1287±243.03mm3，并且对于1mg组是492±100.8mm3。
[0563] mAb806在建立的异种移植物模型中的功效
[0564] 考虑到mAb806在预防性异种移植物模型中的功效，随后检查其抑制建立的肿瘤异种移植物的生长的能力。抗体处理如预防模型中所描述的，除了它在肿瘤对于U87MG.Δ2-7异种移植物已达到65±6.42mm3的平均肿瘤体积并且对于亲本U87MG异种移植物已达到84±9.07mm3的平均肿瘤体积时起始外。再一次，在1mg/注射的剂量下，mAb806对亲本U87MG异种移植物的生长没有作用(图10A)。相比之下，mAb806以剂量依赖性方式显著抑制U87MG.Δ2-7异种移植物的生长(图10B)。在第17天时，在对照动物被处死前一天，平均肿瘤体积对于对照组是935±215.04mm3，对于0.1mg/注射组是386±57.51mm3(p＜0.01)，并且对于1mg注射组是217±58.17mm3(p＜0.002)。
[0565] 为了检查用mAb806观察到的生长抑制是否局限于表达de2-7 EGFR的细胞，在建立的模型中检查其针对U87MG.wtEGFR肿瘤异种移植物的功效。这些细胞充当用于包含3
EGFR基因扩增而无de2-7 EGFR表达的肿瘤的模型。当肿瘤已达到73±7.5mm的平均肿瘤体积时，起始mAb806处理。当与用媒介物处理的对照肿瘤比较时，mAb806显著抑制建立的U87MG.wtEGFR异种移植物的生长(图10C)。在对照动物被处死的当天，平均肿瘤体积对于
3 3
对照组是960±268.9mm，并且对于用1mg注射处理的组是468±78.38mm(p＜0.04)。
EGFR基因扩增而无de2-7 EGFR表达的肿瘤的模型。当肿瘤已达到73±7.5mm的平均肿瘤体积时，起始mAb806处理。当与用媒介物处理的对照肿瘤比较时，mAb806显著抑制建立的U87MG.wtEGFR异种移植物的生长(图10C)。在对照动物被处死的当天，平均肿瘤体积对于
3 3
对照组是960±268.9mm，并且对于用1mg注射处理的组是468±78.38mm(p＜0.04)。
[0566] 建立的肿瘤的组织学和免疫组织化学分析
[0567] 为了评估mAb806处理的以及对照U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物之间的潜在组织学差异(分别在24和42天时收集)，用H&E染色福尔马林固定、石蜡包埋的切片。在来自用mAb806处理的U87MG.Δ2-7(在处理结束后3天收集)和U87MG.wtEGFR异种移植物(在处理结束后9天收集)的切片中可见坏死区域。这个结果在许多肿瘤异种移植物(n＝4)中一致地观察到。然而，来自用对照处理的异种移植物的切片分析未显示用mAb806处理可见的相同坏死区域。来自mAb806或对照处理的U87MG异种移植物的切片也用H&E染色，并且未揭示在2个组之间在细胞生活力中的差异，这进一步支持mAb806结合诱导减少的细胞生活力/在肿瘤异种移植物内的坏死的假定。
[0568] 执行U87MG、U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物切片的免疫组织化学化学分析，以测定在mAb806处理后的de2-7和wtEGFR表达水平。如上在第24和42天时收集切片，并且用528或806抗体进行免疫染色。如预期的，528抗体染色所有异种移植物切片，在经处理的和对照肿瘤之间的强度中无明显减少。U87MG切片的染色用mAb806是无法检测的，然而，观察到U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物切片的阳性染色。在对照和经处理的U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物之间不存在mAb806染色密度中的差异，暗示抗体处理不下调de2-7或wtEGFR表达。
[0569] 用mAb806处理A431异种移植物
[0570] 为了证实mAb806的抗瘤作用不局限于U87MG细胞，将抗体施用于具有A431异种6
移植物的小鼠。这些细胞包含扩增的EGFR基因且表达约2×10受体/细胞。如上所述，mAb806结合约10％的这些EGFR且靶向A431异种移植物。当在先前描述的预防性异种移植物模型中检查时，mAb806显著抑制A431异种移植物的生长(图11A)。在第13天时，当
3
对照动物被处死时，平均肿瘤体积在对照组中是1385±147.54mm，并且对于1mg注射处理
3
组是260±60.33mm(p＜0.0001)。
移植物的小鼠。这些细胞包含扩增的EGFR基因且表达约2×10受体/细胞。如上所述，mAb806结合约10％的这些EGFR且靶向A431异种移植物。当在先前描述的预防性异种移植物模型中检查时，mAb806显著抑制A431异种移植物的生长(图11A)。在第13天时，当
3
对照动物被处死时，平均肿瘤体积在对照组中是1385±147.54mm，并且对于1mg注射处理
3
组是260±60.33mm(p＜0.0001)。
[0571] 在分开的实验中，0.1mg mAb的剂量在预防模型中也显著抑制A431异种移植物的生长。
[0572] 考虑到mAb806在预防性A431异种移植物模型中的功效，检查其抑制建立的肿瘤异种移植物的生长的能力。抗体处理如预防模型中所描述的，除了它直到肿瘤已3
达到201±19.09mm的平均肿瘤体积时起始外。mAb806显著抑制建立的肿瘤异种移植物的生长(图11B)。在第13天时，在对照动物被处死时，平均肿瘤体积对于对照组是
3 3
1142±120.06mm，并且对于1mg注射组是451±65.58mm(p＜0.0001)。
达到201±19.09mm的平均肿瘤体积时起始外。mAb806显著抑制建立的肿瘤异种移植物的生长(图11B)。在第13天时，在对照动物被处死时，平均肿瘤体积对于对照组是
3 3
1142±120.06mm，并且对于1mg注射组是451±65.58mm(p＜0.0001)。
[0573] 总之，用此处描述的mAb806的治疗研究明确证实U87MG.Δ2-7异种移植物生长的剂量依赖性抑制。相比之下，未观察到亲本U87MG异种移植物的抑制，尽管存在它们继续在体内表达wtEGFR的事实。mAb806不仅显著减少异种移植物体积，它还在肿瘤内诱导显著坏死。这是显示此类抗体在体内针对人de2-7 EGFR表达神经胶质瘤异种移植物的成功治疗用途的第一篇报道。
[0574] EGFR的基因扩增已在许多不同肿瘤中得到报道，并且在约50％神经胶质瘤中观察到(Voldberg等人，1997)。已提出通过增加细胞内信号和细胞生长，由受体基因扩增介导的后续EGFR超表达可以赋予生长优势(Filmus等人，1987)。U87MG细胞系用wtEGFR转染，以便产生模拟EGFR基因扩增过程的神经胶质瘤细胞。用mAb806处理建立的U87MG.wtEGFR异种移植物导致显著生长抑制。因此，mAb806还介导针对包含EGFR基因扩增的细胞的体内抗瘤活性。令人感兴趣的是，U87MG.wtEGFR异种移植物的mAb806抑制看起来比用U87MG.Δ2-7肿瘤观察到的那种更不有效。这可能反映了mAb806对于扩增的EGFR具有较低亲和力且仅结合在细胞表面上表达的小比例受体的事实。然而，应当指出尽管对U87MG.wtEGFR异种移植物体积的小作用，mAb806处理在这些异种移植物内产生大面积坏死。
[0575] 为了排除mAb806仅介导U87MG衍生细胞系的抑制的可能性，我们测试了其针对A431异种移植物的功效。这种鳞状细胞癌衍生细胞系包含显著的EGFR基因扩增，这在体外和体内得到保留。A431异种移植物用mAb806的处理在预防和建立的模型中产生显著生长抑制，指示mAb806的抗瘤作用不局限于经转染的U87MG细胞系。
[0576] 实施例11
[0577] A431异种移植物用mAb806和AG1478的组合治疗处理
[0578] 在具有A431异种移植物的小鼠中测试与AG1478组合的mAb806的抗瘤作用。与HER2-neu和血小板衍生的生长因子受体激酶比较(Calbiochem目录号658552)，AG1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)是EGFR激酶的有效和选择性抑制剂。包括3种对照：仅用媒介物处理、媒介物+仅mAb806、和媒介物+仅AG1478。结果在图12中举例说明。0.1mg mAb806在异种移植前1天以及在异种移物后1、3、6、8和10天时施用。
400μg AG1478在异种移物后0、2、4、7、9和11天时施用。
400μg AG1478在异种移物后0、2、4、7、9和11天时施用。
[0579] 当单独施用时，AG1478和mAb806产生肿瘤体积的显著减少。然而，在组合中，肿瘤体积的减少得到极大增强。
[0580] 此外，mAb806与A431细胞的EGFR的结合在AG1478的存在和不存在下评估。细胞在无血清培养基中放置过夜，随后用AG1478在37℃处理10分钟，在PBS中洗涤2次，随后在1％Triton中裂解，并且通过以12,000g离心10分钟制备裂解物。随后以通过Schooler和Wiley，Analytical Biochemistry 277，135-142(2000)描述的测定的修改形式，通过ELISA对于806反应性评估裂解物。板用在PBS/EDTA中的10μg/ml mAb806在室温包被过夜，并且随后洗涤2次。板随后用10％血清白蛋白/PBS在37℃封闭2小时且洗涤2次。1∶20细胞裂解物在37℃加入10％血清白蛋白/PBS中1小时，随后洗涤4次。将在10％血清白蛋白/PBS中的抗EGFR(SC-03；Santa Cruz Biotechnology Inc.)在室温反应90分钟，将板洗涤4次，并且将在10％血清白蛋白/PBS中的抗兔-HRP(如果来自Silenus，那么
1∶2000)在室温加入90分钟，洗涤4次，并且使用ABTS作为底物显色。发现mAb806结合在增加量的AG1478的存在下显著增加(图13)。
1∶2000)在室温加入90分钟，洗涤4次，并且使用ABTS作为底物显色。发现mAb806结合在增加量的AG1478的存在下显著增加(图13)。
[0581] 实施例12
[0582] 在对于EGFR状态预分型的人成胶质细胞瘤中的免疫反应性
[0583] 考虑到在成胶质细胞瘤中EGFR表达、扩增和突变的高发生率，执行详细的免疫组织化学研究，以便评价806在除异种移植物外的肿瘤中的特异性。通过免疫组织化学分析16个成胶质细胞瘤的组。这个16个成胶质细胞瘤的组通过RT-PCR对于扩增的野生型EGFR和de2-7EGFR表达的存在预分型。这些肿瘤中的6个仅表达wtEGFR转录物，10个具有wtEGFR基因扩增，其中这些中的5个仅显示野生型EGFR转录物，并且5个显示野生型EGFR和de2-7基因转录物。
[0584] 使用应用于组织学载玻片且在冷丙酮中固定10分钟的新鲜冷冻组织的5mm切片执行免疫组织化学分析。用生物素化的马抗小鼠抗体随后为抗生物素蛋白-生物素-复合反应检测结合的初次抗体。二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)用作色原。通过光学显微镜检查评估在组织中的免疫组织化学反应性程度，并且如下以25％增量根据免疫反应性细胞数目进行分级：
[0585] 局灶＝小于5％
[0586] +＝5-25％
[0587] ++＝25-50％
[0588] +++＝50-75％
[0589] ++++＝＞75％。
[0590] 528抗体在所有肿瘤中显示强烈反应性，而DH8.3免疫染色局限于表达de2-7EGFR的那些肿瘤(表2)。与在FACS和玫瑰花结测定中的先前观察一致，mAb806不与表达来自非扩增EGFR基因的wtEGFR转录物的成胶质细胞瘤反应(表2)。对于mAb806的这种反应性模式类似于在异种移植物研究中观察到的那种，并且再次暗示这种抗体识别de2-7和扩增的EGFR而不是在细胞表面上表达时的wtEGFR。
[0591] 表2
[0592] mAbs528、DH8.3和806对就野生型EGFR和突变的de2-7EGFR的存在及其扩增状态预分型的成胶质细胞瘤的免疫反应性
[0593]扩增 de2-7EGFR表达 528 DH8.3 806
否 ++++ - -
否 ++++ - -*
否 ++++ - -
否 ++ - -
否 +++ - -
否 ++++ - -
是 否 ++++ - ++++
是 否 ++++ - +
是 否 ++++ - +++
是 否 ++++ - ++++
是 否 ++++ - +-++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++ ++
否 ++++ - -
否 ++++ - -*
否 ++++ - -
否 ++ - -
否 +++ - -
否 ++++ - -
是 否 ++++ - ++++
是 否 ++++ - +
是 否 ++++ - +++
是 否 ++++ - ++++
是 否 ++++ - +-++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++++ ++++
是 是 ++++ ++ ++
[0594] *局灶染色。
[0595] 实施例13
[0596] 在正常组织中的EGFR免疫反应性
[0597] 为了测定de2-7EGFR是否在正常组织中表达，在25种组织的组中进行用mAb806和DH8.3的免疫组织化学研究。在测试的任何组织中不存在与mAb806或DH8.3的强免疫反应性，暗示de2-7EGFR在正常组织中不存在(表3)。用mAb806在扁桃体中存在一些可变的染色，其局限于表皮的基细胞层和上皮的粘膜鳞状细胞。在胎盘中，观察到滋养层上皮的偶然免疫染色。令人感兴趣的是，表达高内源水平wtEGFR的2种组织肝脏和皮肤未能显示任何显著的mAb806反应性。对于肝脏样品完全未观察到反应性，并且在皮肤样品中的基底角化细胞中和在扁桃体粘膜的鳞状上皮中仅偶尔检测到弱和不一致的局灶反应性(在研究的所有样品中的不超过10％)，进一步证实这种抗体不结合在细胞的表面上表达的wtEGFR至任何显著程度(表3)。所有组织对于wtEGFR是阳性的，如通过用528抗体可见的普遍染色证明的(表3)。
[0598] 表3
[0599] 528、DH8.3和806对正常组织的反应性
[0600]
[0601] *在各种组织中的某些基质染色。
[0602] 实施例14
[0603] 在各种肿瘤中的EGFR免疫反应性
[0604] 使用12种不同恶性肿瘤的组检查在其他肿瘤类型中的de2-7EGFR程度。528抗体在除黑素瘤和精原细胞瘤外分析的许多肿瘤中显示通常同质的染色。当存在时，DH8.3免疫反应性局限于偶然局灶肿瘤细胞，指示如果存在的话，使用这种检测系统在脑外的肿瘤中存在很少的de2-7EGFR表达(表4)。在某些肿瘤中还存在血管的局灶染色和用DH8.3抗体结缔组织的不同扩散染色(表4)。这种染色强烈依赖于所使用的抗体浓度且视为非特异性本底反应性。mAb806显示在64％头与颈肿瘤和50％肺癌中的阳性染色(表4)。除了在30％病例中阳性的尿道肿瘤外的其他地方存在很少的mAb806反应性。
[0605] 因为头与颈和肺癌对于DH8.3抗体是阴性的，所以在这些肿瘤中用mAb可见的反应性可能与EGFR基因扩增相关。
[0606] 表4
[0607] 在肿瘤组上的单克隆抗体528、DH8.3和806
[0608]
[0609] *局灶染色。
[0610] 实施例15
[0611] 在未对于EGFR状态选择的人成胶质细胞瘤中的免疫反应性
[0612] 为了证实mAb806的独特特异性且评估反应性，在未就其EGFR状态预选择的46种成胶质细胞瘤的组中将其与528和DH8.3抗体比较。528抗体在除2个(编号27和29)(44/46，95.7％)外的所有样品中是强烈和同质地阳性的。这2个病例对于mAb806和mAbDH8.3也是阴性的。mAb806在27/46(58.7％)个病例中是阳性的，其中22个在超过
50％的肿瘤中展示同质免疫反应性。DH8.3抗体在15/46(32.6％)个成胶质细胞瘤中是阳性的，其中9个显示同质免疫反应性。这些未选择肿瘤的免疫化学染色在表5中制表。
50％的肿瘤中展示同质免疫反应性。DH8.3抗体在15/46(32.6％)个成胶质细胞瘤中是阳性的，其中9个显示同质免疫反应性。这些未选择肿瘤的免疫化学染色在表5中制表。
[0613] 在除1个(编号35)外的每一个病例中在mAb806和DH8.3之间存在一致性。在44个病例中完成对于EGFR扩增存在的分子分析(表5)。在这些中，30个病例用先前建立的mAb806免疫反应性模式共分型：例如16个mAb806阴性病例未揭示EGFR扩增，并且14个EGFR扩增病例也是mAb806免疫阳性的。然而，显示806免疫反应性的13个病例对于EGFR扩增是阴性的，而1个EGFR扩增病例是mAb806阴性的。这些扩增阴性和806阳性病例的突变状态的进一步分析在下文描述，并且提供了对于13个病例中大多数的解释，其对于EGFR扩增是阴性的并且由806识别。
[0614] 随后，对41/46个病例执行通过RT-PCR的缺失突变的分子分析(表5)。在这些中，34个病例用对于缺失突变特异性的DH8.3共分型：12个病例在RT-PCR和免疫组织化学中是阳性的，并且22个病例是阴性/阴性的。3个病例(#2、#34和#40)对于缺失突变是DH8.3阳性/RT-PCR阴性的，并且3个病例(#12、#18和#39)是DH8.3阴性/RT-PCR阴性的。如基于我们的先前特异性分析预期的，mAb806免疫反应性在除1个病例(#35)外的所有DH8.3阳性组织中可见。
[0615] 病例#3也揭示了突变(在表5中指名A2)，这包括de2-7突变的序列，但这看起来不是具有801个碱基丧失的标准de2-7缺失(数据未显示)。这个病例对于DH8.3反应性是阴性的，但显示与806的反应性，指示806可以识别另外且可能独特的EGFR突变。
[0616] 表5
[0617] 46种未选择的成胶质细胞瘤用mAbs 528、806和DH8.3的免疫组织化学分析[0618]
[0619] *N＝未扩增的，A-扩增的，
[0620] +WT＝野生型，5′-mut
[0621] nd＝未完成。
[0622] 在19/27或超过70％的病例中用扩增或de2-7突变型EGFR共分型的806抗体反应性。值得注意的是这8个病例中的2个也是DH8.3反应性的。
[0623] 实施例16
[0624] 颅内神经胶质瘤肿瘤的全身处理和分析
[0625] 为了测试抗ΔEGFR单克隆抗体mAb806的功效，我们用mAb806、同种型对照IgG或PBS的腹膜内注射处理荷有颅内ΔEGFR超表达神经胶质瘤异种移植物的裸鼠。
[0626] 因为人成胶质细胞瘤的原始外植块快速丧失在培养物中扩增的、重排受体的表达，所以没有现有成胶质细胞瘤细胞系显示此类表达。为了加强与在人肿瘤中可见那些相当的表达水平的维持，如先前描述的(Nishikawa等人(1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，7727-7731)，用ΔEGFR、激酶缺乏性ΔEGFR(DK)或野生型EGFR(wtEGFR)病毒感染U87MG、LN-Z308和A1207(来自Dr.S.Aaronson，Mount Sinai Medical Center，New York，NY的礼物)细胞，这也赋予对于G418的抗性。
[0627] 如先前描述的(Nishikawa等人，1994)，通过FACS选择表达相似水平的各种EGFR等位基因的群体(这些表达水平大致对应于25个基因拷贝的扩增水平；人成胶质细胞瘤一般具有10-50个基因拷贝的截短受体的扩增水平)，并且分别指名为U87MG.ΔEGFR、U87MG.DK、U87MG.wtEGFR、LN-Z308.ΔEGFR、LN-Z308.DK、LN-Z308.wtEGFR、A1207.ΔEGFR、A1207.DK和A1207.wtEGFR。将其各自在包含G418的培养基中维持(U87MG细胞系，400μg/ml；LN-Z308和A1207细胞系，800μg/ml)。
[0628] 如先前描述的(Mishima等人(2000)A peptide derived from the non-receptor binding region of urokinase plasminogen activator inhibits glioblastoma growth and angiogenesis in vivo in combination with cisplatin.Proc.Natl.Acad.Sci.5 5
U.S.A.97，8484-8489)，将在5μlPBS中的U87MG.ΔEGFR细胞(1×10)或5×10LN-Z308.ΔEGFR、A1207.ΔEGFR、U87MG、U87MG.DK和U87MG.wtEGFR细胞植入裸鼠脑的右纹状体(corpus stratum)内。从植入后第0到14天，每隔一天通过在100μl体积中的1μg mAbs的腹膜内注射完成用mAb806或IgG2b同种型对照的全身治疗。对于脑内U87MG.ΔEGFR肿瘤的直接治疗，从第1天时开始，每隔一天在肿瘤注射部位注射在5μl体积中的10μg mAb806或IgG2b同种型对照，进行5天。
U.S.A.97，8484-8489)，将在5μlPBS中的U87MG.ΔEGFR细胞(1×10)或5×10LN-Z308.ΔEGFR、A1207.ΔEGFR、U87MG、U87MG.DK和U87MG.wtEGFR细胞植入裸鼠脑的右纹状体(corpus stratum)内。从植入后第0到14天，每隔一天通过在100μl体积中的1μg mAbs的腹膜内注射完成用mAb806或IgG2b同种型对照的全身治疗。对于脑内U87MG.ΔEGFR肿瘤的直接治疗，从第1天时开始，每隔一天在肿瘤注射部位注射在5μl体积中的10μg mAb806或IgG2b同种型对照，进行5天。
[0629] 用PBS或同种型对照IgG处理的动物具有13天的生存中值，而用mAb806处理的小鼠具有生存中值方面高达21天的61.5％增加(P＜0.001；图24A)。
[0630] 与对照组的生存中值比较(数据未显示)，在肿瘤建立后，植入后3天小鼠的处理也使mAb806处理的动物的生存中值延长46.1％(从13天到19天；P＜0.01)。
[0631] 为了测定mAb806的这些抗瘤作用是否延长超过U87MG.ΔEGFR异种移植物，将相似处理施用于荷有LN-Z308.ΔEGFR和A1207.ΔEGFR的其他神经胶质瘤细胞异种移植物的动物。荷有LN-Z308.ΔEGFR异种移植物的mAb806处理小鼠的生存中值从对于对照的19天延长到58天(P＜0.001；图24B)。值得注意的是，8个mAb806处理的动物中的4个存活超过60天(图24B)。荷有A1207.ΔEGFR异种移植物的动物的生存中值也从对于对照的24天延长到29天(P＜0.01；数据未显示)。
[0632] mAb806处理抑制ΔEGFR超表达脑瘤生长
[0633] 荷有U87MG.ΔEGFR和LN-Z308.ΔEGFR异种移植物的小鼠分别在第9天和第15天时实施安乐死。组织病理学分析肿瘤切片并且测定肿瘤体积。与对于动物存活观察到的结果一致，与对照组的体积比较，mAb806处理使U87MG.ΔEGFR的体积显著减少约90％(P＜0.001；图24C)，并且使LN-Z308.ΔEGFR异种移植物的体积显著减少超过95％(P＜0.001；图24D)。对于荷有A1207.ΔEGFR肿瘤的动物获得类似结果(65％体积减少，P＜0.01；数据未显示)。
[0634] 用mAb806的瘤内处理延长荷有U87MG.ΔEGFR脑瘤的小鼠的存活
[0635] 还测定mAb806的直接瘤内注射对于U87MG.ΔEGFR异种移植物处理的功效。在植入后1天，动物给予mAb806或同种型对照IgG的瘤内注射。对照动物存活15天，而mAb806处理的小鼠保持存活18天(P＜0.01；图24E)。虽然用mAb806的瘤内处理略微有效，但它使多次颅内注射的困难成为必需且增加感染的危险。我们因此集中于全身处理用于进一步研究。
[0636] mAb806处理略微延长荷有U87MG.wtEGFR而不是U87MG或U87MG.DK颅内异种移植物的小鼠的存活
[0637] 为了测定通过mAb806的生长抑制对于表达ΔEGFR的肿瘤是否是选择性的，我们处理荷有U87MG、U87MG.DK(激酶缺乏性ΔEGFR)和U87MG.wtEGFR脑异种移植物的动物。mAb806处理不延长用表达低水平的内源野生型EGFR(wtEGFR)的U87MG肿瘤植入的小鼠(图25A)(Huang等人(1997)The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.J.Biol.Chem.，272，2927-2935)，或荷有超表达激酶缺乏性ΔEGFR加上低水平的内源wtEGFR的U87MG.DK异种移植物的动物(图25B)的存活。mAb806处理略微延长荷有超表达wtEGFR的U87MG.wtEGFR肿瘤的小鼠的存活(P＜0.05，生存中值23天与对于对照组的26天比较)(图25C)。
[0638] mAb806反应性与体内抗瘤功效关联
[0639] 为了理解mAb806对表达各种水平或不同类型EGFR的肿瘤的差异作用，我们通过FACS分析测定了mAb806与各种肿瘤细胞的反应性。染色的细胞用FACS Calibur使用Cell Quest软件(Becton-Dickinson PharMingen)进行分析。对于第一种抗体，使用下述mAbs：mAb806、抗EGFRmAb克隆528和克隆EGFR.1。小鼠IgG2a或IgG2b用作同种型对照。
[0640] 与先前报道一致(Nishikawa等人(1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，7727-7731)，抗EGFR mAb528识别ΔEGFR和wtEGFR，并且证实与U87MG细胞比较对于U87MG.ΔEGFR细胞更强的染色(图26A，528)。
[0641] 相比之下，抗体EGFR.1与wtEGFR而不是ΔEGFR反应(Nishikawara等人，1994)，因为U87MG.ΔEGFR细胞如U87MG细胞那样弱反应(图26A，小图EGFR.1)。
[0642] 这种EGFR.1抗体与U87MG.wtEGFR比与U87MG细胞更强烈地反应，因为U87MG.wtEGFR细胞超表达wtEGFR(图26A，小图EGFR.1)。尽管mAb806与U87MG.ΔEGFR和U87MG.DK细胞而不与U87MG细胞强烈反应，但它与87MG.wtEGFR弱反应，这指示mAb806对于ΔEGFR是选择性的，与超表达的wtEGFR具有弱交叉反应性(图26A，小图mAb806)。
[0643] 与U87MG.wtEGFR的这个反应性水平在数量和质量上类似于通过抗体处理介导的存活延长(图25C)。
[0644] 我们通过免疫沉淀进一步测定mAb806特异性。将在各种细胞系中的EGFRs用抗体mAb806、抗EGFR mAb克隆528(Oncogene Research Products，Boston，MA)或克隆EGFR.1(Oncogene Research Products)免疫沉淀。
[0645] 简言之，细胞用裂解缓冲液进行裂解，所述裂解缓冲液包含50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、10％甘油、1％Triton X-100、2mM EDTA、0.1％SDS、0.5％脱氧胆酸钠、10mM PPi钠、1mM苯甲基磺酰氟、2mM Na3V04、5μg/ml亮抑酶肽和5μg/ml抑肽酶。在蛋白A和G琼脂糖添加前，将抗体与细胞裂解物在4℃温育1小时。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤2次，并且用HNTG缓冲液[50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、0.1％Triton X-100和10％甘油]洗涤1次，电泳且转移至硝酸纤维素膜。
[0646] 电泳分离的蛋白质的印迹用抗EGFR抗体，C13(由Dr.G.N.Gill，University of California，San Diego，CA提供)进行探测，用于检测在免疫印迹上的野生型和ΔEGFR(Huang等人，1997)，并且使用ECL化学发光检测系统(Amersham Pharmacia Biotech.)显现蛋白质。如先前描述的(Nagane等人(1998)Drug resistance of human glioblastoma cells conferred by a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor through modulation of Bcl-XL and caspase-3-like proteases.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，5724-5729)，针对Bcl-X(兔多克隆抗体；Transduction Laboratories，Lexington，KY)和磷 酸酪 氨酸 (4G10，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)的抗体用于蛋白质印迹分析。
[0647] 与FACS分析一致，抗体528识别wtEGFR和突变型受体(图26B-小图IP：528)，而抗体EGFR.1与wtEGFR而不与突变型种类反应(图26B，小图IP：EGFR.1)。此外，在U87MG.ΔEGFR和U87MG.DK细胞中的突变型受体水平与U87MG.wtEGFR细胞中wtEGFR的水平相当(图26B，小图IP：528)。
[0648] 然而，与来自U87MG.ΔEGFR和U87MG.DK细胞沉淀的更大量的突变型受体比较，抗体mAb806仅能够沉淀来自U87MG.wtEGFR细胞裂解物的少量wtEGFR，和来自U87MG细胞无法检测的量(图26B，小图IP：mAb806)。总的来说，这些数据暗示mAb806识别也存在于小部分的wtEGFR中的ΔEGFR中的表位，仅当它在细胞表面上超表达时(参见下文mAb806表位的进一步讨论和提及)。
[0649] mAb806处理减少在U87MG.ΔEGFR脑瘤中的ΔEGFR自磷酸化且下调Bcl.XL表达[0650] 接下来研究在通过mAb806的生长抑制下的机制。因为ΔEGFR的羧基末端的组成性激活激酶活性和自磷酸化对于其生物功能是必需的(Nishikawa等人(1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，7727-7731；Huang 等 人，1997；Nagane等人(1996)A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis.Cancer Res.，56，5079-5086；Nagane等人(2001)Aberrant receptor signaling in human malignant gliomas：mechanisms and therapeutic implications.Cancer Lett.162(Suppl.1)，S17-S21)。在来自处理和对照动物的肿瘤中测定ΔEGFR磷酸化状态。如图27A中所示，mAb806处理急剧地减少ΔEGFR自磷酸化，尽管受体水平在mAb806处理的异种移植物中仅略微降低。我们先前已显示受体自磷酸化引起抗凋亡基因Bcl-XL的上调，这在减少ΔEGFR超表达肿瘤的凋亡中起关键作用(Nagane等人，1996；Nagane等人，2001)。因此，随后测定mAb806处理对Bcl-XL表达的作用。来自mAb806处理动物的ΔEGFR肿瘤事实上的确显示减少水平的Bcl-XL(图27A)。
[0651] mAb806处理降低U87MG.ΔEGFR肿瘤中的生长和血管发生，并且增加凋亡
[0652] 根据由mAb806处理引起的体内抑制及其对受体信号的生物化学作用，我们测定来自对照或处理小鼠的肿瘤的增殖速率。通过mAb806处理肿瘤的Ki-67染色测量的增殖指数显著低于对照肿瘤的增殖指数(P＜0.001；图28)。
[0653] 简言之，为了评估肿瘤中的血管发生，将它们在包含氯化锌的溶液中固定，石蜡包埋，切片且使用单克隆大鼠抗小鼠CD31抗体(Becton-Dickinson PharMingen；1∶200)免疫染色。通过对福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织的Ki-67免疫组织化学执行肿瘤细胞增殖的评估。在脱石蜡和再水合后，组织切片与在甲醇中的3％过氧化氢温育，以猝灭内源过氧化物酶。切片用山羊血清封闭30分钟，并且与初次抗体在4℃温育过夜。切片随后用PBS洗涤且与生物素化的二次抗体温育30分钟。在用PBS几次洗涤后，使用链霉亲和素辣根过氧化物酶显现产物，用二氨基联苯胺作为色原和苏木精作为复染剂。作为增殖的测量，Ki-67标记指数测定为在高倍(3400)视野中标记的核：总核比。
[0654] 在每种情况下通过全身随机取样计数约2000个核。对于巨噬细胞和NK细胞染色，使用生物素化的mAbF4/80(Serotec，Raleigh，NC)和多克隆兔抗去唾液酸基GM1抗体(Dako Chemicals，Richmond，VA)分别免疫染色用缓冲的4％多聚甲醛溶液固定的冷冻切片。使用计算机化分析以血管面积定量血管发生。为了这个目的，使用抗CD31免疫染色切片，并且使用计算机化的图像分析系统无复染剂进行分析。如先前描述的(Mishima等人，2000)，通过使用CCD彩色照相机以3200放大率捕获切片的数字图像测定MVAs。随后使用Image Pro Plus版本4.0软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)分析图像，并且通过测量每个切片中的染色总量测定MVA。对于每个载玻片评估4个视野。将这个值表示为每个视野中的总面积百分率。结果在每个实验中通过至少2个观察者(K.M.，H-J.S.H.)加以证实。
[0655] 此外，如先前描述的(Mishima等人，2000)，通过使用TUNEL法检测在肿瘤组织中的凋亡细胞。TUNEL阳性细胞在X400下计数。凋亡指数计算为每个视野中的凋亡细胞数目：总细胞数目比。凋亡指数通过TUNEL染色的分析证实，mAb806处理的肿瘤中的凋亡细胞数目与对照肿瘤比较显著增加(P＜0.001；图28)。
[0656] 还通过来自经处理的和对照样品的肿瘤的对于CD31的免疫染色分析肿瘤血管化的程度。为了定量肿瘤血管化，使用计算机化的图像分析测量微血管面积(MVAs)。mAb806处理的肿瘤显示比对照肿瘤小30％的MVA(P＜0.001；图28)。
[0657] 为了理解受体和抗体之间的相互作用是否可以引发炎症应答，我们对于巨噬细胞标记F4/80和NK细胞标记无唾液酸基GM1染色肿瘤切片。巨噬细胞在整个肿瘤基质得到鉴定，且特别在mAb806处理的U87MG.ΔEGFR肿瘤外周累积(图28)。我们观察到在肿瘤中和周围浸润的少数NK细胞，以及在mAb806处理和同种型对照肿瘤之间没有显著差异(数据未显示)。
[0658] 实施例17
[0659] 用mAb806和mAb528的组合免疫治疗
[0660] 本文所示实验描述了设计为测定依照本发明抗体的功效的体内工作。
[0661] 4-6周龄的雌性裸鼠用作实验动物。小鼠接受在其各自胁腹中的3×106肿瘤细胞的皮下接种。
[0662] 动物接受U87MG.D2-7、U87MG.DK或A431细胞，所有这些同上描述。治疗在肿瘤已生长至足够大小时开始。
[0663] 小鼠随后接受下列之一的注射：(i)磷酸盐缓冲盐水、(ii)mAb806(0.5mg/注射)、(iii)mAb528(0.5mg/注射)或(iv)2种mAbs组合。就“(iv)”而言，不同组的小鼠接受每种mAb的0.5mg/注射、或每种mAb的0.25mg/注射。
[0664] 检查的第一组小鼠是已接受U87MG.D2-7注射的那些。处理方案在接种后9天开始，并且持续3次/周，进行2周(即动物在它们用细胞注射后9、11、13、16、18和20天接3
种)。在处理方案开始时，平均肿瘤直径是115mm。每个组包含50只小鼠，其各自具有2个肿瘤。
种)。在处理方案开始时，平均肿瘤直径是115mm。每个组包含50只小鼠，其各自具有2个肿瘤。
[0665] 在接受抗体组合(各0.5mg/注射)的小鼠组内，存在3次完全消退。在任一其他组中不存在消退。图18A图解显示了结果。
[0666] 在第二组小鼠中，注射的材料是相同的，除组合治疗包含0.25mg每种抗体/注射外。注射在用细胞接种后10、12、14、17、19和21天给予。在治疗开始时，平均肿瘤大小是3
114mm。结果显示于图18B中。
114mm。结果显示于图18B中。
[0667] 第三组小鼠接受U87MG.DK的接种。在用细胞接种后18天开始治疗注射，并且在3
第20、22、25、27和29天时继续。在处理开始时的平均肿瘤大小是107mm。图18C概括了结果。治疗注射与第一组相同。
第20、22、25、27和29天时继续。在处理开始时的平均肿瘤大小是107mm。图18C概括了结果。治疗注射与第一组相同。
[0668] 最后，在接种后8、10、12和14天时，已用A431细胞接种的第四组小鼠接受与组I3
和III相同的注射。在开始时，平均肿瘤大小是71mm。结果显示于图18D中。
和III相同的注射。在开始时，平均肿瘤大小是71mm。结果显示于图18D中。
[0669] 结果指示组合抗体治疗显示减少肿瘤中的协同作用。参见图18A。根据图18B，在较低剂量可见相似作用，指示作用不只是由于剂量水平。
[0670] 组合治疗不抑制U87MG.DK的生长(图18C)，指示抗体免疫功能不是图18A和18B中所见的减少的原因。
[0671] 应当指出，如图18D中所示，组合治疗也显示对A431肿瘤的协同功效，其中4个剂量导致60％的完全应答率。这些数据暗示由mAb806识别的EGFR分子在功能上不同于由528抑制的那种。
[0672] 实施例18
[0673] 肿瘤异种移植物生长的mAb806抑制
[0674] 如本文讨论且在本实施例中进一步证实且讨论的，已出乎意料地发现mAb806抑制表达de2-7或扩增的EGFR而不是野生型EGFR的肿瘤异种移植物的生长。
[0675] 如实施例1中所述制备细胞系和抗体。为了测定mAb806的特异性，通过FACS分析其与U87MG、U87MG.D2-7和U87MG.wtEGFR细胞的结合。简言之，使用528、806和DH8.3抗体对于野生型和de2-7EGFR表达分析培养的亲本和转染的U87MG细胞系。细胞(13106)与5μg/ml合适抗体或同种型匹配的阴性对照在包含1％HAS的PBS中在4℃温育30分钟。在用PBS/1％HSA的3次洗涤后，细胞与FTTC偶联的山羊抗小鼠抗体(1∶100稀释度；Calbiochem、San Diego、CA)一起在4℃温育另外30分钟。在3次后续洗涤后，通过观察最低20,000个事件，在Epics Elite ESP(Beckman Coulter、Hialeah、FL)上分析细胞，并且使用用于Windows的EXPO(版本2)分析。包括无关IgG2b(针对人抗原A33的mAb100-310)作为用于mAb806的同种型对照，并且包括528抗体，因为它识别de2-7和wtEGFR。
[0676] 仅528抗体能够染色亲本U87MG细胞系(图29)，这与证实这些细胞表达wtEGFR的先前报道一致(Nishikawa等人(1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，7727-7731)。mAb806具有类似于对照抗体的结合水平，明确证实它不能结合wtEGFR(图29)。同种型对照抗体与U87MG.D2-7和U87MG.wtEGFR细胞系的结合类似于对于U87MG细胞观察到的那种。mAb806染色U87MG.D2-7和U87MG.wtEGFR细胞，指示mAb806特异性识别de2-7EGFR和超表达EGFR的亚型(图29)。如预期的，528抗体染色U87MG.D2-7和U87MG.wtEGFR细胞系(图29)。在U87MG.wtEGFR细胞上528抗体染色的强度比mAb806高得多，暗示mAb806仅识别部分超表达的EGFR。用U87MG.wtEGFR细胞观察到的mAb806反应性类似于用超表达wtEGFR.3的另一个细胞系A431细胞获得的那种。
[0677] 使用U87MG.D2-7和A431细胞执行Scatchard分析，以测定在每个细胞系上关于9 -1
mAb806的相对亲和力和结合位点。mAb806对于de2-7EGFR受体具有1.1×10M 的亲和力，
5
并且识别2.4×10结合位点/细胞的平均值(3次分开实验)，如实施例4中指出的。相比
7 -1
之下，mAb806对于在A431细胞上的wtEGFR的亲和力仅是9.5×10M ，如实施例8中指出
5
的。令人感兴趣的是，mAb806识别在A431的表面上的2.3×10结合位点，这比在这些细胞中发现的EGFR报道数目略微低10倍。为了证实在我们的A431细胞的表面上的EGFR数
125
目，我们使用 I标记的528抗体执行Scatchard分析。如预期的，这种抗体与A431细胞
6
的表面上的约2×10位点结合。因此，看起来mAb806仅结合在A431细胞的表面上的部分
125
EGFR受体。重要的是，I标记的mAb806完全不与亲本U87MG细胞结合，即使在细胞数目
7
增加至1×10时。
mAb806的相对亲和力和结合位点。mAb806对于de2-7EGFR受体具有1.1×10M 的亲和力，
5
并且识别2.4×10结合位点/细胞的平均值(3次分开实验)，如实施例4中指出的。相比
7 -1
之下，mAb806对于在A431细胞上的wtEGFR的亲和力仅是9.5×10M ，如实施例8中指出
5
的。令人感兴趣的是，mAb806识别在A431的表面上的2.3×10结合位点，这比在这些细胞中发现的EGFR报道数目略微低10倍。为了证实在我们的A431细胞的表面上的EGFR数
125
目，我们使用 I标记的528抗体执行Scatchard分析。如预期的，这种抗体与A431细胞
6
的表面上的约2×10位点结合。因此，看起来mAb806仅结合在A431细胞的表面上的部分
125
EGFR受体。重要的是，I标记的mAb806完全不与亲本U87MG细胞结合，即使在细胞数目
7
增加至1×10时。
[0678] 使用mAb806、sc-03(对于EGFR的COOH-末端结构域特异的商业多克隆抗体)和35
IgG2b同种型对照，在 S标记后通过免疫沉淀在各种细胞系中进一步表征mAb806反应性。
35
简言之，细胞用在不含甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中的100mCi/ml Tran S-标记(ICN Biomedicals，Irvine，CA)标记16小时，所述DMEM补充有5％透析的FCS。在用PBS洗涤后，细胞在4℃置于裂解缓冲液(1％Triton X-100、30mM HEPES、150mM NaCl、500μM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氯(AEBSF)、150nM抑肽酶、1μM E-64蛋白酶抑制剂、0.5mM EDTA和1μM亮抑酶肽，pH 7.4)中1小时。裂解物通过以12,000g离心10分钟得到澄清，并且随后在蛋白A-琼脂糖添加前与5μg合适抗体一起在4℃温育30分钟。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤3次，与SDS样品缓冲液混合，通过使用4-20％Tris/甘氨酸凝胶的凝胶电泳分离，该凝胶随后干燥且暴露于X射线胶片。
IgG2b同种型对照，在 S标记后通过免疫沉淀在各种细胞系中进一步表征mAb806反应性。
35
简言之，细胞用在不含甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中的100mCi/ml Tran S-标记(ICN Biomedicals，Irvine，CA)标记16小时，所述DMEM补充有5％透析的FCS。在用PBS洗涤后，细胞在4℃置于裂解缓冲液(1％Triton X-100、30mM HEPES、150mM NaCl、500μM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氯(AEBSF)、150nM抑肽酶、1μM E-64蛋白酶抑制剂、0.5mM EDTA和1μM亮抑酶肽，pH 7.4)中1小时。裂解物通过以12,000g离心10分钟得到澄清，并且随后在蛋白A-琼脂糖添加前与5μg合适抗体一起在4℃温育30分钟。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤3次，与SDS样品缓冲液混合，通过使用4-20％Tris/甘氨酸凝胶的凝胶电泳分离，该凝胶随后干燥且暴露于X射线胶片。
[0679] sc-03抗体免疫沉淀来自U87MG.Δ2-7细胞的3个条带；在这些细胞中观察到与2个de2-7EGFR条带对应的双重峰，和与wtEGFR对应的更高分子量条带(图22和30)。相比之下，虽然mAb806免疫沉淀2个de2-7EGFR条带，但wtEGFR完全不存在。在U87MG.wtEGFR和A431细胞中可见的模式是基本上等同的。sc-03抗体免疫沉淀与来自A431细胞的wtEGFR对应的单一条带(图22和30)。mAb806也免疫沉淀与来自U87MG.wtEGFR和A431细胞的wtEGFR对应的单一条带(图22和30)。与FACS和Scatchard数据一致，通过mAb806免疫沉淀的EGFR量大大小于在细胞表面上存在的总EGFR。考虑到mAb806和sc-03免疫沉淀相似量的de2-7EGFR，这个结果支持mAb806抗体仅识别在超表达受体的细胞中的部分EGFR的概念。在mAb806和528抗体之间的比较显示等同的反应性模式(数据未显示)。无关IgG2b(用于mAb806的同种型对照)不免疫沉淀来自任一细胞系的EGFR(图22和30)。使用等同条件，mAb806不免疫沉淀来自亲本U87MG细胞的EGFR(数据未显示)。
[0680] 在预防性异种移植物模型中还对于针对U87MG和U87MG.Δ2-7肿瘤的功效检查mAb806。在肿瘤接种前当天腹膜内施用抗体或媒介物，并且每周给予3次，进行2周。在1mg/注射的剂量下，mAb806对表达wtEGFR的亲本U87MG异种移植物的生长没有作用(图
9A)。相比之下，mAb806以剂量依赖性方式显著抑制U87MG.Δ2-7异种移植物的生长(图
3
9B)。肿瘤接种后20天，当对照动物被处死时，平均肿瘤体积对于对照组是1600±180mm，
3
对于0.1mg/注射组是明显更小的500±95mm(P＜0.0001)，并且对于1mg/注射组是
3
200±42mm(P＜0.0001)。处理组在第24天时被处死，在此时平均肿瘤体积对于0.1mg处
3 3
理组是1300±240mm，并且对于1mg组是500±100mm(P＜0.005)。
9A)。相比之下，mAb806以剂量依赖性方式显著抑制U87MG.Δ2-7异种移植物的生长(图
3
9B)。肿瘤接种后20天，当对照动物被处死时，平均肿瘤体积对于对照组是1600±180mm，
3
对于0.1mg/注射组是明显更小的500±95mm(P＜0.0001)，并且对于1mg/注射组是
3
200±42mm(P＜0.0001)。处理组在第24天时被处死，在此时平均肿瘤体积对于0.1mg处
3 3
理组是1300±240mm，并且对于1mg组是500±100mm(P＜0.005)。
[0681] 考虑到mAb806在预防性异种移植物模型中的功效，检查其抑制建立的肿瘤异种移植物的生长的能力。抗体处理如预防模型中所描述，除了它在肿瘤对于U87MG.Δ2-7异3
种移植物已达到65mm的平均肿瘤体积(在植入后10天)并且对于亲本U87MG异种移植物
3
已达到84mm的平均肿瘤体积(在植入后19天)时起始外(参见实施例10)。再一次地，即使在1mg/注射的剂量下，mAb806对亲本U87MG异种移植物的生长也没有作用(图10A)。
相比之下，mAb806以剂量依赖性方式显著抑制U87MG.Δ2-7异种移植物的生长(图10B)。
3
在第17天时，在对照动物被处死前一天，平均肿瘤体积对于对照组是900±200mm，对于
3 3
0.1mg/注射组是400±60mm(p＜0.01)，并且对于1mg注射组是220±60mm(p＜0.002)。
用IgG2b同种型对照处理U87MG.Δ2-7异种移植物对肿瘤生长没有作用(数据未显示)。
种移植物已达到65mm的平均肿瘤体积(在植入后10天)并且对于亲本U87MG异种移植物
3
已达到84mm的平均肿瘤体积(在植入后19天)时起始外(参见实施例10)。再一次地，即使在1mg/注射的剂量下，mAb806对亲本U87MG异种移植物的生长也没有作用(图10A)。
相比之下，mAb806以剂量依赖性方式显著抑制U87MG.Δ2-7异种移植物的生长(图10B)。
3
在第17天时，在对照动物被处死前一天，平均肿瘤体积对于对照组是900±200mm，对于
3 3
0.1mg/注射组是400±60mm(p＜0.01)，并且对于1mg注射组是220±60mm(p＜0.002)。
用IgG2b同种型对照处理U87MG.Δ2-7异种移植物对肿瘤生长没有作用(数据未显示)。
[0682] 为了检查用mAb806观察到的生长抑制是否局限于表达de2-7EGFR的细胞，在建立的模型中检查其针对U87MG.wtEGFR异种移植物的功效。这些细胞充当用于包含EGFR基因3
扩增而无de2-7EGFR表达的肿瘤的模型。当肿瘤已达到73mm的平均肿瘤体积时(在植入后22天)，起始mAb806处理。当与用媒介物处理的对照肿瘤比较时，mAb806显著抑制建立的U87MG.wtEGFR异种移植物的生长(图10C)。在对照动物被处死的当天，平均肿瘤体积对
3 3
于对照组是1000±300mm，并且对于用1mg注射处理的组是500±80mm(P＜0.04)。
扩增而无de2-7EGFR表达的肿瘤的模型。当肿瘤已达到73mm的平均肿瘤体积时(在植入后22天)，起始mAb806处理。当与用媒介物处理的对照肿瘤比较时，mAb806显著抑制建立的U87MG.wtEGFR异种移植物的生长(图10C)。在对照动物被处死的当天，平均肿瘤体积对
3 3
于对照组是1000±300mm，并且对于用1mg注射处理的组是500±80mm(P＜0.04)。
[0683] 为了评估mAb806处理的以及对照U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物之间的潜在组织学差异，用H&E染色福尔马林固定、石蜡包埋的切片(图31)。在来自mAb806处理的U87MG.Δ2-7(mAb806处理的异种移植物在肿瘤接种后24天收集，并且媒介物处理的异种移植物在18天时收集)和U87MG.wtEGFR异种移植物(mAb806异种移植物在肿瘤接种后42天收集，并且媒介物处理的异种移植物在37天时收集；图31)的切片中可见坏死区域。这个结果在许多肿瘤异种移植物(对于每个细胞系，n＝4)中一致地观察到。然而，来自用媒介物处理的U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物(n＝5)的切片未显示在mAb806处理后可见的相同坏死区域(图31)。在等同时间取出的媒介物和mAb806处理的异种移植物也显示肿瘤坏死中的这些差异(数据未显示)。因此，在所观察到的坏死中的增加并非通过用于mAb806处理的异种移植物的更长生长期引起。此外，来自mAb806处理的U87MG异种移植物的切片也用H&E染色，并且未揭示任何坏死区域(数据未显示)，这进一步支持mAb806结合诱导减少的细胞生活力的假定，其导致在肿瘤异种移植物内增加的坏死。
[0684] 执行U87MG、U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物切片的免疫组织化学分析，以测定在mAb806处理后的de2-7和wtEGFR表达水平(图32)。如预期的，528抗体染色所有异种移植物切片，在经处理的和对照肿瘤之间在强度方面无明显减少(图32)。U87MG切片的染色用mAb806是无法检测的；然而，观察到U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物切片的阳性染色(图32)。在对照和经处理的U87MG.Δ2-7和U87MG.wtEGFR异种移植物之间不存在mAb806染色强度方面的差异，暗示抗体处理不导致缺乏mAb806反应性的克隆变体的选择。
[0685] 为了证实mAb806的抗瘤作用不局限于U87MG细胞，将抗体施用于包含A431异种6
移植物的小鼠。这些细胞包含扩增的EGFR基因且表达约2×10受体/细胞。我们先前已显示mAb806结合～10％的这些EGFRs且靶向A431异种移植物(Garcia等人(1993)
Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell along carcinomas.Cancer Res.53，3217-3220)。当在先前描述的预防性异种移植物模型中检查时，mAb806显著抑制A431异种移植物的生长(图11A)。在第13天时，当对照动物被
3
处死时，平均肿瘤体积在媒介物处理的组中是1400±150mm，并且对于1mg/注射处理组
3
是260±60mm(P＜0.0001)。在分开的实验中，0.1mg mAb的剂量在预防模型中也显著(P＜0.05)抑制A431异种移植物的生长(数据未显示)(参见实施例10)。
移植物的小鼠。这些细胞包含扩增的EGFR基因且表达约2×10受体/细胞。我们先前已显示mAb806结合～10％的这些EGFRs且靶向A431异种移植物(Garcia等人(1993)
Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell along carcinomas.Cancer Res.53，3217-3220)。当在先前描述的预防性异种移植物模型中检查时，mAb806显著抑制A431异种移植物的生长(图11A)。在第13天时，当对照动物被
3
处死时，平均肿瘤体积在媒介物处理的组中是1400±150mm，并且对于1mg/注射处理组
3
是260±60mm(P＜0.0001)。在分开的实验中，0.1mg mAb的剂量在预防模型中也显著(P＜0.05)抑制A431异种移植物的生长(数据未显示)(参见实施例10)。
[0686] 考虑到mAb806在预防性A431异种移植物模型中的功效，检查其抑制建立的肿瘤异种移植物的生长的能力。抗体处理如预防模型中所描述，除了它直到肿瘤已达到3
200±20mm的平均肿瘤体积时起始外。mAb806显著抑制建立的A431异种移植物的生长(图
3
11B)。在第13天，即对照动物被处死的当天，平均肿瘤体积对于对照组是1100±100mm，并
3
且对于1mg注射组是450±70mm(P＜0.0001)。
200±20mm的平均肿瘤体积时起始外。mAb806显著抑制建立的A431异种移植物的生长(图
3
11B)。在第13天，即对照动物被处死的当天，平均肿瘤体积对于对照组是1100±100mm，并
3
且对于1mg注射组是450±70mm(P＜0.0001)。
[0687] 实施例19
[0688] 嵌合806抗体的构建、表达和分析
[0689] 嵌合抗体是其中例如小鼠、大鼠或其他物种的重和轻链可变区连接到人重和轻链区上的一类分子。重组产生嵌合抗体。嵌合抗体的一个优点是它们可以减少异种抗原作用，即非人抗体(例如小鼠、大鼠或其他物种)的固有免疫原性。此外，重组制备的嵌合抗体通常可以以大量产生，特别是当利用高水平表达载体时。
[0690] 对于高水平生产，最广泛使用的哺乳动物表达系统是利用通过二氢叶酸还原酶缺陷(″dhfr-″)中国仓鼠卵巢细胞提供的基因扩增程序的那种。该系统是技术人员众所周知的。系统基于二氢叶酸还原酶″dhfr″基因，其编码催化二氢叶酸至四氢叶酸转换的DHFR酶。为了实现高产量，用包含功能DHFR基因连同编码所需蛋白质的基因的表达载体转染dhfr-CHO细胞。在这种情况下，所述蛋白质是重组抗体重链和/或轻链。
[0691] 通过增加竞争性DHFR抑制剂氨甲蝶呤(MTX)的量，重组细胞通过扩增dhfr基因发展抗性。在标准情况下，所采用的扩增单位比dhfr基因的大小大得多，并且因此抗体重链是共扩增的。
[0692] 当需要蛋白质例如抗体链的大规模生产时，表达水平和待采用细胞的稳定性是关键的。在长期培养中，重组CHO细胞群体就其在扩增过程中的特异性抗体生产率而言丧失同质性，即使它们衍生自单个亲本克隆。
[0693] 制备双顺反子表达载体用于在嵌合抗体的重组表达中使用。这些双顺反子表达载体采用“内部核糖体进入位点”或“IRES”。在用于生产嵌合抗EGFR的这些构建体中，免疫球蛋白链和可选标记cDNAs经由IRES连接。IRES是在细胞反式作用因子的帮助下将小核糖体亚单位应答召募至mRNA中的内部起始密码子的顺式作用元件。IRES促进来自多顺反子转录单位的2种或更多种蛋白质在真核细胞中的表达。其中可选标记基因以帽依赖性方式翻译、和目的基因以IRES依赖性方式翻译的双顺反子表达载体的使用已应用于各种实验方法。IRES元件已成功地掺入载体内用于细胞转化、转基因动物的产生、重组蛋白质生产、基因治疗、基因捕获和基因靶向。
[0694] 嵌合抗体806(ch806)构建的概括
[0695] 使用标准分子生物学技术，通过克隆来自亲本鼠杂交瘤的806抗体的VH和VL链生成嵌合806抗体。随后将VH和VL链克隆到pREN哺乳动物表达载体内，其构建在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中阐述，并且转染到CHO(DHFR-/-ve)细胞内用于扩增和表达。简言之，在胰蛋白酶消化后，使用电穿孔在标准条件下，用各10μg LC和HC表达载体共转移6
4×10CHO细胞。在室温的10分钟休眠期后，将细胞加入15ml培养基(10％胎牛血清、次黄嘌呤/胸苷补充物与添加剂)中，且转移至15×10cm细胞培养皿。板随后在正常条件下置于温箱内2天。
4×10CHO细胞。在室温的10分钟休眠期后，将细胞加入15ml培养基(10％胎牛血清、次黄嘌呤/胸苷补充物与添加剂)中，且转移至15×10cm细胞培养皿。板随后在正常条件下置于温箱内2天。
[0696] 在此时，庆大霉素、5nM氨甲蝶呤的添加，胎牛血清由透析胎牛血清的替换和次黄嘌呤/胸苷的去除起始用LC和HC成功转染的克隆从培养基的选择。在转染后第17天时，挑选且筛选在选择下生长的个别克隆用于表达嵌合806抗体。ELISA用于筛选，并且由用变性可溶性EGF受体(已知变性EGFR允许806结合)包被ELISA板组成。这种测定允许筛选通过个别克隆的生产水平以及也允许待筛选抗体的功能性。所有克隆都显示是功能生产性ch806，并且获得最佳生产者且扩展用于扩增。为了扩增生产的ch806水平，对最高生产克隆实施在更高氨甲蝶呤浓度(100nM与5nM比较)下的再选择。这使用上述程序进行。
[0697] 在100nM MTX下 生 长的 克 隆 随 后在 Biological Production Facility，Ludwig Institute，Melbourne，澳大利亚上传代，用于测量生产水平，断绝血清，细胞分库(banking)。细胞系已显示在滚瓶中稳定产生～10mg/升。
[0698] pREN ch806LC neo载体的核酸序列在SEQ ID NO：7中提供。pREN ch806HC DHFR载体的核酸序列在SEQ ID NO：8中提供。
[0699] 图33描述了采用IRES的载体pREN-HC和pREN-LC。在于2002年2月13日提交的共同未决的美国专利申请号60/355,838中描述且公开了pREN双顺反子载体系统，其整体引入本文作为参考。
[0700] 通过FACS分析评价ch806，以证实嵌合806展示与鼠亲本抗体的结合特异性相同的结合特异性。使用野生型细胞(U87MG亲本细胞)、超表达EGF受体的细胞(A431细胞和UA87.wtEGFR细胞)和UA87.Δ2-7细胞(数据未显示)执行分析。使用超表达EGFR的细胞和表达de2-7EGFR的细胞获得mAb806和ch806的相似结合特异性。在野生型细胞中未观察9 -1
到结合。Scatchard分析揭示使用U87MGde2-7细胞对于放射性标记的ch806的6.4×10M的结合亲和力(数据未显示)。
到结合。Scatchard分析揭示使用U87MGde2-7细胞对于放射性标记的ch806的6.4×10M的结合亲和力(数据未显示)。
[0701] 在荷有U87MG-de2-7异种移植物肿瘤的BALB/c裸鼠中执行ch806抗体的生物分布分析，并且结果显示于图34中。小鼠用5μg放射性标记的抗体进行注射，并且在8、24、48和74小时以4只/时间点的组处死。收集器官，称重且在γ计数器中测量放射性。与
111 123
在74小时时间段内具有高肿瘤摄取和累积肿瘤保留的 In标记的ch806比较，I标记的
111
ch806展示对于肿瘤减少的靶向。在74小时时，In标记的抗体展示约30％ID/克组织和
111
4.0的肿瘤血液比(图35)。 In标记的ch806显示在肝脏、脾和肾中的某些非特异性保留。这对于这种同种型的使用是共同的，并且随着时间而降低，这支持这种结合对于ch806
111
是非特异性的且是由于 In结合的观点。
111 123
在74小时时间段内具有高肿瘤摄取和累积肿瘤保留的 In标记的ch806比较，I标记的
111
ch806展示对于肿瘤减少的靶向。在74小时时，In标记的抗体展示约30％ID/克组织和
111
4.0的肿瘤血液比(图35)。 In标记的ch806显示在肝脏、脾和肾中的某些非特异性保留。这对于这种同种型的使用是共同的，并且随着时间而降低，这支持这种结合对于ch806
111
是非特异性的且是由于 In结合的观点。
[0702] 在建立的肿瘤模型中对于治疗功效评价嵌合抗体ch806。将在100μl PBS中的6
3×10U87MG.Δ2-7细胞皮下接种到4-6周龄雌性裸鼠(Animal Research Centre，Western Australia，澳大利亚)的双侧胁腹内。包括mAb806作为阳性对照。结果在图36中描述。
3
处理肿瘤已达到50mm的平均体积时开始，并且由在所示天数时腹膜内给予的1mg ch806或
2 3
mAb806、总共5次注射组成。使用公式(长度×宽度 )/2测定以mm表示的肿瘤体积，其中长度是最长轴，并且宽度是与长度成直角的测量。对于每个处理组，数据表示为平均肿瘤体积+/-S.E.。ch806和mAb806展示针对U87MG.Δ2-7异种移植物几乎等同的抗瘤活性。
3×10U87MG.Δ2-7细胞皮下接种到4-6周龄雌性裸鼠(Animal Research Centre，Western Australia，澳大利亚)的双侧胁腹内。包括mAb806作为阳性对照。结果在图36中描述。
3
处理肿瘤已达到50mm的平均体积时开始，并且由在所示天数时腹膜内给予的1mg ch806或
2 3
mAb806、总共5次注射组成。使用公式(长度×宽度 )/2测定以mm表示的肿瘤体积，其中长度是最长轴，并且宽度是与长度成直角的测量。对于每个处理组，数据表示为平均肿瘤体积+/-S.E.。ch806和mAb806展示针对U87MG.Δ2-7异种移植物几乎等同的抗瘤活性。
[0703] Ch806免疫效应子功能的分析
[0704] 材料与方法
[0705] 抗体和细胞系
[0706] 通 过 Biological Production Facility，Ludwig Institute for Cancer Research，Melbourne，澳大利亚，制备鼠抗de2-7EGFR单克隆抗体mAb806、嵌合抗体ch806(IgG1)和对照同种型匹配的嵌合抗G250单克隆抗体cG250。补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定利用U87MG.de2-7和A431细胞作为靶细胞。先前描述的U87MG.de2-7细胞系是由包含de2-7EGFR的逆转录病毒转染的人星形细胞瘤细胞系(Nishikawa等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，7727-31)。人鳞状癌A431细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。所有细胞系在具有Glutamax的DMEM/F-12(Life Technologies，Melbourne，澳大利亚)中培养，所述DMEM/F-12补充有10％热灭活FCS(CSL，Melbourne，澳大利亚)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。为了维持对于逆转录病毒转染的U87MG.de2-7细胞的选择，在培养基中包括400μg/ml G418。
[0707] 人外周血单核细胞(PBMC)效应细胞的制备
[0708] 从健康志愿者供体血液中分离PBMCs。通过在Ficoll-Hypaque(ICN Biomedical Inc.，Ohio，USA)上的密度离心分级分离肝素化全血。收集PBMC级分，并且用包含5％热灭+活FCS，补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640洗涤3次。
[0709] 靶细胞的制备
[0710] 通过先前公开方法(Nelson，D.L.等人(1991)In：J.E.Colignan，A.M.Kruisbeek，D.D.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober(编辑)，Current Protocols in Immunology，第7.27.1.页New York：Greene Publishing Wiley Interscience)的修饰，执行CDC和ADCC
6 51
测定。简言之，5×10靶U87MG.de2-7和A431细胞用50μCi Cr(Geneworks，Adelaide，澳
6
大利亚)/1×10细胞进行标记，并且在37℃温育2小时。细胞随后用PBS(0.05M，pH 7.4)
4
洗涤3次，并且第四次洗涤应用培养基。将标记细胞的等分试样(1×10细胞/50μl)加入96孔微量滴定板(NUNC，Roskilde，Denmark)的每个孔中。
6 51
测定。简言之，5×10靶U87MG.de2-7和A431细胞用50μCi Cr(Geneworks，Adelaide，澳
6
大利亚)/1×10细胞进行标记，并且在37℃温育2小时。细胞随后用PBS(0.05M，pH 7.4)
4
洗涤3次，并且第四次洗涤应用培养基。将标记细胞的等分试样(1×10细胞/50μl)加入96孔微量滴定板(NUNC，Roskilde，Denmark)的每个孔中。
[0711] CDC测定
[0712] 向50μl标记的靶细胞中，在浓度范围0.00315-10μg/ml内一式三份加入50μl ch806或同种型对照抗体cG250，并且在冰上温育5分钟。随后加入50μl新鲜制备的健康供体补体(血清)，以获得1∶3的血清最终稀释度。微量滴定板在37℃温育4小时。51
在离心后，计数在上清液中释放的 Cr(Cobra II自动化γ计数器，Canberra Packard，
51
Melbourne，澳大利亚)。从实验 Cr释放、总(50μl靶细胞+100μl 10％Tween 20)和自发(50μl靶细胞+100μl培养基)释放中计算特异性裂解百分率。
在离心后，计数在上清液中释放的 Cr(Cobra II自动化γ计数器，Canberra Packard，
51
Melbourne，澳大利亚)。从实验 Cr释放、总(50μl靶细胞+100μl 10％Tween 20)和自发(50μl靶细胞+100μl培养基)释放中计算特异性裂解百分率。
[0713] ADCC测定
[0714] 通过2个4小时51lCt释放测定测量由健康供体PBMCs实现的ch806介导的ADCC。在第一个测定中，标记的靶细胞与效应细胞在96孔“U”形底微量滴定板(NUNC，Roskilde，Denmark)中以50∶1的效应子/靶(E∶T)细胞比铺板。对于ADCC活性测量，将0.00315-10μg/ml(终浓度)测试和对照抗体一式三份地加入每个孔中。在第二个ADCC测定中，将ch806的ADCC活性在一系列的效应子：靶细胞比内与亲本鼠mAb806比较，其中测试抗体浓度恒定在1μg/ml。在2个测定中，将微量滴定板在37℃温育4小时，并且随后
51
从每个孔中收获50μl上清液，并且通过γ计数测定释放的 Cr(Cobra II自动化γ计数器，Canberra Packard，Melbourne，澳大利亚)。在测定中包括对照用于校正自发释放(单独的培养基)和总释放(10％Tween20/PBS)。平行运行应用相同亚类抗体的合适对照。
51
从每个孔中收获50μl上清液，并且通过γ计数测定释放的 Cr(Cobra II自动化γ计数器，Canberra Packard，Melbourne，澳大利亚)。在测定中包括对照用于校正自发释放(单独的培养基)和总释放(10％Tween20/PBS)。平行运行应用相同亚类抗体的合适对照。
[0715] 根据下式计算细胞裂解百分率(细胞毒性)：
[0716]
[0717] 细胞毒性百分比(％)针对抗体浓度(μg/ml)进行描绘。
[0718] 结果
[0719] CDC分析的结果在图37中呈现。最低CDC活性在高达10μg/ml ch806的存在下观察到，其中CDC与用同种型对照cG250观察到的那种相当。
[0720] 在50∶1 E∶T比下ch806介导的对靶U87MG.de2-7和A431细胞的ADCC在图38中呈现。有效ch806特异性细胞毒性针对靶U87MG.de2-7细胞展示，但最低ADCC由ch806对A431细胞介导。所达到的细胞毒性水平反映在2个细胞群上的ch806结合位点数目。靶U87MG.de2-7细胞表达～1×106de2-7EGFR，其这由ch806特异性识别，而在A431细胞上表达的仅1×106野生型EGFR分子的亚型由ch806识别(参见上文实施例)。
[0721] 执行进一步ADCC分析，以比较由1μg/ml ch806介导的对靶U87MG.de2-7细胞的ADCC与由1μg/ml亲本鼠mAb806实现的ADCC。结果在图39中呈现。mAb806的嵌合化已实现通过亲本鼠mAb实现的ADCC的显著改善，其中在E∶T比25∶1和50∶1下实现大于30％细胞毒性。
[0722] 亲本鼠mAb806免疫效应子功能的缺乏已在嵌合化后得到明显改善。ch806介导良好的ADCC，但最低的CDC活性。
[0723] 实施例20
[0724] 针对嵌合抗体ch806的抗独特型抗体的生成
[0725] 为了帮助mAb806或ch806的临床评估，需要实验室测定以监控抗体的血清药代动力学，且定量针对小鼠-人嵌合抗体的任何免疫应答。生成小鼠单克隆抗独特型抗体(抗ids)，且对于作为ELISA试剂的合适性进行表征用于测量在患者血清样品中的ch806，且在人抗嵌合抗体免疫应答分析中用作阳性对照。这些抗独特型抗体还可以用作治疗或预防疫苗，在患者中生成天然抗EGFR抗体应答。
[0726] 用于生成抗独特型抗体的方法是本领域众所周知的(Chatterjee等人，2001；Uemura等人，1994；Steffens等人，1997；Safa和Foon，2001；Brown和Ling，1988)。
[0727] 简言之，如下生成小鼠单克隆抗独特型抗体(抗ids)。使来自用ch806免疫接种小鼠的脾细胞与SP2/0-AG14浆细胞瘤细胞融合，并且针对与ch806的特异性结合和对于抗原的竞争性结合通过ELISA选择抗体产生杂交瘤(图40)。最初选择了25个杂交瘤，并且指名为LMH-11、-12、-13和-14的4种分泌证实与ch806、mAb806特异性结合，且能够中和ch806或mAb806抗原结合活性的抗体(图41)。ch806/mAb806独特型或CDR区的识别由与纯化多克隆人IgG的交叉反应性的缺乏加以证实。
[0728] 在不存在帮助测定血清样品中的ch806的容易获得的重组抗原de2-7EGFR的情况下，在用于测量临床样品中的ch806的敏感性、特异性ELISA的开发中，采用新抗独特型ch806抗体同时结合806可变区的能力(图42)。使用LMH-12用于捕获和生物素化的LMH-12用于检测，验证的ELISA证实用于测量血清中的ch806(2μg/ml-1.6ng/ml)的可高度再现结合曲线，具有3ng/ml检测极限。(n＝12；1-100ng/ml，变异系数＜25％；100ng/ml-5μg/ml，变异系数＜15％)。对于测试的3个健康供体血清，本底结合不是明显的，并且对于同种型对照hu3S193，观察到可忽略不计的结合。杂交瘤测试高水平的抗体LMH-12，并且计划更大规模的产生，以使得能够测量ch806且定量在临床样品中的任何免疫应答(Brown和Ling，1988)。
[0729] 结果
[0730] 小鼠免疫接种和免疫接种前和后血清样品的杂交瘤克隆选择免疫反应性指示高滴度小鼠抗ch806和抗huIgG mAbs的发展。最初选择产生结合ch806而不是huIgG的抗体的25个杂交瘤。这些杂交瘤中的一些的结合特征在图42A和42B中显示。随后通过有限稀释对于来自单细胞的克隆扩增追踪具有高亲和力结合的这些抗ch806杂交瘤中的4个(克隆3E3、SB8、9D6和4D8)，并且分别指名为Ludwig Institute for Cancer Research Melbourne Hybridoma(LMH)-11、-12、-13和-14(图42)。
[0731] 所选择的抗独特型抗体的结合和阻断活性
[0732] 抗ch806抗体同时结合2种ch806抗体的能力是其在用于测定血清ch806水平的ELISA中作为试剂使用的希望特征。克隆杂交瘤LMH-11、-12、-13和-14证实同时结合(数据未显示)。
[0733] 在克隆扩增后，用sEGFR621对于中和ch806或mAb806抗原结合活性的能力，通过ELISA检查杂交瘤培养上清液。结果证实抗独特型mAbs LMH-11、-12、-13和-14的拮抗活性，其在溶液中阻断ch806和鼠mAb806与用sEGFR包被的板结合(对于LMH-11、-12、-13，见图41)。
[0734] 在滚瓶中的更大规模培养后，通过ELISA验证建立的克隆杂交瘤LMH-11、-12、-13和-14的结合特异性。通过小鼠单克隆抗体同种分型试剂盒，将LMH-11到-14抗体鉴定为同种型IgG1κ。
[0735] 在临床血清样品中的ch806药代动力学ELISA测定开发
[0736] 为了帮助测定血清样品中的ch806，在用于临床样品中的ch806的灵敏性和特异性ELISA测定的开发中利用抗独特型ch806抗体同时结合806可变区的能力。3个纯化克隆LMH-11、-12和-13(图49B和49C分别就其捕获且随后检测血清中结合的ch806的能力比较。结果指示使用LMH-12(10μg/ml)用于捕获和生物素化的LMH-12用于检测获得对于血清中ch806的最高灵敏度(3ng/ml)，其具有可忽略不计的本底结合。
[0737] 已分别使用1μg/ml抗独特型LMH-12和1μg/ml生物素化的LMH-12用于捕获和检测，建立了最佳药代动力学ELISA条件，执行方法的验证。一式四份地执行3次分开的ELISAs，以用同种型对照hu3S193测量来自3个健康供体的供体血清或1％BSA/培养基中的ch806。验证结果在图43中呈现，并且证实用于测量血清中的ch806(2μg/ml-1.6ng/ml)的可高度再现结合曲线，具有3ng/ml的检测极限。(n＝12；1-100ng/ml，变异系数＜25％；100ng/ml-5μg/ml，变异系数＜15％)。对于测试的3种血清中的任何，本底结合都不是明显的，并且对于同种型对照hu3S193，观察到可忽略不计的结合。
[0738] 实施例21
[0739] 碳水化合物结构的评价和抗体识别
[0740] 进行实验以进一步评价碳水化合物结构在EGFR(扩增的和de2-7EGFR)通过mAb806抗体的结合和识别中的作用。
[0741] 为了测定碳水化合物结构是否直接涉及mAb806表位，用PNGase F处理在CHO细胞中表达的重组sEGFR，以去除N联糖基化。在处理后，蛋白质在SDS-PAGE上运行，转移至膜且用mAb806免疫印迹(图44)。如预期的，去糖基化sEGFR在SDS-PAGE上更快速运行，指示碳水化合物已成功地去除。mAb806抗体明确结合去糖基化的材料，证实抗体表位在性质中是肽而不仅仅是糖基化表位。
[0742] 用针对EGFR的不同抗体免疫沉淀由用35S代谢标记的细胞系制备的裂解物(图45)。如预期的，528抗体免疫沉淀来自U87MG.Δ2-7细胞的3个条带，上面条带对应于野生型(wt)EGFR，并且2个下面条带对应于de2-7EGFR。这2个de2-7EGFR条带先前已得到报道，并且假定代表差异糖基化(Chu等人(1997)Biochem.J.Jun 15；324(Pt3)：885-861)。
相比之下，mAb806仅免疫沉淀2个de2-7EGFR条带，其中野生型受体即使在过度暴露后也完全不存在(数据未显示)。令人感兴趣的是，当与528抗体比较时，mAb806显示与下面de2-7EGFR条带增加的相对活性，但与上面条带减少的反应性。SC-03抗体，即针对EGFR的C末端结构域的商业兔多克隆抗体，免疫沉淀如用528抗体可见的3个EGFR条带，尽管由这种抗体免疫沉淀的受体总量明显更少。当使用无关IgG2b抗体作为用于mAb806的对照时，未观察到条带(参见实施例18)。
相比之下，mAb806仅免疫沉淀2个de2-7EGFR条带，其中野生型受体即使在过度暴露后也完全不存在(数据未显示)。令人感兴趣的是，当与528抗体比较时，mAb806显示与下面de2-7EGFR条带增加的相对活性，但与上面条带减少的反应性。SC-03抗体，即针对EGFR的C末端结构域的商业兔多克隆抗体，免疫沉淀如用528抗体可见的3个EGFR条带，尽管由这种抗体免疫沉淀的受体总量明显更少。当使用无关IgG2b抗体作为用于mAb806的对照时，未观察到条带(参见实施例18)。
[0743] 528抗体免疫沉淀来自U87MG.wtEGFR细胞的与野生型受体对应的单一条带(图45)。mAb806还免疫沉淀来自这些细胞的单一条带，然而，这个EGFR条带比528反应受体明显更快速地迁移。SC-03抗体免疫沉淀来自U87MG.wtEGFR细胞的2个EGFR反应条带，进一步证实mAb806和528识别在来自这些细胞的全细胞裂解物中不同形式的EGFR。
[0744] 如用U87MG.wtEGFR细胞观察到的，528抗体免疫沉淀来自A431细胞的单一EGFR条带(图45)。528反应EGFR条带在这些低百分率凝胶(6％)上是非常宽的，并且可能反映受体糖基化的多样性。在用mAb806免疫沉淀后也可见单一EGFR条带。虽然与528总体宽反应条带比较，这个EGFR条带并不相当快速地迁移，但它以可再现性方式定位于宽528条带的前缘。与U87MG.Δ2-7细胞裂解物不同，来自A431裂解物由mAb806免疫沉淀的EGFR总量大大少于用应用528抗体，该结果与显示mAb806仅识别这些细胞表面上的部分EGFR的我们Scatchard数据一致(参见实施例4)。用SC-03的免疫沉淀导致关于528抗体的单一宽EGFR条带。类似结果用NH5细胞获得(数据未显示)。总之，这个数据指示mAb806与EGFR的更快速迁移种类优先反应，这可能代表差异糖基化形式的受体。
[0745] 为了测定mAb806反应性在受体加工的哪个阶段出现，进行脉冲/跟踪实验。A43135
和U87MG.Δ2-7细胞用 S甲硫氨酸/半胱氨酸脉冲5分钟，随后在用mAb806或528免疫沉淀前在37℃温育各个时间(图46)。在A431细胞中用528抗体的免疫沉淀模式对于EGFR特异性的构象依赖性抗体是典型的。少量受体在0分钟时(即在5分钟脉冲后)进行免疫沉淀，其中标记的EGFR的量在每个时间点增加。在受体的分子量方面也存在随着时间的同时增加。相比之下，mAb806反应性EGFR材料在0分钟时以高水平存在，在20分钟时达到峰值，并且随后在每个进一步时间点减少。因此，看起来mAb806优先识别在加工的早期阶段发现的EGFR形式。
和U87MG.Δ2-7细胞用 S甲硫氨酸/半胱氨酸脉冲5分钟，随后在用mAb806或528免疫沉淀前在37℃温育各个时间(图46)。在A431细胞中用528抗体的免疫沉淀模式对于EGFR特异性的构象依赖性抗体是典型的。少量受体在0分钟时(即在5分钟脉冲后)进行免疫沉淀，其中标记的EGFR的量在每个时间点增加。在受体的分子量方面也存在随着时间的同时增加。相比之下，mAb806反应性EGFR材料在0分钟时以高水平存在，在20分钟时达到峰值，并且随后在每个进一步时间点减少。因此，看起来mAb806优先识别在加工的早期阶段发现的EGFR形式。
[0746] 在脉冲标记的U87MG.Δ2-7细胞中观察到的抗体反应性更复杂。在0分钟时用528抗体的免疫沉淀揭示小量下面de2-7EGFR条带被标记(图46)。528反应性de2-7EGFR下面条带的量随着时间增加，在60分钟时达到峰值，并且在2和4小时时缓慢下降。直到
60分钟时也未检测到显著量的标记的de2-7EGFR上面条带，这之后水平继续增加直到时程结束。这明确指示上面de2-7EGFR是更成熟形式的受体。mAb806反应性也在时间过程研究期间改变，然而，mAb806优先沉淀de2-7EGFR的下面条带。事实上，直到标记后4小时也未见显著水平的mAb806上面条带。
60分钟时也未检测到显著量的标记的de2-7EGFR上面条带，这之后水平继续增加直到时程结束。这明确指示上面de2-7EGFR是更成熟形式的受体。mAb806反应性也在时间过程研究期间改变，然而，mAb806优先沉淀de2-7EGFR的下面条带。事实上，直到标记后4小时也未见显著水平的mAb806上面条带。
[0747] 上文实验暗示mAb806与更未成熟糖基化形式的de2-7和wtEGFR优先反应。通过35
免疫沉淀来自用 S甲硫氨酸/半胱氨酸标记过夜的不同细胞系的EGFR，并且随后对所得到的沉淀物实施内切糖苷酶H(Endo H)消化，测试这种可能性。这种酶优先去除来自蛋白质的高甘露糖型碳水化合物(即未成熟的糖基化)，同时留下完整的复合糖(即成熟的糖基化)。标记的U87MG.Δ2-7细胞裂解物用528、mAb806和SC-03的免疫沉淀和用Endo H的消化给出相似结果(图47)。
免疫沉淀来自用 S甲硫氨酸/半胱氨酸标记过夜的不同细胞系的EGFR，并且随后对所得到的沉淀物实施内切糖苷酶H(Endo H)消化，测试这种可能性。这种酶优先去除来自蛋白质的高甘露糖型碳水化合物(即未成熟的糖基化)，同时留下完整的复合糖(即成熟的糖基化)。标记的U87MG.Δ2-7细胞裂解物用528、mAb806和SC-03的免疫沉淀和用Endo H的消化给出相似结果(图47)。
[0748] 如预期的，下面de2-7EGFR条带对Endo H于消化是完全敏感的，在Endo H消化后在SDS-PAGE上更快速地迁移，证实这个条带代表高甘露糖形式的de2-7EGFR。上面de2-7EGFR条带对于Endo H消化是基本上抵抗的，在Endo H消化后仅显示出在迁移中非常轻微的差异，指示大多数碳水化合物结构具有复杂类型。在酶消化后在上面条带的分子量方面小但可再现的减少暗示，虽然在上面de2-7EGFR条带上的碳水化合物占优势地具有复杂类型，但它的确具有某些高甘露糖结构。令人感兴趣的是，这些细胞还表达少量内源wtEGFR，这在528免疫沉淀后明确可见。在Endo H消化后在野生型受体的分子量中也存在小但显著的减少，指示它也包含高甘露糖结构。
[0749] 免疫沉淀的wtEGFR对Endo H消化的敏感性在U87MG.wtEGFR和A431细胞中是相似的(图47)。通过528抗体沉淀的大量材料对于Endo H酶是抵抗的，尽管小量材料具有高甘露糖形式。再一次地，在Endo H消化后在wtEGFR的分子量中存在小的减少，暗示它的确包含某些高甘露糖结构。使用SC-03抗体的结果类似于528抗体。相比之下，在U87MG.wtEGFR和A431细胞中由mAb806沉淀的大多数EGFR对Endo H是敏感的，证实mAb806优先识别高甘露糖形式的EGFR。用HN-5细胞获得相似结果，其中由mAb806沉淀的大多数材料对Endo H消化是敏感的，而由mAb528和SC-03沉淀的大多数材料对Endo H消化是抵抗的(数据未显示)。
[0750] 用125I执行A431细胞系的细胞表面碘化，随后用806抗体免疫沉淀。关于表面碘化的方案如下：细胞裂解、免疫沉淀、Endo H消化、SDS PAGE和放射自显影术如本文上文所述。对于标记，细胞在具有10％FCS的培养基中生长，用EDTA解离，用PBS洗涤2次，随6 125
后重悬浮于400μl PBS(约2-3x10细胞)中。向其中加入15μl I(100mCi/ml原液)、
100μl牛乳过氧化物酶(1mg/ml)原液、10μl H2O2(0.1％原液)，并且使其温育5分钟。随后加入另外的10μl H2O2，并且温育进一步继续3分钟。细胞随后用PBS再洗涤3次，并且在1％Triton中裂解。A431细胞系用乳过氧化物酶的细胞表面碘化、随后用806抗体的免疫沉淀显示，类似于上文描述的全细胞裂解物，在A431细胞的细胞表面上由结合的806识别的占优势形式EGFR对EndoH消化是敏感的(图48)。这证实在A431细胞的细胞表面上由806结合的EGFR形式是EndoH敏感形式，并且因此是高甘露糖类型。
后重悬浮于400μl PBS(约2-3x10细胞)中。向其中加入15μl I(100mCi/ml原液)、
100μl牛乳过氧化物酶(1mg/ml)原液、10μl H2O2(0.1％原液)，并且使其温育5分钟。随后加入另外的10μl H2O2，并且温育进一步继续3分钟。细胞随后用PBS再洗涤3次，并且在1％Triton中裂解。A431细胞系用乳过氧化物酶的细胞表面碘化、随后用806抗体的免疫沉淀显示，类似于上文描述的全细胞裂解物，在A431细胞的细胞表面上由结合的806识别的占优势形式EGFR对EndoH消化是敏感的(图48)。这证实在A431细胞的细胞表面上由806结合的EGFR形式是EndoH敏感形式，并且因此是高甘露糖类型。
[0751] 实施例22
[0752] 人源化(镶嵌)抗体806
[0753] A.hu806构建
[0754] 构建用于人源化806抗体(hu806)的表达载体。命名为8C65AAG(11891bp；SEQ ID NO：41)的载体设计为在单一GS启动子驱动的基因表达盒中包含关于全长hu806的2种基因(图53和54)。
[0755] 重链可变(VH)和恒定(CH)区(分别为SEQ ID NOS：42和43)在图55A中显示，其中VH区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：44、45和46)由下划线指示。
[0756] 轻链可变(VL)和恒定(CL)区(分别为SEQ ID NOS：47和48)在图55B中显示，其中VL区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：49、50和51)由下划线指示。
[0757] 为了获得人源化806抗体构建体，采用镶嵌(v)技术(Daugherty等人(1991)Polymerase chain reaction facilitates the cloning，CDR-grafting，and rapid exptession of a murine monoclonal antibody directed against the CD 18component of leukocyte integrins.Nucleic Acids Res.19(9)，2471-6；美国 专 利 6,797,492to Daugherty；Padlan，E.A.(1991)A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.Mol.Immunol.28(4-5)，489-98；European Patent No.519596to Padlan等人)。为了使806抗体可变结构域的免疫原性降到最低，同时保存配体结合性质，进行在构架区中不同于人抗体中通常发现那些的表面暴露残基的替换。为了实现这点，小鼠单克隆抗体(mAb)806的VL和VH链已通过基因合成和重叠PCR引物技术进行再改造。CL(κ)链以这种方式进行装配。为了证实完整结合位点的保存，vVL和vVH也以scFv形式表达，所述scFv形式通过ELISA证实与包括806抗原表位的合成肽的良好结合，和与重组EGF受体(EGFR)细胞外结构域(ECD)的良好结合，如通过表面等离子体共振(SPR)分析测量的。
[0758] 使用密码子优化的κ-LC和新设计的密码子和剪接位点优化的人IgG1重链恒定区，v806VL和v806VH已改造到全长人IgG1背景内，以达到在NS0和CHO细胞系统中的稳定基因表达。表达系统基于LONZA GS表达系统，其使用如由LONZA Biologics提供的pEE12.4和pEE6.4重和轻链表达载体。
[0759] 通过8C65AAG载体的瞬时表达获得的hu806抗体产物(图55)通过SPR与重组EGFR-ECD反应，并且通过ELISA与合成EGFR 806肽表位反应。将8C65AAG载体转移至LICR Affiliate Christoph Renner(University of Zurich)，用于生成稳定GS-NS0 hu806细胞系，且转移至LICR，Melbourne Centre，用于生成GS-CHO hu806细胞系。
[0760] 用于hu806抗体基因构建、扩增和克隆的策略
[0761] 镶嵌和密码子优化
[0762] 抗体镶嵌是旨在对抗HAMA(人抗小鼠抗体)应答的人源化策略。小鼠mAbs被患者的免疫系统视为“外来”抗原，并且即使在单次施用后也诱导免疫应答，阻止试剂在这些患者中的进一步使用。在mAb806镶嵌过程的第一个步骤中，分析在mAb806中的VL和VH链的氨基酸序列，并且对于表面暴露分级mAb806蛋白质序列中的每个氨基酸残基(图56和图57)。仅将位于抗体分子外的那些氨基酸考虑用于可能的修饰，因为这些是将暴露于抗体识别的唯一氨基酸。使用BLAST，比较mAb806蛋白质序列与3种人抗体序列(VH36germ、CAD26810和AAA37941)。无论何时mAb806表面残基不匹配人抗体序列的共有区，该残基被鉴定为待改变成共有序列。最初对ch806的VL中的12个、和VH链中的14个氨基酸实施镶嵌(图56和图57)。
[0763] 密码子优化是基于用于表达这些抗体的系统的密码子偏爱改善抗体或其他蛋白质的异源表达的方法。在hu806制备中的目标之一是利用密码子优化，以改善对于这种抗体的表达水平。表达系统基于使用如由LONZA Biologics提供的pEE12.4和pEE6.4HC和LC表达载体的LONZA GS表达系统，以及NS0和/或CHO细胞作为生产细胞。因此，考虑密码子在NS0/CHO表达系统中是否是有利的，做出关于哪个密码子用于给定氨基酸的决定。
[0764] 通过PCR的806DNA序列构建和扩增
[0765] 以下述方式合成关于镶嵌的、密码子优化形式的hu806抗体可变重(VH)和可变轻(VL)区域的序列：对于每个区域(VH或VL)，8-10个寡核苷酸设计为重叠有义和反义引物。这些寡核苷酸将以此类方式彼此重叠，以便覆盖整个hu806VH或VL序列，包括信号序列、编码序列、内含子，并且包括在5′末端的HindIII位点和在3′末端的3’BamHI位点。寡核苷酸图在图56B和57B中呈现，并且引物细节在下文提供。
[0766] 简言之，如下通过PCR装配hu806VH或VL：最初在3次分开反应中组合v806hc-或v806lc-寡核苷酸1、2、3、4，寡核苷酸5、6和寡核苷酸7、8、9、10。每种侧面寡核苷酸的等分试样(50pmol)和5pmol每种内部寡核苷酸加入包含25μl 2×HotStar Taq Master Mix(Qiagen)和48μl无核酸酶水的50μl PCR反应中。热循环程序如下：95℃；15”，[94℃；30”，58℃；30”，72℃；30”]×20个循环，72℃；10”，4℃。这3次反应的产物在通过凝胶电泳分离后切除。它们随后使用盐柱(Qiagen-Qiaspin Minipreps)纯化且组合。这些产物通过PCR使用引物1和10进一步扩增。这个第二个反应的产物包括关于HindIII和BamHI的限制酶位点，使得能够插入表达质粒内。
[0767] 用于PCR合成hu806V区的寡核苷酸：
[0768]
[0769] hu806CL：
[0770] 以类似于用于可变区那种的方式制备密码子优化形式的恒定κ轻链(CL)。然而，最初PCR步骤涉及仅2种初步产物的制备，其使用寡核苷酸VKlcons-1、2、3、4；和5、6、7、8。此外，在质粒插入前，关于这种产物的侧面限制位点是BamHI和NotI。
[0771] 用于PCR合成hu806CL区的寡核苷酸：
[0772]
[0773] hu806CH：
[0774] 合成的、人源化形式的IgG1恒定重链(CH)基因(SEQ ID NO：80)购自GeneArt，Regensburg，德国。基因对于在CHO/NS0细胞中的表达进行密码子优化。基因序列、限制位点等的细节在图58中显示。
[0775] 表达质粒的构建
[0776] 对于瞬时转染和初步测试，将以上文描述方式制备的hu806VH和VL序列连接到包含一般恒定区的表达载体内。由LICR Affiliate Christoph Renner(University of Zurich，Switzerland)提供的这些载体被称为pEAK8HC(其包含一般CH)和a33-xm-lc(其包含一般CL)。在CIP的存在下使用BamHI和HindIII消化载体，随后将hu806VH和VL连接到相应载体内。根据制造商的说明书，将所得到的质粒用于转化Top10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)。经转化的大肠杆菌在LB+氨苄青霉素板上铺板，并且通过限制性消化和PCR筛选抗性克隆。一般而言，将分离且进一步扩增以这种方式检测的8个阳性克隆。通过自动化DNA测序分析从这些菌落中纯化的DNA。
[0777] 使用BamHI和NotI通过限制酶消化和连接，将密码子优化形式的恒定区加入这些载体中。如上所述选择、测序且分析这些转化体。在全长抗体链连接到Lonza GS系统内之前，在一种情况下，通过使用BamHI消化、使用DNA聚合酶填入和平端连接，破坏在可变和恒定区序列之间的BamHI位点。
[0778] 然后用NotI随后为HindIII消化包含hu806(VH+CH)或hu806(VL+CL)的限制性片段。这些消化物设计为产生在NotI位点的平端，并且因此以下述方式连续完成：首先用NotI消化质粒。使用1％琼脂糖凝胶通过电泳分离完全消化的(单切)质粒。随后切除这种产物且在盐柱上纯化，且使用DNA聚合酶填入。这种反应的产物是盐柱纯化的且随后用HindIII消化。随后通过凝胶电泳分离，切除且纯化这种产物(对于hu806(VH+CH)～1.3Kb，和对于hu806(VL+CL～0.8Kb)。
[0779] 载体pEEl2.4和pEE6.4(Lonza Biologics plc，Slough，UK)各自在HindIII和PmlI上消化。使hu806(VH+CH)与pEE12.4连接，以制备pEE12.4-hu806H，并且使hu806(VL+CL)与pEE6.4连接，以制备pEE6.4-hu806L。
[0780] 在筛选后，制备组合的、双重基因Lonza质粒，以包含hu806重和轻链序列。简言之，用NotI和SalI限制酶消化pEE12.4-hu806H和pEE6.4-hu806L载体。使所产生的片段分离且连接在一起，所述所产生的片段包含GS转录单位和hCMV-MIE启动子，随后为hu806重或轻链表达盒。所得到的“组合”Lonza质粒(指名8C65AAG)用于在HEK 293系统中的单一质粒瞬时转染，以及在NS0和CHO系统中的稳定转染。质粒图显示于图53中。
[0781] 对于构建体的修饰
[0782] 在图59和图60中分别显示了与mAb806比较的镶嵌hu806Hc和hu806Lc的全序列验证的氨基酸序列。在附录内侧接hu806序列的是指示最初镶嵌改变的星号(*)，并且数目(1-8)指本文描述的编号修饰编号1到编号8。
[0783] 就图60而言，参考文件(mAb806LC)不正确地指示修饰#1的主题：在位置91上的组氨酸(H)，而不是正确的酪氨酸(Y)。在图60中包括原始、未校正的文件序列，以举例说明在位置91上对hu806做出的必需修饰。
[0784] 在最初构建和测序阶段后，对hu806cDNA序列做出许多修饰。关于做出这些修饰的原因包括：引入4个限制酶位点用于序列修饰目的，以便校正在PCR过程中引入的在序列中的2个氨基酸错误，以便校正起于最初mAb806文件的一个氨基酸错误，和以便改造4个另外氨基酸改变以实现另外镶嵌变体。执行下述8个修饰阶段：
[0785] 1.hu806VI：CDR3H91Y
[0786] 由其制备原始寡核苷酸的文件不正确地陈述在mAb806VL序列的CDR3中在位置91上存在CAC(组氨酸，H)。定点诱变用于生成TAC的正确序列(酪氨酸，Y；专利WO02/092771)。在该位置上在氨基酸序列中的序列改变是从CVQHAQF(SEQ ID NO：84)到CVQYAQF(SEQ ID NO：85)。与ch806比较的最终DNA和翻译蛋白质序列在图61中显示。
[0787] 关于hu806VL区的组氨酸至酪氨酸修饰的有义引物(PDV1；40聚体)
[0788] 5’-CCACATACTACTGCGTCCAGTACGCTCAGTTCCCCTGGAC-3’(SEQ ID NO：86)[0789] 关于hu806VL区的组氨酸至酪氨酸修饰的反义引物(PDV2；20聚体)
[0790] 5’-CTGGACGCAGTAGTATGTGG-3’(SEQ ID NO：87)。
[0791] 2.hu806重链：限制位点DraIII和FseI的添加
[0792] 限制酶位点加入hu806VH和VL区周围的内含子。这些限制位点(在pREN载体系统中独特的，LICR)设计为使对表达盒做出修饰的过程容易。不包括最初信号区的hu806VH序列可以通过在DraIII上的单一消化去除或插入。此外，FseI可以与NotI(pREN系统)或EcoRI(Lonza系统)协调使用，以切掉恒定区，实现来自原始序列的BamHI的功能。
[0793] 这些修饰使用2步PCR过程实现。产物随后用HindIII和BglII进行消化。它们随后连接到包含密码子优化的恒定区的pREN载体内，所述载体已在HindIII和BamHI上进行消化。这种再连接过程破坏BamHI位点。
[0794] 用于第一个DraIII位点上游的可变区的有义引物(806重链DraIII上；26聚体)[0795] 5’-GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTG-3’(SEQ ID NO：88)
[0796] 掺入DraIII位点I的反义引物(806重链DraIII下；28聚体)
[0797] 5’-CACTGGGTGACTGGCTTCGATGGTGACC-3’(SEQ ID NO：89)
[0798] 用于在2个DraIII位点之间的HC可变区的有义引物(806重链DraIII-FseI上；49聚体)
[0799] 5’-GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC-3’(SEQ ID NO：90)[0800] 掺入DraIII位点II和FseI位点的反义引物(806重链DraIII-FseI下；44聚体)[0801] 5’-CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC-3’(SEQ ID NO：91)。
[0802] 3.hu806轻链：限制位点RsrII和PacI的添加
[0803] 对于hu806轻链，加入的限制位点是具有与重链中的DraIII相同功能的RsrII，和匹配FseI的功能的PacI。
[0804] 用于第一个RsrII位点上游的可变区的有义引物(806轻链RsrII上；22聚体)[0805] 5’-GAGAAGCTTGCCGCCACCATGG-3’(SEQ ID NO：92)
[0806] 掺入RsrII位点I的反义引物(806轻链RsrII下；25聚体)
[0807] 5’-CGGTCCGCCCCCTTGACTGGCTTCG-3’(SEQ ID NO：93)
[0808] 用于在2个RsrII位点之间的LC可变区的有义引物(806轻链RsrII-PacI上；45聚体)
[0809] 5’-CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC-3’(SEQ ID NO：94)[0810] 掺入RsrII位点II和PacI位点的反义引物(806轻链RsrII-PacI下：50聚体)[0811] 5’-CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG-3’(SEQ ID NO：95)。
[0812] 4.hu806VH：再镶嵌P85A
[0813] 关于亲本mAb806在VH氨基酸81-87上的蛋白质序列是SVTIEDT(SEQ ID NO：96)。作为镶嵌过程的部分，在位置84和85上的异亮氨酸和谷氨酸改变成丙氨酸-脯氨酸，以阅读为SVTAPDT(SEQ ID NO：97；图56)。在进一步分析后，决定在这种情况下丙氨酸可能是比脯氨酸更好的选择。定点诱变用于使用下文列出的引物生成这个二次改变(SVTAADT，SEQ ID NO：98)。最终DNA和翻译的蛋白质序列在图62中呈现。
[0814] 有义引物(Fx3；49聚体)
[0815] 5’-CTGCAGCTGAACTCCGTTACAGCCGCAGACACAGCAACATATTACTGCG-3’(SEQ ID NO：99)[0816] 反义引物(Fx4；49聚体)
[0817] 5’-CGCAGTAATATGTTGCTGTGTCTGCGGCTGTAACGGAGTTCAGCTGCAG-3’(SEQ ID NO：100)。
[0818] 5.hu806VH：另外镶嵌
[0819] hu806重链可变区序列在最初镶嵌后进行3个进一步突变：T70S、S76N和Q81K。在位置76上从丝氨酸到天冬酰胺的改变代表对mAb806分子的原始序列的校正回复。包括在框架中的另外改变，因为它们代表在小鼠抗体中未发现但在人抗体中发现的残基。相应地，蛋白质序列TRDTSKSQFFLQ(SEQ ID NO：101)镶嵌为SRDTSKNQFFLK(SEQ ID NO：102)。与mAb806比较的最终DNA和翻译的蛋白质序列在图62中呈现。
[0820] 用于HC可变区5’PCR片段的有义引物(hu806HCfx2-5p-U；49聚体)
[0821] 5’-GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC-3’(SEQ ID NO：103)
[0822] 用于5’PCR片段的反义引物，掺入前2个改变(hu806HCfx2-5p-D；45聚体)[0823] 5’-GATTCTTCGACGTGTCCCTTGAGATTGTGATCCGGCTTTTCAGAG-3’(SEQ ID NO：104)[0824] 用于3’PCR片段的有义引物，掺入所有改变(hu806HCfx2-3p-U；55聚体)[0825] 5’-CAAGGGACACGTCGAAGAATCAGTTCTTCCTGAAACTGAACTCCGTTACAGCCGC-3’(SEQ ID NO：105)
[0826] 用于HC可变区3’PCR片段的反义引物(hu806HCfx2-3p-D；44聚体)
[0827] 5’-CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC-3’(SEQ ID NO：106)。
[0828] 6.hu806VL：E79Q镶嵌
[0829] 这是执行的唯一构建后VL镶嵌修饰。在位置79上采用定点诱变，以校正序列SSLEPE(SEQ ID NO：107)至SSLQPE(SEQ ID NO：108)。与ch806比较的最终DNA和翻译的蛋白质序列在图61中呈现。
[0830] 用于LC可变区5’PCR片段的有义引物(hu806LC-5p-U；45聚体)
[0831] 5’-CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC-3’(SEQ ID NO：109)[0832] 用于5’PCR片段的反义引物，掺入意图突变(hu806LC-5p-D；34聚体)
[0833] 5’-CTCTGGTTGTAAGCTAGAGATGGTCAGTGTATAG-3’(SEQ ID NO：110)
[0834] 用于LC可变区3’PCR片段的有义引物掺入预期突变(hu806LC-3p-U；45聚体)[0835] 5’-CCATCTCTAGCTTACAACCAGAGGACTTTGCCACATACTACTGCG-3’(SEQ ID NO：111)[0836] 用于LC可变区3’PCR片段的反义引物(hu806LC-3p-D；50聚体)
[0837] 5’-CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG-3’(SEQ ID NO：112)。
[0838] 7.hu806轻链：κ恒定区剪接连接修饰
[0839] 需要这个点突变，以校正在密码子优化形式的κ恒定区的剪接中的错误。在这个改变前，从VYACEVTH(SEQ ID NO：113)开始且继续到分子末端的氨基酸链的部分将不包括在最终抗体中(图60)。
[0840] 用于LC恒定κ5’PCR片段的有义引物(F1；21聚体)
[0841] 5’-GGCGGCACAAAACTGGAAATC-3’(SEQ ID NO：114)
[0842] 用于LC恒定κ5’PCR片段的反义引物，掺入校正(F2；59聚体)
[0843] 5′-GATGAGTTACTTCACAGGCATATACTTTGTGCTTTTCATAATCAGCTTTTGACAGTGTC-3′(SEQ ID NO：115)
[0844] 用于LC恒定κ3’PCR片段的有义引物，掺入校正(F3；26聚体)
[0845] 5’-AGTATATGCCTGTGAAGTAACTCATC-3’(SEQ ID NO：116)
[0846] 用于LC恒定κ3’PCR片段的反义引物。(F4；17聚体)
[0847] 5′-GCCACGATGCGTCCGGC-3′(SEQ ID NO：117)。
[0848] 8.hu806VH：N60Q
[0849] 除在构建的最初阶段中对抗体806做出的镶嵌改变外，在VH CDR2中在位置60上的天冬酰胺在这时改变成谷氨酰胺。N-糖基化遵循方案：N X S/T，其中X是任何氨基酸。来自位置60的氨基酸序列是N P S，其遵循这个方案。然而，在用于N-糖基化的X位置上发现脯氨酸(如在我们的例子中)或半胱氨酸是罕见情况。关注的是不一致糖基化可以导致抗体反应性中的变动。因此，去除天冬酰胺，且用其最紧密相关的氨基酸谷氨酰胺替换，去除关于这个位点被糖基化的任何可能性(图59和图62)。
[0850] 镶嵌的hu806抗体8C65AAG构建体的结合
[0851] 执行293FT细胞用最终质粒8C65AAG的瞬时转染，以使得能够制备小数量的hu806用于最初抗原结合验证。合并来自几次小规模重复瞬时转染的培养上清液，浓缩且使用蛋白A层析步骤收集hu806抗体。如通过定量huIgG1 ELISA测量的获得约1-2μg hu806抗体，并且通过Biacore就与重组EGFR-ECD的结合分析抗体(图63)。来自细胞培养基的牛免疫球蛋白与hu806共纯化，并且代表总IgG的主要级分，这限制hu806结合的定量评价。
[0852] 测序引物
[0853] RenVecUPSTREAM：有义引物，在峰8和a33xm载体中的可变区上游开始测序。
[0854] 5’-GCACTTGATGTAATTCTCCTTGG-3’(SEQ ID NO：118)
[0855] RenVecDwnstrmHC：反义引物，在峰8重链质粒上的可变区下游开始测序。在非密码子优化的HC恒定区内退火。
[0856] 5’-GAAGTAGTCCTTGACCAGG-3’(SEQ ID NO：119)
[0857] RenVecDwnstrmLC：反义引物，在a33-xm-lc轻链质粒上的可变区下游开始测序。在非密码子优化的LC恒定区内退火。
[0858] 5’-GAAGATGAAGACAGATGGTGCAG-3’(SEQ ID NO：120)
[0859] Upstrm Lonza：有义引物，在Lonza载体pEE 12.4和pEE 6.4中的可变区上游开始测序。不能与组合的Lonza一起使用，因为这是组合质粒中的一式两份区域。
[0860] 5’-CGGTGGAGGGCAGTGTAGTC-3’(SEQ ID NO：121)
[0861] Dnstrm 6-4：反义引物，在Lonza载体pEE 6.4中的恒定区下游开始测序。
[0862] 5’-GTGATGCTATTGCTTTATTTG-3’(SEQ ID NO：122)
[0863] Dnstrm 12-4：反义引物，在Lonza载体pEE12.4中的恒定区下游开始测序。
[0864] 5’-CATACCTACCAGTTCTGCGCC-3’(SEQ ID NO：123)
[0865] Cod-Opt LC const E：有义引物，对于密码子优化的轻链v-κ恒定区内部。
[0866] 5’-CCATCCTGTTTGCTTCTTTCC-3’(SEQ ID NO：124)
[0867] Cod-Opt LC const F：反义引物，对于密码子优化的轻链v-κ恒定区(vk)内部。
[0868] 5’-GACAGGGCTGCTGAGTC-3’(SEQ ID NO：125)
[0869] 806HCspec：有义引物，对于镶嵌形式的806HC可变区内部且独特。
[0870] 5’-GTGCAGCTCCAAGAGAGTGGAC-3’(SEQ ID NO：126)
[0871] 806LCspec：有义引物，对于镶嵌形式的806LC可变区内部且独特。
[0872] 5’-CAGAGTCCATCCAGCATGTC-3’(SEQ ID NO：127)
[0873] 编码IgG1hu806的质粒8C65AAG的序列的GenBank格式化文本文件和注释在图64中阐述。
[0874] 图53使用载体NTI(Invitrogen)产生。
[0875] 图59-62使用载体NTI AlignX产生。
[0876] 讨论
[0877] 806抗EGF受体抗体的镶嵌涉及VH中的14个氨基酸的突变(图59和图62)，和对于VL链的12个改变(图60和图61)，其中密码子优化如对于在哺乳动物CHO或NS0细胞中的表达所示。指名8C65AAG的最终双重基因载体已进行序列验证，并且检查编码序列和翻译。使用瞬时转染的hu806产物，通过Biacore分析证实与重组EGFR细胞外结构域的结合。
[0878] 产生高水平的完整hu806抗体的稳定单个克隆已在无谷氨酰胺培养基中进行选择，如由LONZA推荐的。稳定克隆已逐步断掉血清，以获得无血清培养物。
[0879] B.hu806的体外和体内表征
[0880] 更高生产的稳定GS-CHO hu806转染子14D8、15B2和40A10以及GS-NS0hu806转染子36进展，并且研究小规模培养，以使得初步hu806产物纯化和表征成为可能。结果指出相似理化性质。相应地，对于最高生产转染子(GS-CHO hu806 40A10)进行更大规模(15L)搅拌槽培养，并且纯化产物在U87MG.de2-7和A431异种移植物模型中进行另外的体外表征和体内治疗研究。
[0881] 方法和结果
[0882] 生产和下游加工：
[0883] 小规模
[0884] 用具有100mL细胞培养体积的E500摇瓶进行摇瓶实验。图76呈现了关于4个转染子在培养过程中的细胞生活力和抗体生产率图表。产物浓度通过ELISA进行评估，其中使用806抗独特型抗体LMH-12(Liu等人(2003)Generation of anti-idiotype antibodies for application in clinical immunotherapy laboratory analyses.Hybrid Hybridomics.22(4)，219-28)作为包被抗体，和ch806临床批次：J06024作为标准。对在收获时的材料进行离心，并且对上清液进行0.2μm过滤，随后抗体通过蛋白A层析进行亲和纯化。
[0885] 大规模
[0886] 表达hu806候选克隆40A10的CHO-K1SV转染子细胞系在具有葡萄糖冲击(shot)补料的15L搅拌槽生物反应器中培养16天，其中使用CD-CHO(Invitrogen)/25μM L-甲硫氨酸亚氨砜(methionine sulfoximine，MSX；Sigma)/GS补充物(Sigma)作为基础培养基。图76C呈现了在15L搅拌槽生物反应器中的细胞生长和容量生产。最终收率通过ELISA是
58mg/L的14.7L。
58mg/L的14.7L。
[0887] 对在收获时的材料进行离心，并且对上清液进行0.2μm过滤，随后在Pall Centrimate浓缩器中使用2×30K膜浓缩至2L。随后将等分试样(4×500ml)应用于250mL蛋白A柱，并且用包含200mM NaCl的50mM柠檬酸盐pH 4.5洗脱。随后合并来自4次运行的洗脱抗体，浓缩且透析到PBS，pH 7.4内。
[0888] 通过OD A280nm定量来自小和大规模培养的hu806产物。根据制造商的说明书，通过尺寸排阻层析(SEC)(小规模图77；大规模，图78)，在还原和非还原条件下的4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE(图79-81)，评价从rProtein-A回收的抗体样品，并且在Ampholine PAG板(pH 3.5-9.5)上用Amersham Multiphor II Electrophoresis系统执行等电聚焦(图82)。
[0889] 蛋白A亲和纯化的hu806抗体展示对于ch806临床参考材料的对称蛋白质峰和等同SEC洗脱谱。SDS-PAGE凝胶谱与免疫球蛋白一致。IEF模式指示具有pI范围为8.66-8.82的3种亚型，这与关于蛋白质序列的计算pI 8.4一致。
[0890] 结合分析
[0891] FACS分析
[0892] 通过OD A280nm对于每种样品测定的抗体浓度的估计值用于用腺癌细胞系A431细胞(包含EGFR基因扩增)FACS分析。我们先前已观察到与wtEGFR特异性mAb5286
比较，mAb806结合在A431肿瘤细胞上表达的～2×10wtEGFR的约10％(Johns等人
(2002)Novel monoclonal antibody specific for the de2-7epidermal growth factor receptor(EGFR)that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.Int.J.Cancer.98(3)，398-408)。细胞用4个hu806样品之一、无关IgG2b抗体或阳性对照ch806进行染色；各自以20μg/ml的浓度进行评价。
还包括对于单独二次抗体的对照[山羊抗hu-IgG(Fc特异性的)FITC缀合的]。复合FACS结合曲线呈现于图83中，且证实对于所有构建体等价的染色。
比较，mAb806结合在A431肿瘤细胞上表达的～2×10wtEGFR的约10％(Johns等人
(2002)Novel monoclonal antibody specific for the de2-7epidermal growth factor receptor(EGFR)that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.Int.J.Cancer.98(3)，398-408)。细胞用4个hu806样品之一、无关IgG2b抗体或阳性对照ch806进行染色；各自以20μg/ml的浓度进行评价。
还包括对于单独二次抗体的对照[山羊抗hu-IgG(Fc特异性的)FITC缀合的]。复合FACS结合曲线呈现于图83中，且证实对于所有构建体等价的染色。
[0893] 还通过FACS对于结合A431以及表达变体EGFRvIII受体的U87MG.de2-7神经胶质瘤细胞评价通过大规模培养产生的hu80640A10样品的细胞结合特征(Johns等人，2002)。一式两份分析的代表结果分别呈现于图84和图85中。如所示的对照包括无关IgG2b抗体(有阴影的直方图)、ch806或528(结合野生型和de2-7EGFR)。
[0894] ch806和hu806抗体证实A431和U87MG.de2-7细胞系的相似染色，支持我们先前观察mAb806特异性识别de2-7EGFR和超表达的EGFR的亚型(Luwor等人(2001)Monoclonal antibody 806inhibits the growth of tumor xenografts expressing either the de2-7or amplified epidermal growth factor receptor(EGFR)but not wild-type EGFR.Cancer Res.61(14)，5355-61)。如预期的，528抗体染色U87MG.de2-7和A431细胞系(图84和85)。
[0895] 细胞结合分析
[0896] 使用表达扩增的EGFR基因的U87MG.de2-7神经胶质瘤细胞系和A431表皮样癌细胞，通过细胞吸附分析评价放射免疫缀合物的抗原结合能力(Lindmo等人(1984)Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.J.Immunol.Methods.72(1)，77-89)。
[0897] 在过量抗原的存在下，通过与抗原表达细胞结合测定hu806和ch806放射缀合物6 6 125
的免疫反应性级分。在20×10-0.03×10细胞/样品的细胞浓度范围内，关于 I-hu806
125 6 6
和 I-ch806的U87MG.de2-7细胞结合结果呈现于图86A中。在200×10-0.39×10细胞
125 125
/样品的细胞浓度范围内，关于 I-hu806和 I-ch806的A431细胞结合结果呈现于图86B中。
的免疫反应性级分。在20×10-0.03×10细胞/样品的细胞浓度范围内，关于 I-hu806
125 6 6
和 I-ch806的U87MG.de2-7细胞结合结果呈现于图86A中。在200×10-0.39×10细胞
125 125
/样品的细胞浓度范围内，关于 I-hu806和 I-ch806的A431细胞结合结果呈现于图86B中。
[0898] Scatchard分析用于计算缔合常数(Ka)(Lindmo等人，1984)。比较单独的标记抗体的低水平(20ng)的结合与在过量未标记抗体的存在下的结合。如先前描述的(Clarke等人(2000)In vivo biodistribution of a humanized抗Lewis Y monoclonal antibody(hu3S193)in MCF-7xenografted BALB/c nude mice.Cancer Res.60(17)，4804-11)，在计算游离的、反应性抗体的量中考虑免疫反应性级分，并且特异性结合(nM；
总抗体×％结合)针对特异性结合/无反应性进行描绘(图87和88)。根据线的负斜率测定缔合常数。
总抗体×％结合)针对特异性结合/无反应性进行描绘(图87和88)。根据线的负斜率测定缔合常数。
[0899] 关于125I-hu806结合在U87MG.de2-7细胞上的EGFRvIII的结合亲和力测定为9 -1 125 9 -1 111 125
1.18×10M 。关于 I-ch806的Ka是1.06×10M 。这些观察与对于 In-和 I-ch806
9 -1 9 -1
分别为1.36×10M 和1.90×10 M 的Ka值的报道结果一致，这与亲本鼠mAb806的
9 -1
1.1×10M 的值是高度相当的(Panousis等人(2005)Engineering and characterization of chimeric monoclonal antibody 806(ch806)for targeted immunotherapy of tumours expressing de2-7EGFR or amplified EGFR.Br.J.Cancer.92(6)，1069-77)。
1.18×10M 。关于 I-ch806的Ka是1.06×10M 。这些观察与对于 In-和 I-ch806
9 -1 9 -1
分别为1.36×10M 和1.90×10 M 的Ka值的报道结果一致，这与亲本鼠mAb806的
9 -1
1.1×10M 的值是高度相当的(Panousis等人(2005)Engineering and characterization of chimeric monoclonal antibody 806(ch806)for targeted immunotherapy of tumours expressing de2-7EGFR or amplified EGFR.Br.J.Cancer.92(6)，1069-77)。
[0900] 在A431细胞上的scatchard分析证实通过2种806构建体对这些细胞上的较小125 9 -1 125
EGFR群体的高亲和力结合。关于 I-ch806的Ka是0.61×10M ；并且对于 I-hu806，Ka
9 -1
＝0.28×10M 。
EGFR群体的高亲和力结合。关于 I-ch806的Ka是0.61×10M ；并且对于 I-hu806，Ka
9 -1
＝0.28×10M 。
[0901] 生物传感器分析
[0902] 使用羧甲基葡聚糖包被的传感器芯片(CM5)，在BIAcore 2000生物传感器上执行生物传感器分析。使用标准胺偶联化学，使芯片在通道3上用806表位肽衍生化(EGFR氨基酸287-302；SEQ ID NO：14；参见于2005年2月17日提交的美国专利申请号11/060,646；于2004年2月20日提交的美国临时专利申请号60/546,602；和于2004年7月1日提交的美国临时专利申请号60/584,623，其公开内容在此整体引入)。通道2由用于系统合适性测定的对照抗原衍生化。通道1用乙醇胺衍生化，并且用作空白对照通道用于校正折射率作用。hu806的样品在HBS缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4；150mM NaCl；3.4mM di-Na-EDTA；
0.005％Tween-20)中进行稀释，并且包含50nM、100nM、150nM、200nM、250nM和300nM的等分试样(120μl)以30μl/分钟的流速在传感器芯片表面上注射。在注射期后，通过在芯片表面上流动HBS缓冲液监控解离600s。洗脱结合抗体，并且在样品之间通过注射20μl
10mM氢氧化钠溶液再生芯片表面。包括阳性对照ch806。使用BIAevaluation软件的平衡结合模型测定结合参数。图89呈现了所生成的传感图。
0.005％Tween-20)中进行稀释，并且包含50nM、100nM、150nM、200nM、250nM和300nM的等分试样(120μl)以30μl/分钟的流速在传感器芯片表面上注射。在注射期后，通过在芯片表面上流动HBS缓冲液监控解离600s。洗脱结合抗体，并且在样品之间通过注射20μl
10mM氢氧化钠溶液再生芯片表面。包括阳性对照ch806。使用BIAevaluation软件的平衡结合模型测定结合参数。图89呈现了所生成的传感图。
[0903] 用hu806和阳性对照ch806在通道3上观察到剂量依赖性结合。通过合适单克隆抗体与对照通道2的剂量依赖性结合证实系统合适性。在hu806(或ch806)和对照抗体之间未观察到交叉反应性。我们的分析测定表观KD(1/Ka)对于hu806是37nM，并且对于ch806是94nM。
[0904] 抗体依赖性细胞毒性分析
[0905] 用靶A431腺癌细胞和新鲜分离的健康供体外周血单核效应细胞，使用纯化的hu806抗体40A10制剂执行ADCC分析。简言之，所有分析一式三份地执行，其应用1)1μg/ml每种抗体，在一系列效应子靶细胞比内(E∶T＝0.78∶1-100∶1)，以及2)在每种抗体的浓度范围(3.15ng/ml-10μg/ml)内，在E∶T＝50∶1下。一式三份地包括关于抗体同种型、自发和总细胞毒性的对照，并且关于特异性细胞毒性的计算如先前描述的(Panousis等人，2005)。结果在图90中呈现。
[0906] hu806一致地证实对于嵌合ch806IgG1优良的ADCC活性。在所示的代表性实验中，与ch806的5％细胞毒性比较，1μg/mL的hu806实现30％细胞毒性的ADCC。
[0907] 体内806治疗研究
[0908] 在BALB/c裸鼠中使用建立的A431腺癌或U87MG-de2-7神经胶质瘤异种移植物研6
究hu806的治疗效果。为了建立异种移植物，用在100μ1PBS中的1×10A431腺癌细胞或
6
1×10U87MG.de2-7神经胶质瘤细胞，皮下注射到小鼠的右和左腹股沟乳房线内。通过公式
2
[(长度×宽度 )/2]计算肿瘤体积(TV)，其中长度是最长轴，并且宽度是与长度成直角的测量。在最初实验中，具有建立的A431或U87MG.de2-7异种移植物的5只BALB/c裸鼠的组(n＝10个肿瘤/组)通过IP注射接受1mg hu806或1mg ch806抗体或PBS媒介物对照的处理。分别地，对于A431在第6、8、11、13、15和18天，并且对于U87MG.de2-7细胞系在第4、6、8、11、13和15天时施用治疗。直到由于肿瘤负荷的伦理考虑的实验终止时的平均值±SEM肿瘤体积对于A431异种移植物在图91中呈现，直到第25天时，并且对于U87MG.de2-7异种移植物在图92中呈现，直到第31天时。
究hu806的治疗效果。为了建立异种移植物，用在100μ1PBS中的1×10A431腺癌细胞或
6
1×10U87MG.de2-7神经胶质瘤细胞，皮下注射到小鼠的右和左腹股沟乳房线内。通过公式
2
[(长度×宽度 )/2]计算肿瘤体积(TV)，其中长度是最长轴，并且宽度是与长度成直角的测量。在最初实验中，具有建立的A431或U87MG.de2-7异种移植物的5只BALB/c裸鼠的组(n＝10个肿瘤/组)通过IP注射接受1mg hu806或1mg ch806抗体或PBS媒介物对照的处理。分别地，对于A431在第6、8、11、13、15和18天，并且对于U87MG.de2-7细胞系在第4、6、8、11、13和15天时施用治疗。直到由于肿瘤负荷的伦理考虑的实验终止时的平均值±SEM肿瘤体积对于A431异种移植物在图91中呈现，直到第25天时，并且对于U87MG.de2-7异种移植物在图92中呈现，直到第31天时。
[0909] 与PBS媒介物对照比较，用hu806的体内治疗评价显示A431异种移植物生长的显著减少。对于hu806观察到的A431异种移植物生长曲线与ch806处理组是高度相当的。在建立的U87MG.de2-7异种移植物中，PBS对照组在第20天时实施安乐死。hu806治疗证实与PBS对照比较，到第20天肿瘤生长的显著减少(P＜0.001)，并且类似于ch806组在第20天后持续的肿瘤生长迟缓。
[0910] 讨论
[0911] 蛋白A亲和纯化的hu806抗体展示与ch806临床参考材料等同的SEC洗脱谱，和与免疫球蛋白一致的SDS-PAGE凝胶谱。IEF模式与预期的pI 8.4一致。
[0912] 通过Scatchard细胞结合和生物传感器表位结合分析，hu806抗体证实与ch806抗体高度相当的结合曲线和亲和力参数。hu806和ch806与EGFRvIII和超表达的野生型EGFR的结合亲和力是相似的且在低纳摩尔范围中。通过FACS分析的细胞结合支持这些观察。
[0913] 此外，hu806证实对靶抗原阳性A431细胞相对于ch806构建体显著改善的ADCC。
[0914] 用hu806的体内治疗评价显示在A431异种移植物生长中的显著减少，这与ch806处理组是高度相当的。在建立的U87MG.de2-7异种移植物中，hu806治疗证实与PBS对照比较，到第20天肿瘤生长的显著减少，并且类似于ch806组在第20天后的持续肿瘤生长迟缓。
[0915] 实施例23
[0916] 单克隆抗体175
[0917] 如实施例1中讨论的，选择克隆175(IgG2a)用于进一步表征。
[0918] a.材料与方法
[0919] 细胞系
[0920] Δ2-7EGFR转染的U87MG.Δ2-7(Huang等人(1997)J.Biol.Chem.272，2927-2935)和A431细胞系(Ullrich等人(1984)Nature.309，418-425)先前已得到描述。激素依赖性前列腺细胞系DU145(Mickey等人(1977)Cancer Res.37，4049-4058)得自ATCC(atcc.org)。
[0921] 所有细胞系维持在DMEM(Life Technologies，Grand Island，NY)中，所述DMEM包含10％FCS(CSL，Melbourne)、2mM谷氨酰胺(Sigma Chemical Co，St.Louis)、和青霉素/链霉素(Life Technologies，Grand Island)。此外，U87MG.Δ2-7细胞系维持在400mg/ml遗传霉素(Life Technologies，Inc，Grand Island)中。BaF/3(Palacios等人(1984)Nature.309，126-131)和表达不同EGF受体的BaF/3细胞系(Walker等人(2004)J.Biol.Chem.2(79)，22387-22398)照常规维持在RPMI1640(GIBCO BRL)中，所述RPMI 1640补充有10％胎牛血清(GIBCO BRL)和作为IL-3来源的10％WEHI-3B条件培养基(Ymer等人(1985)Nature.19-25；317，255-258)。所有细胞系在37℃在空气/CO2(95％-5％)气氛中生长。
[0922] 抗体和肽
[0923] mAb806和mAb175在Ludwig Institute for Cancer Research(LICR)New York Branch生成，并且在Biological Production Facility(Ludwig Institute for Cancer Research，Melbourne)产生且纯化。鼠成纤维细胞系NR6ΔEGFR用作免疫原。通过用在佐剂5 6
中的5×10-2×10细胞以2-3周间隔皮下免疫接种BALB/c小鼠5次生成小鼠杂交瘤。完全弗氏佐剂用于第一次注射。其后，使用不完全弗氏佐剂(Difco)。来自免疫接种小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合。在血细胞吸附测定中就与细胞系NR6、NR6wtEGFR和NR6ΔEGFR的反应性筛选新近生成的克隆的上清液，并且随后通过血细胞吸附测定用人成胶质细胞瘤细胞系U87MG、U87MGwtEGFR和U87ΔEGFR进行分析。
中的5×10-2×10细胞以2-3周间隔皮下免疫接种BALB/c小鼠5次生成小鼠杂交瘤。完全弗氏佐剂用于第一次注射。其后，使用不完全弗氏佐剂(Difco)。来自免疫接种小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合。在血细胞吸附测定中就与细胞系NR6、NR6wtEGFR和NR6ΔEGFR的反应性筛选新近生成的克隆的上清液，并且随后通过血细胞吸附测定用人成胶质细胞瘤细胞系U87MG、U87MGwtEGFR和U87ΔEGFR进行分析。
[0924] 完整mAbs(50mg)在PBS中用活化木瓜蛋白酶在37℃以1∶20的比消化2-3小时，并且木瓜蛋白酶用碘乙酰胺灭活。随后使消化物经过在20mM磷酸钠缓冲液pH 8.0中的蛋白A琼脂糖柱(Amersham)，其中流通物通过阳离子交换使用Mono-S柱(Amersham)进一步纯化。蛋白质随后使用10,000MWCO离心浓缩器(Millipore)进行浓缩。对于Fab-肽复合物，将摩尔过量的冷冻肽直接加入Fab中，并且在设置结晶试验前在4℃温育2小时。
[0925] 使用在哺乳动物细胞中表达的EGFR片段的mAb175作图
[0926] 在用这些片段转染前一天，在包含2ml培养基的6孔组织培养板中以8×105/孔种植人293T胚肾成纤维细胞。根据制造商的说明书，用与Lipofectamine 2000(Invitrogen)复合的3-4μg质粒DNA转染细胞。在转染后24-48小时，抽吸细胞培养物，并且细胞单层在250μ：裂解缓冲液(1％Triton X-100、10％甘油、150mM NaCl、50mM HEPES pH 7.4、1mM EGTA和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中裂解。使细胞裂解物的等分试样(10-15μl)与包含1.5％β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液混合，通过在100℃加热5分钟变性，并且在10％NuPAGE Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上进行电泳。随后将样品电转移至硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜在TBST缓冲液(10mM Tris-HCI，pH 8.0，100mM NaCl和
0.1％Tween-20)中清洗，并且在包含2.5％脱脂乳的TBST中在室温封闭30分钟。膜在
4℃与在封闭缓冲液中的0.5μg/ml mAb175温育过夜。平行膜用检测c-myc表位的mAb
9B11(1∶5000，Cell Signaling Technology，Danvers，Massachusetts)探测过夜。膜在TBST中洗涤，并且在包含辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG(Biorad)的封闭缓冲液中在室温以1∶5000稀释度温育2小时。印迹随后在TBST中洗涤，并且在与Western Pico化学发光底物(Pierce，Rockford，Illinois)温育后使用放射自显影胶片显影。
0.1％Tween-20)中清洗，并且在包含2.5％脱脂乳的TBST中在室温封闭30分钟。膜在
4℃与在封闭缓冲液中的0.5μg/ml mAb175温育过夜。平行膜用检测c-myc表位的mAb
9B11(1∶5000，Cell Signaling Technology，Danvers，Massachusetts)探测过夜。膜在TBST中洗涤，并且在包含辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG(Biorad)的封闭缓冲液中在室温以1∶5000稀释度温育2小时。印迹随后在TBST中洗涤，并且在与Western Pico化学发光底物(Pierce，Rockford，Illinois)温育后使用放射自显影胶片显影。
[0927] 使用在哺乳动物细胞和酵母中表达的EGFR片段的mAb175作图
[0928] 以残基274、282、290和298开始且都以氨基酸501结束且与生长激素融合的一系列重叠c-myc标记的EGFR胞外域片段先前已得到描述(Johns等人(2004)J.Biol.Chem.279，30375-30384)。EGFR蛋白质在酵母细胞表面上的表达如先前描述的执行(Johns等人，2004)。
[0929] 简言之，经转化的菌落在30℃在基本培养基中在振荡平台上生长约1天，直至达到OD600 5-6，所述基本培养基包含酵母氮源、酪蛋白水解物、右旋糖和磷酸盐缓冲液pH7.4。随后通过转移至包含半乳糖的基本培养基针对蛋白质展示诱导酵母细胞，并且伴随振荡在30℃温育24小时。培养物随后贮存于4℃，直至分析。包含c-myc单克隆抗体9E10
6
的原始腹水液得自Covance(Richmond，CA)。1×10酵母细胞用冰冷的FACS缓冲液(包含1mg/ml BSA的PBS)洗涤，并且在50μl的终体积中与抗c-myc腹水(1∶50稀释度)或人EGFR单克隆抗体(10μg/ml)在4℃温育1小时。细胞随后用冰冷的FACS缓冲液洗涤，并且在50μl的终体积中与藻红蛋白标记的抗小鼠IgG(1∶25稀释度)在4℃温育1小时，避光。在用冰冷的FACS缓冲液洗涤酵母细胞后，用Coulter Epics XL流式细胞仪(Beckman-Coulter)获得荧光数据，并且用WinMDI细胞计量术软件(J.Trotter，Scripps University)分析。对于线性与构象表位比较的测定，酵母细胞在80℃加热30分钟，随后在用抗体标记前在冰上冷却20分钟。表7中列出的EGFR突变体系列先前已得到描述(Johns等人，2004)。
6
的原始腹水液得自Covance(Richmond，CA)。1×10酵母细胞用冰冷的FACS缓冲液(包含1mg/ml BSA的PBS)洗涤，并且在50μl的终体积中与抗c-myc腹水(1∶50稀释度)或人EGFR单克隆抗体(10μg/ml)在4℃温育1小时。细胞随后用冰冷的FACS缓冲液洗涤，并且在50μl的终体积中与藻红蛋白标记的抗小鼠IgG(1∶25稀释度)在4℃温育1小时，避光。在用冰冷的FACS缓冲液洗涤酵母细胞后，用Coulter Epics XL流式细胞仪(Beckman-Coulter)获得荧光数据，并且用WinMDI细胞计量术软件(J.Trotter，Scripps University)分析。对于线性与构象表位比较的测定，酵母细胞在80℃加热30分钟，随后在用抗体标记前在冰上冷却20分钟。表7中列出的EGFR突变体系列先前已得到描述(Johns等人，2004)。
[0930] 表面等离子体共振(BIAcore)
[0931] BIAcore 3000用于所有实验。使用胺、硫醇或Pms偶联，以5μl/分钟的流速，将包含假定mAb806表位的肽固定在CM5传感器芯片上(Wade等人(2006)Anal.Biochem.348，315-317)。使mAb806和mAb175在25℃以5μl/分钟的流速经过传感器表面。在运行之间通过以10μl/分钟的流速注射10mM HCI再生表面。
[0932] 免疫沉淀和蛋白质印迹
[0933] 细胞用裂解缓冲液(1％Triton X-IOO、30mM HEPES、150mM NaCl、500mM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟、150nM抑肽酶、1mM E-64蛋白酶抑制剂、0.5mM EDTA和1mM亮抑酶肽，pH7.4)裂解20分钟，通过以14,000×g离心30分钟澄清，用相关抗体以5μg/ml的终浓度免疫沉淀60分钟，并且通过琼脂糖-A珠捕获过夜。样品随后用2X NuPAGE SDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱，在NuPAGE凝胶(3-8％或4-12％)上分辨，电转移到Immobilon-P转移膜(Millipore)上，随后在通过化学发光射线照相术检测前用相关抗体探测。
[0934] 免疫组织化学
[0935] 冷冻切片用5μg/ml mAb175或无关同种型对照在室温染色60分钟。根据制造商的说明书，结合的抗体使用Dako Envision+HRP检测系统进行检测。切片最后用水清洗，用苏木精复染且固定。
[0936] 异种移植物模型
[0937] 在100μL PBS中的U87MG.Δ2-7细胞(3×106)皮下接种到4-6周龄、雌性BALB/c裸鼠(Animal Research Centre，Perth，澳大利亚)的双侧胁腹内。如先前报道的(Perera等人(2005)Clin.Cancer Res.11，6390-6399)，所有研究使用建立的肿瘤模型进行。在肿瘤2
已达到在合适图例中所示的平均体积后，开始处理。使用公式(长度×宽度 )/2测定以
3
mm表示的肿瘤体积，其中长度是最长轴，并且宽度是垂直测量。对于每个处理组，数据表示为平均肿瘤体积±SE。通过单侧斯氏t检验针对显著性分析所有数据，其中p＜0.05被视为统计上显著的。这个研究计划得到Animal Ethics Committee of the Austin Hospital批准。
已达到在合适图例中所示的平均体积后，开始处理。使用公式(长度×宽度 )/2测定以
3
mm表示的肿瘤体积，其中长度是最长轴，并且宽度是垂直测量。对于每个处理组，数据表示为平均肿瘤体积±SE。通过单侧斯氏t检验针对显著性分析所有数据，其中p＜0.05被视为统计上显著的。这个研究计划得到Animal Ethics Committee of the Austin Hospital批准。
[0938] 表达EGFR突变体构建体的稳定细胞系的生成和表征
[0939] 使用定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)生成wtEGFR的突变。用于每次诱变的模板是人EGFR cDNA(登记号x00588)(Ullrich等人(1984)Nature.309，418-425)。执行每种构建体的自动化核苷酸测序，以证实EGFR突变的完整性。野生型和突变型(C173A/C281A)EGFR通过电穿孔转染到BaF/3细胞内。
[0940] 通过在含新霉素培养基中选择，得到表达突变型EGFR的稳定细胞系。在最终选择后，从每种细胞系中分离mRNA，逆转录且通过PCR扩增EGFR序列。通过测序PCR产物证实在表达的EGFR中的所有突变。在FACStar(Becton和Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上通过FACS分析测定EGFR的表达水平，其中使用在PBS、5％FCS、5mM EDTA中以10μg/ml的抗EGFR抗体mAb528(Masui等人(1984)Cancer Res.44，1002-1007；Gill等人(1984)J.Biol.Chem.259，7755-7760)，随后为Alexa 488标记的抗小鼠Ig(1∶400最终稀释度)。通过使细胞与无关、类别匹配的初次抗体温育测定本底荧光。所有细胞在RPMI、10％FCS、10％WEHI3B条件培养基和1.5mg/ml G418中照常规传代。
[0941] 突变型EGFR的EGF依赖性激活
[0942] 对表达wtEGFR或C271A/C283A-EGFR的细胞进行洗涤，并且在不含血清或IL-3的培养基中温育3小时。通过离心收集细胞，并且重悬浮于包含EGF(100ng/ml)的培养基或相等体积的PBS中。细胞在15分钟后收获，团块化且在包含p-巯基乙醇的SDS/PAGE样品缓冲液中直接裂解。在NuPAGE 4-12％梯度凝胶上分离样品，转移至Immobilon PVDF膜，并且用抗磷酸酪氨酸(4G10，Upstate Biotechnologies)或抗EGFR抗体(mAb806，在LICR产生)探测。使用化学发光检测反应条带。
[0943] EGF和抗体对细胞增殖的作用
[0944] 收获在对数期中生长的细胞，并且用PBS洗涤2次，以去除残留IL-3。使细胞重悬5
浮于RPMI 1640加上10％FCS中，并且以10细胞/孔仅连同载体或连同增加浓度的EGF一起种植到96孔板内。在合适时，固定浓度的mAb528或mAb806(2μg/孔)也加入培养物中。使用MTT测定来测定增殖(van de Loosdrecht等人(1994)J.Immunol.Methods.174，
311-320)。
浮于RPMI 1640加上10％FCS中，并且以10细胞/孔仅连同载体或连同增加浓度的EGF一起种植到96孔板内。在合适时，固定浓度的mAb528或mAb806(2μg/孔)也加入培养物中。使用MTT测定来测定增殖(van de Loosdrecht等人(1994)J.Immunol.Methods.174，
311-320)。
[0945] 与构象特异性抗体的反应性
[0946] 通过离心收集细胞，并且用对照或测试抗体染色(都以10μg/ml在FACS缓冲液中在冰上40分钟，在FACS缓冲液中洗涤)，随后为Alexa 488标记的抗小鼠Ig(1∶400最终稀释度，在冰上20分钟)。细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤，通过离心收集，并且在FACScan上分析；使用在Cell Quest(Becton and Dickinson)中的统计工具对于每种样品测定峰荧光通道和平均荧光。从所有测量中推导本底(阴性对照)荧光。选择中值荧光值作为最具代表性的峰形和荧光强度，并且用于得到mAb806与mAb528结合的比。
[0947] Fab 175和Fab 806、Fab-肽复合物的晶体结构测定和在溶液中806肽表位的NMR结构
[0948] 通过分子替换测定结构，并且精修，对于Fab806用R＝0.225/Rfree(R游离)＝0.289；并且对于Fab806：肽用R＝0.226/Rfree＝0.279；对于Fab806用R＝0.210/Rfree＝0.305，并且对于Fab806：肽用R＝0.203/Rfree＝0.257会聚(converge)。
[0949] 使用10mg/ml Fab和包含0.1M乙酸钠缓冲液pH 4.6，6-8％PEG6000和15-20％异丙醇的储库，通过悬滴蒸汽扩散生长天然806Fab的晶体。对于数据收集，将晶体转移至包含0.1M乙酸钠缓冲液pH 4.6、10％PEG6000、15-20％异丙醇和10％甘油的冷冻保护剂溶液。晶体随后固定在尼龙环中，并且直接速冻到液氮内。
[0950] 使用10mg/ml Fab-肽复合物和包含0.2M乙酸铵16-18％PEG 5,000单乙醚的储库，通过悬滴蒸汽扩散生长806Fab-肽复合物的晶体，随后通过种植技术改善晶体质量。对于数据收集，将晶体转移至由补充有25％甘油的储库组成的冷冻保护剂溶液。晶体随后固定(mounted)在尼龙环中，并且直接速冻到液氮内。
[0951] 使用Topaz结晶系统(Fluidigm，San Francisco)，通过游离界面扩散最初生长175Fab-肽复合物的晶体。使用7mg/ml Fab与相似条件0.1M Bis-tris丙烷缓冲液、0.2M乙酸铵和18％PEG 10,000，通过悬滴蒸汽扩散生长微晶体。随后通过划线种植到0.15m甲酸钠和15％PEG 1500内改善微晶体，以获得小板形晶体。对于数据收集，将晶体转移至由补充有25％甘油的储库组成的冷冻保护剂溶液。晶体随后固定在尼龙环中，并且直接速冻到液氮内。
[0952] 使用在配备AXCO光学的Rigaku micromax-007发电机上的R-AXIS IV检测器，内部收集关于806Fab和175Fab复合物晶体的衍射数据，这些数据随后使用CrystalClear进行加工。在ADSC quantum315CCD检测器上在束线X29，Brookhaven National Laboratory收集806Fab-肽复合物数据，这些数据用HKL2000进行加工(Otwinowski，Z.和Minor，W.(1997)Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.Academic Press(New York))(数据收集统计学在表9中显示)。使用程序MOLREP(Vagin，A.和Teplyakov，A.(1997)J.Appl.Cryst.30，1022-1025)使用Fab结构的坐标通过分子替换分辨天然806Fab，在REFMAC5(Murshudov等人(1997)Acta crystallographica 53，240-255)中 和 在 Coot(Emsley，P.和 Cowtan，K.(2004)Acta crystallographica 60，
2126-2132)中的模型构建执行2E8结构精修。
2126-2132)中的模型构建执行2E8结构精修。
[0953] 使用程序MOLREP使用806Fab结构的坐标通过分子替换分辨806肽和175Fab-肽结构，精修和重建再次在REFMAC5、以及COOT和O中执行。最终结构的验证用PROCHECK(Laskowski等人(1993)J.Appl.Cryst.26，283-291)和WHATCHECK(Hoofft等人(1996)Nature 381，272)执行。
[0954] NMR研究
[0955] 对于NMR研究，15N标记的肽作为与SHP2的SH2结构域的融合物重组产生，其中使用先前由Fairlie等人(Fairlie等人(2002)Protein expression and purification15
26，171-178)描述的方法，除了大肠杆菌在补充有 NH4Cl的Neidhardt′s基本培养基(Neidhardt等人(1974)Journal of bacteriology 119，736-747)中生长外。使用CNBr从融合配偶体中切割肽，通过反相HPLC纯化，并且通过MALDI-TOF质谱法和N末端测序证实其身份。在806抗体结合序列内的甲硫氨酸残基突变为亮氨酸，以使得能够从融合配偶体中而不是在肽自身内切割。
26，171-178)描述的方法，除了大肠杆菌在补充有 NH4Cl的Neidhardt′s基本培养基(Neidhardt等人(1974)Journal of bacteriology 119，736-747)中生长外。使用CNBr从融合配偶体中切割肽，通过反相HPLC纯化，并且通过MALDI-TOF质谱法和N末端测序证实其身份。在806抗体结合序列内的甲硫氨酸残基突变为亮氨酸，以使得能够从融合配偶体中而不是在肽自身内切割。
[0956] 用于NMR研究的样品在包含5％2H2O、70mM NaCl和50mM NaPO4 pH 6.8的H2O溶液中制备。所有谱使用冷冻探头在Bruker Avance500分光计上在298K获得。使用标准2D15
TOCSY和NOESY以及 N编辑的TOCSY和NOESY谱，建立在不存在m806Fab的情况下肽的序
15
列分配。通过在fAb806的不存在和存在下监控肽的 N HSQC谱，检查在肽和fAb806之间
15
的相互作用。在fAb806的存在下肽的 N HSQC谱的光谱扰动指示肽在存在的溶液条件下能够与fAb806结合。复合物形式的肽的详细构象未得到测定。与关于mAb806肽的随机螺旋化学位移值的偏差显示于图93中。
TOCSY和NOESY以及 N编辑的TOCSY和NOESY谱，建立在不存在m806Fab的情况下肽的序
15
列分配。通过在fAb806的不存在和存在下监控肽的 N HSQC谱，检查在肽和fAb806之间
15
的相互作用。在fAb806的存在下肽的 N HSQC谱的光谱扰动指示肽在存在的溶液条件下能够与fAb806结合。复合物形式的肽的详细构象未得到测定。与关于mAb806肽的随机螺旋化学位移值的偏差显示于图93中。
[0957] ch806肿瘤在患者中的生物分布
[0958] 为了证实mAb806在体内的肿瘤特异性，在cGMP条件下改造且产生嵌合形式(ch806)(Panousis等人(2005)Br.J.Cancer.92，1069-1077)。进行I期首次人体(first-in-man)试验，以评估ch806在具有806阳性肿瘤的患者中的安全性、生物分布和免疫应答，并且安全性、生物分布和药代动力学的结果先前已得到报道(Scott等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104，4071-4076)。为了限定与患者中的正常组织(即肝脏)
111
比较ch806在肿瘤中的特异性，通过来自5-7mCi(200-280MBq) In-ch806注射后一周内获
111
得的全身γ照相机图像计算 In-ch806的％注射剂量(ID)，执行ch806在肿瘤和肝脏的
111
定量摄取。基于每个个别患者中的目的区域执行肝脏和肿瘤剂量测定法计算。 In-ch806输注图像数据集对于本底和减弱进行校正，允许计算累积活性。执行剂量测定法计算，以得
111
到注射后一周时期内 In-ch806在肿瘤和肝脏中的浓度。
111
比较ch806在肿瘤中的特异性，通过来自5-7mCi(200-280MBq) In-ch806注射后一周内获
111
得的全身γ照相机图像计算 In-ch806的％注射剂量(ID)，执行ch806在肿瘤和肝脏的
111
定量摄取。基于每个个别患者中的目的区域执行肝脏和肿瘤剂量测定法计算。 In-ch806输注图像数据集对于本底和减弱进行校正，允许计算累积活性。执行剂量测定法计算，以得
111
到注射后一周时期内 In-ch806在肿瘤和肝脏中的浓度。
[0959] b.测序
[0960] 如下测序mAb175的可变重(VH)和轻(VL)链，并且鉴定其互补决定区(CDRs)：
[0961] mAb175VH链：核酸(SEQ ID NO：128)和氨基酸(SEQ ID NO：129)序列分别显示于图74A和74B中。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：130、131和132)由图74B中的下划线指示。
[0962] mAb175VL链：核酸(SEQ ID NO：133)和氨基酸(SEQ ID NO：134)序列分别显示于图75A和75B中。互补决定区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NOS：135、136和137)由图75B中的下划线指示。
[0963] 关于mAb175的序列数据基于序列和晶体结构数据，因为细胞系不是克隆的，并且因此已从细胞系中获得多个序列。上文所述的mAb175序列已通过晶体结构加以证实，并且基于单独的标准序列数据在VL链CDR1和CDR2各自中与先前序列相差单个氨基酸。基于最终序列和晶体结构数据，也已获得mAb175的不同同种型(罕见IgG2a同种型)。
[0964] mAb175特异性
[0965] 初步结合研究暗示mAb175展示与mAb806相似的对于EGFR的特异性。在mAb806(IgG2b)和mAb175(IgG2a)的CDR区域中，氨基酸序列是几乎等同的，各自中具有仅一个氨基酸差异(图65；参见下文实施例26)。所有这些差异保存侧链的电荷和大小。明确地，这些抗体已独立地出现。
[0966] c.实验
[0967] 进行一组免疫组织化学实验，以分析mAb175结合的特异性。mAb175染色超表达EGFR的A431异种移植物的切片(图66A)和表达Δ2-7EGFR的U87MG.Δ2-7神经胶质瘤异种移植物的切片(图66A)。相比之下，mAb175不染色U87MG异种移植物切片。U87MG细胞系仅表达适度水平的野生型EGFR(图66A)，并且不具有可检测的EGFR自分泌环。最重要的是，mAb175不与正常人肝脏切片结合(图66B)。因此，mAb175看起来证实与mAb806相同的特异性，即它检测超表达和截短的人EGFR，而不是以适度水平表达的wtEGFR。
[0968] mAb175表位的鉴定
[0969] 因为mAb175还结合Δ2-7EGFR，其中氨基酸6-273被缺失，以及EGFR1-501，mAb175表位必须包含在残基274-501内。当测定mAb806的表位时，我们表达与人GH的羧基末端融合的一系列c-myc标记的EGFR片段，全部以氨基酸501终止(Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342，539-550；Johns等人(2004)J.Biol.Chem.279，30375-30384)。
[0970] mAb175在蛋白质印迹中也与274-501和282-501EGFR片段反应，但不检测以氨基酸290或298开始的片段(图73)。所有GH-EGFR融合蛋白的存在使用c-myc抗体9EI0加以证实(图73)。因此，mAb175表位的关键决定簇接近氨基酸290定位。最后，具有缺失的mAb806表位的274-501EGFR片段(Δ287-302)对于mAb175结合也是阴性的(图73)，暗示这个区域类似地决定大多数mAb175结合。
[0971] 第二种方法用于进一步表征mAb175表位。包含EGFR的细胞外结构域的片段在酵母的表面上表达，并且使用流式细胞术通过间接免疫荧光测试mAb175结合。mAb175识别对应于Δ2-7EGFR的细胞外结构域的酵母片段273-621，而不识别片段1-176、1-294、294-543或475-621(图67A和图67B)。因此，至少部分mAb175表位必须包含在氨基酸274-294之间的区域内，这与使用EGFR片段的免疫印迹数据一致。因为mAb175与273-621的变性片段结合(图67C)，所以表位在性质上必须是线性的(图73)。明确的是mAb806和mAb175识别EGFR的相似区域和构象。
[0972] 使 用 表 面 等 离 子 体 共 振 (BIAcore)，研 究 了 mAb175 与 EGFR 肽(287CGADSYEMEEDGVRKC302；SEQ ID NO：138))的结合。使用胺、硫醇-二硫化物交换或Pms-Ser偶联化学，将EGFR287-302固定在生物传感器表面上。后一方法通过N末端半胱氨酸专一地固定肽(Wade等人(2006)Anal.Biochem.348，315-317)。
[0973] mAb175结合所有定向的EGFR287-302(表6)。mAb175对于EGFR287-302的亲和力范围为对于Pms-丝氨酸偶联的35nM到对于胺偶联的154nM。在所有情况下，mAb175对于EGFR287-302的结合亲和力低于对于mAb806获得的那种(表6)。我们还测定了mAb175对EGFR的2个不同细胞外片段的亲和力。mAb175以类似于使用肽获得的那种的亲和力结合1-501片段(16nM与35nM比较)(表6)。如预期的，mAb175针对可以形成栓系构象的1-621全长细胞外结构域的亲和力低得多(188nM)。尽管mAb806和mAb 175对于EGFR287-302具有相似亲和力，但mAb175看起来展示对于EGFR的细胞外结构域的更高亲和力(表6)。明确地，mAb175表位包含在EGFR287-302内，并且如同mAb806，对于EGFR的细胞外结构域的结合亲和力取决于构象。
[0974] 表6
[0975] 关于mAb806和mAb175与EGFR表位结合的抗体亲和力的BIAcore测定
[0976]
[0977] 在酵母的表面上表达的273-621EGFR片段的突变体组(Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342，539-550；Johns等人(2004)J.Biol.Chem.279，30375-30384)用于表征mAb175表位的精细结构。mAb 175和mAb806展示对于突变体几乎等同的反应性模式(表7)。287-302二硫键的破坏对表位反应性仅具有中等作用，因为抗体在C287与所有突变体结合，并且在C302与某些但并非全部突变体结合(表7)。对于mAb175结合关键的氨基酸包括E293、G298、V299、R300和C302(表7)。mAb175看起来对于突变V299和D297适度地更敏感，但mAb806也显示对于在这些位点的某些突变减少的结合(表7)。再次，mAb175表位看起来与由mAb806识别的表位基本上相同。
[0978] 表7
[0979] EGFR表位287-302突变在酵母上的展示以及关于mAb806和mAb175的结合分数[0980]EGFR突变体 mAb806结合 mAb175结合
C287A + +
C287G + +
C287R + +
C287S + +
C287W + +
C287Y + +
G288A ++ ++
A289K ++ ++
D290A ++ ++
S291A ++ ++
Y292A ++ ++
E293A + +
E293D + +
E293G + +
E293K - -
M294A ++ ++
E295A ++ ++
E296A ++ ++
D297A ++ +在接触中
D297Y + +
G298A + +
G298D - -
G298S - -
V299A ++ +在接触中
V299D - -
V299K ++ +在接触中
R300A ++ ++
R300C + +
R300P - -
K301A ++ ++
K301E + +
C302A - -
C302F + +
C302G - -
C302R + +
C302S - -
C302Y + +
C287A + +
C287G + +
C287R + +
C287S + +
C287W + +
C287Y + +
G288A ++ ++
A289K ++ ++
D290A ++ ++
S291A ++ ++
Y292A ++ ++
E293A + +
E293D + +
E293G + +
E293K - -
M294A ++ ++
E295A ++ ++
E296A ++ ++
D297A ++ +在接触中
D297Y + +
G298A + +
G298D - -
G298S - -
V299A ++ +在接触中
V299D - -
V299K ++ +在接触中
R300A ++ ++
R300C + +
R300P - -
K301A ++ ++
K301E + +
C302A - -
C302F + +
C302G - -
C302R + +
C302S - -
C302Y + +
[0981] mAb175针对由Δ2-7EGFR或EGFR自分泌环刺激的肿瘤异种移植物的功效
[0982] 检查mAb806和mAb175针对U87MG.Δ2-7神经胶质瘤异种移植物的体内抗瘤活性。在抗体治疗(在所示天数一周3次，进行2周)开始前，允许异种移植物建立6天。在3
这时，平均肿瘤体积是100mm(图68A)。mAb175处理导致与用媒介物或mAb806处理比较总体肿瘤生长速率的减少，并且在接种后第19天当对照组由于伦理原因被处死时高度显著(与对照比较P＜0.0001和与mAb806比较P＜0.002)。在这时的平均肿瘤体积对于媒介
3
物、mAb806和mAb175处理组分别为1530、300和100mm(图68A)，证实mAb175活性针对表达Δ2-7EGFR的异种移植物的抗瘤活性。
这时，平均肿瘤体积是100mm(图68A)。mAb175处理导致与用媒介物或mAb806处理比较总体肿瘤生长速率的减少，并且在接种后第19天当对照组由于伦理原因被处死时高度显著(与对照比较P＜0.0001和与mAb806比较P＜0.002)。在这时的平均肿瘤体积对于媒介
3
物、mAb806和mAb175处理组分别为1530、300和100mm(图68A)，证实mAb175活性针对表达Δ2-7EGFR的异种移植物的抗瘤活性。
[0983] 即使U87MG细胞表达约1×105EGFR/细胞，mAb 806也不能识别任何表面EGFR，并且并不令人惊讶地，不抑制U87MG体内生长。此外，这些细胞不共表达任何EGFR配体。进行关于EGFR表位是否瞬时暴露且因此能够在包含EGFR自分泌环的细胞中由mAb806和mAb175识别的研究。前列腺细胞系DU145表达以类似于U87MG细胞中观察到那种的水平的wtEGFR，然而，与U87MG细胞不同，DU145细胞包含TGF-α基因的扩增且因此显示EGFR/TGF-α自分泌环。如通过FACS分析测定的，mAb175和806都DU145细胞结合(图68B)，并且两者都能够免疫沉淀从这些细胞中提取的小比例EGFR(图68C)。2种技术都显示较大的mAb175结合，然而，当与结合L2结构域的mAb528比较时，mAb175和mAb806仅结合在这些细胞的表面上的EGFR亚型(图68B和图68C)。用第二种前列腺细胞系(LnCap)；(数据未显示)和结肠系(LIM1215)可见相似观察，这两者也包含EGFR自分泌环(Sizeland，A.M.和Burgess，A.W.(1992)Mol Cell Biol.3，1235-1243；Sizeland，A.M.和Burgess，A.W.(1991)Mol Cell Biol.11，4005-4014)。明确地，mAb806和mAb175可以识别在自分泌刺激环的存在下在细胞上的仅小比例EGFR。
[0984] 因为mAb175和mAb806与U87MG细胞相比更有效地结合DU145细胞中表达的EGFR，所以进行研究以分析这些抗体在裸鼠中生长的DU145异种移植物中的抗瘤活性。在治疗开始(在所示天数一周3次，进行3周)前，允许异种移植物建立18天。在这时，平均肿瘤体3
积是90mm(图68D)。mAb175和mAb806都抑制DU145异种移植物的生长。对照组在第67
3 3
天时被处死，并且与对于mAb806和mAb175组分别为605和815mm比较，具有1145mm 的平均肿瘤体积(分别为p＜0.007和0.02)(图68D)。
积是90mm(图68D)。mAb175和mAb806都抑制DU145异种移植物的生长。对照组在第67
3 3
天时被处死，并且与对于mAb806和mAb175组分别为605和815mm比较，具有1145mm 的平均肿瘤体积(分别为p＜0.007和0.02)(图68D)。
[0985] 与mAb806和mAb175的Fab片段接触的EGFR287-302的3D结构
[0986] 为了理解mAb806和mAb175如何可以识别以某些但并非全部构象的EGRF的分子细节，在与氧化EGFR287-302表位(分别以2.0和 分辨率，图69A&69B)的复合物中和单独地(分别以 和 分辨率)测定关于2种抗体的Fab片段的晶体结构。在2种情况下，游离和复合的Fab结构基本上相同，并且肽的构象和抗体的CDR环得到充分限定(图69)。表位采用β-带(ribbon)结构，其中带的一个边缘指向Fab，并且V299埋入抗原结合位点的中心处(图69C-E)。表位的2个末端暴露于溶剂，这与这些抗体结合长得多的多肽一致。
[0987] 在与表位接触的20个抗体残基中，在mAb806和mAb175之间仅存在2个置换(图65)。mAb175接触残基是：轻链S30、S31、N32、Y49、H50、Y91、F94、W96和重链D32、Y33、A34、Y51、S53、Y54、S55、N57、R59、A99、G100、R101；mAb806接触残基是相同的，具有对于轻链的序列差异N30和重链F33。EGFR287-302通过在肽残基293-302之间的紧密接触与Fab结合，其中大多数接触在残基297和302之间。EGFR287-302和Fab的主链原子之间的唯一氢键是关于残基300和302(图69F)。表位序列的识别通过与残基E293(对于Fab的H50和R101)、D297(对于Y51和N57)、R300(对于D32)和K301(经由水分子对于Y51和W96)的侧链氢键发生。疏水接触在G298、V299和C302进行。
[0988] 在293和302之间的表位主链构象在Fab806和Fab175晶体中是基本上等同的( 对于这些残基中的Cα原子)。尽管由二硫键约束，但肽的N末端(287-292)与任一抗体结构不进行显著接触，并且这个区域中的构象不同。然而，Fab806复合物中的这个区段看起来相当混乱。更令人感兴趣的是，与抗体接触的EGFR287-302肽构象与栓系或未栓系EGFR结构的主链中观察到的EGFR287-302构象非常紧密相关(Li等人，2005；
Garrett等人，2002)。对于来自Fab175复合物的EGFR287-302，在Cα位置中的rms偏差分别为0.66和 (图69)。
Garrett等人，2002)。对于来自Fab175复合物的EGFR287-302，在Cα位置中的rms偏差分别为0.66和 (图69)。
[0989] 为了获得通过mAb806和mAb175的EGFR识别的进一步了解，在溶液、游离和15
806Fab的存在下，通过NMR光谱学研究 N标记的氧化肽EGFR287-302的构象(参见材料与方法)。对于游离肽，指定共振，并且与对于随机螺旋的那些比较。基本上，游离肽采用随机螺旋结构，不是如在天然EGFR中可见的β带(Garrett等人(2002)Cell 20；110，763-773)。
806Fab的存在下，通过NMR光谱学研究 N标记的氧化肽EGFR287-302的构象(参见材料与方法)。对于游离肽，指定共振，并且与对于随机螺旋的那些比较。基本上，游离肽采用随机螺旋结构，不是如在天然EGFR中可见的β带(Garrett等人(2002)Cell 20；110，763-773)。
[0990] 在Fab添加后，观察到共振位移。然而，由于起于在Fab添加后拓宽的显著线的弱信号和复合物的成功结晶，未进一步追踪Fab806-表位复合物的溶液结构。尽管明确，但当肽与mAb806(或mAb175)的Fab片段结合时，看起来Fab选择或诱导匹配天然受体中的该肽的肽构象。
[0991] 为了研究mAb806和mAb175为何仅识别EGFR的某些构象，通过叠加EGFR287-302，将mAb175的Fab片段对接到EGFR(栓系和未栓系的单体)的细胞外结构域上。对于Δ2-7样片段，不存在与受体的显著立体冲突。在未栓系形式中，存在埋入的Fab基本上更可接近的表面积( 与栓系形式中的 比较)。因此，这种抗原可以与抗体的非CDR区域进行另外接触，如由酵母表达突变体指示的(Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342，539-550)。
相反，将整个EGFR胞外域对接到Fab上，存在与在表位(残基187-286)前且运行通过Fab的中心的部分CR1结构域的大量空间重叠(图69D和69E)。因此，因为CR1结构域在栓系或未栓系构象中具有基本上相同的结构，所以mAb806或mAb175将不能与任一形式的EGFR结合。明确地，关于以wtEGFR的已知构象的CR1结构域和允许表位结合的定向，在表位的定向之间必须存在差异。CR1结构域的检查指示在EGFR287-302前的二硫键(271-283)约束阻断对表位的接近的多肽；这个二硫键的破坏即使不涉及与抗体的直接结合，也将预期允许CR1结构域的部分解折叠，从而使得mAb175或mAb806可以获得对表位的接近。
相反，将整个EGFR胞外域对接到Fab上，存在与在表位(残基187-286)前且运行通过Fab的中心的部分CR1结构域的大量空间重叠(图69D和69E)。因此，因为CR1结构域在栓系或未栓系构象中具有基本上相同的结构，所以mAb806或mAb175将不能与任一形式的EGFR结合。明确地，关于以wtEGFR的已知构象的CR1结构域和允许表位结合的定向，在表位的定向之间必须存在差异。CR1结构域的检查指示在EGFR287-302前的二硫键(271-283)约束阻断对表位的接近的多肽；这个二硫键的破坏即使不涉及与抗体的直接结合，也将预期允许CR1结构域的部分解折叠，从而使得mAb175或mAb806可以获得对表位的接近。
[0992] EGFR 271-283二硫键的破坏增加mAb806结合
[0993] 蛋白质中的二硫键提供了增加的结构刚度，但在某些细胞表面受体中特别是用于细胞因子和生长因子的那些中，二硫键的瞬时破坏和二硫键更换可以控制受体的功能(Hogg，P.J.(2003)Trends in biochemical sciences 28，210-214)。因为这是通过其mAb806和mAb175可以获得对其结合位点的接近的一种机制，所以通过使在位置271和283上的任何一个或两个半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基(C271A/C283A)，尝试增加表位的可接近性。能够表达全长C271A-、C283A-或C271A/C283A-EGFR的载体转染到IL-3依赖性Ba/F3细胞系内。选择以等价于wtEGFR的水平表达C271A-和C271A/C283A-EGFR突变体的稳定Ba/F3克隆(图70A。未观察到表达高水平的突变体C283A-EGFR的Ba/F3细胞。如先前描述的，wtEGFR与mAb806弱反应；然而，突变型受体与mAb528、mAb806和抗FLAG抗体同样强烈地反应，暗示受体在细胞表面上表达，正确折叠并且对于mAb806的表位在此情况下是完全可接近的。为了证实mAb806比wtEGFR更有效地识别C271A/C283A突变体，测定mAb806结合与mAb528结合的比。因为野生型和C271A/C283A EGFR都是N末端FLAG标记的，所以还测定了mAb806和mAb528与M2抗体结合的比。如先前报道的，mAb806仅识别在Ba/F3细胞的表面上表达的小部分的总wtEGFR(mAb806/528结合比是0.08)(表8)。相比之下，mAb806识别在细胞表面上表达的基本上所有C271A/C283A突变型EGFR(mAb806/528结合比1.01)(图70A和表8)。
[0994] 表8
[0995] mAb806与表达野生型或C271A/C283A EGFR的细胞的反应性
[0996]
[0997] *关于4个独立克隆的平均值。
[0998] 2个半胱氨酸的突变不损害EGF结合或受体功能。表达C271A/C283A EGFR突变体的BaF3细胞在EGF的存在下增殖(图70B)。再现地观察到关于EGF在表达C271A/C283A突变的细胞中的剂量应答曲线中的左移，暗示对于配体更高的亲和力或对于突变型受体增强的信号潜力。蛋白质印迹分析证实C271A/C283A突变体以与wtEGFR相似的水平表达，并且响应EGF刺激是酪氨酸磷酸化的(图70C)。与在其他细胞系中的先前研究一致，mAb806对在体外EGF诱导的表达wtEGFR的Ba/F3细胞的增殖没有作用，而配体阻断mAb528完全抑制EGF诱导的这些细胞的增殖(图70D，左图)。相比之下，mAb806完全消除表达C271A/C283A突变体的BaF3细胞中EGF诱导的增殖(图70D，右图)。当271-283半胱氨酸环被破坏时，不仅mAb806更有效地结合，而且在结合后，mAb806阻止配体诱导的增殖。
[0999] 表9
[1000] 数据收集和精修统计学
[1001] 数据收集
[1002]
[1003] 精修
[1004]
[1005] 讨论
[1006] 用EGFR287-302表位的结构研究显示mAb806和mAb175都识别wtEGFR结构中的相同3D结构基序，指示这种主链构象也在Δ2-7EGFR中出现且暴露。然而，关键的是，这些结构中的表位定向会阻止抗体对相关氨基酸的接近。这与mAb806在生理水平不结合在细胞表面上表达的wtEGFR的实验观察一致。
[1007] 用EGFRC271A/C283A突变体的结果指示CR1结构域可以打开，以允许mAb806和mAb175与这种突变型受体化学计量地结合。这种突变型受体仍可以采取天然构象，因为它对EGF刺激是充分响应的，但与wtEGFR不同，由mAb806充分抑制。如果具有这个二硫键破坏的错误折叠形式的EGFR存在于癌细胞的表面上，那么数据明确显示它将能够起始细胞信号传导且应由mAb806或mAb175抑制。
[1008] 数据的另一个解释是在配体激活过程中，受体的结构重排可以诱导在表位附近的局部解折叠，允许受体采用允许结合的构象。在晶体结构中，表位位于EGFR胞外域的物理中心附近，并且对表位的接近通过折叠的CR1结构域和EGFR胞外域的四级结构阻断。在栓系和未栓系的构象中，CR1结构域的完整性通过与L1：配体：L2结构域(未栓系的)或L2：CR2结构域(栓系的)的另外相互作用得到稳定。然而，表位区域具有在胞外域中发现的最高热参数中的一些：mAb806/175表位是结构上不稳定的。在受体激活过程中，当受体经历在栓系和未栓系的构象之间的转变时，mAb806和mAb175可以接近表位。因此，在分子水平，这些机制可以促成mAb806和mAb175与正常细胞可忽略不计的结合，和与具有超表达和/或激活EGFR的肿瘤细胞基本上更高水平的结合。
[1009] 实施例24
[1010] 单克隆抗体124和1133
[1011] 如上文实施例1中讨论的，mAb124和mAb1133与mAb806同时生成，并且发现展示与本文讨论的mAb806的独特性质相似的性质，特别是对于超表达的野生型EGFR的特异性。
[1012] 最初筛选在New York进行(Jungbluth等人(2003)A Monoclonal Antibody Recognizing Human Cancers with Amplification/Over-Expression of the Human Epidermal Growth Factor Receptor PNAS.100，639-644。进行ELISA竞争评价和Biacore分析，以测定mAb124和/或mAb1133是识别与mAb806等同的表位还是识别替代的EGFR决定簇。
[1013] FACS分析
[1014] 通过FACS评价与U87MG.Δ2-7、A431和HN5细胞的抗体结合。所有抗体展示与mAb806的那种相似的特异性，具有对于de2-7EGFR的强结合和对于超表达的野生型EGFR的低结合。
[1015] 竞争ELISA
[1016] 进行一系列竞争ELISAs，以测定124和1133抗体是否与mAb806表位竞争。简言之，EGFR的变性可溶结构域(sEGFR)包被在ELISA板上。未标记的124或1133抗体随后跨越板以增加浓度加入。在洗涤后，将生物素化的mAb806加入每个孔中，以测定它是否仍可以结合sEGFR。使用链霉亲和素缀合的HRP实现结合mAb806的检测。如果抗体结合与mAb806相同(或重叠)的表位，那么不预期mAb806结合。
[1017] 结果在表10中概括。对于mAb124和mAb1133观察到浓度依赖性抑制结合作用：mAb806结合随着未标记抗体浓度下降而增加，暗示124和1133抗体识别与mAb806等同的表位或紧密接近的表位。
[1018] 表10
[1019] 概括mAb124和mAb1133与sEGFR的竞争ELISA结合。
[1020]未标记的阻断抗体 生物素标记的806的结合
124 无
1133 无
806(用于抑制的对照) 无
无关IgG2b ++++
124 无
1133 无
806(用于抑制的对照) 无
无关IgG2b ++++
[1021] FACS分析：细胞结合竞争
[1022] U87MG.Δ2-7细胞与未标记的抗体124、1133预温育。在测定中包括阳性对照806和同种型对照。洗涤细胞，并且随后用Alexa488缀合的mAb806染色，并且通过FACS测定806结合水平。
[1023] 结果在表11中概括。124和1133抗体阻断mAb806与细胞表面的结合，指出与mAb806等同的表位或紧密接近的表位的识别。
[1024] 表11
[1025] FACS分析：U87MG.Δ2-7细胞结合竞争
[1026]未标记的阻断抗体 Alexa488-标记的806的抑制
124 +++
1133 +++
806 ++++
IgG2b对照 无
124 +++
1133 +++
806 ++++
IgG2b对照 无
[1027] BIAcore分析：与mAb806肽表位的结合
[1028] 包含mAb806表位的EGFR氨基酸序列287CGADSYEMEEDGVRKC302(SEQ ID NO：14)作为肽合成，且在生物传感器芯片上固定。测量抗体124、1133和806(200nM)与这种肽的结合。所获得的最大结合共振单位(RU)在表12中概括。124、1133显示与肽的明确结合，证实806肽表位的识别。
[1029] 表12
[1030] BIAcore分析：与mAb806肽表位的最大结合
[1031]抗体 与mAb806肽的结合(RU)
806 1100
124 1000
1133 800
806 1100
124 1000
1133 800
[1032] 讨论
[1033] 如本实施例中所示，mAb124和mAb1133与由mAb806识别的EGFR肽结合，并且阻断mAb806与EGFR的细胞外结构域和表达de2-7EGFR的细胞的结合。因此，这3种抗体识别在EGFR上的相同决定簇。
[1034] 实施例25
[1035] ch806的临床测试
[1036] 设计临床研究以检查在具有不同肿瘤类型的患者中在肿瘤靶向/生物分布/药代动力学分析中ch806的体内特异性。
[1037] 1.材料与方法
[1038] 试验设计
[1039] 这个首次人体试验是开放(open label)、剂量逐步上升的I期研究。主要目的是评估在具有表达806抗原的晚期肿瘤的患者中ch806的单次输注的安全性。次要研究目的是测定111In-ch806的生物分布、药代动力学和肿瘤摄取；测定患者对ch806的免疫应答；和评价ch806的临床活性的早期证据。选择单一剂量用于这个研究，以便最佳地评价ch806对于在肿瘤上表达的EGFR的体内特异性。在研究开始前，该方案得到Human Research and Ethics Committee of the Austin Hospital批准。试验在Australian Therapeutic Goods Administration Clinical Trials Exemption(CTX)方案下进行。所有患者都给出书面知情同意书。
[1040] 合格标准包括：基于存档肿瘤样品(如果存档肿瘤样品的免疫组织化学评价显示对于806表达阳性的任何细胞，那么肿瘤定义为806阳性的，参见下文)的生色原位杂交或免疫组织化学，对于806抗原表达阳性的晚期或转移性肿瘤；组织学或细胞学证明的恶性肿瘤；在CT扫描上具有至少一个病灶≥2cm的可测量疾病；至少3个月的预期存活；Karnofsky机能量表(KPS)≥70；足够的血液学、肝脏和肾功能；年龄＞18岁；并且能够给出知情同意书。淘汰标准包括：活性中枢神经系统转移灶(除非得到充分治疗且稳定)；在研究进入前4周内的化学治疗、免疫治疗、生物学治疗或放射治疗；先前抗体暴露[除非没有人抗嵌合抗体(HACA)的证据]；未能从先前癌症治疗的作用中完全恢复；全身性皮质类固醇或免疫抑制剂的同时使用；不受控制的感染或其他严重疾病；妊娠或哺乳；未使用医学上可接受的避孕手段的具有分娩潜力的女性。
[1041] 患者接受经过60分钟通过在生理盐水/5％人血清白蛋白中的静脉内输注用111
铟-111( In，200-280MBq；5-7mCi)痕量标记的ch806的单次输注。计划的剂量逐步上升
2
意指患者加入4个剂量水平之一：5、10、20和40mg/m。选择这些剂量，以允许评价ch806对于在肿瘤上表达的EGFR的特异性，且测定任何正常组织区室在体内是否结合ch806(且影响药代动力学或生物分布)。在所有患者中评估生物分布、药代动力学和免疫应答。
铟-111( In，200-280MBq；5-7mCi)痕量标记的ch806的单次输注。计划的剂量逐步上升
2
意指患者加入4个剂量水平之一：5、10、20和40mg/m。选择这些剂量，以允许评价ch806对于在肿瘤上表达的EGFR的特异性，且测定任何正常组织区室在体内是否结合ch806(且影响药代动力学或生物分布)。在所有患者中评估生物分布、药代动力学和免疫应答。
[1042] 在111In-ch806输注后第0天、第1天、第2或3天、第4或5天和第6或7天，执行用于评价生物分布和肿瘤摄取的全身γ照相机成像。在这些时间点时以及另外在第14天(±2天)和第21天(±2天)，获得用于药代动力学的血样。在基线时和每周一次，获得用于评价HACA水平的血样，直到第30天。在每次研究就诊时执行毒性评价。每周执行一次体格检查以及常规血液学和生物化学，直到研究结束(第30天)。在第30天时执行再分级。
[1043] 剂量逐步上升标准
[1044] 在加入任何另外患者前，对在每个剂量水平时的第一个患者观察4周。如果在ch806输注4周内在前2个患者的任何中未观察到剂量限制性毒性(DLT)，那么随后4个患者进入下一个最高剂量滴度。如果2个患者的任何群(cohort)中的一个患者在从第一个剂量的4周内经历DLT，那么另外4个患者(最大6个)进入该剂量水平。如果在任何剂量水平中的6个中的仅仅一个患者经历≥3级毒性，那么后续患者进入下一个剂量水平。
[1045] DLT定义为3级非血液学毒性，或4级血液学毒性，如通过NCI CommonTerminology Criteria for Adverse Events(CTCAE v3.0)测定的。最大耐受剂量(MTD)定义为低于其中6个中的2个或更多个患者经历DLT的剂量的ch806剂量。
[1046] ch806的放射性标记
[1047] 临 床 级 别 的ch806 在 Biological Production Facility of the Ludwig Institute for Cancer Research，Melbourne，澳大利亚中产生。根据先前描述的方法(Scott等人(2000)Cancer Res 60，3254-3261；Scott等人(2001)J.Clin.Oncol.19(19)，111
3976-3987)，抗体ch806经由双官能金属离子螯合物CHX-A″-DTPA用 In(MDS Nordion，Kanata，加拿大)进行标记。
3976-3987)，抗体ch806经由双官能金属离子螯合物CHX-A″-DTPA用 In(MDS Nordion，Kanata，加拿大)进行标记。
[1048] γ照相机成像
[1049] 在111In-ch806输注后第0天时，和在输注后直到第7天至少3个进一步机会时，111
在所有患者中获得 In-ch806生物分布的全身图像。在这个时期过程中的至少一个机会时还获得具有已知肿瘤的身体区域的单光子发射计算机体层摄影(SPECT)图像。在双头γ照相机(Picker International，Cleveland，OH)上获得所有γ照相机图像。
在所有患者中获得 In-ch806生物分布的全身图像。在这个时期过程中的至少一个机会时还获得具有已知肿瘤的身体区域的单光子发射计算机体层摄影(SPECT)图像。在双头γ照相机(Picker International，Cleveland，OH)上获得所有γ照相机图像。
[1050] 药代动力学
[1051] 在第0天-111In-ch806输注前时；随后在111In-ch806输注后5分钟、60分钟、2小时和4小时、第1天、第2或3天、第4或5天和第6或7天时，收集用于药代动力学分析的血液。在第14天(±2天)和第21天(±2天)和第30天(±2天)时，也获得用于ch806蛋白质的药代动力学的更多血液。
[1052] 对血清样品一式两份地等分，且连同合适的111In标准一起在γ闪烁计数器(Packard Instruments，Melbourne，澳大利亚)中计数。血清的结果表示为％注射剂量/40
升(％ID/L)。使用用于在人血清中ch806蛋白质的免疫化学测量的验证方案 ，执行在每次输注后患者血清ch806蛋白质水平的测量。关于在血清样品中的ch806的定量极限是
70ng/mL。所有样品一式三份地测定，并且通过至少1∶2的系数进行稀释。ch806的测量血清水平表示为μg/mL。
升(％ID/L)。使用用于在人血清中ch806蛋白质的免疫化学测量的验证方案 ，执行在每次输注后患者血清ch806蛋白质水平的测量。关于在血清样品中的ch806的定量极限是
70ng/mL。所有样品一式三份地测定，并且通过至少1∶2的系数进行稀释。ch806的测量血清水平表示为μg/mL。
[1053] 在输注后对血清111In-ch806测量执行药代动力学计算，并且ELISA测定患者血清ch806蛋白质水平，其中使用曲线拟合程序(WinNonlin Pro Node 5.0.1，Pharsight Co.，1 1
Mountain View，CA)。对于下述参数测定估计值：T/2α和T/2β(处置初和末期的半衰期)；V1，中央区室的体积；Cmax(最大血清浓度)；AUC(外推至无限时间的血清浓度曲线下面积)；和CL(总血清清除)。
Mountain View，CA)。对于下述参数测定估计值：T/2α和T/2β(处置初和末期的半衰期)；V1，中央区室的体积；Cmax(最大血清浓度)；AUC(外推至无限时间的血清浓度曲线下面积)；和CL(总血清清除)。
[1054] 111In-ch806的全身清除以及肿瘤和器官剂量测定法
[1055] 基于每个个别患者111In-ch806输注图像数据集中的目的区域，执行全身和正常器官(肝脏、肺、肾和脾)剂量测定法计算，允许使用OLINDA对于最终剂量测定法结果计算累积活性和分析(Stabin等人(2005)J.Nucl.Med.46(6)，1023-1027)。在每个时间点111
时在 In-ch806图像数据集上还对于合适肿瘤限定目的区域，对于本底和减弱进行校正，
111
并且执行剂量测定法计算，以得到以肿瘤/克表示的 In-ch806浓度(Scott等人(2005)Clin.Cancer Res.11(13)，4810-4817)。基于注射的mg ch806蛋白质剂量，将其转换为μg ch806/克肿瘤组织。
时在 In-ch806图像数据集上还对于合适肿瘤限定目的区域，对于本底和减弱进行校正，
111
并且执行剂量测定法计算，以得到以肿瘤/克表示的 In-ch806浓度(Scott等人(2005)Clin.Cancer Res.11(13)，4810-4817)。基于注射的mg ch806蛋白质剂量，将其转换为μg ch806/克肿瘤组织。
[1056] HACA分析
[1057] 在ch806输注前随后每周一次直到ch806输注后30天时，获得用于HACA评价的血样。如先前描述的(Scott等人，2005；Liu等人(2003)Hybrid Hybridomics 22(4)，219-28；Ritter等人(2001)Cancer Res.61(18)，685-6859)，通过ELISA和通过表面等离子体共振技术使用BIAcore2000仪器分析样品。
[1058] 免疫组织化学方法
[1059] 如下免疫染色来自试验上每个患者的福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织：简言之，在Target Retrieval Solution，pH 6.0(10分钟；Dako，Glostrup，Denmark)中微波抗原修复前，将4μm石蜡包埋的组织切片固定到 Plus载玻片
(Menzel-Glaser，德国)上，脱石蜡且再水合。切片随后用3％H2O2处理10分钟，以消除内源过氧化物酶，且在室温与m806抗体(4μg/ml)或合适浓度的同种型匹配的阴性对照抗体(IgG2b；Chemicon，Temecula，CA)一起温育60分钟。使用PowerVision Kit(ImmunoVision Technologies，Brisbane，CA)检测抗体结合。为了允许免疫染色的显现，切片与色原3-氨基-9-乙基咔唑(0.4％，Sigma Chemical Co.MO，USA)一起温育10分钟，并且用Mayer’s苏木精复染。通过省略初次抗体制备用于免疫染色程序的阴性对照。结果表示为阳性肿瘤细胞染色的百分率。
(Menzel-Glaser，德国)上，脱石蜡且再水合。切片随后用3％H2O2处理10分钟，以消除内源过氧化物酶，且在室温与m806抗体(4μg/ml)或合适浓度的同种型匹配的阴性对照抗体(IgG2b；Chemicon，Temecula，CA)一起温育60分钟。使用PowerVision Kit(ImmunoVision Technologies，Brisbane，CA)检测抗体结合。为了允许免疫染色的显现，切片与色原3-氨基-9-乙基咔唑(0.4％，Sigma Chemical Co.MO，USA)一起温育10分钟，并且用Mayer’s苏木精复染。通过省略初次抗体制备用于免疫染色程序的阴性对照。结果表示为阳性肿瘤细胞染色的百分率。
[1060] 生色原位杂交方法
[1061] 在用 Tissue Pre-treatment Kit(Zymed Laboratories Inc.SouthSan Francisco，CA)预处理前，来自试验上每个患者的福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织进行切片，且固定到 Plus载玻片上，脱石蜡且再水合。切片随后用
EGFR DNA探针覆盖，在95℃变性10分钟并且在37℃温育过夜。在杂交后，
TM
载玻片在0.5X SSC中洗涤。使用 CISH Polymer Detection Kit执行探针
的检测。在＞25％癌细胞中显示信号簇或≥5次个别信号的切片视为具有与m806反应性相关的EGFR基因的扩增。
EGFR DNA探针覆盖，在95℃变性10分钟并且在37℃温育过夜。在杂交后，
TM
载玻片在0.5X SSC中洗涤。使用 CISH Polymer Detection Kit执行探针
的检测。在＞25％癌细胞中显示信号簇或≥5次个别信号的切片视为具有与m806反应性相关的EGFR基因的扩增。
[1062] 2.结果
[1063] 患者
[1064] 8个患者(1个女性和7个男性；平均年龄61岁(范围44-75)]完成这个试验(表16)。主要肿瘤部位、先前治疗史和在研究进入时的疾病部位也显示于表16中。所有8个患者在存档肿瘤中具有806抗原阳性(表16)。
[1065] 所有患者满足纳入标准，并且除患者8(其具有原发性脑瘤)外，在研究进入时全部具有转移性疾病。分类为靶病灶的疾病部位包括：肺(5个患者)、脑(1个患者)、淋巴结(1个患者)、声门上(supraglottis)(1个患者)。转移性疾病的其他部位(非靶病灶)包括肾上团块、骨和淋巴结(表16)。Karnofsky机能状态中值是90(范围80-100)。
[1066] 表16
[1067] 患者特征
[1068]
[1069] 缩写：F＝女性；M＝男性；NSCLC＝非小细胞肺癌；SCC＝鳞状细胞癌；RT＝放射治疗；CT＝化学治疗；LN＝淋巴结；PD＝进行性疾病；SD＝稳定疾病*对于de2-7EGFR表达阳性 对于EGFR基因扩增阳性。
[1070] 不利事件和HACA
[1071] 与ch806相关的不利事件在表17和18中列出。未观察到输注相关的不利事件。不存在DLT，并且因此未达到MTD。在研究者的判断中可能可归于ch806的主要毒性是：短暂瘙痒(pruritis)、轻度恶心、疲劳/嗜睡、以及对ALP和GGT血清水平的可能作用。观察到在患者5中在GGT水平中的CTC2级升高，然而，这在基线1级升高的本底上，并且在性质上是瞬时的。报道了3个严重不利事件(SAEs)，并且无一归于ch806。总之，ch806在所有剂量水平时是安全和良好耐受的，其中观察到一般可预测和可管理的微小毒性。由于可用于试验的cGMP ch806的有限量，不执行进一步的剂量逐步上升。
[1072] 在8个患者的唯一一个(患者1)中观察到对ch806的阳性免疫应答(具有ELISA和BIAcore方法的一致性)。
[1073] 表17
[1074] 与ch806相关的不利事件的发生
[1075]
[1076] *数目代表在每个剂量水平任何事件的发作数目。
[1077] 表18
[1078] 研究试剂相关的不利事件的分布
[1079]
[1080] *患者数目。
[1081] ch806的放射性标记
[1082] 存在在试验过程中施用的总共8次111In-ch806输注。111In-ch806的平均值(±SD)放射化学纯度和免疫反应性分别测量为99.3±0.1％和77.4±7.0％。
[1083] ch806的生物分布
[1084] 在所有剂量水平下在患者中111In-ch806生物分布的最初模式与血池活性一致，所111
述血池活性随着时间过去逐步清除。在注射后一周时期，在肝脏和脾中的 In-ch806摄取
111
与 In-螯合物代谢产物通过网状内皮系统的正常清除一致。在所有剂量水平在所有患者
111
的靶病灶(≥2cm)中观察到 In-ch806的特异性定位(图94)，包括定位于肺(患者1、3、
4、5和7)、腹部(患者1和2)、和右侧颈部中的声门上区域(患者6)中的靶病灶。在脑瘤
111 111
(患者8)中 In-ch806的高摄取也得到证实(图95)。重要的是，在肿瘤中 In-ch806的摄取不取决于806抗原表达的水平。例如，患者4证实通过肺靶病灶的高摄取，尽管在存档
111
肿瘤中通过IHC对于806反应性＜10％阳性(图96)。在患者4中在靶病灶中 In-ch806的这个摄取程度与患者3中可见的那种相当，其中50-75％肿瘤细胞对于在存档的样品免疫组织化学上的806抗原染色是阳性的(图96)。
述血池活性随着时间过去逐步清除。在注射后一周时期，在肝脏和脾中的 In-ch806摄取
111
与 In-螯合物代谢产物通过网状内皮系统的正常清除一致。在所有剂量水平在所有患者
111
的靶病灶(≥2cm)中观察到 In-ch806的特异性定位(图94)，包括定位于肺(患者1、3、
4、5和7)、腹部(患者1和2)、和右侧颈部中的声门上区域(患者6)中的靶病灶。在脑瘤
111 111
(患者8)中 In-ch806的高摄取也得到证实(图95)。重要的是，在肿瘤中 In-ch806的摄取不取决于806抗原表达的水平。例如，患者4证实通过肺靶病灶的高摄取，尽管在存档
111
肿瘤中通过IHC对于806反应性＜10％阳性(图96)。在患者4中在靶病灶中 In-ch806的这个摄取程度与患者3中可见的那种相当，其中50-75％肿瘤细胞对于在存档的样品免疫组织化学上的806抗原染色是阳性的(图96)。
[1085] 药代动力学
[1086] 关于111In-ch806的单次输注的个别患者药代动力学参数T1/2α和T1/2β、V1、Cmax、AUC和CL显示于表19中。Kruskal-Wallis秩和检验应用于α和β半衰期、V1和清除。在剂量水平之间未观察到显著差异(P＞0.05)。
[1087] 关于合并群体ELISA数据的药代动力学曲线拟合显示于图97中。平均1 1
值±SD药代动力学参数是T/2α29.16±21.12小时、T/2β172.40±90.85小 时、
V12984.59±91.91ml和CL 19.44±4.05ml/小时。对于每个患者测量的峰和谷ch806血清浓度(Cmax和Cmin)数据呈现于表20中。如预期的，用每个剂量水平对于Cmax和Cmin观察到
111
线性关系。对于ch806ELISA药代动力学数据测定的平均值±SD值与对于 In-ch806药代动力学数据获得的值良好一致(表19)。
值±SD药代动力学参数是T/2α29.16±21.12小时、T/2β172.40±90.85小 时、
V12984.59±91.91ml和CL 19.44±4.05ml/小时。对于每个患者测量的峰和谷ch806血清浓度(Cmax和Cmin)数据呈现于表20中。如预期的，用每个剂量水平对于Cmax和Cmin观察到
111
线性关系。对于ch806ELISA药代动力学数据测定的平均值±SD值与对于 In-ch806药代动力学数据获得的值良好一致(表19)。
[1088] 表19
[1089] 在每个剂量水平和跨越所有剂量水平对于111In-CHX-A″-DTPA-ch806的平均值±SD药代动力学参数估计值
[1090]
[1091] 表20
[1092] 通过ELISA分析测定的Cmax和Cmin S血清ch806水平
[1093]
[1094] *Cmax＝注射后60分钟；Cmin＝第7天 第8天血清水平。
[1095] 111In-ch806的剂量测定法
[1096] 跨越所有剂量水平在所有患者中的全身清除是相似的，具有948.6±378.6小时的T1/2生物学(平均值±SD)。由于相对短的物理半衰期，生物半衰期的计算对有效半衰期中的小改变是非常敏感的。在剂量水平之间在全身清除中不存在统计显著差异[Kruskal-Wallis秩和检验：P-值＝0.54](图98)。
[1097] 111In-ch806从正常器官(肝脏、肺、肾和脾)中的清除未显示出剂量水平之间的差异，并且平均T1/2有效分别计算为78.3、48.6、69.7和66.2小时。在这些正常器官之间在清除中不存在统计上显著的差异。特别地，肝脏清除未显示出剂量水平之间的差异(图98)，指示对于ch806在肝脏中没有可饱和的抗原区室。
[1098] 对于6个患者完成肿瘤剂量测定法分析。患者1和2具有接近于心脏血池的靶病111
灶，或在某些图像采集过程中的移动，这阻止精确分析。测量的 In-ch806峰摄取在输注-3
后5-7天出现，并且范围为5.2-13.7 x 10 ％注射剂量/克肿瘤组织。
灶，或在某些图像采集过程中的移动，这阻止精确分析。测量的 In-ch806峰摄取在输注-3
后5-7天出现，并且范围为5.2-13.7 x 10 ％注射剂量/克肿瘤组织。
[1099] 临床活性的评价
[1100] 在这一个月研究期完成时，发现5个患者具有稳定疾病，并且3个患者具有进行性2
疾病(表16)。令人感兴趣的是，一个患者(患者7，40mg/m剂量水平)在研究期过程中具有可触摸耳淋巴结的瞬时皱缩的临床证据(在细针抽吸物上证明为转移性SCC)，这暗示ch806可能的生物学活性。然而，这个患者在研究完成时已通过RECIST证实进行性疾病。
疾病(表16)。令人感兴趣的是，一个患者(患者7，40mg/m剂量水平)在研究期过程中具有可触摸耳淋巴结的瞬时皱缩的临床证据(在细针抽吸物上证明为转移性SCC)，这暗示ch806可能的生物学活性。然而，这个患者在研究完成时已通过RECIST证实进行性疾病。
[1101] 另外数据
[1102] 如报道的，8个患者[1个女性和7个男性；平均年龄61岁(范围44-75)]完成这个1期试验(Scott等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104，4071-4076)。所有患者都满足纳入标准，并且除患者8(其具有原发性脑瘤)外，在研究进入时全部具有转移性疾111
病。在所有患者中可见通过肿瘤的Ab摄取，并且 In-ch806，嵌合形式的mAb806，证实在
111
肿瘤中迅速和高水平的摄取(图71)。 In-ch806从正常器官(肝脏、肺、肾和脾)中的清除未显示出剂量水平之间的差异(Scott等人，2007)。特别地，肝脏清除未显示出剂量水平之间的差异，指示对于ch806在肝脏中没有可饱和的抗原区室。总肝脏摄取是紧接输注后
14.45±2.43％ID的最大限度，并且到72小时下降到8.45±1.63％ID，并且到输注后一周下降到3.18±0.87％ID。这与针对wtEGFR的抗体(例如225)的摄取形成鲜明对比，所述抗体已显示对于输注后在3天期间在肝脏中达到超过30％ID(对于40mg剂量)(Divgi
111
等人(1991)J.Natl.Cancer Inst.83，97-104)。测量的 In-ch806峰肿瘤摄取在输注后
5-7天出现。由于靶病灶与心脏血池的接近和患者移动，患者1和3中的定量肿瘤摄取的计-3
算无法精确进行。在肿瘤中的峰ch806摄取范围为5.21-13.73 x 10 ％注射剂量/克肿m2
瘤组织。在肿瘤中的实际ch806浓度的计算显示(平均值±SD)0.85±0μg/gm(5mg/ )、m2 2 2
0.92±0μg/gm(10mg/ )、3.80±1.10μg/gm(20mg/m)和 7.05±1.40μg/gm(40mg/m)的峰值。
病。在所有患者中可见通过肿瘤的Ab摄取，并且 In-ch806，嵌合形式的mAb806，证实在
111
肿瘤中迅速和高水平的摄取(图71)。 In-ch806从正常器官(肝脏、肺、肾和脾)中的清除未显示出剂量水平之间的差异(Scott等人，2007)。特别地，肝脏清除未显示出剂量水平之间的差异，指示对于ch806在肝脏中没有可饱和的抗原区室。总肝脏摄取是紧接输注后
14.45±2.43％ID的最大限度，并且到72小时下降到8.45±1.63％ID，并且到输注后一周下降到3.18±0.87％ID。这与针对wtEGFR的抗体(例如225)的摄取形成鲜明对比，所述抗体已显示对于输注后在3天期间在肝脏中达到超过30％ID(对于40mg剂量)(Divgi
111
等人(1991)J.Natl.Cancer Inst.83，97-104)。测量的 In-ch806峰肿瘤摄取在输注后
5-7天出现。由于靶病灶与心脏血池的接近和患者移动，患者1和3中的定量肿瘤摄取的计-3
算无法精确进行。在肿瘤中的峰ch806摄取范围为5.21-13.73 x 10 ％注射剂量/克肿m2
瘤组织。在肿瘤中的实际ch806浓度的计算显示(平均值±SD)0.85±0μg/gm(5mg/ )、m2 2 2
0.92±0μg/gm(10mg/ )、3.80±1.10μg/gm(20mg/m)和 7.05±1.40μg/gm(40mg/m)的峰值。
[1103] 讨论
[1104] 如本实施例中所示，本研究代表针对仅在超表达、突变型或配体激活形式EGFR上暴露的表位的嵌合抗体的生物分布和肿瘤靶向的首次报道。ch806显示在所有患者中肿瘤部位的极佳靶向，没有正常组织摄取的证据，并且没有显著毒性。ch806的这些体外和体内特征使其与靶向EGFR的所有其他抗体区分。
[1105] 在高达40mg/m2的剂量时，ch806是良好耐受的，未观察到DLT，并且未达到MTD。可能可归于ch806的主要毒性是短暂瘙痒、轻度恶心、疲劳/嗜睡、以及对ALP和GGT血清水平的可能作用。这些患者的恶性肿瘤晚期性质意指他们的疾病还可以是这些不利事件的促成因子。在可能涉及研究药物的不利事件中，所有都是轻度的，许多是自限性的，并且无一需要任何主动处理。重要的是，即使在最高剂量水平时，在任何患者中也未观察到皮疹或胃肠道紊乱。在这个单次剂量研究中ch806的极佳耐受性证明在重复剂量试验中测试的下一个步骤。
[1106] 在所有患者中ch806的生物分布显示血池活性的逐渐清除，并且没有明确的111
In-ch806正常组织摄取。ch806的极佳肿瘤摄取在所有患者中也是明显的，包括肺、淋巴结和肾上腺转移灶，以及在间皮瘤和神经胶质瘤中。这在所有剂量水平上观察到，包括5mg/
2
m(研究的最低剂量)，这是通过针对wtEGFR的其他抗体显现肿瘤中的摄取所需剂量的十
33
分之一到二十分之一 。与针对wtEGFR的抗体比较，在ch806的摄取中的这个差异可以归
33
于其大量正常组织(肝脏和皮肤)摄取，这是由于wtEGFR充当抗原槽(sink) 。此外，通
111
过存档肿瘤样品的免疫组织化学评价的， In-ch806的定位即使在具有低表达806的患者
111
中也很高(图96)。在神经胶质瘤中 In-ch806的摄取是特别令人难忘的(图97)，并且与在全身性或甚至局部输注后关于脑瘤的抗体靶向的任何公开数据相当。这个数据支持ch806对于由广泛范围的肿瘤表达的EGFR的独特选择性，并且证实在人中这种抗体的正常组织摄取的缺乏。
In-ch806正常组织摄取。ch806的极佳肿瘤摄取在所有患者中也是明显的，包括肺、淋巴结和肾上腺转移灶，以及在间皮瘤和神经胶质瘤中。这在所有剂量水平上观察到，包括5mg/
2
m(研究的最低剂量)，这是通过针对wtEGFR的其他抗体显现肿瘤中的摄取所需剂量的十
33
分之一到二十分之一 。与针对wtEGFR的抗体比较，在ch806的摄取中的这个差异可以归
33
于其大量正常组织(肝脏和皮肤)摄取，这是由于wtEGFR充当抗原槽(sink) 。此外，通
111
过存档肿瘤样品的免疫组织化学评价的， In-ch806的定位即使在具有低表达806的患者
111
中也很高(图96)。在神经胶质瘤中 In-ch806的摄取是特别令人难忘的(图97)，并且与在全身性或甚至局部输注后关于脑瘤的抗体靶向的任何公开数据相当。这个数据支持ch806对于由广泛范围的肿瘤表达的EGFR的独特选择性，并且证实在人中这种抗体的正常组织摄取的缺乏。
[1107] 药代动力学分析显示ch806具有超过一周的终末半衰期，并且没有111In-ch806血2
清清除的剂量依赖性。对于AUC、Cmax和Cmin也观察到线性关系，其中超过10mg/m的剂量
1 1
水平达到超过1μg/mL的谷血清浓度。V1、Cl、T/2α和T/2β值在剂量水平之间是一致的，并且与一般的IgG1人抗体相一致(Scott等人，2005；Steffens等人(1997)J.Clin.Oncol
15，1529-1537；Scott等人(2001)J.Clin.Oncol.19(19)，3976-3987)。当ELISA ch806计
111
算与 In-ch806测量比较时，ch806的清除也测定为较慢的。虽然这个差异可以通过研究患者的小数目加以解释，但对于ch806ELISA的更长取样时间点将支持这个值为更代表真实ch806清除。关于ch806的药代动力学值与迄今为止报道的其他嵌合抗体相当(Steffens等人，1997；Scott等人，2001)，并且支持ch806的每周一次给药方案。
清清除的剂量依赖性。对于AUC、Cmax和Cmin也观察到线性关系，其中超过10mg/m的剂量
1 1
水平达到超过1μg/mL的谷血清浓度。V1、Cl、T/2α和T/2β值在剂量水平之间是一致的，并且与一般的IgG1人抗体相一致(Scott等人，2005；Steffens等人(1997)J.Clin.Oncol
15，1529-1537；Scott等人(2001)J.Clin.Oncol.19(19)，3976-3987)。当ELISA ch806计
111
算与 In-ch806测量比较时，ch806的清除也测定为较慢的。虽然这个差异可以通过研究患者的小数目加以解释，但对于ch806ELISA的更长取样时间点将支持这个值为更代表真实ch806清除。关于ch806的药代动力学值与迄今为止报道的其他嵌合抗体相当(Steffens等人，1997；Scott等人，2001)，并且支持ch806的每周一次给药方案。
[1108] 定量剂量测定法和药代动力学结果指示对于在这个试验中评价的剂量水平对于ch806不存在可饱和的正常组织区室。重要的是，对药代动力学以及全身和肝脏器官清除的剂量依赖性的缺乏与针对wtEGFR的抗体的所有报道研究形成鲜明对比(Baselga J.和Artega C.L.(2005)J.Clin.Oncol.23，2445-2449；Divgi等人J.Natl.Cancer Inst.83(2)，97-104；Baselga J(2001)Eur.J.Cancer 37Suppl.4，S16-22；Gibson等 人 (2006)Clin.Colorectal Cancer 6(1)，29-31；Rowinsky等人(2004)J.Clin.Oncol.22，3003-3015；Tan等人(2006)Clin.Cancer Res.12(21)，6517-6522)，支持在人中ch806的肿瘤特异性和正常组织结合的缺乏。这些观察提供了关于ch806(或人源化形式)潜力的有力证据，以选择性靶向肿瘤中的EGFR，避免其他EGFR抗体和激酶抑制剂的正常毒性(特别是皮肤)(Lacouture AE(2006)Nature Rev.Cancer 6，803-812；Adams G.P.和Weiner L.M.(2005)Nat.Biotechnol.23(9)，1147-1157)，并且潜在达到更大的疗效。此外，有效负荷递送的可能性(由于mAb 806在肿瘤细胞中的快速内化)，和其中组合毒性可能降到最低的与其他生物制品例如EGFR抗体和酪氨酸激酶抑制剂的组合处理，得到来自这个试验的数据的强烈支持。这个研究提供了靶向对于肿瘤特异性的EGFR上的表位的能力的明确证据，并且这个独特方法对于癌症治疗的进一步临床开发正在进行中。
[1109] 实施例26
[1110] 序列比较
[1111] 在本文中阐述且比较了关于mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133和hu806各自的VH链和VL链CDRs。
[1112] 表13
[1113] 鼠抗体同种型和CDR序列比较(Kabat)1
[1114] A.可变轻链
[1115]
[1116] B.可变重链
[1117]
[1118] 1与mAb806CDR序列的差异是有下划线的。
[1119] 上文对于分别抗体同种型给出的CDRs基于Kabat分析。如对于本领域技术人员显而易见的，CDRs还可以基于其他分析进行限定，例如Kabat和Chothia定义的复合物。例如，对上述同种型应用复合Kabat和Chothia分析，关于各自同种型的VL链CDRs和VH链CDRs的序列如表14中所示。
[1120] 表14
[1121] 鼠抗体同种型和CDR序列比较(复合Kabat和Chothia)1
[1122] A.可变轻链
[1123]
[1124] B.可变重链
[1125]
[1126] 1与mAb806CDR序列的差异是有下划线的
[1127] 2参见共同未决的美国专利申请号10/145,598(美国专利号7,589,180)的图17[1128] 2参见共同未决的美国专利申请号10/145,598(美国专利号7,589,180)的图16。
[1129] 表15
[1130] mAb806和hu806 CDR序列比较(Kabat)1
[1131] A.可变轻链
[1132]
[1133] B.可变重链
[1134]1
[1135] 与mAb806 CDR序列的差异是有下划线的。
[1136] 如上所示，mAb806、mAb175、mAb124和mAb1133同种型的CDR序列是等同的，除了将预期引起同源蛋白质折叠用于表位识别的高度保守的氨基酸改变外。与上文实施例中提供的结合和其他数据累积地，这个数据显示这些同种型和hu806是紧密相关的家族成员变体，其显示对于mAb806在上文讨论的相同独特性质(例如与仅在超表达、突变或配体激活形式的EGFR中对于结合可接近的在EGFR上的表位结合，导致对于肿瘤表达的EGFR而不是正常组织中的wtEGFR的独特特异性)，并且证实特别具有不同CDR序列的独特可变区序列的抗体具有相同特征和结合能力。
[1137] 参考文献
[1138] Aboud-Pirak，E.，Hurwitz，E.，Bellot，F.，Schlessinger，J.，and Sela，M.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86，3778-3781.
[1139] Aboud-Pirak，E.，Hurwitz，E.，Pirak，M.E.，Bellot，F.，Schlessinger，J.，and Sela，M.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80，1605-1611.
[1140] Arteaga，C.1.and Baselga，J.(2004)Cancer Cell.5，525-531.
[1141] Ashley，D.M.，Batra，S.K.，and Bigner，D.D.“Monoclonal antibodies to growth factors and growth factor receptors：their diagnostic and therapeutic potential in brain tumors.”J.Neurooncol.，35：259-273，1997.
[1142] Atlas，I.，Mendelsohn，J.，Baselga，J.，Fair，W.R.，Masui，H.，and Kumar，R.“Growth regulation of human renal carcinoma cells：role of transforming growth factor a.”Cancer Res.，52：3335-3339，1992.
[1143] Baselga J，Pfistet D，Cooper MR，等人“Phase I studies of anti-epidermal growth factor receptor chimeric antibody C225alone and in combination with cisplatin.”J.Clin.Oncol.2000；18：904-14.
[1144] Baselga，1.(2006)Science.312，1175-1178.
[1145] Baselga，J.and Arteaga，C.L.(2005)J.Clin.Oncol.23，2445-2459.
[1146] Baselga，J.Clinical trials of Herceptin(R)(trastuzumab).Eur.J.Cancer，37：1824，2001.
[1147] Baselga，J.，Norton，L.，Albanell，J.，Kim，Y.M.，and Mendelsohn，J.“Recombinant humanized anti-HER2 antibody(Herceptin)enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts.”Cancer Res.，58：2825-2831，1998.
[1148] Baselga，J.，Norton，L.，Masui，H.，Pandiella，A.，Coplan，K.，Miller，W.H.，and Mendelsohn，J.“Antitumor effects of doxorubicin in combination with anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.”J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)，85：1327-1333，1993.
[1149] Baselga，J.，Pfister，D.，Cooper，M.R.，Cohen，R.，Burtness，B.，Bos，M.，D′Andrea，G.，Seidman，A.，Norton，L.，Gunnett，K.，Falcey，J.，Anderson，V.，Waksal，H.，and Mendelsohn，J.“Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin.”J.Clin.Oncol.18：904，2000.
[1150] Baselga，J.，Tripathy，D.，Mendelsohn，J.，Baughman，S.，Benz，C.C，Dantis，L.，Sklarin，N.T.，Seidman，A.D.，Hudis，C.A.，Moore，J.，Rosen，P.P.，Twaddell，T.，Henderson，1.C.，and Norton，L.“Phase II study of weekly intravenous recombinant humanized anti-pl85HER2monoclonal antibody in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer.”J.Clin.Oncol.，14：737-744，1996.[1151] Batra SK，Castelino-Prabhu S，Wikstrand CJ，等人“Epidermal growth factor ligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.”Cell Growth Differ.1995；6：1251-9.[1152] Bernier，J.(2006)Expert.Rev Anticancer Ther.6，1539-1552.
[1153] Bhattacharya-Chatterjee，M.，S.K.Chatterjee， 等 人 (2001). ″ The anti-idiotype vaccines for immunotherapy.″Curr.Opin.Mol.Ther.3(1)：63-9.Biol.Cell.13，4029-4044.
[1154] Bouyain，S.，Longo，P.A.，Li，S.，Ferguson，K.M.，and Leahy，D.J.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102，15024-15029.
[1155] Brady，L.W.，Miyamoto，C.，Woo，D.V.，Rackover，M.，Emrich，J.，Bender，H.，Dadparvar，S.，Steplewski，Z.，Koprowski，H.，Black，P.，等人“Malignant astrocytomas treated with iodine-125 labeled monoclonal antibody 425against epidermal growth factor receptor：a Phase I trial.”Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.，22：225-230，1992.
[1156] Brown，G.and N.Ling(1988).Murine Monoclonal Antibodies.Antibodies，Volume 1.A Practical Approach.D.Catty.Oxford，England，IRL Press：81-104.[1157] Burgess，A.W.，Cho，H.S.，Eigenbrot，C.，Ferguson，K.M.，Garrett，T.P.，Leahy，D.J.，Lemmon，M.A.，Sliwkowski，M.x.，Ward，C.W.，and Yokoyama，S.(2003)Mol.Cell.12，541-552.
[1158] Chao，G.，Cochran，1.R，and Wittrup，K.D.(2004)J.Mol.Biol.342，539-550.[1159] Cho，H.S.and Leahy，D.J.(2002)Science 297，1330-1333.
[1160] Cho，H.S.，Mason，K.，Ramyar，K.x.，Stanley，A.M.，Gabelli，S.B.，DelUley，D.W.，Jr.，and Leahy，D.J.(2003)Nature 421，756-760.
[1161] Clarke，K.，等人，”In vivo biodistribution of a humanized anti-Lewis Y monoclonal antibody(hu3S 193)in MCF-7xenografted BALB/c nude mice.”Cancer Res，2000.60(17)：p.4804-11.
[1162] Clarke，K.，Lee，F.T.，Brechbiel，M.W.，Smyth，F.E.，Old，L.J.，and Scott，A.M.“Therapeutic efficacy of anti-Lewis(y)humanized3S 193radioimmunotherapy in a breast cancer model：enhanced activity when combined with Taxolchemotherapy.”Clin.Cancer Res.，6：3621-3628，2000.
[1163] Clayton，A.H.，Walker，F.，Orchard，S.G.，Henderson，C.，Fuchs，D.，Rothacker，J.，Nice，E.C.，and Burgess，A.W.(2005)J.Biol.Chem.280，30392-30399.
[1164] Daugherty BL，DeMartino JA，Law MF，Kawka DW，Singer II，MarkGE.“Polymerase chain reaction facilitates the cloning，CDR-grafting，and rapid expression of a murine monoclonal antibody directed against the CD18 component of leukocyte integrins.”Nucleic Acids Res.1991 19(9)：2471-6.
[1165] de Larco，J.E.and Todaro，G.J.(1978)J.Cell.Physiol.94，335-342.[1166] de Larco，J.E.，Reynolds，R.，Carlberg，K.，Engle，C.，and Todaro，G.J.(1980)J.Biol.Chem.255，3685-3690.
[1167] den Eynde，B.and Scott，A.M.Tumor Antigens.In：P.J.Delves andI.M.Roitt(eds.)，Encyclopedia of Immunology，Second Edition，pp.2424 31.London：
Academic Press，1998.
Academic Press，1998.
[1168] DeNardo SJ，Kroger LA，DeNardo GL.“A new era for radiolabeled antibodies in cancer？”Curr.Opin.Immunol.1999；11：563-9.
[1169] Divgi，C.R.，Welt，S.，Kris，M.，Real，F.X.，Yeh，S.D.，Gralla，R.，Merchant，B.，Schweighart，S.，Unger，M.，Larson，S.M.，等人“Phase I and imaging trial of indium11-labeled anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody 225in patients with squamous cell lung carcinoma.”J.Natl.Cancer Inst.，83：97-104，
1991.
1991.
[1170] Domagala，T.，Konstantopoulos，N.，Smyth，F.，Jorissen，R.N.，Fabri，L.，Geleick，D.，Lax，I.，Schlessinger，J.，Sawyer，W.，Howlett，G.J.，Burgess，A.W.，and Nice，E.C.“Stoichiometry，kinetic and binding analysis of the interaction between Epidermal Growth Factor(EGF)and the Extracellular Domain ofthe EGF receptor.”Growth Factors.18：11-29，2000.
[1171] Domagala，T.，N.Konstantopoulos，等人(2000).″Stoichiometry，kinetic and binding analysis of the interaction between epidermal growth factor(EGF)and the extracellular domain of the EGF receptor.”Growth Factors 18(1)：11-29.[1172] Safa，M.M.and K.A.Foon(2001).″Adjuvant immunotherapy for melanoma and colorectal cancers.″Semin.Oncol.28(1)：68-92.
[1173] Ekstrand AJ，Sugawa N，James CD，等人“Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-or C-terminal tails.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992；89：4309-13.
[1174] Ekstrand，A.J.，James，C.D.，Cavenee，W.K.，Seliger，B.，Pettersson，R.F.，and Collins，V.P.(1991)Cancer Res.51，2164-2172.
[1175] Emsley，P.and Cowtan，K.(2004)Acta crystallographica 60，2126-2132.[1176] Faillot，T.，Magdelenat，H.，Mady，E.，Stasiecki，P.，Fohanno，D.，Gropp，P.，Poisson，M.，and Delattre，J.Y.“A Phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas.”Neurosurgery(Baltimore)，39：478-483，1996.
[1177] Fairlie，W.D.，Uboldi，A.D.，De Souza，D.P.，Hemmings，G.1，Nicola，N.A.，and Baca，M.(2002)Protein expression and purification 26，171-178.
[1178] Fan，Z.，and Mendelsohn，J.“Therapeutic application of anti-growth factor receptor antibodies.”Curr.Opin.Oncol.，10：67-73，1998.
[1179] Fan，Z.，Baselga，J.，Masui，H.，and Mendelsohn，J.“Antitumor effect of antiepidermal growth factor receptor monoclonal antibodies pluscis-diamminedichloroplatinum on well established A431 cell xenografts.”Cancer Res.，53：4637-4642，1993.
[1180] Fan，Z.，Masui，H.，Altas，I.，and Mendelsohn，J.“Blockade of epidermal growth factor receptor function by bivalent and monovalent fragments of225 anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.”Cancer Res.，53：4322-4328，1993.
[1181] Feldkamp，M.M.，Lala，P.，Lau，N.，Roncari，L.，and Guha，A.“Expression of activated-epidermal growth factor receptors，Ras-guanosine triphosphate，and mitogenactivated protein kinase in human glioblastoma multiforme specimens.”Neurosurgery(Baltimore)，45：1442-1453，1999.
[1182] Ferguson，K.M.，Berger，M.B.，Mendrola，J.M.，Cho，H.S.，Leahy，D.J.，and Lemmon，M.A.(2003)Mol.Cell 11，507-517.
[1183] Fernandes H，Cohen S，Bishayee S.“Glycosylation-induced conformational modification positively regulates receptor-receptor association：a study with an aberrant epidermal growth factor receptor(EGFRvIII/deEGFR)expressed in cancer cells.”J.Biol.Chem.2001；276：5375-83.
[1184] Filmus J，Pollak MN，Cailleau R，等 人“MDA-468，a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor(EGF)receptors，has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF.”Biochem.Biophys.Res.Commun.1985；128：898-905.
[1185] Filmus，J.，Trent，J.M.，Pollak，M.N.，and Buick，R.N.“Epidermal growth factor receptor gene-amplified MDA-468 breast cancer cell line and its nonamplified variants.”Mol.Cell.Biol.，7：251-257，1987.
[1186] Gadella，T.W.J.and Jovin，T.M.(1995)Journal of Cell Biology129，1543-1558.
[1187] Gan H.K.，Walker F.，Burgess A.W.，Rigopoulos A..，Scott A.M.and Johns T.G.“The Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)Tyrosine Kinase Inhibitor AG1478 Increases the Formation of Inactive Untethered EGFR Dimers：Implications For Combination Therapy With Monoclonal Antibody 806.”J.Biol.Chem.(2007)；282(5)：2840-50.
[1188] Garcia de Palazzo，I.E.，Adams，G.P.，Sundareshan，P.，Wong，A.J.，Testa，J.R.，Bigner，D.D.，and Weiner，L.M.“Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-smalt cell along carcinomas.”Cancer Res.，53：3217-3220，1993.[1189] Garrett，T.P.，McKern，N.M.，Lou，M.，Elleman，T.C.，Adams，T.E.，Lovrecz，G.0.，Zhu，H.J.，Walker，F.，Frenkel，M.J.，Hoyne，P.A.，Jorissen，R.N.，Nice，E.C.，Burgess，A.W.，and Ward，C.W.(2002)Cell，110，763-773.
[1190] Garrett，T.P.，McKern，N.M.，Lou，M.，Elleman，T.C.，Adams，T.E.，Lovrecz，G.0.，Kofler，M.，Jorissen，R.N.，Nice，E.c.，Burgess，A.W.，and Ward，C.W.(2003)Mol.Cell.11，495-505.
[1191] Gill，G.N.，Kawamoto，T.，Cochet，C.，Le，A.，Sato，J.D.，Masui，H.，McLeod，C.，and Mendelsohn，J.(1984)J.Biol.Chem.259，7755-7760.
[1192] Goldstein NI，Prewett M，Zuklys K，等人“Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumor xenograft model.”Clin.Cancer Res.1995；1：1311-8.
[1193] Grandis，J.R.，Melhem，M.F.，Gooding，W.E.，Day，R.，Holst，V.A.，Wagener，M.M.，Drenning，S.D.，and Tweardy，D.J.“Levels of TGP-a and BOFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival.”J.Natl.Cancer Inst.，90：32CE，1998.
[1194] Green，M.C.，Murray，J.L.，and Hortobagyi，G.N.“Monoclonal antibody therapy for solid tumors.”Cancer Treat.Rev.，26：269-286，2000.
[1195] Gunther，N.，Betzel，C.，and Weber，W.“The secreted form of the epidermal growth factor receptor.Characterization and crystallization of the receptor ligand complex.”J.Biol.Chem.265：22082-5，1990.
[1196] Halaisch，M.E.，Schmidt，U.，Botefur，I.C.，Holland，J.P.，and Ohnuma，T.“Marked inhibition of glioblastoma target cell tumorigenicity in vitro by retrovirus-mediated transfer of a hairpin ribozyme against deletion-mutant epidermal growth factor receptor messenger RNA.”J.Neurosurg.，92：297-305，2000.[1197] Han，Y.，Caday，C.G.，Nanda，A.，Cavenee，W.K.，and Huang，H.J.“Tyrphostin AG 1478 preferentially inhibits human glioma cells expressing truncated rather than wild-type epidermal growth factor receptors.Cancer Res.”56：3859-3861，1996.
[1198] Harari，D.，and Yarden，Y.“Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer.”Oncogene，19：6102-6114，2000.
[1199] Hills D，Rowlinson-Busza G，Gullick WJ.“Specific targeting of a mutant，activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.”Int.J.Cancer 1995；63：537-43.
[1200] Hogg，P.J.(2003)Trends in biochemical sciences 28，210-214.
[1201] Holbro，T.and Hynes，N.E.(2004)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.44：195-217.，195-217.
[1202] Hooft，R.W.，Vriend，G.，Sander，C.，and Abola，E.E.(1996)Nature 381，272.[1203] Huang HS，Nagane M，Klingbeil CK，等人“The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.”J.Biol.Chem.1997；272：2927-35.
[1204] Humphrey，P.A.，Wong，A.1.，Vogelstein，B.，Zalutsky，M.R.，Fuller，G.N.，Archer，G.E.，Friedman，H.S.，Kwatra，M.M.，Bigner，S.H.，and Bigner，D.D.“Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma”(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，4207-4211.
[1205] Johns TG，Perera RM，Vernes SC，Vitali AA，Cao DX，Cavenee WK，Scott AM and Furnari FB.“The efficacy of EGFR-specific antibodies againstglioma xenografts is influenced by receptor levels，activation status and heterodimerization.”Clin.Cancer Res.(2007)；13(6)：1911-1925.
[1206] Johns TG，Stockert E，Ritter G，Jungbluth AA，H-J.Su Huang，Cavenee WK，Smyth FE，Hall CM，Watson N，Nice EC，Gullick WJ，Old LJ，Burgess AW，Scott AM.“Novel monoclonal antibody specific for the DE2-7 Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.”Int.J.Cancer(2002)98：398-408
[1207] Johns，T.G.，Adams，T.E.，Cochran，J.R.，Hall，N.E.，Hoyne，P.A.，Olsen，M.J.，Kim，YS.，Rothacker，J.，Nice，E.C.，Walker，F.，Ritter，G.，Jungbluth，A.A.，Old，L.J.，Ward，C.W.，Burgess，A.W.，Wittrup，K.D.，and Scott，A.M.“Identification of the Epitope for the EGFR-Specific Monoclonal Antibody 806 Reveals that it Preferentially Recognizes an Untethered Form of the Receptor.”J.Biol.Chem.(2004)279：30375-30384
[1208] Johns，T.G.， 等 人，“Novel monoclonal antibody specific for the de2-7epidermal growth factor receptor(EGFR)that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.”Int.J.Cancer，2002.98(3)：p.398-408.
[1209] Johns，T.G.，Luwor，R.B.，Murone，C.，Walker，F.，Weinstock，J.，Vitali，A.A.，Perera，R.M.，Old，L.J.，Nice，E.C.，Burgess，A.W.and Scott，A.M.“Anti-tumor efficacy of cytotoxic drugs and the monoclonal antibody 806 is enhanced by the epidermal growth factor receptor(EGFR)inhibitor AG1478.”PNAS(2003)100：15871-15876[1210] Johns，T.G.，Mellman I.，Cartwright G.A.，Ritter G.，Old L.J.，Burgess A.W.and Scott A.M.“The anti-tumor monoclonal antibody 806recognizes a high-mannose form of the EGF receptor that reaches the cell surface when cells over-express the receptor.”FASEB J.(2005)19(7)：780-2.
[1211] Jorissen，R.N.，Walker，F.W.，Pouliot，N.，Garrett，T.P.J.，Ward，C.W.，and Burgess，A.W.“Epidermal growth factor receptor：mechanisms of activation and signaling.”Exp.Cell Res.284，31-53.2003.
[1212] Jungbluth，A.A.，Stockert，E.，Huang，H-J.S.，Collins，VP，Coplan，K.，Iversen，K.，Kolb，D.，Johns T.G.，Scott A..M.，Gullick W.J.，Ritter，G.，Cohen L.，Cavanee W.K.，Old，L.J.A
[1213] “Monoclonal Antibody Recognizing Human Cancers with Amplification/Over-Expression of the Human Epidermal Growth Factor Receptor.”PNAS(2003)100：639-644.
[1214] Korshunov，A.，Golanov，A.，Sycheva，R.，and Pronin，I.“Prognostic value of tumor associated antigen immunoreactivity and apoptosis in cerebral glioblastomas：an analysis of 163 cases.”J.Clin.Pathol.，52，-574-580，1999.[1215] Kwok TT，Sutherland RM.“Differences in EGF related radiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and low numbers of EGF receptors.”Br.J.Cancer 1991；64：251-4.
[1216] Laskowski，R.A.，MacArthur，M.W.，Moss，D.S.，and Thornton，J.M.(1993)J.Appl.Cryst.26，283-291.
[1217] Lee F.T.，Mountain A.J.，O’Keefe G.J.，Sagona J.，Rigopoulos A.，Smyth F.E.，Govindan S.V.，Goldenberg D.M.，Old L.J.and Scott A.M.“ImmunoPET detection of xenografts expressing de2-7 EGFR using Iodine-124 labelled ch806 via residualising ligand IMPR4.”J.Nucl.Med.(2006)47(5)suppl 1：429P.
[1218] Li D.，Ji H.，Zaghlul S.，McNamara K.，Liang M.C.，Shimamura T.，Kubo S.，Takahashi M.，Chirieac L.R.，Padera R.F.，Scott A.M.，Jungbluth，A.A.，Cavenee W.K.，Old L.J.，Demetri G.D.，Wong KK.“Therapeutic anti-EGFR antibody 806 generates responses in murine de novo EGFR mutant-dependent lung carcinomas.”J.Clin.Invest.(2007)；117(2)：346-352.
[1219] Lindmo，T.， 等 人，“Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.”J.Immunol.Methods，1984.72(1)：p.77-89.
[1220] Liu，Z.，Panousis，C.，Smyth，F.E.，Murphy，R.，Wirth，V.，Cartwright，G.，Johns，T.G.，and Scott，A.M.“Generation of Anti-Idiotype Antibodies for Application in Clinical Immunotherapy Laboratory Analyses.”Hybridoma and Hybridomics，(2003)22(4)：219-228.
[1221] Luwor RB，Johns TG，Murone C，H-J.Su Huang，Cavenee WK，Ritter G，Old LJ，Burgess AW，Scott AM.“Monoclonal Antibody 806Inhibits the Growth of Tumor Xenografts Expressing Either the DE2-7 or Amplified Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)but not Wild-Type EGFR.”Cancer Research(2001)61：5355-5361.[1222] Luwor，R.B.，Zhu，H-J.，Walker，F.，Vitali A.A.，Perera，R.M.，Burgess，A.W.，Scott，A.M.and Johns，T.G.“The Tumor Specific de2-7Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)confers Increased survival in BaF/3 Cells Via a PI-3 Kinase Dependent Mechanism.”Oncogene(2004)23：6095-6104
[1223] MacDonald，A.，Chisholm，G.D.，and Habib，F.K.(1990)Br.J Cancer.62，579-584.
[1224] Masui，H.，Kawamoto，T.，Sato，J.D.，Wolf，B.，Sato，G.，and Mendelsohn，J.“Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.”Cancer Res.，44：1002-1007，1984.[1225] Mellinghoff，I.K.，Cloughesy，T.F.，and Mischel，P.S.(2007)Clin.Cancer Res.13，378-381.
[1226] Mendelsohn，J.“Epidermal growth factor receptor inhibition by a monoclonal antibody as anticancer therapy.Clin.Cancer Res.”3：2703-2707，1997.[1227] Mickey，D.D.，Stone，K.R.，Wunderli，H.，Mickey，G.H.，Vollmer，R.T.，and Paulson，D.F.(1977)Cancer Res.37，4049-4058.
[1228] Mineo C，Gill GN，Anderson RG.“Regulated migration of epidermal growth factor receptor from caveolae.”J.Biol.Chem.1999；274：30636-43.
[1229] Mishima K，Johns TG，Luwor RB，Scott AM，Stockert E，Jungbluth AA，Ji X，Suvarna P，Voland JR，Old LJ，H-J.Su Huang，Cavenee WK.“Growth Suppression of Intracranial Xenografted Glioblastomas Overexpressing Mutant Epidermal Growth Factor Receptors by Systemic Administration of Monoclonal Antibody(mAb)806，a Novel Monoclonal Antibody Directed to the Receptor.”Cancer Research(2001)61：5349-5354.
[1230] Mishima，K.Nagane，M.，Lin，H.，Cavenee，W.K.，and Huang，H-J.S.“Expression of a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor mediates glioma cell invasion in vivo.”Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，40：519，1999.
[1231] Mishima，K.，Mazar，A.P.，Gown，A.，Skelly，M.，Ji，X.D.，Wang，X.D.，Jones，T.R.，Cavenee，W.K.，and Huang，H-J.S.“A peptide derived from the non-receptor-binding region of urokinase plasminogen activator inhibits glioblastoma growth and angiogenesis in vivo in combination with cisplatin.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8484-8489，2000.
[1232] Moscatello，D.K.，Holgado-Madruga，M.，Godwin，A.K.，Ramirez，G.，Gunn，G.，Zoltick，P.W.，Biegel，J.A.，Hayes，R.L.，and Wong，A.J.“Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.”Cancer Res.，55：5536-5539，1995.
[1233] Murshudov，G.N.，Vagin，A.A.，and Dodson，E.J.(1997)Acta crystallographica53，240-255.
[1234] Nagane，M.，Coufal，F.，Lin，H.，Bogler，O.，Cavenee，W.K.，and Huang，H.J.“A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducingapoptosis.”Cancer Res.56：5079-86，1996.
[1235] Nagane，M.，Levitzki，A.，Gazit，A.，Cavenee，W.K.，and Huang，H-J.S.“Drug resistance of human glioblastoma cells conferred by a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor through modulation of Bcl-XL and caspase-3-like proteases.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：5724-5729，1998.[1236] Nagane，M.，Lin，H.，Cavenee，W.K.，and Huang，H-J.S.“Aberrant receptor signaling in human malignant gliomas：mechanisms and therapeutic implications.”Cancer Lett.，162(Suppl.1)：S17-S21，2001.
[1237] Neidhardt，F.C.，Bloch，P.L.，and Smith，D.F.(1974)Journal of bacteriology119，736-747.
[1238] Nishikawa，R.，Ji，X.D.，Harmon，R.C.，Lazar，C.S.，Gill，G.N.，Cavenee，W.K.，and Huang，H.J.A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：7727-7731，1994.[1239] Ogiso，H.，Ishitani，R，Nureki，0.，Fukai，S.，Yamanaka，M.，Kim，1.H.，Saito，K.，Sakamoto，A.，Inoue，M.，Shirouzu，M.，and Yokoyama，S.(2002)Cell 20；11O，775-787.[1240] Okamoto S，Yoshikawa K，Obata Y，等人“Monoclonal antibody against the fusion junction of a deletion-mutant epidermal growth factor receptor.”Br.J.Cancer 1996；73：1366-72.
[1241] Olapade-Olaopa，E.O.，Moscatello，D.K.，MacKay，E.H.，Horsburgh，T.，Sandhu，D.P.，Terry，T.R.，Wong，A.J.，and Habib，F.K.“Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.”Br.J.Cancer.82：186-94，2000.
[1242] Old，L.J.“Immunotherapy for cancer.”Sci.Am.，275：102-109，1996.[1243] Otwinowski，Z.and Minor，W.(1997)“Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.”Academic Press(New York).
[1244] Padlan EA.“A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-bindingproperties.”Mol.Immunol.1991 28(4-5)：489-98.
[1245] Padlan等人，EP 519596，Merck/NIH
[1246] Palacios，R，Henson，G.，Steinmetz，M.，and McKeam，J.P.(1984)Nature.309，126-131.
[1247] Panousis，C.，Rayzman，V.M.，Johns，T.G.，Renner C.，Liu Z.，Cartwright，G.，Lee F-T.，Wang，D.，Gan，H.，Cao，D.，Kypridis，A.，Smyth，F.E.，Brechbiel，M.W.，Burgess，A.W.，Old，L.J.and Scott，A.M.“Engineering and characterization of chimeric monoclonal antibody806(ch806)for targeted immunotherapy of tumours expressing de2-7 EGFR or amplified EGFR.”Br.J.Cancer(2005)92：1069-1077.
[1248] PCT Patent WO02092771，2002.
[1249] Perera R.M.，Narita Y.，Furnari，F.B.，Luwor，R.B.，Burgess，A.W.，Old，L.J.，Cavenee，W.K.，Scott，A.M.and Johns，T.G.“A novel EGFR antibody that displays synergistic anti-tumor activity when combined with conventional EGFR therapeutics.”Clinical Cancer Research(2005)11：6390-6399.
[1250] Perera R.M.，Zoncu R.，Johns T.G.，Pypaert M.，Lee F.T.，Mellman I.，Old L.J.，Toomre D.K.，and Scott A.M.“Internalization，intracellular trafficking，and biodistribution of monoclonal antibody 806：a novel anti-epidermal growth factor receptor antibody.”Neoplasia.(2007)；9(12)：1099-110
[1251] Perez-Soler，R.，Donato，N.J.，Shin，D.M.，Rosenblum，M.G.，Zhang，H.Z.，Tornos，C.，Brewer，H.，Chan，J.C.，Lee，J.S.，Hong，W.K.，等人“Tumor epidermal growth factor receptor studies in patients with non-small-cell lung cancer or head and neck cancer treated with monoclonal antibody RG 83852.”J.Clin.Oncol.，12：730-739，1994.
[1252] Pietras，R.J.，Pegam，M.D-，Finn，R-S.，Maneval，D.A.，and Slmon，D.J.“Remission of human breast cancer xenografts on therapy with humanized monoclonal antibody to HER-2 receptor and DNA-reactive drugs.”Oncogene，17：2235-2249，1998.
[1253] Ponten J，Macintyre EH.“Long term culture of normal and neoplastic human glia.”Acta Pathol.Microbiol.Scand.1968；74：465-86.
[1254] Press，O.W.，DeSantes，K.，Anderson，S.K.，and Geissler，F.“Inhibition of catabolism of radiolabeled antibodies by tumor cells using lysosomotropic amines and carboxylic ionophores.”Cancer Res.50：1243-50，1990.
[1255] Reist CJ，Batra SK，Pegram CN，等人“In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody：comparison with its murine parent.”Nucl.Med.Biol.1997；24：639-47.
[1256] Reist，C.J.，Archer，G.E.，Kurpad，S.N.，Wikstrand，C.J.，Vaidyanathan，G.，Willingham，M.C.，Moscatello，D.K.，Wong，A.J.，Bigner，D.D.，and Zalutsky，M.R.“Tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies：use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenografts.”Cancer Res.，55：4375-4382，1995.
[1257] Reist，C.J.，Archer，G.E.，Wikstrand，C.J.，Bigner，D.D.，and Zalutsky，M.R.“Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenografts after labeling using N-succinimidyl5-iodo-3-pyridinecarboxylate.”Cancer Res.57：1510-5，1997.
[1258] Reist，C.J.，Batra，S.K.，Pegram，C.N.，Bigner，D.D.，and Zalutsky，M.R.“In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody：comparison with its murine parent.”Nucl.Med.Biol.24：63947，1997.[1259] Reist，C.J.，Garg，P.K.，Alston，K.L.，Bigner，D.D.，and Zalutsky，M.R.“Radioiodination of internalizing monoclonal antibodies usingN-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate.”Cancer Res.56：4970-7，1996.[1260] Rodeck，U.，Herlyn，M.，Herlyn，D.，Molthoff，C.，Atkinson，B.，Varello，M.，Steplewski，Z.，and Koprowski，H.“Tumor growth modulation by a monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor：immunologically mediated and effector cell-independent effects.”Cancer Res.，47：3692-3696，1987.
[1261] Salomon，D.S.，Brandt，R.，Ciardiello，F.，and Normanno，N.“Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies.”Crit.Rev.Oncol.Hematol.，19：183-232，1995.
[1262] Sampson，J.H，Crotty，L.E.，Lee，S.，Archer，G.E.，Ashley，D.M.，Wikstrand，C.J.，Hale，L.P.，Small，C.，Dranoff，G.，：Friedman，A.H.，Friedman，H.S.，and Bigner，D.D，“Unarmed，tumor-specific monoclonal antibody effectively treats brain tumors.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：7503-7508，2000.
[1263] Santon，J.B.，Cronin，M.T.，MacLeod，C.L.，Mendelsohn，J.，Masui，H.，and Gill，G.N.“Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice.”Cancer Res.46：4701-5，1986.[1264] Sato，J.D.，Le，A.D.，and Kawamoto，T.“Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors.”Methods Enzymol.146：63-81，1987.
[1265] Schlessinger，J.(2002)Cell 20；110，669-672.
[1266] Scott A.M.，Gill S.S.，Lee F.，Liu Z.，Skrinos E.，Murone C.，Saunder T.，Chappell B.，Papenfuss A.，Old L.J.“A Phase I single dose escalation trial of ch806 in patients with advanced tumors expressing the 806 antigen.”Journal of Clinical Oncology，2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I.Vol.24，No.18S(June 20 Supplement)，(2006)：13028.
[1267] Scott A.M.，Lee FT.，Tebbutt N.，Herbertson R.，Gill S.S.，Liu Z.，Skrinos E.，Murone C.，Saunder T.H.，Chappell B.，Papenfuss A.T.，Poon A.M.T.，Hopkins W.，Smyth F.E.，MacGregor D.，Cher L.M.，Jungbluth A.A.，Ritter，G.，Brechbiel M.W.，Murphy R.，Burgess AW，Hoffman E.W.，Johns T.J.，Old L.J.“A Phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2007)104(10)：4071-6.Epub 2007 February 28.
[1268] Scott，A.M.，and Welt，S.Antibody-based immunological therapy.Curr.Opin.Immunol.，9：717-722，1997.
[1269] Seymour L.“Novel anti-cancer agents in development：exciting prospects and new challenges.”Cancer Treat.Rev.1999；25：301-12.
[1270] Sizeland，A.M.and Burgess，A.W.(1991)Mol.Cell Bio.11，4005-4014.[1271] Sizeland，A.M.and Burgess，A.W.(1992)Mol.Biol.Cell 3，1235-1243.[1272] Slamon，D.J.，Godolphin，W.，Jones，L.A.，Holt，J.A.，Wong，S.G.，Keith，D.E，Levin，W.J.，Stuart，S.G.，Udove，J.，Ullrich，A.，and Press，M.F.“Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.”Science(Wash.DC).244：707-712，1989.
[1273] Sliwkowski，M.X.，Lofgren，J.A.，Lewis，G.D.，Hotaling，T.E.，Fendly，B.M.，and Fox，J.A.“Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab(Herceptin).”Semin.Oncol.，26(Suppl.12)：60-70，1999.
[1274] Sok，J.c.，Coppelli，F.M.，Thomas，S.M.，Lango，M.N.，Xi，S.，Hunt，J.1.，Freilino，M.1.，Graner，M.W.，Wikstrand，C.J.，Bigner，D.D.，Gooding，W.E.，Furnari，F.B.，and Grandis，J.R.(2006)Clin.Cancer Res.12，5064-5073.
[1275] Stamos，J.，Sliwkowski，M.X.，and Eigenbrot，C.(2002)J.Biol..Chem.277，46265-46272.
[1276] Sturgis，E.M.，Sacks，P.G.，Masui，H.，Mendelsohn，J.，and Schantz，S.P.“Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cancer.”Otolaryngol.Head Neck Surg.111：633-43，1994.
[1277] Sugawa，N.，Ekstrand，A.J.，James，C.D.，and Collins，V.P.“Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：8602-8606，1990.
[1278] Tang，C.K.，Gong，X.Q.，Moscatello，D.K.，Wong，A.J.，and Lippman，M.E.“Epidermal growth factor receptor in enhances tumorigenicity in human breast cancer.”Cancer Res.，60：3081-3087，2000.
[1279] Teramoto，T.，Onda，M.，Tokunaga，A.，and Asano，G.“Inhibitory effect of antiepidermal growth factor receptor antibody on a human gastriccancer.”Cancer(Phila.)，77：1639-1645，1996.
[1280] Todaro，G.J.，Delarco，J.E.，and Cohen，S.(1976)Nature 264，26-31.[1281] Trail，P.A.，and Bianchi，A.B.“Monoclonal antibody drug conjugates in the treatment of cancer.”Curr.Opin.Immunol.，11：584-588，1999.
[1282] Uemura，H.，E Okajima，等 人 (1994). ″ Internal image anti-idiotype antibodies related to renal-cell carcinoma-associated antigen G250. ″ Int.J.Cancer 56(4)：609-14.
[1283] Ullrich，A.，Coussens，L.，Hayflick，J.S.，Dull，T.J.，Gray，A.，Tam，A.W.，Lee，J.，Yarden，Y.，Libermann，T.A.，Schlessinger，J.，and.(1984)Nature.309，418-425.[1284] Vagin，A.and Teplyakov，A.(1997)J.Appl.Cryst.30，1022-1025.
[1285] van de Loosdrecht，A.A.，Beelen，R.H.，Ossenkoppele，G.J.，Broekhoven，M.G.，and Langenhuijsen，M.M.(1994)J.Immunol.Methods.174，311-320.
[1286] Voldborg，B.R.，Damstrup，L.，Spang-Thomsen，M.，and Poulsen，H.S.“Epidermal growth factor receptor(EGFR)and EGFR mutations，function and possible role in clinical trials.”Ann.Oncol.，8：1197-1206，1997.
[1287] Wade，J.D.，Hojo，K.，Kawasaki，K.，Johns，T.G.，Catimel，B.，Rothacker，J.，and Nice，E.C.(2006)Anal.Biochem.348，315-317.
[1288] Waksal，H.W.“Role of an anti-epidermal growth factor receptor in treating cancer.”Cancer Metastasis Rev.，18：427-436，1999.
[1289] Walker，F.，Orchard，S.G.，Jorissen，R N.，Hall，N.E.，Zhang，H.H.，Hoyne，P.A.，Adams，T.E.，Johns，T.G.，Ward，C.，Garrett，T.P.，Zhu，H.1.，Nerrie，M.，Scott，A.M.，Nice，E.C.，and Burgess，A.W.(2004)J.Biol.Chern.79，22387-22398.
[1290] Weiner，L.M.“An overview of monoclonal antibody therapy ofcancer.”Semin.Oncol.，26(Suppl.12)：41-50，1999.
[1291] Wersall，P.，Ohlsson，I.，Biberfeld，P.，Collins，V.P.，von Krusenstjerna，S.，Larsson，S.，Mellstedt，H.，and Boethius，J.“Intratumoral infusion of the monoclonal antibody，mAb 425，against the epidermal-growth-factor receptor in patients with advanced malignant glioma.”Cancer Immunol.Immunother.，44：157-164，1997.
[1292] Whitson K.B.，Red M.L.，Whitson S.R.，McCoy A.，Vitali A.A.，Walker F.，Johns T.G.，Beth A.H.and Staros J.A.“Functional Effects
of Selective Glycosylation at Asn-579 of the Epidermal Growth Factor
Receptor.”Biochemistry(2005)44：14920-14931
of Selective Glycosylation at Asn-579 of the Epidermal Growth Factor
Receptor.”Biochemistry(2005)44：14920-14931
[1293] Wikstrand，C.J.，Cokgor，I.，Sampson，J.H.，and Bigner，D.D.“Monoclonal antibody therapy of human gliomas：current status and future approaches.”Cancer Metastasis Rev.，18：451-464，1999.
[1294] Wikstrand，C.J.，Hale，L.P.，Batra，S.K.，Hill，M.L.，Humphrey，P.A.，Kurpad，S.N.，McLendon，R.E.，Moscatello，D.，Pegram，C.N.，Reist，C.J.，等 人“Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.”Cancer Res.55：3140-3148，1995.
[1295] Wikstrand，C.J.，McLendon，R.E.，Friedman，A.H.，and Bigner，D.D.“Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor，EGFRvIII.”Cancer Res.57：4130-40，1997.[1296] Wikstrand，C.J.，Reist，C.J.，Archer，G.E.，Zalutsky，M.R.，and Bier，D.D.“The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII)：characterization and utilization as an immunotherapeutic target.”J.
Neurovirol.，4：148-158，1998.
Neurovirol.，4：148-158，1998.
[1297] Wong，A.J.，Ruppert，J.M.，Bigner，S.H.，Grzeschik，C.H.，Humphrey，P.A.，Bigner，D.S.，and Vogelstein，B.“Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2965-2969，1992.
[1298] Yamazaki H，Fukui Y，Ueyama Y，等人“Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene(c-erbB)in human brain tumors.”Mol.Cell Biol.1988；8：1816-20.
[1299] Yamazaki H，Ohba Y，Tamaoki N，等 人“A deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors.”Jpn.J.Cancer Res.1990；81：773-9.[1300] Yarden，Y.and Schlessinger，J.(1987)Biochemistry.26，1443-1451.[1301] Yarden，Y.and Sliwkowski，M.X.(2001)Nat.Rev.Mol.Cell BioI.2，127-137.[1302] Yen，L.，Benlimame，N.，Nie，Z.R.，Xiao，D.，Wang，T.，Al Moustafa，A.E，Esumi，H.，Milanini，J.，Hynes，N.E.，Pages，G.，and Alaoui-Jamali，M.A.(2002)Mol.Biol.Cell.13(11)：4029-44.
[1303] Ymer，S.，Tucker，W.Q.，Sanderson，C.1.，Hapel，A.J.，Campbell，H.D.，and Young，1.G.(1985)Nature.19-25；317，255-258.
[1304] Zhang，x.，Gureasko，J.，Shen，K.，Cole，P.A.，and Kuriyan，J.(2006)Cell.125，1137-1149.
[1305] Burgess AW，Cho HS，Eigenbrot C，Ferguson KM，Garrett TP，Leahy DJ，Lemmon MA，Sliwkowski MX，Ward CW，&Yokoyama S(2003)Mol.Cell.12：541-552.
[1306] Ferguson KM(2008)Annu.Rev.Biophys.37，353-373.
[1307] Mendelsohn J&Baselga J(2006)Semin.Oncol.33，369-385.
[1308] Herbst RS，Kim ES，&Harari PM(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1，719-732.[1309] Lynch DH&Yang XD(2002)Semin.Oncol.29，47-50.
[1310] Baselga J&Arteaga CL(2005)J.Clin.Oncol.23，2445-2459.
[1311] Burgess AW(2008)Growth Factors 26，263-274.
[1312] Milano G，Spano JP，&Leyland-Jones B(2008)Br.J.Cancer 99，1-5.
[1313] Solomon BM&Jatoi A(2008)Curr.Oncol.Rep.10，304-308.
[1314] Nishikawa R，Ji XD，Harmon RC，Lazar CS，Gill GN，Cavenee WK，&Huang HJ(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，7727-7731.
[1315] Humphrey PA，Wong AJ，Vogelstein B，Zalutsky MR，Fuller GN，Archer GE，Friedman HS，Kwatra MM，Bigner SH，&Bigner DD(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，4207-4211.
[1316] Johns TG，Stockert E，Ritter G，Jungbluth AA，Huang HJ，Cavenee WK，Smyth FE，Hall CM，Watson N，Nice EC，等人(2002)Int.J.Cancer.98，398-408.
[1317] Jungbluth AA，Stockert E，Huang HJ，Collins VP，Coplan K，Iversen K，Kolb D，Johns TJ，Scott AM，Gullick WJ，等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，639-644.[1318] Scott AM，Lee FT，Tebbutt N，Herbertson R，Gill SS，Liu Z，Skrinos E，Murone C，Saunder TH，Chappell B，等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104，4071-4076.[1319] Johns TG，Luwor RB，Murone C，Walker F，Weinstock J，Vitali AA，Perera RM，Jungbluth AA，Stockert E，Old LJ，等 人 (2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，15871-15876.
[1320] Perera RM，Narita Y，Furnari FB，Gan HK，Murone C，Ahlkvist M，Luwor RB，Burgess AW，Stockert E，Jungbluth AA，等人(2005)Clin.Cancer.Res.11，6390-6399.[1321] Johns TG，Adams TE，Cochran JR，Hall NE，Hoyne PA，Olsen MJ，Kim YS，Rothacker J，Nice EC，Walker F，等人(2004)J.Biol.Chem.279，30375-30384.
[1322] Walker F，Orchard SG，Jorissen RN，Hall NE，Zhang HH，Hoyne PA，Adams TE，Johns TG，Ward C，Garrett TP，等人(2004)J.Biol.Chem.279，22387-22398.
[1323] Sivasubramanian A，Chao G，Pressler HM，Wittrup KD，&Gray JJ(2006)Structure 14，401-414.
[1324] Luwor RB，Johns TG，Murone C，Huang HJ，Cavenee WK，Ritter G，Old LJ，Burgess AW，&Scott AM(2001)Cancer Res.61，5355-5361.
[1325] Ching KZ，Ramsey E，Pettigrew N，D′Cunha R，Jason M，&Dodd JG(1993)Mol.Cell Biochem.126，151-158.
[1326] Sizeland AM&Burgess AW(1991)Mol.Cell Biol.11，4005-4014.
[1327] Chao G，Cochran JR，&Wittrup KD(2004)J.Mol Biol.342，539-550.
[1328] Garrett TP，McKern NM，Lou M，Elleman TC，Adams TE，Lovrecz GO，Zhu HJ，Walker F，Frenkel MJ，Hoyne PA，等人(2002)Cell 110，763-773.
[1329] Li S，Schmitz KR，Jeffrey PD，Wiltzius JJ，Kussie P，&Ferguson KM(2005)Cancer Cell.7，301-311.
[1330] Hogg PJ(2003)Trends Biochem.Sci.28，210-214.
[1331] Li S，Kussie P，&Ferguson KM(2008)Structure 16，216-227.
[1332] Schmiedel J，Blaukat A，Li S，Knochel T，&Ferguson KM(2008)Cancer Cell 13，365-373.
[1333] Sandler AB(2006)Oncology(Williston Park)20，35-40.
[1334] Sampson JH，Crotty LE，Lee S，Archer GE，Ashley DM，Wikstrand CJ，Hale LP，Small C，Dranoff G，Friedman AH，等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，7503-7508.[1335] Ullrich A，Coussens L，Hayflick JS，Dull TJ，Gray A，Tam AW，Lee J，Yarden Y，Libermann TA，&Schlessinger J(1984)Nature.309，418-425.
[1336] Walker F，Hibbs ML，Zhang HH，Gonez LJ，&Burgess AW(1998)Growth Factors16，53-67.
[1337] Wade JD，Hojo K，Kawasaki K，Johns TG，Catimel B，Rothacker J，&Nice EC(2006)Anal.Biochem.348，315-317.
[1338] Vagin AA&Isupov MN(2001)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57，1451-1456.
[1339] Murshudov GN，Vagin AA，&Dodson EJ(1997)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.53，240-255.
[1340] Ferguson KM，Berger MB，Mendrola JM，Cho HS，Leahy DJ，&Lemmon MA(2003)Mol.Cell 11，507-517.
[1341] Rettig WJ，Old LJ(1989)Annu.Rev.Immunol.7：481-511.
[1342] Van den Eynde BJ，Scott AM(1998)in Encyclopedia of Immunology，eds Roitt DPJ，Roitt IM(Academic Press：London)，pp 2424-2431.
[1343] Maloney DG，Grillo-Lopez AJ，White CA，Bodkin D，Schilder RJ，Neidhart JA，Janakiraman N，Foon KA，Liles TM，Dallaire BK，等人(1997)Blood 90(6)：2188-2195.[1344] Baselga J，Artega CL(2005)J.Clin.Oncol.23：2445-2449.
[1345] Voldborg BR，Damstrup L，Spang-Thomsen M，Poulsen HS(1997)Ann.Oncol.8(12)：1197-206.
[1346] Baselga J，Tripathy D，Mendelsohn J，Baughman S，Benz CC，Dantis L，Sklarin NT，Seidman AD，Hudis CA，Moore J，等人(1996)J.Clin.Oncol.14：737-744.
[1347] Welt S，Divgi CR，Real FX，Yeh SD，Garin-Chesa P，Finstad CL，Sakamoto J，Cohen A，Sigurdson ER，Kemeny N，等人(1990)J.Clin.Oncol.8(11)：1894-906.[1348] Scott AM，Lee FT，Jones R，Hopkins W，MacGregor D，Cebon J，Hannah A，U P，Rigopolous A，Sturrock S，等人(2005)Clin.Cancer Res.11(13)：4810-4817.
[1349] Steffens MG，Boerman OC，Oosterwijk-Wakka JC，Oosterhof GO，Witjes JA，Koenders EB，Oyen WJ，Buijs WC，Debruyne FM，Corstens FH，等 人 (1997)J.Clin.Oncol.15：1529-1537.
[1350] Scott AM，Geleick D，Rubira M，Clarke K，Nice EC，Smyth FE，Stockert E，Richards EC，Carr FJ，Harris WJ，等人(2000)Cancer Res60：3254-3261.
[1351] Scott AM，Lee F-T，Hopkins W，Cebon JS，Wheatley JM，Liu Z，Smyth FE，Murone C，Sturrock S，MacGregor D，等人(2001)J.Clin.Oncol.19(19)：3976-3987.
[1352] Welt S，Divgi CR，Scott AM，Garin-Chesa P，Finn RD，Graham M，Carswell EA，Cohen A，Larson SM，Old LJ(1994)J.Clin.Oncol.12：1193-1203.
[1353] Scott AM，Wiseman G，Welt S，Adjei A，Lee FT，Hopkins W，Divgi CR，Hanson LH，Mitchell P，Gansen DN，等人(2003)Clin.Cancer Res.9：1639-47.
[1354] Sugawa N，Ekstrand AJ，James CD，Collins VP(1990)Proc.Natl.Acad.Sci USA.87(21)：8602-8606.
[1355] Wong AJ，Bigner SH，Bigner DD，Kinzler KW，Hamilton SR，Vogelstein B(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6899-6903.
[1356] Nishikawa R，Ji XD，Harmon RC，Lazar CS，Gill GN，Cavenee WK，Huang HJ(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(16)：7727-7731.
[1357] Hills D，Rowlinson-Busza D，Gullick WJ(1995)Int.J.Cancer 63(4)：537-543.[1358] Sridhar SS，Seymour L，Shepherd FA(2003)Lancet Oncol.4(7)：397-406.[1359] Goldstein NI，Prewett M，Zuklys K，Rockwell P，Mendelsohn J(1995)Clin.Cancer Res.1(11)：1311-1318.
[1360] Humphrey PA，Wong AJ，Vogelstein B，Zalutsky MR，Fuller GN，Archer GE，Friedman HS，Kwatra MM，Bigner SH，Bigner DD(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(11)：4207-4211.
[1361] Baselga J，Pfister D，Cooper MR，Cohen R，Burtness B，Bos M，D′Andrea G，Seidman A，Norton L，Gunnett K，等人(2000)J.Clin.Oncol.18(4)：904-914.
[1362] Graeven U，Kremer B，Sudhoff T，Kiling B，Rojo F，Weber D，Tillner J，Unal C，Schmiegel W(2006)Br.J.Cancer 94(9)：1293-1299.
[1363] Ramos TC，Figueredo J，Catala M，Gonzales S，Selva JC，Cruz TM，Toldeo C，Silva S，Pestano Y，Ramos M，等人(2006)Cancer Biol.Ther.5(4)：375-379.
[1364] Johns TG，Stockert E，Ritter G，Jungbluth AA，Huang HJ，Cavenee WK，Smyth FE，Hall CM，Watson N，Nice EC，等人(2002)Int.J.Cancer 98(3)：398-408.
[1365] Jungbluth AA，Stockert E，Huang HJ，Collins VP，Coplan K，Iversen K，Kolb D，Johns TG，Scott AM，Gullick WJ，等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100(2)：639-644.[1366] Johns TG，Adams TE，Wittrup KD，Hall NE，Hoyne PA，Cochrane JR，Olsen MJ，Kim YS，Rothacker J，Nice EC，等人(2004)J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384.[1367] Johns TG，Mellman I，Cartwright GA，Ritter G，Old LJ，Burgess AW，Scott AM(2005)FASEB J.19(7)：780-782.
[1368] Luwor RB，Johns TG，Murone C，Huang HJ，Cavenee WK，Ritter G，Old LJ，Burgess AW，Scott AM(2001)Cancer Res.61(14)：p.5355-5361.
[1369] Johns TG，Luwor RB，Murone C，Walker F，Weinstock J，Vitali AA，Perera RM，Jungbluth AA，Stockert E，Old LJ，等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(26)：15871-15876.
[1370] Mishima K，Johns TG，Luwor RB，Scott AM，Stockert E，Jungbluth AA，Ji XD，Suvarna P，Voland JR，Old LJ，等人(2001)Cancer Res.61(14)：5349-5354.
[1371] Perera RM，Narita Y，Furnari FB，Tavernasi ML，Luwor RB，Burgess AW，Stockert E，Jungbluth AA，Old LJ，Cavenee WK，等人(2005)Clin.Cancer Res.11(17)：6390-6399.
[1372] Panousis C，Rayzman VM，Johns TG，Renner C，Liu Z，Cartwright G，Lee F-T，Wang D，Kypridis A，Smyth FE，等人(2005)Br.J.Cancer.92(6)：1069-1077.
[1373] Divgi CR，Welt S，Kris M，Real FX，Yeh SD，Gralla R，Merchant B，Schweighart S，Unger M，Larson SM，等人(1991)J.Natl.Cancer Inst.83(2)：97-104.
[1374] Baselga J(2001)Eur.J.Cancer 37 Suppl 4：S16-22.
[1375] Gibson TB，Ranganathan A，Grothey A(2006)Clin.Colorectal Cancer 6(1)：29-31.
[1376] Rowinsky EK，Schwartz GH，Gollob JA，Thompson JA，Vogelzang NJ，Figlin R，Bukowski R，Haas N，Lockbaum P，Li YP，等人(2004)J.Clin.Oncol.22：3003-3015.[1377] Tan AR，Moore DF，Hidalgo M，Doroshow JH，Polpin EA，Goodin S，Mauro D，Rubin EH(2006)Clin.Cancer Res.12(21)：6517-6522.
[1378] Lacouture AE(2006)Nature Rev.Cancer.6：803-812.
[1379] Adams GP，Weiner LM(2005)Nat.Biotechnol.23(9)：1147-1157.
[1380] Liu Z，Panousis C，Smyth FE，Murphy R，Wirth V，Cartwright G，Johns TG，Scott AM(2003)Hybrid Hybridomics 22(4)：219-28.
[1381] Stabin MG，Sparks RB，Crowe E(2005)J.Nucl.Med.46(6)：1023-1027.[1382] Ritter G，Cohen LS，Williams C Jr，Richards EC，Old LJ，Welt S(2001)Cancer Res.61(18)：685-6859。
[1383] 本发明可以以其他形式体现或以其他方式执行，而不背离其精神或基本特征。本公开内容因此在所有方面被视为举例说明性而不是限制性的，本发明的范围由附加权利要求指出，并且在等价含义和范围的范围内的所有改变预期在其中包含。
[1384] 各种参考文献在整个说明书中引用，并且在上文参考文献列表中提供，其各自整体引入本文作为参考。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 癌症的治疗 | 2020-05-12 | 888 |
| 癌症治疗药 | 2020-05-12 | 964 |
| 癌症治疗 | 2020-05-11 | 875 |
| 治疗癌症 | 2020-05-11 | 968 |
| 癌症治疗 | 2020-05-11 | 688 |
| 治疗性肽治疗和预防癌症的用途 | 2020-05-11 | 109 |
| 癌症治疗 | 2020-05-12 | 386 |
| 癌症治疗 | 2020-05-12 | 47 |
| 癌症的治疗 | 2020-05-12 | 822 |
| 用于治疗癌症的使用化疗和免疫治疗的代谢靶向癌细胞的方法 | 2020-05-12 | 126 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈