用于治疗胃癌和其他癌症的抗肿瘤相关肽及相关抗癌疫苗组合物
阅读：1013发布：2020-12-16
专利汇可以提供用于治疗胃癌和其他癌症的抗肿瘤相关肽及相关抗癌疫苗组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 系关于免疫 治疗 肽及其在免疫疗法，特别是 癌症免疫疗法 中的用途。本发明披露了单独形式的或与其他 肿瘤 相关肽(刺激抗肿瘤免疫应答 疫苗 组合物的活性药物成分)组合形式的肿瘤相关T辅助细胞肽表位。特别是本发明的肽组合物可用于引发胃癌(GC)抗肿瘤免疫应答的疫苗化合物。，下面是用于治疗胃癌和其他癌症的抗肿瘤相关肽及相关抗癌疫苗组合物专利的具体信息内容。
1.一种药物组合物，其包括至少两种肽以及一种药用载体，所述肽由一种氨基酸序列组成，其选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10、SEQ ID No 20和SEQ ID No 24。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包括至少另外一种肽，所述肽由一种氨基酸序列组成，其选自SEQ ID NO 11至SEQ ID NO 22。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，包括至少两种MHC I类肽，其中一种所述肽由一种选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 3的氨基酸序列组成，其中另一种所述肽由一种选自SEQ ID NO 11的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所含肽的选择性、数和/或量均具有组织、癌症和/或患者特异性。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包括至少一种合适的佐剂，该佐剂系选自以下的组，包括1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA
206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel载体系统、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17DBCG、Aquila公司的QS21刺激子、Ribi公司的Detox.Quil、弗氏、霍乱毒素、MF59。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中佐剂系为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、或咪喹莫特或resimiquimod。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，另外含有至少一种抗原提呈细胞。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述抗原提呈细胞为树突状细胞。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述至少一种抗原提呈细胞为
a)用权利要求1所述肽冲击或载入，或
b)包括一种编码权利要求1所述肽的表达载体。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述疫苗的给药方式为静脉注射。
用于治疗胃癌和其他癌症的抗肿瘤相关肽及相关抗癌疫苗组
合物
[0001] 本发明涉及免疫治疗肽及其在免疫疗法，特别是癌症免疫疗法中的用途。本发明披露了单独形式的或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫应答疫苗组合物的活性药物成分)组合形式的肿瘤相关T辅助细胞肽表位。特别是本发明的肽组合物可用于疫苗组合物中，以引发针对胃癌(GC)和其他癌症的抗肿瘤免疫应答。
[0002] 为了本发明之目的，所有参考文献均透过引用以其完整形式纳入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 胃癌是恶性细胞在胃壁形成的一种疾病。胃癌可发生于胃部的任何一部分，可能扩散到整个胃部以及其他器官；尤其是食道、肺和肝脏。胃癌是全球第四最常见的癌症，2002年有93万确诊病例。胃癌具有高死亡率(每年 80万)，使之成为全球仅次于肺癌导致癌症死亡的第二大最常见原因。此病较常见于男性，更常见于亚洲国家和发展中国家。(可从WHO获取信息。)
[0005] 在美国，胃癌约占每年所有新发癌症病例的2％(25500例)，但在其他国家更常见。在韩国，胃癌是位于第一位的癌种，占恶性肿瘤的20.8％。在日本，胃癌仍是男性最常见的癌症。在美国，每年约有8000名男性和13000女性被诊断患有胃癌。大部分为70岁以上。
[0006] 胃癌是全球第四大常见癌症，仅次于肺癌、乳腺癌、结肠癌和直肠癌。此外，胃癌仍是第二大最常见癌症死因。据美国癌症协会估计，2007年有一百万新发病例，其中近70％发生在发展中国家，大约80万例死亡(参见美国癌症协会的出版物)。
[0007] 此疾病的全球发病率中存在巨大的地域差异。该疾病的发病率在亚洲和南美洲部分地区最高，在北美最低。根据记录，该疾病的死亡率在智利、日本、南美和前苏联最高。
[0008] 除了日本通常进行早期检测外(在韩国以有限的方式进行)，世界大部分地区均不进行筛查，因此，胃癌在得到确诊时通常已为晚期。因而，胃癌仍然对医疗保健专业人士带来重大挑战。胃癌的危险因素为幽门螺杆菌(H.pylori)感染、吸烟、摄入高量盐分、以及其他饮食因素。少数胃癌(1％至3％)与胃癌遗传易感性症候群相关。在弥漫型胃癌常染色体显性遗传易感性家族中，大约25％发生E-cadherin基因突变。这一亚群胃癌被称为遗传性弥漫性胃癌。12这可能有益于提供遗传咨询，并考虑在种系截断的年轻无症状携带者中进行预防性胃切除术
[0009] 胃壁由3层组织组成：粘膜(最内)层、肌(中间)层和浆膜(最外)层。胃癌首先发生于粘膜层内壁，随着生长而扩散至外层。有四种标准治疗方法可治疗胃癌。胃癌治疗方法包括手术、化疗、放疗或放化疗。手术是胃癌的主要治疗方法。手术的目的是进行完全切除，并使切缘为阴性(R0切除)。但是，大约有50％局部胃癌不能进行R0切除。R1切除表示在显微镜下可发现残留癌细胞(切缘阳性)，R2切除表示有肉眼可见的残留癌细胞，但疾病未向远处转移。患者结果取决于诊断时发现的最初期别。(NCCN肿瘤学临床实践指南TM)
[0010] 对于II期疾病的患者，治疗性手术切除后的5年生存率为30-50％，III期患者为10-25％。这些患者有极高的局部及全身复发的可能性。80-90％的胃癌患者均会发生转移，在较早期别得到确诊的患者中6个月生存率为65％，而在较晚期确诊的患者中不到15％。
[0011] 因此，仍然需要对以下癌症患者实施安全有效的新型治疗方案：胃癌、摄护腺(上皮)癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)(Qian et al.，2009)、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤(Banerjee et al.，2000)、结肠(上皮)癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈(上皮)癌、人乳腺癌、摄护腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔(上皮)癌、膀胱癌、卵巢(上皮)癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等恶性实体瘤、以及其他肿瘤。还需要在不使用化疗药物或可能导致严重副作用的其他药物的前提下即可提升患者康乐的治疗方案。
[0012] 结直肠癌
[0013] 根据美国癌症协会的报导，在美国，结直肠癌(CRC)是位于第三位的最常见癌症，每年困扰着超过175,000名新发患者。在美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙和英国，每年有超过480,000例患者罹患该疾病。它是发达国家癌症死亡的最常见原因之一。研究表明，结直肠癌的发病是遗传和环境因素之间相互作用的结果。在大多数病例中，结直肠肿瘤似乎由腺瘤息肉演变而来；但是这个演变过程可能需要很多年。结直肠癌的主要风险因素是年龄，90％的病例在50岁之后诊断患有此病。根据美国癌症协会的报导，结直肠癌的其他风险因素包括饮酒、高脂肪和/或红色肉类饮食、水果和蔬菜的摄取量不足。结直肠癌的发病率继续上升，特别是日本等地区，这些地区接受西化饮食，摄入过多的脂肪和肉类而纤维摄入量减少，这些因素可能是罪魁祸首。但是发病率的上升速度比不上以前，这可能是由于进行了更多的筛查和息肉切除从而防止了息肉发展成为癌症。
[0014] 和大多数实体肿瘤的治疗一样，一线治疗为手术治疗，然而，手术受益者仍仅限于早期患者，但有很大一部分患者在确诊时已是晚期。基于氟尿嘧啶的化疗方案是晚期结直肠癌的标准治疗。这些治疗方案的大多数为所谓的FOLFOX方案(输注5-FU/亚叶酸+奥沙利铂)和FOLFIRI(伊立替康、亚叶酸，团注和连续输注5-FU)方案。
[0015] 第三代细胞毒素类药物的引入，如伊立替康和奥沙利铂，增加了显著改善疗效的希望，但预后仍较差，转移癌的存活率一般仍只有大约20个月，因此，治疗该疾病的需求仍远未满足。
[0016] 最近出现了新一代药物，即分子靶向药物，如阿瓦斯丁(贝伐单抗)和爱必妥(西妥昔单抗)，而且大约有40种针对不同阶段结直肠癌的化合物处于后期临床研发阶段。这些化合物中的几种相结合可增加未来潜在治疗选择的数量。绝大部分药物都处于研发的第二阶段，这些化合物比其他任何药物都更多地针对促使结直肠癌发展的表皮生长因子受体(EGFR)，这是由于80％以上结直肠癌患者的EGRF表达都上调。
[0017] 针对II期结直肠患者使用最近批准的单克隆抗体(mAb)联合化疗(西妥昔单抗+伊立替康或FOLFOX4方案；贝伐单抗单药或与FOLFOX4方案联合)的临床试验目前正在进行。经过三至四年的观察，预计这些试验会得出有统计学意义的结果。
[0018] 目前肿瘤科所用的单克隆抗体(mAb)一般都很可能不会干扰积极免疫治疗。事实上，有临床前证据表明，用贝伐单抗去除VEGF是DC-介导的T细胞启动的积极结果。
[0019] 摄护腺癌和其他典型肿瘤
[0020] 据估计，2007年有27050人死于摄护腺癌，它是男性癌症死亡的首要原因。虽然自20世纪90年代初以来，其死亡率在白人和非裔美国男性中一直下降，但是，非裔美国男性的死亡率仍然比白人男性高两倍以上。摄护腺癌是男性中最常见的癌症。非裔美国男性的发病率显著高于白人男性，其原因不明。在过去20年里，摄护腺癌的发病率发生了很大的变化：在1988-1992年期间迅速上升、1992-1995年期间急剧下降、自1995年以来略有增加。这些趋势在很大程度上反映了采用摄护腺特异抗原(PSA)血液检查进行摄护腺癌筛查的增加。过去10年中发病率增加趋缓最有可能是由于在65岁以上的男性中普遍开展PSA筛查。在
65岁以上的男性中，摄护腺癌的发病率趋于稳定。在白人男性中，发病率于1992年达到高峰(每100000人男性中有237.6人)，而在非裔美国男性中，于1993年达到高峰(每100000人男性中有342.8人)。
65岁以上的男性中，摄护腺癌的发病率趋于稳定。在白人男性中，发病率于1992年达到高峰(每100000人男性中有237.6人)，而在非裔美国男性中，于1993年达到高峰(每100000人男性中有342.8人)。
[0021] 摄护腺癌的治疗包括观察等待、手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗，或以上方法的某些组合疗法。哪种方案最佳取决于疾病的阶段、Gleason评分和PSA水平。其他重要因素包括男性的年龄、一般健康状况，以及对潜在治疗及其可能副作用的感觉。由于所有的治疗均可能有一定的副作用，如：勃起功能障碍和尿失禁，因此治疗讨论往往注重于治疗目标和生活方式改变的风险之间的平衡。
[0022] 如果癌症已扩散出摄护腺，治疗选择会发生明显的变化，因此，大多数治疗摄护腺癌的医生使用各种X射断层照片来预测扩散概率。观察等待、HIFU、放射治疗、冷冻手术和外科手术一般在癌症仍然局限在摄护腺内的男性中进行。激素疗法和化疗常常在疾病已经扩散出摄护腺的患者中进行。但是，也有特例：对于一些晚期肿瘤，可使用放射治疗，对于一些早期肿瘤，可使用激素治疗。如果初始的治疗失败并且癌症进展，也可使用冷冻疗法、激素疗法和化疗。
[0023] 在因临床怀疑器官有限生长而接受摄护腺癌根治术的摄护腺癌患者中，很多人的手术准备确诊性病理检验显示，局部性扩展肿瘤扩展至器官的边界之外。这些患者有早期局部复发的高风险，就生化复发而言，由于PSA水平不断增高，通常可以检测。在这种情况下的治疗选择包括外部放疗和激素治疗；然而，这些治疗方法的价值，特别是延长患者的长期存活率方面，不能认为已经得到证实。此外，可能的治疗相关并发症，如尿道狭窄的发展(放疗)、性欲丧失和阳痿、骨质疏松方面的骨骼中钙盐降低的风险、以及病理性骨折风险明显增加(激素消融)，也必须予以考虑。
[0024] 在所有摄护腺癌中，有90％以上在发现时处于局部性和区域性阶段；肿瘤在此阶段确诊的患者5年相对存活率接近100％。在过去25年中，所有阶段肿瘤组合在一起的5年存活率从69％上升至接近90％。根据最新的资料，10年相对存活率为93％，15年相对存活率为77％。存活率，特别是5年存活率的巨大提升，部分归因于早期诊断和治疗的改进。但是，在肿瘤扩散至其他组织和器官后，患者的存活率显著下降。
[0025] 肺癌
[0026] 2007年美国预计新发病例为21万例，约占确诊癌症病例的15％。男性发病率显著下降，从1984年的每10万人102例高点，下降到2003年的78.5例。在女性中，这一发病率在一段长期的增长之后正趋向于平稳。为了治疗之目的，临床上肺癌分为小细胞肺癌(13％)和非小细胞肺癌(87％)。
[0027] 在男性和女性中，癌症相关死亡的大多数均为肺癌。据估计，2007年有16.039万人死亡，约占所有癌症死亡人数的29％。自1987年以来，每年死于肺癌的女性多于乳腺癌患者。从1991年至2003年，男性的死亡率持续下降，每年约下降1.9％。女性肺癌死亡率在连续增长几十年后正趋于平稳。肺癌死亡率的这些趋势反映了过去30年吸烟率的下降。
[0028] 治疗选择根据癌症的类型(小细胞和非小细胞肺癌)和阶段确定，包括手术、放疗、化疗、靶向生物治疗，如贝伐单抗 和埃罗替尼 对于局部癌，通常选择外科手术治疗。最近的研究表明，手术随后化疗可提高早期非小细胞肺癌的存活率。由于该疾病在发现时通常已经扩散，因此，常常使用放射和化疗，有时与手术联合使用。单一化疗或放化疗结合是治疗小细胞肺癌的通常选择；采用这一方案，有很大比例的患者获得缓解，在一些病例中，缓解为持久缓解。
[0029] 肺癌的1年相对存活率在1975-1979年期间为37％，至2002年，略上升至42％，这主要是由于手术技术的改进和组合疗法的使用。然而，所有阶段的肺癌组合在一起，5年存活率仅为16％。对于疾病在检出时仍为局部性的病例，存活率为49％；但是仅有16％的肺癌在此早期得到确诊。
[0030] 表1：2007年美国按性别估计的新发癌症病例和死亡人数(American Cancer Society.Cancer Facts&Figures 2007.Atlanta：American Cancer Society；2007.)[0031]
[0032] 因此，对于胶质母细胞瘤、摄护腺肿瘤、乳腺癌、食管癌、结直肠癌、透明细胞肾细胞癌、肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母细胞瘤以及表现出过量表达生存素的其他肿瘤仍然需要有效且安全的新治疗方案，从而在不使用化疗药物或其他可能导致严重副作用的药物的情况下，增强患者的康乐。
具体实施方式
[0033] 除非另有说明，否则本文使用的所有术语定义如下。本文所用「肽」这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但最短可为8个氨基酸长度，最长可为10、11、12、13、14、15、16、17、或18个氨基酸长度。
[0034] 本文所用「寡肽」这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于14个氨基酸。
[0035] 「多肽」这一术语系指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，「多肽」这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。
[0036] 肽、寡肽、蛋白质或编码此类分子的核苷酸如果能诱导免疫应答，则具有「免疫原性」(因此是本发明中的一种「免疫原」)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞应答的能力。因此「，免疫原」是一种能够诱导免疫应答的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞应答的分子。
[0037] T细胞「表位」要求的是一种结合至MHC I或II类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可由载有以相应亲和力结合至MHC/肽复合体的匹配T细胞受体的一种T细胞来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。与MHC-II类分子结合的T细胞表位通常长度为12-30个氨基酸。对于表位结合至MHC II类分子的情况，同一个肽与相应的T细胞表位可共享一个共同的核心节段，但是由于核心序列的氨基末端上游和核心序列的羧基端下游的侧翼序列分别具有不同的长度，因而总体长度不同。MHC II类受体具有更开放的构造，结合至MHC II类受体上的肽相应地不完全埋于MHC II类分子的肽结合槽裂结构中，这是因为它们位于MHC I类分子的肽结合槽裂之中。出人意料的是，对于根据SEQ ID NO：1的肽，情况并非如此，因为肽长度的微小差异会导致活性的极度降低(见下文)。
[0038] 在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。
[0039] MHC II类基因的人基因组有三种不同基因位点：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。MHC II类受体是异源二聚体，包含一个α链和一个β链，两者均透过跨膜区在细胞膜中锚定。HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*07是两种不同的MHC II类β等位基因的例子，它们已知在这些位点被编码。II类等位基因具有很高的多态性，例如，已经描述的有数百种不同的HLA-DRB1等位基因。对于HLA-A*02和最常见的HLA-DR血清类型，不同人群中的表达频率如表2所示。
[0040] 表2：提供了HLA-A*02和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人(Mori et al.，1997)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)2改编，从美国人群范围内的单体型频率中推导出。由于连锁不平衡，某些HLA-DR等位基因内的A*02组合与其预期单一频率相比，可能是浓缩的或频率较低。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献(Chanock et al.，2004).
[0041]
[0042] 表3：提供了HLA-A*024和HLA*A02402血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人(Mori et al.，1997)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)2改编，从美国人群范围内的单体型频率中推导出。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献(Chanock et al.，2004)。
[0043] 表3：全球血清型HLA*02和A*2402的表达频率
[0044] 等位基因 人群 根据等位基因频率算得的显型
A*24 菲律宾人 65％
A*24 俄罗斯涅涅茨人 61％
A*2402 日本人 59％
A*24 马来西亚人 58％
A*2402 菲律宾人 54％
A*24 印度人 47％
A*24 韩国人 40％
A*24 菲律宾人 65％
A*24 俄罗斯涅涅茨人 61％
A*2402 日本人 59％
A*24 马来西亚人 58％
A*2402 菲律宾人 54％
A*24 印度人 47％
A*24 韩国人 40％
[0045] A*24 斯里兰卡人 37％
A*24 中国人 32％
A*2402 印度人 29％
A*24 澳大利亚西部人 22％
A*24 美国人 22％
A*24 俄罗斯萨马拉人 20％
A*24 南美人 20％
A*24 欧洲人 18％
A*24 中国人 32％
A*2402 印度人 29％
A*24 澳大利亚西部人 22％
A*24 美国人 22％
A*24 俄罗斯萨马拉人 20％
A*24 南美人 20％
A*24 欧洲人 18％
[0046] 因此，为了治疗和诊断目的，与数种不同的HLA II类受体以合适的亲和力结合的肽是非常理想的。与数种不同的HLA II类分子结合的肽被称为混杂结合剂。
[0047] 本文提到的DNA序列既包括单链DNA也包括双链DNA。因此，除非本文另有所指，否则具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双链体(双链DNA)以及该序列的互补序列。术语「编码区」系指在自然基因组环境中自然或正常编码基因表达产物的该基因部分，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。
[0048] 编码区可来自正常基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。
[0050] 编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。
[0051] 术语「表达产物」系指多肽或蛋白，它是基因序列和任何核酸序列的转译产物，这些序列编码遗传密码退化所造成的同等物，从而编码同样的氨基酸。
[0052] 「片断」这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。
[0053] 术语「DNA片段」系指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们至少从分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即，未污染内源性材料并且其数量或浓度使得能使用标准生化方法(如，使用克隆载体)识别、处理和回收片段及其组分核苷酸序列准。此等片段以开放阅读框架(未被内部未转译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未转译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。
[0054] 术语「引物」表示一种短核酸序列，可配有一个DNA链，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链的地方含有一个游离的3'OH端。
[0055] 术语「启动子」表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。
[0056] 术语「分离」表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
[0057] 本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以「纯化」的形式存在。术语「纯化」并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同质性的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确考虑到所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。
[0058] 根据本发明披露的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以「浓缩的形式」存在。本文中所使用的术语「浓缩」系指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，更方便地来说，即按体重计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。
[0059] 「活性片段」这一术语是指产生免疫应答的片段(即具有免疫原性活性)，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫应答采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞应答。或者「，活性片段」也可用于诱导体外T细胞应答。
[0060] 本文中所使用的术语「部分」(portion)、「段」(segment)、「片段」(fragment)，如果与多肽相关，指的是残基的连续序列(如：氨基酸残基)，其序列是构成较大序列的一部分。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。这表示，任何此类片段必定包含与SEQ ID NO：1至20序列基本相同(如果不是完全相同)的一个节段、片段或部分作为其氨基酸序列的一部分，其对应于SEQ ID NO：1至20的天然蛋白或「亲本」蛋白。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何共同核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。
[0061] 根据本发明，术语「百分等同度」或「百分同一度」，如果指的是序列，则表示在拟对比序列(「对比序列」)与所述序列或权利要求的序列(「参考序列」)排列比对后，把一种序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算百分等同度：
[0062] 百分等同度=100[I-(C/R)]
[0063] 其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中
[0064] (i)参考序列中每个硷基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准硷基或氨基酸；
[0065] (ii)参考序列中每个空隙，以及
[0066] (iii)参考序列中每个对准硷基或氨基酸与被比对比序列中对准硷基或氨基酸不同，即构成一个差异；
[0067] 并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个硷基或氨基酸的参考序列中的硷基或氨基酸数目。
[0068] 如果「被对比序列」和「参考序列」之间存在的一个比对按上述计算的百分等同度大致等于或大于指定的最低百分等同度，则被对比序列与参考序列具有指定的最低百分等同度，虽然可能存在按本文上述计算的百分等同度低于指定百分等同度的比对。
[0069] 如无另外说明，那么本文公开的原始肽可以透过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定「保守取代」的基础。
[0070] 在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。
[0071] 较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种「激进」取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用并不是完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。
[0072] 当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，具有非标准R基团的氨基酸(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。
[0073] 如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的叠加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。
[0074] 术语「T细胞应答」是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和启动。对于MHC I类限制性CTL，效应子功能可能为肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞溶解、细胞因子分泌，优选为肽诱导的干扰素-γ、TNF-α或IL-2，效应分子分泌、优选为肽或脱颗粒作用诱导的颗粒酶或穿孔素。对于MHCII类限制辅助性T细胞效应子功能可能为肽诱导的细胞因子分泌，优选为，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL5、IL-10或IL-2或肽诱导的脱颗粒作用。CTL和辅助性T细胞的可能效应子功能不仅限于此列表所述功能。
[0075] 免疫治疗方法
[0076] 是否能刺激免疫应答取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的提呈增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索控制免疫系统中的体液和细胞免疫的各种机制。
[0077] 细胞免疫应答的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别细胞液8至10个源自蛋白或缺损核糖体产物(DRIPS)(Schubert U，Antón LC，Gibbs J，Norbury CC，Yewdell JW，Bennink JR.；Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes；Nature 2000；404(6779)：770-774)的残基中带有主要组织兼容性复合体(MHC)的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
[0078] MHC分子有两类：MHC-I类分子，在细胞核提呈因主要内源性、细胞质或细胞核蛋白质、DRIPS和较大肽蛋白裂解产生的肽的细胞上都能发现此类分子。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈。MHC-II类分子，主要发现于专职抗原提呈细胞(APC)上，并主要提呈内吞作用过程中被APC摄取并随后进行加工的外源性蛋白肽。对于I-类分子，抗原加工的其他方法描述为：其允许MHC-II类分子提呈来自外源性肽(如：自吞作用)。肽和MHC-I类分子的复合物由CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞的相应TCR识别，而肽和MHC-II类分子的复合物由CD4阳性辅助T细胞的相应TCR识别。
[0079] CD4阳性辅助T细胞在安排抗肿瘤T细胞应答的效应子功能中发挥重要作用，因此，肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对研发能引发抗肿瘤免疫应答的药物可能非常重要(Gnjatic，S.，D.Atanackovic，E. M.Matsuo，A.Selvakumar，N.K.Altorki，R.G.Maki，B.Dupont，G.Ritter，Y.T.Chen，A.Knuth，and L.J.Old.Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients：
Correlation with antibody responses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100(15)：
8862-7)。CD4+T细胞可局部提高IFN-γ的水平。
Correlation with antibody responses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100(15)：
8862-7)。CD4+T细胞可局部提高IFN-γ的水平。
[0080] 哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应细胞(如，CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞也能透过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成，从而抑制肿瘤的出现(Qin，Z.and T.Blankenstein.CD4+T-cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells.Immunity.2000，12：677-686)。此外，研究还显示，CD4阳性T细胞可识别HLA-II类分子所提呈的肿瘤相关抗原中的肽，这样可透过诱导抗体(Ab)应答而阻止肿瘤进展(Kennedy，R.C.，M.H.Shearer，A.M.Watts，and R.K.Bright.CD4+T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen.Cancer Res.2003，
63：1040-1045).与肿瘤相关肽和HLA-I类分子相结合相比较而言，迄今只对TAA的少量II类配体有过描述(www.cancerimmunity.org，www.syfpeithi.de)。
63：1040-1045).与肿瘤相关肽和HLA-I类分子相结合相比较而言，迄今只对TAA的少量II类配体有过描述(www.cancerimmunity.org，www.syfpeithi.de)。
[0081] 由于HLA II类分子的组成性表达通常仅限于免疫系统的细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽被认为是不可能的事。然而，发明家最近成功地在肿瘤中直接识别了MHC-II类表位(EP 1642905，EP 1760088；Dengjel J，Nastke MD，Gouttefangeas C，Gitsioudis G，Schoor O，Altenberend F，Müller M， B，Missiou A，Sauter M，Hennenlotter J，Wernet D，Stenzl A，Rammensee HG，Klingel K， S.；Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas；Clin Cancer Res.2006；12：4163-4170).
[0082] 在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。出人意料的是，在肿瘤患者的肿瘤细胞中发现有MHC-II类分子的表达(Dengjel J，Nastke MD，Gouttefangeas C，Gitsioudis G，Schoor O，Altenberend F，Müller M， Missiou A，Sauter M，Hennenlotter J，Wernet D，Stenzl A，Rammensee HG，Klingel K，S.；Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas；Clin Cancer Res.2006；12：4163-4170)
[0083] 对于触发(引发)细胞免疫应答的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-10个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(「锚」)。这样，每个MHC的等位基因都有「结合基序」，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合(Rammensee HG，Bachmann J，Stevanovic S.MHC ligands and peptide motifs，Landes Bioscience，USA，1997)。
[0084] 在MHC依赖性免疫应答中，肽不仅必须能与肿瘤细胞表达的某些MHC分子结合，而且它们还必须能被带有T细胞特异性受体(TCR)的T细胞识别。
[0085] 肿瘤特异性T淋巴细胞识别的抗原，也就是说，它们的表位，可以是所有蛋白质类中的分子，如，酶、受体、转录因子等。此外，肿瘤相关抗原也可以只存在于肿瘤细胞中，如突变基因产物中。另一种重要的肿瘤相关抗原是组织特异性抗原，如，表达于不同类型肿瘤和健康睾丸组织中的「癌睾丸」(CT)抗原。
[0086] 多种肿瘤相关抗原已经得到确定。此外，在识别其他肿瘤相关抗原方面也做了大量研究。有些肿瘤相关抗原，在本领域中也称作肿瘤特异性抗原，具有组织特异性。实例包括但不仅限于黑色素瘤的酪氨酸酶、摄护腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中诸如bcr/abl的染色体交叉(易位)部位。但是，许多得到确定的肿瘤相关抗原出现于多种类型肿瘤中，有些抗原，如，实际上导致转化事件的致癌蛋白和/或肿瘤抑制基因(肿瘤抑制基因是Linehan WM，Walther MM，Zbar B关于肾癌综述The genetic basis of cancer of the kidney.J Urol.2003 Dec；170(6Pt1)：2163-72中所提及的)几乎出现于所有类型肿瘤中。例如，控制细胞生长和分化的正常细胞蛋白，如p53(一种肿瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累积突变，导致这些基因产物的表达上调，从而致癌{McCartey1998}(McCartey et al.Cancer Research，1998，15：58 2601-5；Disis et al.Ciba Found.Symp.1994，187：198-211)。这些突变蛋白也可是多种癌症的肿瘤特异性免疫应答的一个靶标。
[0087] 癌症患者免疫治疗的目标是特异性启动免疫系统细胞，特别是作用于肿瘤细胞而不作用于健康组织的所谓细胞毒性T细胞(CTL，称为「杀伤细胞」、也称为CD8阳性T细胞)。肿瘤细胞因表达肿瘤相关蛋白而与健康细胞不同。细胞表面的HLA分子将细胞内容物提呈到细胞外，从而使细胞毒性T细胞辨别出健康细胞和肿瘤细胞。这透过把细胞内的所有蛋白分解为短肽，然后再粘附到HLA分子并提呈到细胞表面上而实现(Rammensee et al.，1993))。提呈于肿瘤细胞但在人体健康细胞上没有或少得多的肽称为肿瘤相关肽(TUMAP)。
[0088] 对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而正常健康组织根本不表达或表达数量较少。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原通常是源于由于细胞周期调控或凋亡等功能在正常细胞转化为肿瘤细胞中直接受累的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标。在这两种情况中，存在抗原氨基酸序列的表位都至关重要，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(「免疫原性肽」)可导致体外或体内T细胞应答。
[0089] 基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞应答的前提是存在有着相应TCR的T细胞并且没有这个特定表位的免疫耐受性。辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1细胞应答的辅助T细胞表位支援CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合物)。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其他肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫应答的疫苗化合物的活性药物成分。
[0090] 由于CD8及CD4依赖型应答共同和协同促进抗肿瘤作用，因此，CD8+CTL(MHC-I分子)或CD4阳性CTL(MHC-II类分子)对肿瘤相关抗原的识别和鉴定对研发肿瘤疫苗非常重要。因此，提出含有与任一类MHC复合体结合的肽组合物是本发明的一个目标。
[0091] 使用肿瘤相关肽进行的临床试验由Boon及其同事在20世纪90年代中期开始进行，主要针对黑色素瘤。试验的最佳临床有效率为10％至30％。使用基于肽的疫苗单一治疗的任何临床试验中，都未曾报导有严重的副作用或严重的自身免疫性。用黑色素瘤相关肽治疗的一些患者报导有轻度的白癜风。
[0092] 但是，使用一种CTL通常不足以消灭所有肿瘤细胞。肿瘤具有很强的诱变性，能快速对CTL的攻击作出反应，透过改变CTL的蛋白质模式以逃避被CTL识别。为了反击肿瘤逃逸机制，在接种疫苗中，运用各种特异性肽。这样，可同时使用数种CTL克隆物对肿瘤进行广泛的同时攻击。这可能会减少肿瘤逃避免疫应答打击的机会。这一假设最近已经在治疗晚期黑色素瘤患者的一项临床研究中得到证实。除了少数情况之外，至少有三次不同T细胞应答的患者显示出目标临床反应或稳定的病情((Banchereau et al.，2001))以及生存期延长(与J.Banchereau私下交流结果)，但绝大多数少于三次T细胞应答的患者诊断患有进展性疾病。
[0093] 申请人的一项研究显示，当使用一种由13种不同肽组成的疫苗接种肾细胞癌患者时，得到了类似结果(H.Singh-Jasuja，S.Walter，T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich，M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch；Correlation of T-cell response，clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901，a novel multi-peptide vaccine；ASCO Meeting 2007 Poster#3017；M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich，T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter，H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief；An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901，ASCO meeting 2007；Poster#3017)。
[0094] 因此，研发一种肿瘤疫苗的主要任务不仅要识别和鉴定新型肿瘤相关抗原及其免疫原T辅助表位，而且还要组合不同抗原表位以增加每位患者对一种以上表位产生应答的可能性。因此，本发明的一个目标是提出有能力与人主要组织兼容性复合体(MHC)I(HLA-I)或II(HLA-II)类分子结合的肽氨基酸序列的组合物。本发明的另一目标是提出一种基于肽组合物的有效抗癌疫苗。
[0095] 在本发明中，发明人分离和描述了与直接来自于哺乳动物肿瘤(主要为胃癌患者的原发样本)中的HLA-I或II类分子结合的肽，肿瘤样本还包括胶质母细胞瘤、结直肠癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤和胃癌的原发组织样本。
[0096] 本发明提出了这样的肽：它们来源于致瘤相关抗原并且有能力与MHC(HLA)-II类分子充分结合，触发人白细胞免疫应答，特别是淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4阳性T淋巴细胞、介导Th1型免疫应答的CD4阳性T淋巴细胞。
[0097] 本发明还提出了这样的肽：它们来源于致瘤相关抗原，并且有能力与MHC(HLA)-I类分子充分结合，触发人白细胞免疫应答，特别是淋巴细胞、T淋巴细胞、CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞以及对癌症患者接种疫苗有益的两种肽的组合物。
[0098] 根据本发明，其目标透过这样的方式达成：提供了一种至少有两种肽组成的药物组合物，这两种肽含有从SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10组成的基团中所选的氨基酸序列、和/或含有与SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10组成的基团85％同源的一个变异氨基酸序列，和/或含有编码SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10的多聚核苷酸或变异氨基酸序列的核酸，以及药学上可接受的载体。同时，本发明的药物组合物还可包括至少这样一种额外的肽：它含有从SEQ ID NO 11至SEQ ID NO：22组成的基团中所选的氨基酸序列、或含有与SEQ ID NO 11至SEQ ID NO：22组成的基团85％相同的一个变异氨基酸序列，或含有编码SEQ ID NO11至SEQ ID NO：22的多聚核苷酸核酸或变异氨基酸序列的核酸。这些肽的总长度可为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至17个氨基酸。这些肽也可含有非肽键。
[0099] 如下文所述，构成本发明基础的肽都被确定为MHC-I类或II类承载细胞所提呈的肽。因此，这些特殊肽以及其他含有该序列的肽(即衍生肽)都能引发特异性T细胞应答，虽然其诱导的反应程度可能会因不同的肽和患者而不同。差异可能因肽的突变等原因造成。本领域技术人员熟知可应用于确定各个肽诱导反应程度的方法，特别是参照本文实例和有关文献后。
[0100] 优选情况是，发明中的变体可诱导T细胞与发明中各个肽发生交叉反应。
[0101] 肽来源于肿瘤相关抗原，特别是具有蛋白酶解、血管生成、细胞生长、细胞周期调控、细胞分裂、转录调控、转译调控、组织侵袭等功能的肿瘤相关抗原。表4描述了这些肽及生成这些肽的蛋白的功能。
[0102] 表4：本发明中的肽及其亲本蛋白的功能
[0103]
[0104] 表5：本发明组合物中其他有用的免疫原性肽
[0105]
[0106]
[0107] 细胞分裂周期2蛋白(CDC2)
[0108] CDC2，也称为p34cdc2或Cdk1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族Cdk，在细胞周期调控中发挥着关键作用。它是细胞从G2期至M期转换的主要调节基因。在间期结束时，它透过与A型细胞周期蛋白结合被启动并促进有丝分裂发生。核膜破裂后，A型细胞周期蛋白退化并被B型细胞周期蛋白取代。CDC2和cyclinB之间的复合体形成有丝分裂促进因子(MPF)，这对于促进细胞完成有丝分裂至关重要。
[0109] 活性CDC2可使70多种底物磷酸化。例如「，连接分子」组蛋白H1的磷酸化可导致染色质结构松散以及特定基因的转录，RNA聚合酶II的磷酸化增强转录(Cisek and Corden，1989)。BRCA2的磷酸化刺激同源性重组依赖性修复(Esashi et al.，2005)，FOXO1的磷酸化抑制其转录活性，导致细胞增殖和存活。分离酶的磷酸化抑制姐妹染色单体过早分离(Stemmann et al.，2001)。由于细胞分裂后期促进复合体(APC/C)使细胞周期蛋白B泛素化，因此在后期CDC2活性再次被切断，导致其降解。
[0110] CDC2在有丝分裂的功能不具有冗余性，因此其他Cdk(如Cdk2、4和6)的活性不能对其进行补偿。与此相反，据报导，CDC2在细胞周期的其他期别(如G1/S转换期)行使功能，并能够替代「相间激酶」。因此，有人提出CDC2是细胞周期的唯一基本Cdk。
[0111] 除了该基因在细胞周期中的表达和功能，据报导，在某些情况下，CDC2在细胞凋亡的条件下表达，并且活性增强可导致有丝分裂灾变。在多种癌症中发现有CDC2过量表达，虽然其他细胞周期蛋白(如cyclin)的表达失调更加频繁。过量表达CDC2的癌症类型包括摄护腺癌、口腔癌、口腔鳞状癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)(Qian et al.，2009)，幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤(Banerjee et al.，2000)和结肠癌(Yasui et al.，1993)。在一些情况下，过量表达与预后差相关。在胃癌(GC)中，已报导有过量表达和/或活性增强(14/23例)，表明CDC2表达可以发挥致病作用。此外，CDC2被认为属于一种有丝分裂过程中具有活性的一组基因，如果过量表达，则导致肿瘤的染色体不稳定。CDC2和其他Cdk的抑制剂被视为癌症治疗的候选药物(Shapiro，2006)。
[0112] 异常纺锤状小头畸形相关蛋白(ASPM)
[0113] 异常纺锤状小头畸形相关(ASPM)基因是果蝇异常纺锤(asp)蛋白的人直系同源基因，也是常染色体隐性原发性小头畸形的最常见突变基因。在人中，ASPM纯合子突变引起的缺陷性神经形成导致小头症和智力迟钝。
[0114] 原发性常染色体隐性小头畸形(MCPH)最常见的原因似乎是参与神经形成调节的ASPM基因发生突变。ASPM在有丝分裂期间位于纺锤体两极。
[0115] siRNA介导的抑制而对ASPM的抑制性抑制了肿瘤细胞增殖和神经干细胞增殖，这为ASPM是胶质母细胞一个潜在分子靶点提供了支援。相对于正常大脑，ASPM在胶质细胞瘤中呈过量表达。ASPM的表达可作为恶性胶质瘤的一个标志物，代表一个潜在的治疗靶点。不论p53的突变状态和肿瘤期别如何，ASPM过量表达都是一种预测肝细胞癌(HPC)侵袭性/转移可能性增加、肿瘤早期复发(ETR)高风险的分子标志物，因此预后差。ASPM在永生细胞、癌细胞和非小细胞肺癌(NSCLC)组织中表达上调(Jung et al.，2009)。
[0117] 泛素羧基末端水解酶15(UCHL5)，也称为泛素C-末端水解酶(UCH37)或INO80R，是与蛋白酶体相关的脱泛素酶。它透过切割C-端Cys76和Lys48之间的异肽键而使蛋白连接多聚泛素链与远端分开(Nishio et al.，2009)。
[0118] UCHL5与hRpn13(也称为Adrm1)结合，Adrm1是蛋白酶体19S(PA700)调节粒子的组成部分，启动其异肽酶活性。hRpn13也有泛素受体的功能，从而使底物识别耦合至去泛素化。UCHL5也可与Rpn10/S5a结合，后者为位于「顶盖」与「底部」之间的19S粒子的另一组成部分，但这种相互作用未能启动UCHL5。UCH37可援救泛素化不良的底物或其他因蛋白质水解而降解缓慢的泛共轭物。另外，它也可透过促进多聚泛素化底物从在易位入蛋白水解核心(26S蛋白酶体的20S粒子)的19S调节复合体中的最初结合位点释放，从而增强降解作用。在细胞核中，UCHL5也与Ino80染色质重构复合体相关。蛋白酶体结合后，它被启动并可能有助于转录调节或被表明由Ino80和蛋白酶体介导的DNA修复。UCHL5的功能可能至少部分是由其他蛋白质产生，因为虽然RNA干扰介导的UCHL5抑制加速了细胞蛋白质的降解，但对细胞生长、蛋白酶体结构或蛋白水解能力没有产生可检测到的影响。
[0119] 泛素特异性蛋白酶，如UCHL5参与了细胞周期进展的控制、分化、DNA复制和修复、转录、蛋白质质量控制、免疫应答和细胞凋亡等几个过程。至少有一些证据表明UCHL5可导致恶性转化。UCHL5在人宫颈癌组织中的活性与相邻正常组织相比已被证明为上调。它能够去泛素化，并使TGF-β受体及其下游调节因子Smad稳定，从而增强TGF-β信号传导。TGF-β信号传导增强在癌症进展晚期充当一种肿瘤启动子，尽管它具有双重功能、并且在癌症早期和启动之前也可能是一种肿瘤抑制因子(Wicks et al.，2005；Wicks et al.，2006；Horton et al.，2007；Bierie and Moses，2006)。
[0120] c-Met
[0121] 参见实例EP 08008292.8和EP1507795B1。此外，c-Met透过磷酸化的组成性启动也被认定为人类透明肾细胞癌的一种重要发生机制(Nakaigawa et al.，2006)。
[0122] 往往由肿瘤缺氧诱导的Met过量表达可导致受体的组成性活化并与较差预后具有相关性。使内源性MET基因沉默、在肿瘤细胞中过量表达，导致体外完全侵袭性生长计划实施受损、缺乏肿瘤生长以及体内实验性转移发生的减少。值得注意的是，在已确定的转移癌中使MET沉默导致它们几乎完全消退(Corso et al.，2008)。
[0123] 巨噬细胞刺激蛋白受体(MST1R)
[0124] MST1R(别名RON)受体是细胞表面受体酪氨酸激酶Met家族的一员，主要表达于上皮细胞和巨噬细胞上。与c-MET一样，RON由多种上皮源性肿瘤及癌细胞系表达，它被认为在肿瘤发生中发挥着功能性作用。临床研究表明，MST1R过量表达与患者预后结果较差以及转移相关。
[0125] MST1R在胃癌组织和相应的瘤旁组织表达显著，但在正常胃黏膜中并不表达(Zhou et al.，2008)。MST1R受体可诱导与其各自配体发生反应的细胞迁移、侵袭、增殖和存活。此外，MST1R具有体外、动物模型体内致癌活性，而且往往在人癌症中下调(Dussault and Bellon，2009)。资料显示，与体外以及肿瘤生长降低和原位移植到体内摄护腺后微血管密度下降的MST1R表达细胞相比，摄护腺癌细胞中的MST1R抑制可导致血管内皮细胞趋化作用明显降低。研究表明，与对照细胞相比，MST1R激酶在高度致瘤性结肠癌细胞系中RNA干扰介导的抑制可导致增殖下降。
[0126] 染色体结构维持蛋白4(SMC4)
[0127] 染色体结构维持(SMC)蛋白是染色体ATP酶，自细菌至人类高度保守，在较高阶染色体的组织和动力学的许多方面发挥着基础性作用。
[0128] SMC4蛋白是凝聚蛋白的核心组成部分，在染色质凝聚中发挥作用，还与细胞核仁分离、DNA修复和染色质支架的维持相关。单个生物体的真核细胞至少有六个SMC蛋白，它们形成三个不同的异源二聚体且具有专门的功能：SMC2和SMC4的功能是充当凝聚蛋白复合体的核心，对染色体的组装和分离非常重要。
[0129] 用RT-PCR对25种不同的正常组织的mRNA水平分析结果显示，该基因在正常摄护腺和唾液腺中呈高表达，在结肠、胰腺和小肠中表达很弱，在其他组织中无表达。对人癌细胞样本的RT-PCR研究表明，RNA在很多癌症细胞系和癌症标本中呈高表达，包括26份人类乳腺癌标本中的23份、所有3份结肠癌标本、以及所有3份胰腺癌标本(Egland et al.，2006)。
[0130] AVL9
[0131] 令人惊讶的是，该蛋白被发现为源蛋白，而关于AVL9蛋白和相应基因的功能相关资料非常少。
[0132] 动粒蛋白Nuf2
[0133] NUF2(CDCA-1)基因编码一种与酵母Nuf2非常类似的蛋白，这是与着丝粒相关的一种保守蛋白复合物的组成部分。在减数分裂前期，当着丝粒与纺锤极体断开连接时，酵母Nuf2从着丝粒中消失，并在染色体分离中发挥着调节作用。研究表明，生存素和hNuf2 csiRNA暂时已知其mRNA，分别透过阻滞有丝分裂导致多核化和细胞死亡(Nguyen et al.，2006)。Nuf2和Hec1均是外板稳定微管正端微管结合点组织时所需要的，而这些结合点需要动粒蛋白中双轴取向所需的持续极向力量(DeLuca et al.，2005)。
[0134] 使用肺癌组织微列阵方法的免疫组织化学分析证实了在各种组织类型的绝大多数肺癌中，CDCA1和KNTC2蛋白质都处于高水平。表达升高与非小细胞肺癌患者预后较差相关。透过携带与KNTC2结合域相应的CDCA1衍生19-氨基酸肽(11R-CDCA1(398-416))的细胞渗透肽而抑制上述蛋白的结合，有效地抑制了非小细胞肺癌细胞(Hayama et al.，2006)。siRNA介导的对CDCA1或KNTC2的抑制发现可抑制非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、结直肠癌和胶质瘤的细胞增殖并诱导凋亡(Kaneko et al.，2009)。CDCA 1基因在宫颈癌中表达不同(mRNA表达由实时PCR验证，蛋白表达由免疫组化验证)(Martin et al.，2009)。对手术切除胃癌组织(弥漫型，6，肠型，4)的RT-PCR证实了在癌症组织中CDCA1的2种变体表达上调。在本研究中发现到了选择性剪接变体，特别是在CDCA1中发现，这些变体可用作抗癌疗法的诊断标志物和/或新型靶标(Ohnuma et al.，2009)。
[0135] 磷酸酯磷酸水解酶2(PPAP2C)
[0136] 该基因编码的蛋白质是磷脂酸磷酸酶(PAP)家族的一员。PAP将磷脂酸转化为甘油二酯，并在新合成甘油脂以及磷脂酶D介导的受体启动信号转导中发挥作用。已经报导有三种编码不同异构体的选择性剪接转录变体。
[0137] PPAP2C是在转化的原发性成人间质干细胞(MSC)中上调的一种潜在新型靶标。PPAP2C的抑制延缓其进入细胞周期的S期，并由p53转录调控，从而降低细胞增殖。有些资料表明，在许多人类癌症中观察到的PPAP2C过量表达可能是细胞增殖增加的必要条件(Flanagan et al.，2009)。一项研究表明，PPAP2C是成纤维细胞的一种细胞周期调节因子。
PPAP2C过量表达(而不是一种催化无效突变)导致过早进入S期，并伴有早熟细胞周期蛋白A积聚。上述情况代表着进入S期速率的重大变化，可能影响有丝分裂、迁移、伤口愈合、发展和肿瘤发生的过程。
PPAP2C过量表达(而不是一种催化无效突变)导致过早进入S期，并伴有早熟细胞周期蛋白A积聚。上述情况代表着进入S期速率的重大变化，可能影响有丝分裂、迁移、伤口愈合、发展和肿瘤发生的过程。
[0138] 泛醇-细胞色素c还原酶结合蛋白(UQCRB)
[0139] UQCRB-基因编码包含10个核编码和1个线粒体编码亚基的泛醇-细胞色素c氧化还原酶复合物组成的一种蛋白。编码蛋白与泛醇结合，并在泛醇结合时参与电子转移。此基因的突变与线粒体复合物III缺乏相关。在X染色体上已经描述有一种假基因。
[0140] UQCRB基因可能是胰腺导管腺癌中一种潜在的癌基因或肿瘤抑制基因(Harada et al.，2009)。UQCRB基因在肝细胞癌中过量表达(Jia et al.，2007)。
[0141] Prominin 1(Prom1)
[0142] Prominin-1，也称为CD133，最初被认为是CD34+造血祖细胞的一种特定分子，之后被证明是各种组织正常干细胞和癌干细胞(CSC)的一种标志物(Mizrak et al.，2008)。但是，关于其作用知之甚少。由于它主要位于浆膜的突出部位，如上皮细胞微绒毛，功能性作用归因于作为浆膜拓扑「组织者」的prominin-1。由于它被发现与胆固醇相互作用，因此，可能在浆膜内维持适当脂质成分起重要作用。
[0143] Prominin-1在很多人体肿瘤中用作CSC标志物。只有一小部分肿瘤细胞的prominin-1通常为阳性，预期作为一种CSC标志物。根据不同肿瘤类型，每个肿瘤阳性细胞数达到1至15％，主要为2％左右。其中经功能测试prominin-1表达细胞被证明为CSC(如形成球形，在免疫缺陷小鼠中启动肿瘤生长的高能力和不对称分裂/自我更新/多能性增长)的肿瘤是：
[0144] -结肠癌(2-2.5％的肿瘤)(Todaro et al.，2007；Ricci-Vitiani et al.，2007)，[0145] -肝癌(Ma et al.，2007；Suetsugu et al.，2006；Yin et al.，2007)，[0146] -胰腺癌(Hermann 2007；Wang 2009)，
[0147] -摄护腺癌(1％的肿瘤)(Richardson et al.，2004)，
[0148] -不同表型的脑肿瘤(Singh et al.，2003；Singh et al.，2004)，
[0149] -急性淋巴细胞性白血病(ALL)等白血病(Cox et al.，2009)，
[0150] -黑色素瘤(Monzani et al.，2007；Rappa et al.，2008)，
[0151] -肺癌(Chen and O'Shea，2008；Eramo et al.，2008；Tirino et al.，2009)，[0152] -尤文氏肉瘤(Suva et al.，2009)，
[0153] -子宫内膜癌(Rutella et al.，2009)，
[0154] -口腔鳞状细胞癌(Zhang et al.，2009)和
[0155] -头颈部鳞状细胞癌((Harper et al.，2007)。
[0156] 此外，几项研究显示，与健康组织相比，prominin-1在癌组织中表达增加，其中大部分研究发现prominin-1的表达与总生存期、肿瘤分期或转移等临床参数呈相关性。实例有非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤和滑膜癌。Prominin-1的表达也与胶质瘤、胰腺癌(高达15％的PROM1+细胞)、结直肠癌、结肠癌、直肠癌和乳腺导管癌的预后较差相关。有趣的是，PROM1 mRNA在转移癌患者的外周血单核细胞(PBMC)中上调，特别是在有骨转移的患者中上调，PROM1在PBMC中的表达是整体生存率的预后因素。在卵巢癌中未发现与预后相关。
[0157] 在弥漫性胃癌中，硅片分析表明有PROM1表达(Katoh and Katoh，2007)，并且(Smith et al.，2008)报导了在蛋白水平与正常胃组织相比在胃癌中过量表达。然而，(Boegl and Prinz，2009)报导了prominin-1表达在胃癌中降低，尤其是在胃癌后期，并声称prominin-1表达与血管生成密切相关，在后期也降低，而与肿瘤生长无关。使用胃癌细胞株的一项研究(Takaishi et al.，2009)声称，CD44是胃癌中的一种CSC标志物，而prominin-1不是。
[0158] (Zhu et al.，2009)提供了prominin-1表达细胞参与肿瘤形成的证据，并报导在小鼠肠道癌症模型中所有肿瘤细胞均产生于Prom1+细胞，但只有7％保留了Prom1+表型。此外，prominin-1(+)细胞已被证明有助于肿瘤血管生成。与CSC预期的一样，prominin-1(+)细胞已被证明因Akt生存途径的启动而具有化学抗性(Ma 2008)。(Bertolini et al.，2009)报导了这些细胞对顺铂治疗无反应。由于FLIP的上调，它们对TRAIL和Fas诱导的细胞凋亡有抗性。它们透过分泌IL-4保护自身不会细胞凋亡。然而，由于它们能被NK细胞(Castriconi et al.，2007；Pietra et al.，2009)和细胞毒性T细胞(Brown et al.，2009)杀灭，因此，可能被免疫系统侵入。
[0159] 基质金属蛋白酶11(MMP11)
[0160] 有人提出基质金属蛋白酶11(MMP11)在需要组织重建的若干生理过程(如：乳腺发育、哺乳后恢复、伤口愈合和瘢痕形成)中以及月经周期中发挥作用。也有人提出它可透过脂肪细胞分化而负调控脂肪的动态平衡。相对于其他的MMP，它不能以裂解典型性细胞外基质分子-胶原VI除外。然而，已确认了其他底物，如α2-巨球蛋白，某些丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，包括α1抗胰蛋白酶、胰岛素样生长因子结合蛋白1和层粘连蛋白受体。
[0161] MMP11被发现是一种在浸润性乳腺癌周围基质细胞中特异性过量表达的基因。进一步研究证实其在乳腺癌和其他类型癌症周围的基质中表达，如皮肤癌、非小细胞以及小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌和结直肠癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤癌、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤(MMP11在星形细胞瘤中表达，但在少突胶质细胞瘤和恶性胶质瘤中表达较低)、唾液腺导管癌、宫颈癌、结外T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和摄护腺癌。研究指出，MMP11在大多数浸润性人癌症的基质中过量表达，但在肉瘤和其他非上皮肿瘤中很少表达，MMP11主要表达于与肿瘤直接相邻的基质细胞中，而肿瘤本身、正常组织和肿瘤远处的基质细胞为阴性。然而，这一点并不能推而广之，因为在某些情况下MMP11也发现于结肠等非癌组织中或肿瘤细胞(如：胰腺、乳腺、蛛网膜和胃肿瘤)中。MMP11水平较高与恶性表型/较高侵袭性及预后不良相关。然而，在乳头状甲状腺癌中，MMP11表达与浸润性特点呈负相关。
[0162] 由于MMP11表达与微血管密度不相关，因此具有血管生成作用的可能性不大。相反，它似乎提高肿瘤细胞的生存并抑制细胞凋亡。有研究指出，成纤维细胞的MMP11导致刺激癌细胞的IGF-1R途径，从而提高其增殖能力。其导致脂肪细胞分化的能力支持癌症中瘤周成纤维细胞样细胞积聚从而有利于癌细胞生存和肿瘤进展的论点(Motrescu and Rio，2008)。
[0163] MMP11发现于肿瘤组织以及胃癌患者血清中，并且表达与转移相关(Yang et al.，2008)。此外，(Deng et al.，2005)显示，MMP11在胃癌肿瘤细胞系和原发肿瘤中呈高表达，而在其他类型癌症的基质中并非绝对没有，并且MMP11似乎提高肿瘤细胞增殖。
[0164] ABL1
[0165] ABL1原癌基因编码Src家族的细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶，研究提示该家族参与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附和应激反应过程(Yoshida，2007)。C-Abl在核和细胞质室之间穿梭。细胞核c-Abl参与细胞生长抑制并促进细胞凋亡。相比而言，对于细胞质c-Abl的作用描述较少。研究提示细胞质c-Abl在形态形成和F-肌动蛋白动力学方面发挥作用，并且在生长因子和整合素配体等细胞外刺激诱导的信号传导中发挥作用。据报导，细胞质c-Abl可促进有丝分裂。C-Abl有丝分裂基质尚未确定，但它们很可能包括Rho家族(尤其是Vav和Sos成员)小GTP酶的调节因子。
[0166] 广泛表达ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活性受CDC2介导的磷酸化调节，表明了ABL1的细胞周期功能。c-Abl蛋白的活性受其SH3域负调节，并且SH3域缺失使ABL1成为一种癌基因。c-Abl非受体酪氨酸激酶在非造血细胞中调节肌动蛋白的反应。一些研究将c-Abl确定为信号级联反应中一个主要作用者，导致肌动蛋白在T细胞活化期间重组(Huang et al.，2008)。
[0167] ABL1基因突变与慢性骨髓性白血病(CML)相关。在CML，该基因在22号染色体上的BCR(断点簇区)基因内易位而被启动。这种新融合基因BCR-ABL编码未调节的、靶向细胞质的酪氨酸激酶，从而使细胞增殖而不被细胞因子调节。这又使该细胞变成癌细胞(Zhao et al.，2009)。启动的c-Abl酪氨酸激酶不是作为一种融合蛋白，在肺癌和乳腺癌等实体恶性肿瘤中发挥了重要作用(Lin and Arlinghaus，2008)。
[0168] 最近的观察表明，c-Abl在实体肿瘤中也有失调节发生。在乳腺癌和NSCLC中已发现有细胞质激酶高活性。但是，并没有达到过量表达的程度，并且组成性激酶活性需要蛋白磷酸化。在乳腺癌细胞中，c-Abl磷酸化由细胞膜酪氨酸激酶(包括SFK、EGFR家族成员和IGF-1受体)诱导。在实体肿瘤中没有发现ABL融合蛋白。
[0169] ABL1与胃癌-在对ABL1表达的一项免疫组织化学研究中，调查了广泛的正常胎儿和成人人体组织以及多种类型的肿瘤类型。大多数肿瘤显示了局灶性或较弱的ABL免疫应答。在软骨肉瘤、脂肪肉瘤、弥漫型胃(印戒)腺癌中发现了最强染色。在后两种情况下，ABL也表达于肿瘤微血管上，提示可能在血管生成中发挥作用。
[0170] 最近的研究显示，感染cagA阳性幽门螺杆菌在胃癌发展中起着至关重要的作用。幽门螺旋杆菌在胃上皮细胞感染延长后阻止EGFR内吞作用和受体降解。此外，这种抑制作用除了透过对非受体激酶c-Abl的CagA磷酸化非依赖型活化外，还透过CagA依赖型活化发生，这反过来又使EGFR靶点pY1173磷酸化(Bauer et al.，2009)。STI571或shRNA对c-Abl激酶活性的选择性抑制阻止了细胞毒素相关基因A(CagA)的持续磷酸化和上皮细胞迁移，提示了c-Abl在幽门螺旋杆菌感染和致病性中的关键作用(Poppe et al.，2007)。
[0171] 激酶阻滞剂的一个实例为伊马替尼(Imatinib mesylate，Gleevec，STI571)，是Bcr/Abl癌蛋白的抑制剂，已成为慢性粒细胞性白血病的一线疗法(Pytel et al.，2009)。伊马替尼已被批准用于治疗晚期胃肠道间质瘤(GIST)患者，其中一种酪氨酸激酶受体KIT，呈异常表达(Croom and Perry，2003)。另一种最近用于癌症治疗的激酶抑制剂是达沙替尼(BMS-354825)，它具有非受体细胞质型ABL特异性(Pytel et al.，2009)。Nilotinib是一种口服二代bcr-abl TKI，用于伊马替尼耐药或不耐受的Ph+CML-CP和-AP成人(Deremer et al.，2008)。
[0172] 在WO 2007/028574中披露了SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 15，CDC42(细胞分裂周期42)是参与调节细胞周期的一种蛋白质。该蛋白质是Rho-子家族的一种小GTP酶，调节控制多种细胞功能的信号通路，其中包括细胞形态、迁移、内吞作用和细胞周期进展。CDC42被发现在胶质母细胞瘤中高度过量表达。
[0173] WO 2004/067023介绍了肿瘤相关抗原生存素衍生的MHC I类限制肽，这些肽能与HLA I类分子高亲和性结合。
[0174] 分泌磷蛋白1(SPP1)，亦称为骨涎蛋白(BSP-1)、早期T淋巴细胞启动(ETA-1)，最经常称为骨桥蛋白(OPN)，是一种人类基因产物，其他物种中也含有。骨桥蛋白是骨重塑中重要的因子。具体来说，研究表明，它具有将破骨细胞锚固至骨矿物质基质的作用。除了骨桥素外，骨头的有机成分大约是I型胶原、骨钙素、骨连接素、骨唾液酸蛋白和碱性磷酸酶干重和计数的20％。I型胶原占蛋白质量的90％。
[0175] OPN与数种整合素受体结合，包括白血球表达的α4β1、α9β1和α9β4。这些受体在这些细胞中有效地执行细胞黏附、迁移和生存的功能。因此，近期的研究工作主要集中于OPN在介导这些反应中的作用。
[0176] 骨桥蛋白表达于广泛的免疫细胞中，包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞，T细胞和B细胞，动力学各不相同。据报导，OPN可以不同方式充当免疫调节剂。首先，它具有趋化特性，促进将细胞征募至发炎部位。它还具有粘附蛋白的功能，参与细胞附着和伤口愈合。另外，OPN介导细胞活化和细胞因子产生，并透过调节细胞凋亡促进细胞存活。
[0177] IL-12促进活化T细胞向Th1型分化，从而产生包括IL-12和IFNγ的细胞因子。OPN可抑制Th2细胞因子IL-10的产生，从而增强Th1应答。OPN影响细胞介导的免疫，并具有Th1细胞因子的功能。它增强了B细胞免疫球蛋白的产生和增殖。2008年的最新研究表明，OPN还会引起肥大细胞脱粒。[Nagasaka A，Matsue H，Matsushima H，et al.(February 2008)。「骨桥蛋白由肥大细胞产生并影响IgE介导的肥大细胞脱粒和迁移」。Eur.J.Immunol.38(2)：489-99]研究人员观察到，与野生型小鼠相比，IgE介导的过敏性反应在剔除OPN的小鼠中显著降低。一项癌症研究也提示了OPN在巨噬细胞活化中的作用，研究人员发现，与OPN缺乏肿瘤相比，产生OPN的肿瘤能够诱导巨噬细胞活化。
[0178] 在很多情况下，OPN是一种重要的抗凋亡因子。OPN阻止巨噬细胞和T细胞以及暴露于有害刺激物的成纤维细胞和血管内皮细胞的活化启动诱导的细胞死亡。OPN可阻止炎症性结肠炎中的非程序性细胞死亡。
[0179] OPN与广泛表达的多种细胞表面受体相互作用的事实使其在许多生理和病理过程中发挥着积极作用，包括伤口愈合、骨转换、肿瘤的发生、炎症、缺血和免疫应答。因此，操控血浆OPN水平可能有利于治疗自身免疫性疾病、癌转移、骨质疏松症和某些形式的应激反应。
[0180] 人表皮生长因子受体3(ERBB3)
[0181] ERBB3编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的一员。它由基因调节剂、其他ERBB和非ERBB受体以及其他激酶和新机制启动。在下游它主要与磷酸肌醇3-激酶/AKT存活/有丝分裂通路相互作用，但也与GRB、SHC、SRC、ABL、rasGAP、SYK和转录调控因子EBP1(Sithanandam and Anderson 413-48)相互作用。
[0182] ERBB3在原发癌中的表达及其在培养细胞中的机制性贡献的研究已表明其与乳癌、卵巢癌、前列腺癌、某些脑细胞癌、视网膜癌、黑素细胞癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌和肺癌具有因果关系或与其维持相关，尽管与各种癌的确定程度不同(Sithanandam and Anderson 413-48)。透过免疫组织化学方法在整个胃肠道的上皮细胞中检测出ERBB3蛋白，包括口咽和食管的扁平上皮细胞、胃壁细胞和小肠及大肠的肠上皮细胞。ERBB3在胃癌中表达增多(Poller et al.275-80；Sanidas et al.935-40)。胃癌细胞系均表达ERBB3和一种剪切分泌产物。ERBB3在胃部恶性肿瘤中的关键作用的有力证据来自一项分化不佳的印戒细胞胃癌研究(Kobayashi et al.1294-301)。Zhang等人采用免疫组织化学方法(IHC)考察了两种病理类型(肠型和扩散型)的胃癌中ERBB3的表达。扩散型GC表现出的ERBB3过度表达率显著高于肠型(26.2％对比5.0％，p<0.01)。ERBB3在两种组织学类型的胃癌(肠型和扩散型)中的选择性过度表达与预后不良紧密相关(Zhang et al.2112-18)。ERBB3表达与涉及肿瘤进展的参数显著相关，包括肿瘤侵袭深度、累及淋巴结、远端转移、肿瘤分期和复发疾病(Hayashi et al.7843-49)。采用免疫组织化学方法，用新冷冻的组织检查了EGFR、c-erbB-2和c-erbB-3在21种胃癌和20种慢性胃炎中的表达和共同表达，考虑了临床病理学变量。通常，胃癌患者显示出的EGFR、c-erbB-2和c-erbB-3过度表达率高于慢性胃炎组(分别为81％和43％；38％和45％；35％和20％)，然而，发现仅EGFR表达具有统计学显著差异(p=0.01)(Slesak et al.2727-32)。
[0183] 已在试验上尝试了几种ERBB3靶向治疗的方法。ERBB3胞外域的RNA适体抑制NPG诱导的ERBB3/ERBB2异源二聚化、ERBB2磷酸化和MCF7乳癌细胞生长(Chen et al.9226-31)。合成设计的锌指转录因子抑制A431鳞状细胞癌细胞中ERBB3基因表达，导致增殖和迁移减少，ERBB3表达抑制的触发效应强于改变ERBB2(Lund et al.9082-91)。维生素E同分异构体γ-生育三烯酸透过特异性阻断ERBB3启动和PI3K/AKT通路的下游刺激抑制哺乳动物细胞增殖(Samant and Sylvester 563-74)。微RNA 125a降解ERBB3 RNA和蛋白，抑制AKT活化和SKBR3哺乳动物癌细胞的细胞生长及侵袭(Scott et al.1479-86)。siRNA在乳癌细胞中下调ERBB3，消除其对酪氨酸激酶抑制剂的继发性耐药并允许诱导细胞凋亡(Sergina et al.437-41)。研究显示ERBB3或AKT的小干扰RNA(siRNA)有望成为一种肺腺癌的治疗手段(Sithanandam et al.1847-59)。
[0184] 研究表明，OPN促进IL-17的产生；OPN在多种癌症中过量表达，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤和间皮瘤；OPN还可导致肾小球肾炎和肾小管间质肾炎；并且OPN可在动脉内的粥样硬化斑块中发现。因此，操控血浆OPN水平可能有利于治疗自身免疫性疾病、癌转移、骨质疏松症和某些形式的应急。
[0185] 人表皮生长因子受体3(ERBB3)
[0186] ERBB3编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的一员。它被神经调节蛋白、其他ERBB和非ERBB受体、以及其他激酶、并以新颖机制启动。在其下游，其明显与磷酸肌醇3-激酶/AKT生存/促有丝分裂途径存在交互作用，而且还与GRB、SHC、SRC、ABL、rasGAP、SYK和转录调节因子EBP1相互作用(Sithanandam and Anderson 413-48)。
[0187] 原发癌ERBB3表达以及其在培养细胞中的机理研究提示了上述结果，确定程度不同、与乳腺癌、卵巢癌、摄护腺癌、某些脑细胞癌、视网膜癌、黑色素细胞癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌和肺癌(Sithanandam and Anderson 413-48)有因果关系。ERBB3蛋白用免疫组织化学方法在整个消化道的上皮细胞中检测到，包括鳞状上皮口咽和食管、胃壁细胞和大小肠表面肠细胞。ERBB3在胃癌中表达增加(Poller et al.275-80；Sanidas et al.935-40)。所有胃癌细胞株均表达ERBB3和截短分泌产物。ERBB3在胃恶性肿瘤中关键作用的有力证据来自于对于低分化印戒细胞胃癌的研究(Kobayashi et al.1294-301)。Zhang等人使用免疫组化(IHC)方法研究了ERBB3在两种病理类型(肠型和弥漫型)胃癌中的表达。弥漫型胃癌比肠型胃癌表现出明显高的ERBB3过量表达比例(26.2％vs.5.0％，p<0.01)。ERBB3在两种组织学类型胃癌中的选择性过量表达与预后较差紧密相关(Zhang et al.2112-18)。
ERBB3表达与肿瘤进展，包括肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期和复发性疾病等参数显著相关(Hayashi et al.7843-49)。EGFR、c-erbB-2和c-erbB-3在21例胃癌和20例慢性胃炎中的表达和共同表达使用免疫组化方法对考虑有临床病理因素的新鲜冷冻组织进行了研究。一般来说，胃癌患者比慢性胃炎组患者显示出较高的EGFR、c-erbB-2和d-erbB-3过量表达发生率(分别为81％和43％；38％和45％；35％和20％)，但是，只有EGFR的表达发现有统计上意义差异(p=0.01)(Slesak et al.2727-32)。
ERBB3表达与肿瘤进展，包括肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期和复发性疾病等参数显著相关(Hayashi et al.7843-49)。EGFR、c-erbB-2和c-erbB-3在21例胃癌和20例慢性胃炎中的表达和共同表达使用免疫组化方法对考虑有临床病理因素的新鲜冷冻组织进行了研究。一般来说，胃癌患者比慢性胃炎组患者显示出较高的EGFR、c-erbB-2和d-erbB-3过量表达发生率(分别为81％和43％；38％和45％；35％和20％)，但是，只有EGFR的表达发现有统计上意义差异(p=0.01)(Slesak et al.2727-32)。
[0188] 在实验中已经尝试过针对ERBB3的几种治疗方法。ERBB3细胞外域的RNA适体抑制NRG诱导的ERBB3/ERBB2异源二聚体化、ERBB2磷酸化和MCF7乳腺癌细胞的生长(Chen et al.9226-31)。抑制ERBB3基因在A431鳞状细胞癌细胞中表达的合成设计锌指转录因子导致细胞增殖和迁移减少，并且ERBB3表达抑制比ERBB2改变有更大的影响(Lund et al.9082-91)。维生素E异构体γ-三烯生育醇透过特异性阻滞ERBB3活化和PI3K/AKT途径的下游刺激而抑制乳腺细胞增殖(Samant and Sylvester 563-74)。微RNA 125a减少了ERBB3 RNA和蛋白、活化AKT和细胞生长以及SKBR3乳腺癌细胞的浸润性(Scott et al.1479-86)。乳腺癌细胞中siRNA对ERBB3的下调阻止了其对酪氨酸激酶抑制剂的二次抗性，并诱导细胞凋亡(Sergina et al.437-41)。ERBB3或AKT的小抑制性RNA(siRNA)显示出作为治疗肺腺癌一种治疗方法的前景(Sithanandam et al.1847-59)。
[0189] 生存素(BIRC5)
[0190] 在胎儿组织和各种人癌症组织中，BIRC5(生存素)-细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一员-表达升高。WO 2004/067023介绍了肿瘤相关抗原生存素衍生的MHC I类限制肽，这些肽能与HLA I类分子高亲和性结合。生存素似乎具有同时调节细胞增殖和凋亡的能力。特别是在胶质母细胞瘤中，可检测到非常高水平的生存素表达(Angileri et al.，2008)。
这表明，生存素在脑胶质瘤中的过量表达可能在恶性增殖、抗凋亡和血管生成中起着重要作用(Zhen et al.，2005；Liu et al.，2006)。尤其是对于胶质母细胞瘤以及其他肿瘤实体，与罹患生存素阴性肿瘤的患者相比，生存素的表达与恶性程度(在胶质母细胞瘤中生存素表达最高)和较短的总存活时间显著相关(Kajiwara et al.，2003；Saito et al.，2007；
Uematsu et al.，2005；Mellai et al.，2008；Grunda et al.，2006；Xie et al.，2006；
Sasaki et al.，2002；Chakravarti et al.，2002)。
这表明，生存素在脑胶质瘤中的过量表达可能在恶性增殖、抗凋亡和血管生成中起着重要作用(Zhen et al.，2005；Liu et al.，2006)。尤其是对于胶质母细胞瘤以及其他肿瘤实体，与罹患生存素阴性肿瘤的患者相比，生存素的表达与恶性程度(在胶质母细胞瘤中生存素表达最高)和较短的总存活时间显著相关(Kajiwara et al.，2003；Saito et al.，2007；
Uematsu et al.，2005；Mellai et al.，2008；Grunda et al.，2006；Xie et al.，2006；
Sasaki et al.，2002；Chakravarti et al.，2002)。
[0191] B型肝核心抗原
[0192] 对于B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白HBc，免疫原肽是众所周知的(Bertoletti et al.，1993；Livingston et al.，1997)。根据本发明，来自HBc的10-氨基酸肽可能纳入作为患者免疫活性的阳性对照，并成功接种入癌症疫苗。
[0193] 表6：源蛋白的癌症相关功能
[0194] 排名“-“<“(+)”<“+”；“?”表示情况目前未知
[0195]
[0196] 从表6中可以看出，本领域技术人员可很容易地使本应用的组合物适用于患者和/或特定的肿瘤，并相应地选择TUMAP。
[0197] 在本发明的一个优选实施例中，药物组合物包括至少两种肽，其中之一含有根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列，并进一步包括含根据SEQ ID NO 11的氨基酸序列的肽。
[0198] 在本发明的一个优选实施例中，药物组合物包括至少两种肽，其中之一含有根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO 2和/或SEQ ID No 11的氨基酸序列。
[0199] 在本发明的一个优选实施例中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQ ID No SEQ ID No 3的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO 2和/或SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
[0200] 在本发明的一个优选实施例中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQ ID No SEQ ID No 1的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO 7和可选SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
[0201] 在本发明的一个优选实施例中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQ ID No SEQ ID No 2的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO 7和可选SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
[0202] 在本发明的一个优选实施例中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQ ID No SEQ ID No 3的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO 7和可选SEQ ID No 11的氨基酸序列的肽。
[0203] 在更为优选的实施例中，药物组合物包括至少有一种以上肽，这些肽含有从SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22以及SEQ ID NO 24组成的基团中所选的氨基酸序列、和/或与SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22以及SEQ ID NO 24至少85％同源的氨基酸序列，和/或含有编码SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22以及SEQ ID NO 24核酸的多聚核苷酸或变异氨基酸序列，以及一种药学上可接受的载体。
[0204] 本发明的进一步优选实施例包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽，这些肽含有从SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22以及SEQ ID NO 24组成的基团中所选的氨基酸序列、和/或与SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10至少85％同源的氨基酸序列、和/或含有编码SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 12和SEQ ID No 11至SEQ ID No 22和SEQ ID NO 24核酸的多聚核苷酸或变异氨基酸序列，以及一种药学上可接受的载体。
[0205] 该药物组合物还可包含更有效的其他肽和/或赋形剂，将进一步解释如下。
[0206] 发明人用给定氨基酸序列的「变种氨基酸序列」表示，一个或多个氨基酸残基等的侧链透过取代另一个自然产生的氨基酸残基的侧链或其他侧链而改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如果不提升的话)其与HLA-A或HLA-DR等合适的MHC分子互动和结合，以及至少维持(如果不提升的话)其产生能识别和杀伤细胞(这些细胞表达含本发明中所定义的一种氨基酸序列的多肽)启动CTL的能力。从数据库中可得知，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合基序相称的核心序列。
[0207] 这些不与T细胞受体互动的氨基酸残基可透过取代另一个几乎不影响T细胞应答并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明中的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或段或变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。
[0208] MHC-II类提呈肽更为大家熟知，这些肽由具有某种HLA特异性氨基酸基序并且N和/或C-端随意延伸(不干扰肽核心序列功能，即被视为与肽和T细胞相互作用无关)的「核心序列」组成。N-和/或C端可分别延伸1至10个氨基酸的长度。这些肽可直接用于载入MHC-II类分子或其序列可克隆入下文所述载体。由于这些肽可在细胞内形成较大肽加工过程的最终产物，因此，也可用长肽。本发明的肽的大小不限，但通常它们的分子量可能小于100000，优选为小于50000，更优选为小于10000，更优选为小于5000，更优选为小于2500，通常约为1000至2000。对于氨基酸残基数目，本发明中的肽可能少于1,000个残基，优选为少于500个残基，更优选为少于100个残基。因此，本发明还提出了总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至17个(即8、9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸的肽或变体的复合物。
[0209] 优选情况是，这些肽含有一个核心序列，其选自由SEQ ID NO 11至SEQ ID NO 22和SEQ ID No 24组成并且C端和/或N端上有1至10个氨基酸延长的群组，更优选的情况是，这些侧翼氨基酸的总数为1至12个，更优选1至10个，更优选1至8个，更优选1至6个，其中侧翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分布(例如所有侧翼氨基酸可以被添加至一个末端，或氨基酸可均等地或以任何其他比例加入两种末端)，但前提是，该肽仍然能根据SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22和SEQ ID No 24任何一个序列所得肽的同样方式与HLA分子结合。
[0210] 相应地，诱导T细胞与本发明中的肽发生交叉反应的变体往往为长度可变的变体。
[0211] 如果一个肽不长于约为12个氨基酸残基，则直接与MHC II类分子结合。优选情况是，两侧核心HLA结合区不会对该肽与MHC-II类分子的结合槽特异性结合能力或该肽提呈至CTL的能力产生重大影响。但是，如上所述，应了解，可使用较大的肽(特别是核苷酸进行编码时)，因为这些较大的肽可被适当的抗原提呈细胞分成片段。另外，侧翼氨基酸可以降低体内肽降解速度，以使提供给CTL的肽实际量高于无侧翼氨基酸的肽。
[0212] MHC I类表位(通常长度为8至10个氨基酸)也可能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。与MHC-II类表位相似，首选情况是，实际表位N-和C-端的拉长前体肽上游和/或下游的侧翼残基不会对该肽提呈至CTL产生重大影响、也不会掩盖加工拉长肽介导的产生实际表位所需的蛋白裂解位点。
[0213] 优选情况是，这些肽含有一个核心序列，其由SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11组成并且C端和/或N端上有1至10个氨基酸的延长，更优选的情况是，这些侧翼氨基酸的总数为1至12个，更优选1至10个，更优选1至8个，更优选1至6个，其中侧翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分布(例如所有侧翼氨基酸可以被添加至一个末端，或氨基酸可均等地或以任何其他比例加入两种末端)，但前提是，该肽仍然能根据SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10和SEQ ID No 11任何一个序列所得肽的同样方式与HLA分子结合。
[0214] 因此，本发明还提出了总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至18个(即8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个)氨基酸的MHC-I类表位的肽或变体。
[0215] 当然，本发明的肽或变体能与人MHC I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合物结合性可用本领域内的已知方法进行测试，例如，本发明下列实施例中所述的方法或文献中所述的检测不同MHC-II类等位基因的方法(例如，Vogt AB，Kropshofer H，Kalbacher H，Kalbus M，Rammensee HG，Coligan JE，Martin R；Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides；J Immunol.1994；153(4)：1665-1673；Malcherek G，Gnau V，Stevanovic S，Rammensee HG，Jung G，Melms A；Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands；J Immunol.1994；153(3)：1141-1149；Manici S，Sturniolo T，Imro MA，Hammer J，Sinigaglia F，Noppen C，Spagnoli G，Mazzi B，Bellone M，Dellabona P，Protti MP；Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+)cytotoxic T cells in association with
histocompatibility leukocyte antigen DR11；J Exp Med.1999；189(5)：871-876；
Hammer J，Gallazzi F，Bono E，Karr RW，Guenot J，Valsasnini P，Nagy ZA，Sinigaglia F；Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules：correlation with
rheumatoid arthritis association；.J Exp Med.1995 181(5)：1847-1855；Tompkins SM，Rota PA，Moore JC，Jensen PE；A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins；J Immunol Methods.1993；163(2)：209-216；Boyton RJ，Lohmann T，Londei M，Kalbacher H，Halder T，Frater AJ，Douek DC，Leslie DG，Flavell RA，Altmann DM；Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes：
analysis in disease discordant human twins，non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice；Int Immunol.1998(12)：1765-1776).
histocompatibility leukocyte antigen DR11；J Exp Med.1999；189(5)：871-876；
Hammer J，Gallazzi F，Bono E，Karr RW，Guenot J，Valsasnini P，Nagy ZA，Sinigaglia F；Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules：correlation with
rheumatoid arthritis association；.J Exp Med.1995 181(5)：1847-1855；Tompkins SM，Rota PA，Moore JC，Jensen PE；A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins；J Immunol Methods.1993；163(2)：209-216；Boyton RJ，Lohmann T，Londei M，Kalbacher H，Halder T，Frater AJ，Douek DC，Leslie DG，Flavell RA，Altmann DM；Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes：
analysis in disease discordant human twins，non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice；Int Immunol.1998(12)：1765-1776).
[0216] 本发明中的肽可能在氨基酸延伸处有其他N和/或C端，其不一定能形成作为MHC分子实际表位的肽，但对有效将本发明中的肽引进细胞具有重要作用(见上文)。在本发明的一实施案中，本发明的肽为融合蛋白，含来自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗原相关不变链(p33，以下称为「Ii」)的80个N-端氨基酸等(Strubin，M.，Mach，B.and Long，E.O.The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J.3(4)，869-872(1984)。
[0217] 本发明还提出一种药物组合物，其包含至少一种本发明中的肽，其中，这些肽的总长度可为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至17个(即9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸。
[0218] 此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫应答。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和非肽键的引入。
[0219] 因此，另一方面，本发明提出了一种药物组合物，其中，至少有一个含非肽键的肽或变体。
[0220] 在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这种逆向反向模拟肽(retro-inverso peptidomimetics)可透过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等在《免疫学杂志》((1997)J.Immunol.159，3230-3237)中所述的方法，此处以引用的方式纳入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(1997年)的研究显示，这些类比肽有利于MHC和辅助性T细胞的应答。以NH-CO键替代CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
[0221] 非肽键为-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美国4897445号专利提出了多肽链中非肽键(-CH2-NH)的非固相合成法，该方法涉及按标准程序合成的多肽以及透过氨基醛和一种含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽键。
[0222] 含上述本发明序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其他化学基团进行合成，从而提高肽的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，例如，疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。
[0223] 另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于提高本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。
[0224] 同样，本发明中的肽或变体可在合成肽之前或之后透过特异氨基酸的反应而进行化学修饰。此类修饰的实例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所着的《Chemical Reagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press，2005)中有概述，以参考文献的方式纳入本文。虽然氨基酸的化学修饰方法无限制，但其包括但不限于透过以下方法修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸吡哆基化、还原烷基化、以2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基团、透过将半胱氨酸过甲酸氧化为磺基丙氨酸而对羧基团和巯基进行氨基修饰、形成易变衍生物、与其他巯基化合物形成混合二硫化合物、与马来酰亚胺反应，与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在碱性pH值下与氰酸盐甲氨酰化。在这方面，建议熟练技术人员参考《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley&Sons NY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白质化学修饰相关的广泛方法。
[0225] 当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化学修饰往往透过氰酸钾的氨基甲酰化实现。
[0226] 一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46，3433)以及其中列出的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式等方法进行合成。
[0227] 纯化可透过以下技术的任何一种或组合方法实现，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/水梯度分离)。
[0228] 肽分析可使用以下方法进行：薄层色谱法、电泳法、特别是，毛细管电泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色谱法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析法以及MALDI、ESI-Q-TOF质谱分析法。
[0229] 另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA等或为单链和/或双链，或多聚核苷酸的原生或稳定形式，如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸，或其组合物，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。不同类型细胞的表达载体为本领域所熟知并且无需过多实验就可选定。
[0230] 一般来说，DNA可以适当的取向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和转译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体透过标准方法被引入宿主。指南可参阅，如：Sambrook等(1989)所着Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Habor Laboratory，Cold Spring Habor，NY。
[0231] 但是，在本发明的一个特别优选实施例中，药物组合物至少包括两种含有从SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 12所选的氨基酸序列的肽。
[0232] 疫苗所含每种肽的最佳量以及最佳给药方案可由一名熟悉本领域的技术人员确定，而无需进行过多实验。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹腔(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选途径为s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选途径为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予1至500mg、50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围曾在以前的试验中成功使用(Brunsvig PF，Aamdal S，Gjertsen MK，Kvalheim G，Markowski-Grimsrud CJ，Sve I，Dyrhaug M，Trachsel S， M，Eriksen JA，Gaudernack G；.Telomerase peptide vaccination：a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer；Cancer Immunol Immunother.2006；55(12)：1553-1564；M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich，T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter，H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief；An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901，ASCO meeting 2007；Abstract No 3017).
[0233] 本发明的药物组合物可能会进行汇编，从而组合物中肽的选择和所含数量都具有组织、癌症和/或患者特异性。例如，特定组织中亲本蛋白的表达模式可引导肽的准确选择，从而避免副作用。这种选择可能取决于待治疗患者具体的癌症类型、以及疾病状态、早期治疗方案、患者免疫状态，当然，还有患者的HLA单倍型。此外，根据特定患者的个人需求，本发明的疫苗可包含个性化成分。根据特定患者的相关TAA的表达、由于个人过敏或其他治疗方法而产生的意外副作用、以及第一轮治疗后对二次治疗或治疗方案的调整，各实例中的肽含量有所不同。
[0234] 对于用作GBM疫苗的一种组合物，例如，亲本蛋白在正常组织中高表达的肽在本发明的组合物中将会避免使用或含量较低。另一方面，如果已知某个患者的肿瘤高表达某种蛋白，则治疗这种癌症的各药物组合物可能含有大量和/或一个以上针对这种特定蛋白的肽，或者可能含有这种蛋白的通路。技术人员可透过以下测试选择免疫原性肽的优选组合，如：测试体外T细胞的代及其效果和总量、针对某些肽的某些T细胞的增殖、亲和力和扩增，以及透过分析IFN-γ的产生(参阅下文实例)测试T细胞的功能性。通常为了上述之目的，最有效的肽然后组合为一种疫苗。
[0235] 一种合适的疫苗将优选为包含1至20个肽，更优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个不同的肽，进一步优选为6、7、8、9、10、11、12、13或14个不同的肽，最优选为10、11、12、13或14个不同的肽。用于癌症疫苗的肽长度为本文披露的任何合适长度。特别是，它可能是一种合适的9-mer肽或一种合适的8-mer或9-mer或10-mer或11-mer肽或12-mer、13-mer、14-mer或15-mer肽.。较长的肽也可能适合，附表4和5中所述的9-mer或10-mer肽优选为MHC-I类肽，而12-至15-mer肽优选为MHC-II类肽。
[0236] 肽组成了肿瘤或癌症疫苗。该疫苗可直接施用到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。
[0237] 该肽可能为纯肽，也可能是与免疫刺激佐剂的组合物(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用、或可能以适当的输送系统给药，例如脂质体。该肽也可共轭形成一种合适的载体(如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露)到合适的载体(参阅WO 95/18145及Longenecker等(1993)Ann.NY Acad.Sci.690,276-291)。该肽也可进行标记、或是一种融合蛋白或是杂合分子。本发明中给出肽序列的肽预期会刺激CD4或CD8CTL。但是，有反向CD阳性T细胞提供帮助时，刺激更为有效。因此，对于刺激CD4T细胞的MHC-II类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD8阳性T细胞的适当表位。另一方面，对于刺激CD8 CTL的MHC-I类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD4阳性T细胞的适当表位。CD4-和CD8刺激表位为本领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。
[0238] 药用载体通常是已熟知的液体，可配制其中的一种有效治疗剂。剂型中的载体虽然可能具有化学和/或生物稳定性、释放特性等等，但是一般不具备任何药理活性。典型配方可在诸如Alfonso R.Gennaro.Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th EditionBaltimore，MD：Lippincott Williams&Wilkins，2000等书籍中找到，包括但不限于盐水、水、缓冲水、0.3％甘氨酸、透明质酸、葡萄糖等。最近，人们发现在人类患者中用作静脉营养很多年的某些脂肪乳剂也可充当一种肽赋形剂。有两种此类乳剂已用作商用脂肪乳剂，名叫Intralipid、Lipofundin。″Intralipid″是瑞典Kabi Pharmacia公司的一种静脉营养脂肪乳剂的注册商标，美国专利号为3169094。″Intralipid″是德国B.Braun Melsungen公司的注册商标。两者均包含大豆油脂肪(1000蒸馏水中含100或200克：即含量分别为10％或20％)。Intralipid中卵黄磷脂用作乳化剂(12g/l蒸馏水)，Lipofundin中蛋黄卵磷脂用作乳化剂(12g/l蒸馏水)。Intralipid和Lipofundin的等渗性均是在它们中加入甘油(25g/l)的结果。
[0239] 为了引发免疫应答，通常疫苗有必要包括使该组合物具有更多免疫原性的佐剂。因此，在本发明的一个优选实施例中，本药物组合物进一步包括了至少一种合适的佐剂。
[0240] 适合的佐剂包括但不仅限于1018ISS、铝盐、 AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特 resiquimod、ImuFact IMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-
21、干扰素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、 载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他专有佐剂，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述
(Aucouturier et al.，2001；Allison and Krummel，1995)。也可使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，此处特别透过引用以其完整形式纳入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.，1996)。
21、干扰素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、 载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他专有佐剂，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述
(Aucouturier et al.，2001；Allison and Krummel，1995)。也可使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，此处特别透过引用以其完整形式纳入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.，1996)。
[0241] 据报导，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可透过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)启动先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞应答，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致TH1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强，甚至CD4T细胞帮助的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的TH1偏移，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与以下其他佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。它们还能加速免疫应答，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂量疫苗也能产生类似的抗体反应(Krieg，2006)。美国6406705B1号专利对CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫应答进行了描述。一种CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其他如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。
[0242] 其他有用的佐剂例子包括但不限于化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如： 多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷酰胺、舒尼替单抗、贝伐单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系统的其他抗体靶向性主要结构(如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需进行过多实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。
[0243] 优选佐剂为咪喹莫特、resiquimod、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、干扰素-α、CpG寡核苷酸和衍生物、聚(I：C)和衍生物、RNA、西地那非、以及PLG的微粒制剂或病毒颗粒。
[0244] 本发明药物组合物的一个优选实施例中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。
[0245] 在本发明药物组合物的一个优选实施例中，佐剂为咪喹莫特或resiquimod。
[0246] 在本发明药物组合物的一个优选实施例中，佐剂为咪喹莫特或resimiquimod。
[0247] 在本发明药物组合物的一个优选实施例中，佐剂为GM-CSF和咪喹莫特的组合物。
[0248] 本发明的组合物可经非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉、腹腔注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所着的Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版，2000年，美国医药协会和制药出版社)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病，优选为结直肠癌。
[0249] 可发现优选制剂，如EP2113253。
[0250] 细胞毒性T细胞(CTL)可识别与MHC分子而不是与完整外来抗原本身结合的以一种肽形式出现的抗原。MHC分子本身位于抗原提呈细胞的细胞表面。因此，只有出现肽抗原、MHC分子和APC三聚体复合物时，才可能启动CTL。相应地，如果并非只有该肽用于启动CTL，而是添加了含各MHC分子的额外APC，则可提高免疫应答。
[0251] 因此，在本发明药物组合物的一个优选实施例中，另外至少包含一种抗原提呈细胞。
[0252] 抗原提呈细胞(或刺激因子细胞)通常在其表面有一个MHC-I类或II类分子，在一个实施例中，该抗原提呈细胞自身基本上不能向MHC-I类或II类分子载入选定抗原。正如下面的更为详细描述，MHC-I类或II类分子在体外可很容易载入选定抗原。
[0253] 优选情况是，哺乳动物细胞的TAP肽转运载体缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽转运载体的适合细胞包括人体肽载入缺陷细胞株T2，可从美国菌种保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)获得，目录号为CRL1992；诸如T2的TAP缺陷细胞株可用作APC，并且由于缺乏TAP，几乎所有由MHC I类分子提呈的肽均受到关注，用于外部载入这些细胞株的空载MHC-I类分子，因此所有作用无疑都将归因于使用的肽。
[0254] 抗原提呈细胞优选为树突状细胞。适当的树突状细胞为自体树突状细胞，用抗原肽作脉冲处理。抗原肽可以是产生适当T细胞应答的任何合适的抗原肽。Murphy等人(1996)在《摄护腺》杂志(The Prostate 29，371-380)以及Tjua等人(1997)(The Prostate 32，272-278)中披露了一种使用自体树突状细胞的T细胞疗法，自体树突状细胞用一种得自与癌症相关的抗原的肽进行脉冲处理。
[0255] 因此，在本发明的一个优选实施例中，至少包含一种抗原提呈细胞的药物组合物以该肽进行脉冲处理或进行载入，例如，透过实例5所示方法。
[0256] 作为一种替代物，抗原提呈细胞包括一个编码肽的表达载体。多聚核苷酸可能选为任何合适的多聚核苷酸，优选为能转导树突状细胞，从而提呈一种肽并诱导免疫性。
[0257] 本发明的核酸优选为由一种病毒核苷酸或病毒组成。例如，腺病毒转导的树突状细胞已被证明可诱导与MUC1相关的抗原特异性抗肿瘤免疫(参阅Gong et al(1997)Gene Ther.4，1023-1028.同样地，可使用基于腺病毒的系统(参阅如，Wan et al(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363)；可使用逆转录病毒系统(Koch et al.，2006)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcs et al(1997)；也可使用血液颗粒介导移转至树突状细胞的方法
{Tuting1997}Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；亦可使用RNA(Ashley et al.，2007)J.Exp.Med.186，1177 1182)。
{Tuting1997}Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；亦可使用RNA(Ashley et al.，2007)J.Exp.Med.186，1177 1182)。
[0258] 一般来说，本发明中，含有发明中的一种或多种核酸的药物组合物可用本发明中那些含有肽的药物复合物的相似给药方式给予，如：静脉注射、动脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、瘤内注射、口服、经皮、经鼻腔、经口腔、经直肠、经阴道、吸入、或外用。
[0259] 由于逃逸机制的原因，肿瘤往往对治疗产生抗性。耐药性可能在治疗期间出现，并在转移和复发肿瘤中表现出来。为了避免这种耐药性，肿瘤通常透过联合给药治疗，转移瘤和无病期后复发的肿瘤后往往需要不同的药物组合来治疗。因此，在本发明的一方面，药物组合物与第二种抗癌药物结合使用。第二种药物可在本发明的药物组合物给药之后给予，也可同时给药。例如，如果化学性质兼容，本发明中的药物组合物可与第二种抗癌药物混合使用，从而实现同时给药。同时给药的另一种方法是，本组合物与抗癌药物同一天给药，给药途径可不同，例如，本发明的药物组合物可注射给药，而第二种抗癌药物可口服。药物组合物和第二种抗癌药物也可在同一疗程给药，但是不在同一天和/或在不同的疗程内给药。
[0260] 另一方面，本发明提出了一种治疗或预防患者癌症的方法，包括给予患者本发明有效治疗量的任何一种药物组合物。
[0261] 有效治疗量是指能引发免疫应答的量，特别是启动CTL亚群。本领域的技术人员使用免疫学标准方法可很容易确定使用量是否有效，如：本说明书实施例中的方法。监测本药物组合物某种量效果的方法是观察受治疗肿瘤的生长和/或其复发情况。
[0262] 在本发明药物组合物的一个特别优选的实施例中，本药物组合物作为抗癌疫苗使用。
[0263] 含肽组合物或肽编码的核酸也可以构成肿瘤或癌症的疫苗。该疫苗可直接施用到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于来自患者免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。
[0264] 本发明的药物组合物可用于治疗癌症或作为癌症疫苗使用。癌症可能为摄护腺(上皮)癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)(Qian et al.，2009)、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤(Banerjee et al.，2000)、结肠(上皮)癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈(上皮)癌、人乳腺癌、摄护腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔(上皮)癌、膀胱癌、卵巢(上皮)癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等恶性实体瘤，优选癌症为胃癌。
[0265] 根据本发明，治疗方法或疫苗的一个最优选实施例中，疫苗为治疗胃癌的一种多肽肿瘤疫苗。该疫苗优选包括从SEQ ID No.1至SEQ ID No.11选定的一系列肿瘤相关肽，它们已经被确定位于原发性胃癌细胞中。这些肽包括HLA-I类和II类肽。这些肽还可至少包括B型肝炎病毒核心抗原中的一种肽(SEQ ID 23)，这种肽为阳性对照肽，作为检测皮内给药疗效的免疫标记物。在一个特别的实施例中，疫苗包括11种肽(根据SEQ ID No.1至SEQ ID No.11)，每种肽含量约为1500μg至75μg，优选为约1000μg至175μg，更优选为约500μg至600μg，最优选为约578μg，所有的肽都可用HPLC和离子交换色谱法进行纯化，外观为白色或类白色粉末。真空冻干粉最好溶于碳酸氢钠，在室温下重组30分钟后用于皮内注射。根据本发明，肽的首选含量约为0.1至100mg，优选为约0.1至1mg，最优选为每500mg溶液中约300μg至800μg。在此，如果未具体说明「，约」一词系指给定值+/-10％。技能娴熟的人员能根据以下因素调整肽的实际使用量，如：患者个体的免疫状态和/或特定癌种所提呈的TUMAP含量。本发明的肽可能有其他形式(无菌溶液等)，而不是真空冻干粉。
[0266] 药品组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽。
[0267] 此处使用的「药用盐」系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制成药剂的酸式或碱式盐进行改性。例如，酸式盐采用自由基(通常其中药物的中性形式具有一种中性-NH2基团)透过与合适酸发生反应而制得。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的硷盐使用药用硷基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。
[0268] 在特别优选的实施例中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)铵或盐酸(氯化物)形式的肽。
[0269] 在一个实施例中，本发明的药物组合物可能包括糖、糖醇、氨基酸(如：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸等)作为骨架形成剂。这些糖可能为单糖、双糖或三糖。这些糖可单独使用，也可与糖醇组合。糖的实例包括：单糖(如：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或山梨糖)、双糖(如：蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)以及三糖(如：棉子糖)。糖醇可能为，例如，甘露糖。优选成分为蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇，更优选为甘露醇。
[0270] 此外，本发明的药物组合物可能包括生理耐受性好的辅料(参见《药用辅料手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》，第五版，Raymond Rowe、Paul Sheskey和Sian Owen编著，医药出版社(2006年))，抗氧化剂如：抗坏血酸或谷胱甘肽，防腐剂如：苯酚、间甲酚、甲基或对羟苯甲酸丙酯、氯丁醇、硫柳汞或苯扎氯铵、稳定剂，骨架形成剂如：蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或山梨醇，甘露醇和/或乳糖及增溶剂如：聚乙二醇(PEG)，即PEG 3000、3350、4000或6000或环糊精，即羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和γ环糊精、或右旋糖酐或泊洛沙姆，即泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、或吐温20、吐温80。在一项优选实施例中，本发明的药物组合物包括一种或多种选自抗氧化剂、骨架形成剂和稳定剂组成的基团耐受性良好的辅料。
[0271] 静脉和肌注给药可接受的pH值范围为pH 2-12，但皮下给药的pH范围降至2.7-9.0，这是因为体内稀释率降低，导致注射部位产生放射的可能性加大。Strickley Robert G.，Pharm.Res.，21，NO：2，201-230(2004)。
[0272] 本发明中含肽和/或核酸的药物制剂给予罹患与各种肽或抗原相关的腺瘤或癌性疾病患者。透过这种方法可以触发T细胞介导的免疫应答。
[0273] 根据本发明，优选的一种药物组合物，其中(尤其是肿瘤相关的)肽、核酸或表达载体含量为组织、癌症和/或患者特异性含量。
[0274] 本发明的另一实施例中，疫苗为核酸疫苗。接种核酸疫苗(如DNA疫苗)编码多肽会导致T细胞应答。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸给予体外细胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子，如白细胞介素-2或GM-CSF。核酸可完全单独给药，也可与免疫刺激佐剂或与免疫刺激细胞因子联合使用，或以适当的输送系统给药，例如脂质体。核酸疫苗可与佐剂一起使用，如上述与肽疫苗一起使用的佐剂。核酸疫苗优选为不与佐剂联合给药。
[0275] 多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。合适的载体和输送系统包括病毒系统，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，都是DNA输送本领域内熟知的方法。也可使用物理输送系统，如透过「基因枪」。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含破伤风类毒素的一个表位(刺激CD-4阳性T细胞)。
[0276] 适当的情况是，给予患者的任何核酸都是无菌、无热原的。裸DNA可肌肉注射、皮内注射或皮下注射。核酸疫苗优选可包括任何合适的核酸输送工具。核酸，优选为DNA，也可用一种脂质体或病毒载体输送系统输送。如果是核酸疫苗(如DNA疫苗)，首选注入肌肉，而肽疫苗首选皮下注射。疫苗也优选注入皮内。
[0277] 我们认为，核酸的吸收和专业抗原提呈细胞(如树突状细胞)编码的肽的表达可能是免疫应答的启动机制所致；然而，树突状细胞可能不会被转染，但是由于它们可能会从组织的转染细胞中挑选出被表达的肽，因此仍然很重要(「交叉启动」，例如，Thomas AM，Santarsiero LM，Lutz ER，Armstrong TD，Chen YC，Huang LQ，Laheru DA，Goggins M，Hruban RH，Jaffee EM.Mesothelin-specific CD8(+)T cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer patients.J Exp Med.2004 Aug 2；200(3)：297-306)。
[0278] Conry等(1996年)在《肿瘤学论文集》(Seminars in Oncology 23，135-147)中、Condon等(1996年)在《自然-医学》(Nature Medicine 2，1122-1127)中、Gong等(1997年)在《自然-医学》(Nature Medicine 3，558-561)中、Zhai等(1996年)在《免疫学杂志》(J.Immunol.156，700-710)中、Graham等(1996年)在《国际癌症杂志》(Int J.Cancer 65，664-670)中、Burchell等(1996)309-313在Breast Cancer，Advances in biology and therapeutics一文中、Calvo等(Eds)、John Libbey Eurotext都对多聚核苷酸介导的癌症免疫化治疗进行了描述，所有文限均透过引用以其完整形式纳入本文。
[0279] 这也可能有益于疫苗特异性靶向作用于细胞群(例如抗原提呈细胞)，可使用局部注射、使用靶向性载体和输送系统、或对患者该类细胞群的选择性纯化以及体外给予肽或核酸(例如，树突状细胞可按Zhou等人(1995年)在Blood 86，3295-3301中、Roth等人(1996年)在Scand.J.Immunology 43，646-651中所述的方法进行分类)。例如，靶向性载体可包括一个组织或肿瘤特异性启动子，引导抗原在适当的位置表达。
[0280] 最后，本发明的疫苗可由待治疗患者具体的癌症类型、以及疾病状态、早期治疗方案、患者免疫状态决定，当然，还有患者的HLA单倍型。此外，根据特定患者的个人需求，本发明的疫苗可包含个性化成分。根据特定患者的相关TAA的表达、由于个人过敏或其他治疗方法而产生的意外副作用、以及第一轮治疗后对二次治疗或治疗方案的调整，各实施中的肽含量有所不同。
[0281] 本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由胶质母细胞瘤产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。
[0282] 含本发明肽的组织切片有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其他本领域内已知的方法检测本发明的某些肽可使病理师判断该组织为恶性的、炎症还是一般病变。本发明肽的提出使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。
[0283] 对病变标本中本发明肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的获益进行判断，特别是如果T淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染或哪些恶性细胞逃避了免疫监视。因此，本发明肽的提出表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。
[0284] 本发明的肽可用于分析对本发明肽发生的淋巴细胞应答(如T细胞应答)，或对本发明肽发生的抗体反应，或分析本发明中与MHC分子络合的肽。这些淋巴细胞应答可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞应答，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，对本发明肽发生的淋巴细胞应答可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞应答监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
[0285] 在另一个方面，本发明涉及一个试剂盒，包括(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；(b)可选项，第二个容器，含冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；以及(c)可选项，(i)使用溶液或(ii)重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。该试剂盒还进一步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。容器优选为瓶子、西林瓶、注射器或试管；也可为多用途容器。药物组合优选为冻干粉剂。
[0286] 本发明中的试剂盒优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑胶。优选情况是，试剂盒和/或容器上有说明，表明重组和/或使用的指示。例如，标签可能表明冻干剂型将重组为上述肽浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。
[0287] 存放制剂的容器可使用多次使用西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型。该试剂盒可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。
[0288] 稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽的最终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(=75μg)，不超过3mg/mL/肽(=1500μg)。该试剂盒还可包括商业和用户角度来说可取的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
[0289] 本发明中的试剂盒可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制剂，该制剂可有其他成分(例如，其他化合物或其药物组合物)，也可无其他成分，或者每种成分都有其不同容器。
[0290] 优选情况是，本发明的试剂盒包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、荷尔蒙或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该试剂盒的成分可进行预络合或每种成分在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该试剂盒的成分可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该试剂盒的成分也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。
[0291] 治疗试剂盒的容器可为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛装固体或液体的工具。通常，当成分不只一种时，试剂盒将包含第二个西林瓶或其他容器，使之可以单独定量。该试剂盒还可能包含另一个盛装药用液体的容器。优选情况是，治疗试剂盒将包含一个设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本试剂盒的组合物)。
[0293] 应该认识到，此处披露和描述的本发明特点不仅可联合使用，而且也可以单独的方式使用，只要在本发明的预期用途范围内。为了本发明之目的，所有参考文献均透过引用以其完整形式纳入本文。
[0295] 图1：微球四聚体技术分析促进了健康供体外周血CDC2-001和ASPM-002特异性CD8+淋巴细胞增殖。与抗CD28+高密度肿瘤抗原A*2402/CDC2-001(左板)或抗CD28+高密度肿瘤抗原A*024/ASPM-002(右板)耦合的微球每周对每孔中1x106 CD8+浓缩PBMC进行了刺激。经过三次体外刺激，所有细胞用抗体CD8FITC+荧光标记的四聚体A*2402/CDC2-001和A*2402/ASPM-002-001进行了染色。细胞在CD8+淋巴细胞上得到门控；图中数字代表CD8+淋巴细胞(多聚体阳性细胞)指定象限内的细胞百分比。
[0296] 图2：IMA-BIR-002和IMA-MET-005衍生15-聚体与最常见HLA-DR等位基因的体外相对结合。为了确定MHC的速率，ProImmune REVEALTM技术采用了HLA-DR装配检测法：肽复合物作为各个肽结合常数的主要决定因素。该法是由ProImmune(Oxford，UK)执行。在固定时间点，完整MHC的量：肽复合物测得后与合格/不合格对照剂(较弱结合剂)进行比较。强力混杂性HLA-DR结合剂作为阳性对照。数值表示各个肽和HLA-DR分子相对于合格/不合格对照剂的结合量。由于REVEALTM技术只限于15聚体，因此只测试了两个重叠的15聚体(第2-16、6-20位置)，而并非测试了全长MET-005。
[0297] 图3a和3b描述了外周血单核细胞(PBMC)中PSMA和生存素特异性IFNγ-分泌CD4+T细胞的提呈，它们于不同时间点取自使用IFNγ-EliSpot检测的免疫患者中。时间点：疫苗接种前(a)以及第3(b)、6(c)、7(d)、8(e)、9(f)、10(g)、11(h)次疫苗接种后。
[0298] 图4显示了PBMC中生存素特异性IFNγ-、IL-5、IL-10、TNFα-分泌CD4+T细胞的提呈，它们于三个不同时间点取自使用细胞内染色法(ICS)检测的接种患者中。时间点：第1(a)、3(b)、7(c)次疫苗接种后。
[0299] 实例
[0300] 1.合成
[0301] 肽透过使用Fmoc策略以标准、广为接受的固相肽合成法合成。用制备方法RP-HPLC纯化之后，进行离子交换纯化程序从而加入生理兼容性反离子(例如，醋酸、氨或氯化物)。最后，在冻干后制得白色至类白色固体。所有的TUMAP优选作为醋酸盐进行给药，其他盐形式也可以。
[0302] 重要的是，每个肽的身份和纯度已使用质谱和RP-HPLC分析法确定。离子交换程序后，用冻干法获得白色至类白色的肽，纯度如表7所示：
[0303] 表7：
[0304]
[0305] 所有的肽接受测试其不同物理化学条件下(如：不同温度和pH值)的稳定性。
[0306] 2.典型药物组合物IMA941的组成
[0307] IMA941由合成肿瘤相关肽(TUMAP)的混合物组成，其中大部分已在原发性结直肠癌细胞中得到确定。TUMAP包括10种能启动细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的HLA-I类结合肽、1种能启动T辅助细胞(CD4+T细胞)的HLA-II类结合肽。辅助性T细胞透过释放细胞因子而辅助细胞毒性T细胞的功能，此类细胞因子能提高CD8+T细胞杀伤力，也可直接作用于肿瘤细胞(Knutson and Disis，2005)。除了这11种TUMAP外，IMA941也可能包含一种病毒控制肽。
[0308] 手术切除的恶性肿瘤样本和GBM患者的正常组织以及健康供体的血液以循序渐进的方法进行分析：
[0309] 首先，使用微阵列全基因组mRNA表达分析法来确定恶性肿瘤组织与一系列正常器官和组织相比过量表达的基因。在第二个步骤中，恶性肿瘤的HLA配体用质谱法确定。随后，确定的HLA配体与基因表达资料进行比较。第1步中检测到的选择性表达或过量表达基因所编码的肽考虑为多肽疫苗的合适候选TUMAP。
[0310] 最后，使用多种免疫检测方法(体外T细胞检测法)检测健康个体中的外周血CD8+T细胞对肿瘤相关HLA配体的活性。
[0311] 3.肿瘤样本IMA941所包含的肿瘤相关肽(TUMAP)的提呈
[0312] 组织样本
[0313] 患者肿瘤组织由日本大阪的京都府立医科大学(KPUM)和日本大阪的大阪市立大学医学研究生院(OCU)提供。所有患者在手术前都获得了书面知情同意。手术后立即用液态氮对组织进行冷冻休克处理，在分离TUMAP前储存于-80°C下。
[0314] 从组织样本中分离HLA肽
[0315] 根据方案(Falk et al.，1991)(Seeger et al.，1999)略加修改，使用HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W6/32、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以固体组织的免疫沉淀法获得了冷冻休克组织样本的HLA肽库(Falk，K.1991；Seeger，F.H.T1999)。
[0316] 用电喷雾-液相色谱质谱(ESI-LCMS)检测TUMAP
[0317] 获得的HLA肽库根据其疏水性用反相色谱(Acquity UPLC system，Waters)分离，洗脱肽用装有电喷雾源的LTQ-Orbitrap杂交质谱(ThermoElectron)进行了分析。肽库被直接载入填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔炼石英微毛细管柱(75μm内径x250mm)，应用流速为400nL每分钟。随后，使用来自流速为300nL每分钟、浓度为10％至33％溶剂B中的两步180分钟二元梯度法对肽进行分离。梯度由溶剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)。金镀膜玻璃毛细管(PicoTip，New Objective)用于引入到纳升电喷雾源。使用前5(TOP5)策略在资料依赖模式下操作LTQ-Orbitrap质谱仪。简言之，首先以高精确质量完全扫描在orbitrap开始一个扫描周期(R=30000)，之后用先前选定离子的动态排除技术在orbitrap中对5种含量最为丰富的前体离子进行MS/MS扫描(R=7500)。串联质谱以SEQUEST和另一种手动控制进行解读。生成的自然肽破碎模式与合成序列相同参考肽的破碎模式进行比较后，确保了被识别的肽序列。图1显示了从肿瘤组织中获得的MHC I类相关肽CDC2-001的一个典型谱及其在UPLC系统中的洗脱谱。
[0318] 实例2
[0319] 编码本发明肽的基因的表达谱
[0320] 并不是所有确定为由MHC分子提呈于肿瘤细胞表面的肽都适合用于免疫治疗，这是因为这些肽大部分都由许多类型细胞表达的正常细胞蛋白衍生而来。这些肽只有很少一部分具有肿瘤相关性，并可能能够诱导对其来源肿瘤识别有高度特异性的T细胞。为了确定这些肽并最大限度地降低这些肽接种所诱导的自身免疫风险，发明人主要采用从过量表达于肿瘤细胞上(与大多数正常组织相比)的蛋白中所获得的肽。
[0321] 理想的肽来源于对该肿瘤独一无二且不出现于其他组织的蛋白中。为了确定具有与理想基因相似表达谱的基因所产生的肽，确定的肽被分别分配到蛋白和基因中，从中获得基因并生成这些基因的表达谱。
[0322] RNA来源与制备
[0323] 手术切除组织标本由两个不同的临床中心(参见实例1)在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即在液态氮中速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂(Ambion公司，Darmstadt，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德国)清理从这些样本中制备的总RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。
[0324] 健康人体组织中的总RNA从商业途径获得(Ambion公司，Huntingdon，英国；Clontech公司，海德堡，德国；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷兰；BioChain公司，Hayward，CA，美国)。混合数个人(2至123个人)的RNA，从而使每个人的RNA得到相等权重。白细胞从4个健康志愿者的血液样本中分离获得。
[0325] 所有RNA样本的质量和数量都在Agilent 2100 Bioanalyzer分析仪(Agilent公司，Waldbronn，德国)上使用RNA 6000 Pico LabChip Kit试剂盒(Agilent公司)进行评估。
[0326] 微阵列实验
[0327] 所有肿瘤和正常组织的RNA样本都使用Affymetrix Human Genome(HG)U133A或HG-U133 Plus 2.0Affymetrix寡核苷酸芯片(Affymetrix公司，Santa Clara，CA，美国)进行基因表达分析。所有步骤都根据Affymetrix手册进行。简言之，如手册中所述，使用SuperScript RTII(Invitrogen公司)以及oligo-dT-T7引物(MWG Biotech公司，Ebersberg，德国)从5-8μg RNA中合成双链cDNA。用BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit(ENZO Diagnostics公司，Farmingdale，NY，美国)进行U133A测定或用GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix公司)进行U133 Plus 2.0测定，之后用链霉亲和素-藻红蛋白和生物素化抗链霉素蛋白抗体(Molecular Probes公司，Leiden，荷兰)进行破碎、杂交和染色，这样完成体外转录。用Agilent 2500A GeneArray Scanner(U133A)或Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000(U133 Plus 2.0)对图像进行扫描，用GCOS软件(Affymetrix公司)在所有参数为预设的情况下对资料进行分析。为了实现标准化，使用了Affymetrix公司提供的100种管家基因(housekeeping gene)。相对表达值用软件给定的signal log ratio进行计算，正常肾组织样本的值任意设置为1.0。
[0328] 本发明的源基因在胃癌中高度过量表达的表达谱如图2所示。
[0329] 4.IMA941 MHC-I类提呈肽的体外免疫原性
[0330] 为了获知关于本发明的TUMAP免疫原性方面的信息，我们使用了Walter，S、Herrgen，L、Schoor，O、Jung，G、Wernet，D、Buhring，HJ、Rammensee，HG和Stevanovic，S等人2003年在Cutting edge：predetermined avidity of human CD8T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres，J.Immunol.，171，4974-4978一文中所述的被广为接受的体外刺激平台进行了研究。使用此平台，本发明10种HLA-A*2402限制TUMAP可显示出免疫原性，从而表明这些肽为对抗人CD8+前体T细胞的T细胞表位(表6)。
[0331] CD8+T细胞体外启动
[0332] 为了用载有肽-MHC复合物(pMHC)和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞(aAPC)进行体外刺激，我们首先从Tuebingen血库中获取健康供体白细胞清除后新鲜HLA-A*24产物而分离出CD8T细胞。
[0333] 然后，以白细胞清除后所得产物直接丰富CD8T细胞，或首先运用标准梯度分离介质(PAA公司， 德国)分离出PBMC(外周血单核细胞)。分离出的CD8淋巴细胞或PBMC使用前在T细胞培养基(TCM)中培养，培养基包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)并补充10％热灭活人AB血清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德国)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Cambrex公司，Cologne，德国)，1mM丙酮酸钠(CC Pro公司，Oberdorla，德国)和20μg/ml庆大霉素(Cambrex公司)。在此步骤，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，Heidelberg，德国)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma公司，Nürnberg，德国)也加入TCM。CD8+淋巴细胞使用MicroBeads(Miltenyi Biotec公司，Bergisch-Gladbach，德国)透过正向选择进行分离。
[0334] pMHC/抗-CD28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出方法如前所述(Walter et al.，2003)并作微小改动。简言之，制备了缺乏跨膜域和在重链羧基端生物素化的生物素化载肽重组HLA-A*2402分子。纯化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗体9.3(Jung et al.，1987)使用制造商(Perbio公司，波恩，德国)推荐的N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行化学生物素化处理。
所用珠为5.6μm的大链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺州，美国)。作为对照的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从Melan-A/MART-1中修饰制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHI)。
所用珠为5.6μm的大链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺州，美国)。作为对照的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从Melan-A/MART-1中修饰制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHI)。
[0335] 在600ng生物素抗CD28+200ng相关生物素pMHC(高密度珠)存在的情况下，将800.000珠/200μl包被于96孔板上。在37°C下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培养1x106 CD8+T细胞与2x105的清洗涂层珠3至4天，从而在96孔板中启动刺激。之后，一半培养基与补充80U/ml IL-2的新鲜TCM进行交换，并且在37℃下持续培养3至4天。这种刺激周期总共进行3次。最后，用Live/dead-Aqua染料(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)、CD8-FITC抗体克隆SK1(BD公司，Heidelberg，德国)和PE-或APC-耦合的A*2402MHC多聚体染色而执行多聚体分析。对于分析，使用了配有合适激光仪和筛检程序的BDLSRII SORP细胞仪。肽特异性细胞以占总CD8+细胞的百分比形式进行计算。多聚体分析结果使用FlowJo软件(Tree Star公司，Oregon，美国)进行评估。特定多聚体+CD8+淋巴细胞的体外填装用适当的门控技术以及与阴性对照刺激组比较而进行检测。如果健康供体中的至少一个可评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8+T细胞株(即该孔包含至少1％特定多聚体+CD8+T细胞，并且特定多聚体+的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10倍)，则检测给定抗原的免疫原性。
[0336] IMA941肽的体外免疫原性
[0337] 对于受到测试的HLA-I类肽，可透过肽特异性T细胞株的生成证明所有14种肽均具有体外免疫原性。TUMAP特异性多聚体对本发明的两种肽染色后经流式细胞仪检测的典型结果如图3所示，同时也含有相应的阴性对照信息。本发明中肽的结果汇总于表8，提出了本发明HLA I类肽的体外免疫原性。体外免疫原性实验的结果显示了可评估肽中的受测试阳性供体和板孔的百分比。每个肽至少有两个供体和24个板孔可评估。
[0338] 表8本发明中HLA I类肽的体外免疫原性
[0339]
[0340] 5.IMA941 II类TUMAP BIR-002的免疫原性
[0341] 为了确认含有SEQ ID NO：11肽的免疫原性，进行了一项临床研究。
[0342] 主要研究目标是：在未检测到明确的转移病灶且摄护腺癌根治术后出现生物化学复发的患者中，对皮下注射摄护腺特异性肽(接种疗法)的基于PSA(摄护腺特异抗原)的反应(PSA-R)。
[0343] 次要研究目标是：对患有摄护腺癌患者并特别考虑T细胞应答相关的免疫现象，研究给予接种疗法的耐受性和可行性。
[0344] 该研究设计为前瞻性、随机I/II期研究，适应症为「未检测到明确转移病灶且摄护腺癌根治术后出现生物化学复发」。
[0345] 研究人群
[0346] 作为本I/II期研究的一部分，我们试图透过在摄护腺癌根治术后出现生物化学复发的HLA-A*02+患者中接种摄护腺特异性肽从而诱导PSA衰退作为肿瘤生长停止的指标。摄护腺特异性肽的组合物经皮下注射，并在抗原性结构的各种给药方式下评估各自的免疫应答程度。
[0347] 相对于以前的疫苗接种研究，本研究计划的目标是治疗肿瘤负荷小且影像学程序不能检测出的患者。所有的患者都使用已知的摄护腺特异性抗原结构的同样方式进行免疫，以增强对恶性转化细胞的免疫应答。19例患者接受了治疗。
[0348] 表9：研究人群的特征
[0349] 总共 ％ 中位数 范围
年龄 19 63 55-77
在新/辅助治疗之前
无 11 58
放疗 3 16
间歇性荷尔蒙疗法 2 11
放疗+间歇性荷尔蒙疗法 2 11
放疗+化疗 1 5
RPX TNM分期
T2a-c R0 6 32
T3a-c R0 6 32
T2a-c R1 3 16
T3a-c R1 3 16
T3aN2 R0 1 5
年龄 19 63 55-77
在新/辅助治疗之前
无 11 58
放疗 3 16
间歇性荷尔蒙疗法 2 11
放疗+间歇性荷尔蒙疗法 2 11
放疗+化疗 1 5
RPX TNM分期
T2a-c R0 6 32
T3a-c R0 6 32
T2a-c R1 3 16
T3a-c R1 3 16
T3aN2 R0 1 5
[0350] Gleason评分
5-7 10 53
8-10 3 16
未知 6 32
接种前RPX月数 41 9-124
OP后首次复发月数 14 1-90
开始接种时的PSA 0.76 0.14-10.8
5-7 10 53
8-10 3 16
未知 6 32
接种前RPX月数 41 9-124
OP后首次复发月数 14 1-90
开始接种时的PSA 0.76 0.14-10.8
[0351] 治疗计划
[0352] 在使用计算机断层扫描和骨骼显像排除明显的转移病灶后，根据不同的给药方式将摄护腺特异性肽疫苗皮下注射至在摄护腺根治术后检测到PSA复发的患者中(PSA在至少14天间隔的两次测量中上升了50％)。该疫苗以每8天的倍数给予，即第0、7、14、28、42和56天给予(每个肽以及每次注射量约为100微克)。每次接种治疗以及在第70天，测定PSA以评估治疗反应。
[0353] 如果检测到了肿瘤反应(完全缓解[PSA-CR]、部分缓解[PSA-PR]、或临床病程稳定[无变化，PSA-NC])，则接受了疫苗的患者根据所选择的给药方式每月维持一次。对患者的免疫治疗反应进行了评估，详情如下：
[0354] 完全缓解(PSA-CR)：在间隔至少4周后测量确定：最初升高的PSA水平正常化。正常化定义为PSA最低值<0.2ng/ml，这是完全摘除肿瘤或摄护腺的摄护腺癌根治术后的预期值。
[0355] 部分缓解：a)PSA-PR ü80％(在间隔至少4周后测量确定最初升高的PSA水平下降80％)；以及b)PSA-PR≤50％(在间隔至少4周后测量确定最初升高的PSA水平下降50％。)[0356] 病情稳定(PSA-SD)：在至少四周后无显著变化。这包括在间隔至少4周后测量确定具有稳定性以及下降小于50％、升高小于10％。
[0357] 进展(PSA-PD)：PSA水平上升超过10％。如果PSA进展，则终止研究。
[0358] 在患者进入研究后，使用表位特异性疫苗；同时考虑在摄护腺上皮细胞(如：PSMA/PSCA)中特异性表达的蛋白。除了研究注射疫苗的一般疗效(PSA监测方法评估的残留肿瘤生长分数)，本研究还研究了各种接种方法的效果(免疫系统的有效调变)。除了仅仅单独皮下注射该肽之外，还使用了佐剂的各种组合物。特别是，用了Montanide(适合用于人体的一个经典的不完全弗氏佐剂)肽疫苗的长效和辅助活性，最近其被描述为十分有利。为此，500μl肽溶液与500μl Montanide混合，之后给药。因此，制成油水乳剂，在数周内缓慢释放水相中所含的抗原。该乳剂的物理稳定性非常高，可在4°C的环境下储存3个月以上，并且无明显相位分离。Montanide的长效功能在几项疫苗接种试验中得到了使用，并且获得了良好效果(Oka et al.，2004)。
[0359] 有一个研究分支研究了以生长因子、GM-CSF、 注射液伴随刺激期间的接种疗效。GM-CSF是肽接种试验中很常用的一种佐剂，这些研究中有几项研究报导提高了临床反应及T细胞应答。最初，GM-CSF为树突状细胞招募和分化因子，被认为可增加疫苗注射部位的树突状细胞的数量。虽然GM-CSF不能自身启动抗原，将细胞提呈为树突状细胞和巨噬细胞，但是有体内间接启动的报导(Molenkamp et al.，2005)。
[0360] 另一个研究分支研究了经上皮细胞使用咪喹莫特伴随活化树突状细胞期间接种的疗效。咪喹莫特以5％软膏(Aldara)给予。它透过对TLR7阳性细胞(如：浆细胞样DC、朗格汉斯细胞、皮肤DC)的作用而具有强免疫刺激性，并启动MyD88依赖性通道。被启动的APC释放T细胞刺激性和炎症细胞因子，上调共刺激和迁移到引流淋巴结。透过将抗原混合至软膏或透过皮下或皮内注射抗原部位应用Aldara，从而使咪喹莫特有可能加强肽诱导的CTL反应，这已经在动物模型中得到证明。
[0361] 另一个研究分支透过将树突状细胞与鱼精蛋白稳定的mRNA编码粘蛋白-1混合以将其同时启动以活化TLR 7/8，并研究了在所述同时启动期间接种的疗效。mRNA显示了小鼠和人免疫细胞群的广泛启动。该制剂中聚碱性蛋白鱼精蛋白的存在提高了mRNA的半衰期并诱导了可能的长效粒子的形成。因此，这种佐剂可与长效特性和APC启动特性结合。
[0362] 总之，该疫苗的施用方式包括以下方法：
[0363] -Montanide乳化肽疫苗的皮下注射
[0364] -500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合外用225μl GM-CSF，以期达到同时生长因子给药所引发的更强的免疫应答
[0365] -500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合局部热疗，后者的目的是达到热诱导的更强的免疫应答
[0366] -500μl Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合经上皮给予咪喹莫特，以透过TLR 7启动树突状细胞
[0367] -500μl Montanide中乳化肽疫苗与55μl粘蛋白-1mRNA/鱼精蛋白一起皮下注射，以透过TLR 7/8启动树突状细胞
[0368] 日程表：本项研究为期3年。
[0369] 摄护腺特异性肽疫苗在第0、7、14、28、42和56天给予患者。对于病情稳定或获得目标肿瘤反应(PSA-CR或PSA-PR)的患者，每月皮内注射接种一次疫苗直到发生可检测到的进展。根据迄今为止的经验，肽注射液可耐受且没有明显不良反应。由于对接种疗法的反应仅根据PSA测量进行了血清学评估，因此，在研究开始时进行一项测试以确定注射的疫苗是否干扰体外的PSA测量值，这可刺激临床反应。在第0、7、14、28、42、56和70天，抽取血液样本进行化验、PSA水平测定、血细胞分类计数、FACS分析和细胞因子测试。如果连续治疗到第70天，则进行为期6周的PSA监测，以便及时发现治疗失败。
[0370] 如果疾病进展得到证明且伴有PSA持续升高，则结束治疗。
[0371] 从第84天开始，继续运用免疫疗法，间隔时间为4周，直到发生可证明的进展或至第420天(第15个月)。在本研究外继续治疗(在成功病例中)的决定根据单个病例的请况作出。本研究未发生意料之外的不良反应。
[0372] 该实验室测试包括凝血、电解质、LDH、β2-M、CK、肝酶、胆红素、肌酐、尿酸、总蛋白、CRP、涂片血细胞分类计数、PSA水平、细胞因子、FACS、Elispot。
[0373] 皮肤对定义细菌和真菌抗原的反应(注射48-72小时后，T细胞介导的迟发型超敏反应(DTH))的分析在本研究开始前将作为患者细胞免疫系统的分析。
[0374] 研究所需的肽(九肽)由PD Dr.Stefan Stevanovic实验室在Prof.H.-G.Rammensee的系里制备。这些肽用HPLC法进行纯化和质谱分析。这些肽的纯度也可用HPLC、质谱和Edman测序法进行检查。使用这些方法，纯度可高达98％(根据当前方法的状态必须视为最高值)。所合成的肽溶于DMSO(CryoSure，WAK Chemie Medical GmbH；10mg/ml)中，在Ampuwa(Fresenius Kabi)中稀释为1∶10，并在无菌条件下分成等份样。
[0375] 临床反应
[0376] 在两名患者中，连续直肠指检发现局部肿瘤后，PET-CT扫描可显示局部复发。在其余的17名患者中，终止研究时，无法证实疾病活跃部位。
[0377] 血细胞分类计数或大量临床化学的的重复实验室评估未发现研究期间有任何异常。
[0378] 在这19例患者中，有16例对根据SEQ ID NO：12所述的生存素II肽(IFN-g ELISPOT，+/-ICS)发生反应。其中，有12名患者在疫苗接种后，诱导了抗生存素T细胞应答。有2名患者之前存在抗T细胞以及2名患者未确定之前是否存在丰富的抗生存素T细胞。
[0379] 生化反应
[0380] 根据PSA初次升高后合作实验室最低可检测值，完全反应被视为不可检测的PSA值。测量值必须在至少间隔4周后确认。PR>80％和>50％必须在四周后做相应的重新评估。PSA下降小于50％或升高小于10％反映了病情稳定(如果在至少四周后确认)。疾病进展被视为比治疗开始时PSA上升超过10％。
[0381] 终止研究的患者的生化反应得到跟踪，直到他们获得了放射或抗荷尔蒙疗法的进一步治疗。
[0382] 19例患者同意参加并且对资料进行了分析，随访最长为时约3.75年。
[0383] PSA稳定性和DT升高
[0384] 根据上述生化反应的标准：治疗开始时PSA值上升不超过10％，2例(10.2％)患者在研究结束时PSA值表现出稳定性(图6，表10、11、12)。在最后一次注射疫苗后的14和16个月分别对上述两名病例进行了随访。在资料截止时，稳定的平均时间为24个月(28和31个月)，平均接种了18(14和20)次疫苗。
[0385] 在这两位患者中，1例患者显示部分反应>50％的时间为9个月，之后一段时间PSA缓慢上升，倍增时间为20.5个月，相比之下，疫苗接种之前倍增时间为9.8个月。初始PSA在pT2pN0 Gleason 5肿瘤手术后18个月开始复发。
[0386] 分析资料发现，8号患者自28个月前接种计划开始以来病情稳定。在第10个月以及第14次疫苗接种后因过敏反应而停止了治疗。他存在不利的pT3b Gleason 3+4情况，在摄护腺癌根治术后PSA值最低点不低于0.6ng/ml，在术后首次下降后PSA进展没有得到及时延缓。倍增时间从6.6个月减缓至148个月。
[0387] 这两名患者在每次接种肽疫苗时都在给药部位皮下注射咪喹莫特。
[0388] PSA DT升高，PSA不稳定
[0389] 第11号患者的PSA DT在研究的六个月期间从1.5个月上升至10.1个月。开始时他的PSA值为10.8ng/ml，在终止研究程序接受抗雄激素单一疗法时，进展至17.8ng/ml，但PET-CT未发现可见的恶性病变。他接受了Aldara作为佐剂。
[0390] 第16号患者开始进入疫苗治疗+粘蛋白-1-mRNA/鱼精蛋白，倍增时间为6.1个月。五个月期间的PSA速率下降至半衰期为2.7个月，之后，PSA DT经统计学计算为上升14.4个月，且在治疗后持续16个月。最初PSA为0.29ng/ml，在治疗期间的前5个月内下降至0.19ng/ml，在以后的8个月内上升至0.4ng/ml，在治疗开始19个月后按研究方案终止研究时，为
0.41ng/ml。
0.41ng/ml。
[0391] PSA进展
[0392] 根据接种疫苗前估计的PSA倍增时间，第5号患者在研究期间出现了进展。但是，截止资料显示，在治疗结束后继续10个月，他的PSA值下降，半衰期为20.2个月。他在接种疫苗结束后仍未接受任何二次治疗。他接受了montanide疫苗注射作为唯一的佐剂。
[0393] 表10：按月计算的PSA倍增时间
[0394]
[0395] *由于PSA下降，研究结束或随访结束时的PSA DT未纳入第5号患者资料。
[0396] 7.将本发明中的HLA-I类限制肽与HLA-A*0201结合
[0398] 本分析的目的是评价HLA-I类肽对HLA-A*0201等位基因编码的MHC分子的亲和力，因为这是IMA941作用模式的一项重要参数。IMA941和MET-001中全部10种HLA-I类限制肽都对HLA-A*0201具有中度至高度的亲和力，解离常数(KD)范围为0.14(MET-001)到2.05nM(CSP-001)。所有值均在0.1(强力结合剂HBV-001)至4.4(中等强度结合剂MUC-001)之间。这些结果证实了IMA941候选疫苗和MET-005衍生的MET-001的所有HLA I类肽均对HLA-A*02具有结合亲和力。
[0399] 测试原理
[0400] 稳定HLA/肽复合物包括三种分子：HLA重链、β-2微球蛋白(b2m)和肽类配体。变性重组HLA-A*0201重链分子的活性可单独保存，使之功能与「空载HLA-A*0201分子」相当。当稀释为包含b2m和相应肽的水缓冲液时，这些分子以完全肽依赖方式迅速有效地折叠。这些可用的分子用在基于ELISA的检测方法中，来衡量肽和HLA-I类分子相互作用间的亲和力(Sylvester，2002)。
[0401] 纯化的重组HLA-A*0201分子与b2m、不同等级剂量的肽一起培养。透过自然抗原加工、MET-005体内产生并被证实的A*0-结合产物MET-001被纳入分析，而不具备HLA-I类结合能力的全长MET-005没有纳入分析。重新折叠HLA/肽复合物的量用定量ELISA法测定。解离常数(KD值)使用从校准HLA/肽复合物稀释液中记录的标准曲线进行计算。
[0402] 结果
[0403] 结果如图2所示。较低的KD值反映了对HLA-A*0201具有较高的亲和力。大多数IMA941肽对HLA-A*0201都具有相似的较强亲和力，范围为0.1(HBV-001，强力结合剂)到44.4nM(MUC-001，中等强度结合剂)。因而，所有IMA941I类TUMAP均对MHC分子A*02具有中等至较强的结合亲和力。
[0404] 8.本发明中的HLA-II类限制肽与HLA-DR结合
[0405] 目的和摘要
[0406] II类TUMAP启动辅助性T细胞，辅助性T细胞在协助I类限制TUMAP引发的CTL功能中起到了至关重要的作用。IMA941II类肽与集中不同的HLA-II类分子结合(混杂结合)对于确保多数接受候选疫苗IMA941的患者能够从支持性辅助T细胞应答中获益非常重要。例如，最显性表达的人类HLA-II类分子HLA-DR具有高度多态性，含有数百种已知等位基因。基于HLA-DRB1单体型的已知等位基因频率和公认的的结合算法，可预测，IMA941-IMA-BIR-002和IMA-MET-005-中的HLA II类配体均是混杂HLA-DR结合肽。具体来说，对于两种IMA941 II类TUMAP，HLA-A*02-阳性白种人表达至少一种适当的HLA-DR等位基因的概率大于90％。至于其余的人II类等位基因HLA-DQ和-DP，由于缺乏频率资料或结合预测算法，未纳入此项计算中，实际混杂比例很可能更高。对于已知的泛DR表位(PADRE，基因型频率Fprojected=93.1％)，两种IMA941 II类TUMAP计算所得的混杂性范围相同。此外，对这些肽的混杂结合透过体外结合实验进行了确认。另外，对于IMA-BIR-002，证实了体内高免疫原性(见前文)。
总而言之，这些结果确认了MET-005和BIR-002是混杂HLA-DR结合肽。
总而言之，这些结果确认了MET-005和BIR-002是混杂HLA-DR结合肽。
[0407] 结合预测原理
[0408] 使用Tübingen大学研发的SYFPEITHI算法(Rammensee et al.，1997；Rammensee et al.，1999)，对IMA941 II类TUMAP与几种常见HLA-DR等位基因的结合进行排名。该算法已被成功地用于确定来自广泛抗原，如，来自人类肿瘤相关抗原TRP2(I类)(Sun et al.，2000)和SSX2(II类)(Neumann et al.，2004)的I类和II类表位。结合阈值根据对公布的已知混杂HLA-DR配体的结合得分分析而被定义为18分。
[0409] 使用了HLA-A*02阳性白种人人群中已公布的HLA-DR单体型频率(Mori et al.，1997)以及高分辨率单体型频率(Chanock et al.，2004)(见表2)。该单体型频率是个体染色体上独特等位基因的频率。由于哺乳动物细胞内的二倍体染色体组，该等位基因的基因型出现频率较高，可以使用Hardy-Weinberg定律进行计算(基因型出现频率F中的单体型频率Gf结果(F=2Gf-Gf2])。
[0410] 已知SYFPEITHI矩阵的DRB1-单体型频率和A*02+白种人人群中的已知个体频率之和为47.8％。因此，预计II类TUMAP与这些等位基因的结合分布为剩余的52％DRB1等位基因，这些资料尚不可获得。
[0411] 最后，混杂结合被定义为一种肽与几种HLA-DR等位基因结合，并且其中之一在白种人群中表达的概率至少为50％。
[0412] 体外结合检测方法原则(ProImmune REVEALTM)
[0413] IMA-BIR-002和IMA-MET-005与HLA-DR宽抗原(HLA-DR1至DR7，也包括分裂抗原HLA-DR11至-DR15(Mori et al.，1997))集合，并使用REVEALTM MHC：肽结合分析方法(ProImmune，Oxford，UK)以确定其并入MHC分子的水平。在此检测方法中，对每种HLA-DR抗原，结合力与合格/不合格对照结合剂、以及阳性对照肽的结合力进行比较。
[0414] 结果
[0415] 根据SYFPEITHI算法预测，IMA-BIR-002可能与含已知结合基序的7/8个HLA-DR等位基因结合(表11)。对于IMA-BIR-002，HLA-A*02阳性白种人表达至少一种适当的HLA-DRB1等位基因的概率为92.6％。因此，两种IMA941 II类肽被预测为是混杂HLA-DR结合剂。
[0416] 如果结合HLA-DRB1等位基因的单体型频率透过本方法的第二个因子被估计过高，则其在IMA941中对于所有II类TUMP的基因型发生率仍然高于50％。此外，IMA-BIR-002与HLA-DR1、3、4和11的混杂结合的实验性确认透过体外结合资料获得(图3)。
[0417] 由于在针对含不同HLA-DR等位基因的摄护腺癌患者的临床试验中已经证明IMA-BIR-002具有广谱免疫原性，该II类肽的混杂性已在体内得到明确证实。
[0418] 总之，IMA941包含的这两种II类肽的HLA-DR结合特性的计算机模拟分析以及体外检测和BIR-002临床试验的其他实验证据强有力地表明，这些TUMAP是人类II类HLA分子的混杂结合剂。
[0419] 表11：IMA941 II类TUMP与含已知结合基序的HLA-DR等位基因的结合得分。表中显示的是白种人群中最常见HLA-DRB1等位基因的SYFPEITHI结合得分。p为HLA-A*02阳性白种人的单体型频率。如果得分等于或大于18，则肽被视为与HLA分子结合。结合DRB1等位基因的p值累积为最小单体型频率pmin。所有DRB1等位基因(包括含不完全结合预测矩阵或频率资料的等位基因)的这些频率的外推法获得了与基因型出现频率Fprojected对应的预计单体频率pprojected。n.d.=无资料
[0420]
[0421] 引用文献列表
[0422] Allison JP，Krummel MF(1995).The Yin and Yang of T cell costimulation.Science 270，932-933.
[0423] Angileri FF，Aguennouz M，Conti A，La TD，Cardali S，Crupi R，Tomasello C，Germano A，Vita G，Tomasello F(2008).Nuclear factor-kappaB activation and differential expression of survivin and Bcl-2 in human grade 2-4 astrocytomas.Cancer 112，2258-2266.
[0424] Ashley AC，Sargent DJ，Alberts SR，Grothey A，Campbell ME，Morton RF，Fuchs CS，Ramanathan RK，Williamson SK，Findlay BP，Pitot HC，Goldberg RM(2007).Updated efficacy and toxicity analysis of irinotecan and oxaliplatin(IROX)：intergroup trial N9741 in first-line treatment of metastatic colorectal cancer.Cancer 110，670-677.
[0425] Aucouturier J，Dupuis L，Ganne V(2001).Adjuvants designed for veterinary and human vaccines.Vaccine 19，2666-2672.
[0426] Banchereau J，Palucka AK，Dhodapkar M，Burkeholder S，Taquet N，Rolland A，Taquet S，Coquery S，Wittkowski KM，Bhardwaj N，Pineiro L，Steinman R，Fay J(2001).Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+)progenitor-derived dendritic cell vaccine.Cancer Res.61，6451-6458.
[0427] Banerjee SK，Weston AP，Zoubine MN，Campbell DR，Cherian R(2000).Expression of cdc2 and cyclin B1 in Helicobacter pylori-associated gastric MALT and MALT lymphoma：relationship to cell death，proliferation，and transformation.Am J Pathol.156，217-225.
[0428] Bauer B，Bartfeld S，Meyer TF(2009).H.pylori selectively blocks EGFR endocytosis via the non-receptor kinase c-Abl and CagA.Cell Microbiol.11，156-169.
[0429] Bertoletti A，Chisari FV，Penna A，Guilhot S，Galati L，Missale G，Fowler P，Schlicht HJ，Vitiello A，Chesnut RC，.(1993).Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein.J.Virol.67，2376-2380.
[0430] Bertolini G，Roz L，Perego P，Tortoreto M，Fontanella E，Gatti L，Pratesi G，Fabbri A，Andriani F，Tinelli S，Roz E，Caserini R，Lo VS，Camerini T，Mariani L，Delia D，Calabro E，Pastorino U，Sozzi G(2009).Highly tumorigenic lung cancer CD 133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin
treatment.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 106，16281-16286.
treatment.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 106，16281-16286.
[0431] Bierie B，Moses HL(2006).TGF-beta and cancer.Cytokine Growth Factor Rev.17，29-40.
[0432] Brown CE，Starr R，Martinez C，Aguilar B，D'Apuzzo M，Todorov I，Shih CC，Badie B，Hudecek M，Riddell SR，Jensen MC(2009).Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+cytolytic T cells.Cancer Res 69，8886-8893.
[0433] Castriconi R，Dondero A，Negri F，Bellora F，Nozza P，Carnemolla B，Raso A，Moretta L，Moretta A，Bottino C(2007).Both CD133+and C.Eur.J Immunol.37，3190-3196.
[0434] Chakravarti A，Noll E，Black PM，Finkelstein DF，Finkelstein DM，Dyson NJ，Loeffler JS(2002).Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas.J Clin Oncol 20，1063-1068.
[0435] Chanock SJ，Foster CB，Miller FW，O′Hanlon TP(2004).HLA-A，-B，-Cw，-DQA1 and-DRB1 Alleles in a Caucasian Population from Bethesda，USA.Hum.Immunol.65，1211-1223.
[0436] Chen Z，O′Shea JJ(2008).Regulation of IL-17 production in human lymphocytes.Cytokine 41，71-78.
[0437] Cisek LJ，Corden JL(1989).Phosphorylation of RNA polymerase by the murine homologue of the cell-cycle control protein cdc2.Nature 339，679-684.[0438] Corso S，Migliore C，Ghiso E，De RG，Comoglio PM，Giordano S(2008).Silencing the MET oncogene leads to regression of experimental tumors and metastases.Oncogene 27，684-693.
[0439] Cox CV，Diamanti P，Evely RS，Kearns PR，Blair A(2009).Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood ALL.Blood 113，3287-3296.[0440] DeLuca JG，Dong Y，Hergert P，Strauss J，Hickey JM，Salmon ED，McEwen BF(2005).Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites.Mol.Biol.Cell 16，519-531.
[0441] Deng H，Guo RF，Li WM，Zhao M，Lu YY(2005).Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells.Biochem.Biophys.Res Commun.326，274-281.
[0442] Deremer DL，Ustun C，Natarajan K(2008).Nilotinib：a second-generation tyrosine kinase inhibitor for the treatment of chronic myelogenous leukemia.Clin Ther.30，1956-1975.Egland KA，Liu XF，Squires S，Nagata S，Man YG，Bera TK，Onda M，Vincent JJ，Strausberg RL，Lee B，Pastan I(2006).High expression of a cytokeratin-associated protein in many cancers.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A
103，5929-5934.
103，5929-5934.
[0443] Eramo A，Lotti F，Sette G，Pilozzi E，Biffoni M，Di VA，Conticello C，Ruco L，Peschle C，De MR(2008).Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.Cell Death Differ 15，504-514.
[0444] Esashi F，Christ N，Gannon J，Liu Y，Hunt T，Jasin M，West SC(2005).CDK-dependent phosphorylation of BRCA2 as a regulatory mechanism for recombinational repair.Nature 434，598-604.
[0445] Falk K，Rotzschke O，Stevanovic S，Jung G，Rammensee HG(1991).Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules.Nature 351，290-296.
[0446] Flanagan JM，Funes JM，Henderson S，Wild L，Carey N，Boshoff C(2009).Genomics screen in transformed stem cells reveals RNASEH2A，PPAP2C，and ADARB1 as putative anticancer drug targets.Mol.Cancer Ther.8，249-260.
[0447] Gabrilovich DI，Chen HL，Girgis KR，Cunningham HT，Meny GM，Nadaf S，Kavanaugh D，Carbone DP(1996).Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells.Nat.Med 2，1096-1103.
[0448] Grunda JM，Nabors LB，Palmer CA，Chhieng DC，Steg A，Mikkelsen T，Diasio RB，Zhang K，Allison D，Grizzle WE，Wang W，Gillespie GY，Johnson MR(2006).Increased expression of thymidylate synthetase(TS)，ubiquitin specific protease 10(USP10)and survivin is associated with poor survival in glioblastoma multiforme(GBM).J Neurooncol.80，261-274.
[0449] Harada T，Chelala C，Crnogorac-Jurcevic T，Lemoine NR(2009).Genome-wide analysis of pancreatic cancer using microarray-based techniques.Pancreatology.9，13-24.
[0450] Harper LJ，Piper K，Common J，Fortune F，Mackenzie IC(2007).Stem cell patterns in cell lines derived from head and neck squamous cell carcinoma.J Oral Pathol.Med 36，594-603.
[0451] Hayama S，Daigo Y，Kato T，Ishikawa N，Yamabuki T，Miyamoto M，Ito T，Tsuchiya E，Kondo S，Nakamura Y(2006).Activation of CDCA1-KNTC2，members of centromere protein complex，involved in pulmonary carcinogenesis.Cancer Res 66，10339-10348.
[0452] Horton RA，Strachan EA，Vogel KW，Riddle SM(2007).A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.Anal.Biochem.360，138-143.
[0453] Huang Y，Fan J，Yang J，Zhu GZ(2008).Characterization of GPR56 protein and its suppressed expression in human pancreatic cancer cells.Mol.Cell Biochem.308，133-139.
[0454] Jia HL，Ye QH，Qin LX，Budhu A，Forgues M，Chen Y，Liu YK，Sun HC，Wang L，Lu HZ，Shen F，Tang ZY，Wang XW(2007).Gene expression profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res 13，1133-1139.[0455] Jung G，Ledbetter JA，Muller-Eberhard HJ(1987).Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates.Proc Natl Acad SciU S A 84，4611-4615.
[0456] Jung HM，Choi SJ，Kim JK(2009).Expression profiles of SV40-immortalization-associated genes upregulated in various human cancers.J Cell Biochem.106，703-713.
[0457] Kajiwara Y，Yamasaki F，Hama S，Yahara K，Yoshioka H，Sugiyama K，Arita K，Kurisu K(2003).Expression of survivin in astrocytic tumors：correlation with malignant grade and prognosis.Cancer 97，1077-1083.
[0458] Kaneko N，Miura K，Gu Z，Karasawa H，Ohnuma S，Sasaki H，Tsukamoto N，Yokoyama S，Yamamura A，Nagase H，Shibata C，Sasaki I，Horii A(2009).siRNA-mediated knockdown against CDCA1 and KNTC2，both frequently overexpressed in colorectal and gastric cancers，suppresses cell proliferation and induces apoptosis.Biochem.Biophys.Res Commun.390，1235-1240.
[0459] Knutson KL，Disis ML(2005).Augmenting T helper cell immunity in cancer.Curr.Drug Targets.Immune.Endocr.Metabol.Disord.5，365-371.
[0460] Koch M，Beckhove P，Op den WJ，Autenrieth D，Wagner P，Nummer D，Specht S，Antolovic D，Galindo L，Schmitz-Winnenthal FH，Schirrmacher V，Buchler MW，Weitz J(2006).Tumor infiltrating T lymphocytes in colorectal cancer：Tumor-selective activation and cytotoxic activity in situ.Ann.Surg.244，986-992.
[0461] Krieg AM(2006).Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation.Nat.Rev.Drug Discov.5，471-484.
[0462] Liu X，Chen N，Wang X，He Y，Chen X，Huang Y，Yin W，Zhou Q(2006).Apoptosis and proliferation markers in diffusely infiltrating astrocytomas：profiling of 17 molecules.J Neuropathol.Exp.Neurol.65，905-913.
[0463] Livingston BD，Crimi C，Grey H，Ishioka G，Chisari FV，Fikes J，Grey H，Chesnut RW，Sette A(1997).The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection.J.Immunol.159，1383-1392.
[0464] Ma S，Chan KW，Hu L，Lee TK，Wo JY，Ng IO，Zheng BJ，Guan XY(2007).Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells.Gastroenterology 132，2542-2556.
[0465] Martin CM，Astbury K，McEvoy L，O′Toole S，Sheils O，O′Leary JJ(2009).Gene expression profiling in cervical cancer：identification of novel markers for disease diagnosis and therapy.Methods Mol.Biol.511，333-359.
[0466] Mellai M，Caldera V，Patrucco A，Annovazzi L，Schiffer D(2008).Survivin expression in glioblastomas correlates with proliferation，but not with apoptosis.Anticancer Res.28，109-118.
[0467] Mizrak D，Brittan M，Alison M(2008).CD133：molecule of the moment.J Pathol.214，3-9.
[0468] Molenkamp BG，Vuylsteke RJ，van Leeuwen PA，Meijer S，Vos W，Wijnands PG，Scheper RJ，de Gruijl TD(2005).Matched skin and sentinel lymph node samples of melanoma patients reveal exclusive migration of mature dendritic cells.Am.J Pathol.167，1301-1307.
[0469] Monzani E，Facchetti F，Galmozzi E，Corsini E，Benetti A，Cavazzin C，Gritti A，Piccinini A，Porro D，Santinami M，Invernici G，Parati E，Alessandri G，La Porta CA(2007).
[0470] Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.Eur.J Cancer 43，935-946.
[0471] Mori M，Beatty PG，Graves M，Boucher KM，Milford EL(1997).HLA gene and haplotype frequencies in the North American population：the National Marrow Donor Program Donor Registry.Transplantation 64，1017-1027.
[0472] Nakaigawa N，Yao M，Baba M，Kato S，Kishida T，Hattori K，Nagashima Y，Kubota Y(2006).Inactivation of von Hippel-Lindau gene induces constitutive phosphorylation of MET protein in clear cell renal carcinoma.Cancer Res.66，3699-3705.
[0473] Neumann F，Wagner C，Kubuschok B，Stevanovic S，Rammensee HG，Pfreundschuh M(2004).Identification of an antigenic peptide derived from the cancer-testis antigen NY-ESO-1 binding to a broad range of HLA-DR subtypes.Cancer Immunol.Immunother.53，589-599.
[0474] Nguyen QN，Chavli RV，Marques JT，Conrad PG，Jr.，Wang D，He W，Belisle BE，Zhang A，Pastor LM，Witney FR，Morris M，Heitz F，Divita G，Williams BR，McMaster GK(2006).Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells.Biochim.Biophys.Acta 1758，394-403.
[0475] Nishio K，Kim SW，Kawai K，Mizushima T，Yamane T，Hamazaki J，Murata S，Tanaka K，Morimoto Y(2009).Crystal structure of the de-ubiquitinating enzyme UCH37(human UCH-L5)catalytic domain.Biochem.Biophys.Res Commun.390，855-860.[0476] Ohnuma S，Miura K，Horii A，Fujibuchi W，Kaneko N，Gotoh O，Nagasaki H，Mizoi T，Tsukamoto N，Kobayashi T，Kinouchi M，Okabe M，Sasaki H，Shiiba K，Miyagawa K，Sasaki I(2009).Cancer-associated splicing variants of the CDCA1 and MSMB genes expressed in cancer cell lines and surgically resected gastric cancer tissues.Surgery 145，57-68.
[0477] Oka Y，Tsuboi A，Taguchi T，Osaki T，Kyo T，Nakajima H，Elisseeva OA，Oji Y，Kawakami M，Ikegame K，Hosen N，Yoshihara S，Wu F，Fujiki F，Murakami M，Masuda T，Nishida S，Shirakata T，Nakatsuka S，Sasaki A，Udaka K，Dohy H，Aozasa K，Noguchi S，Kawase I，Sugiyama H(2004).Induction of WT1(Wilms′tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 101，13885-13890.
[0478] Pietra G，Manzini C，Vitale M，Balsamo M，Ognio E，Boitano M，Queirolo P，Moretta L，Mingari MC(2009).Natural killer cells kill human melanoma cells with characteristics of cancer stem cells.Int Immunol.21，793-801.
[0479] Poppe M，Feller SM，Romer G，Wessler S(2007).Phosphorylation of Helicobacter pylori CagA by c-Abl leads to cell motility.Oncogene 26，3462-3472.
[0480] Pytel D，Sliwinski T，Poplawski T，Ferriola D，Majsterek I(2009).Tyrosine kinase blockers：new hope for successful cancer therapy.Anticancer Agents Med Chem.9，66-76.
[0481] Qian Z，Joslin JM，Tennant TR，Reshmi SC，Young DJ，Stoddart A，Larson RA，Le Beau MM(2009).Cytogenetic and genetic pathways in therapy-related acute myeloid leukemia.Chem.Biol.Interact.
[0482] Rammensee HG，Bachmann J，Emmerich NP，Bachor OA，Stevanovic S(1999).SYFPEITHI：database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics 50，213-219.
[0483] Rammensee，H.G.，Bachmann,J.，and Stevanovic，S.(1997).MHC Ligands and Peptide Motifs.Springer-Verlag，Heidelberg，Germany).
[0484] Rammensee HG，Falk K，Rotzschke O(1993).Peptides naturally presented by MHC class I molecules.Annu.Rev.Immunol.11，213-244.
[0485] Rappa G，Fodstad O，Lorico A(2008).The stem cell-associated antigen CD133(Prominin-1)is a molecular therapeutic target for metastatic melanoma.Stem Cells 26，3008-3017.
[0486] Ricci-Vitiani L，Lombardi DG，Signore M，Biffoni M，Pallini R，Parati E，Peschle C，De Maria R(2007).Human neural progenitor cells display limited cytotoxicity and increased oligodendrogenesis during inflammation.Cell Death.Differ.14，876-878.
[0487] Richardson GD，Robson CN，Lang SH，Neal DE，Maitland NJ，Collins AT(2004).CD133，a novel marker for human prostatic epithelial stem cells.J Cell Sci.117，3539-3545.
[0488] Rutella S，Bonanno G，Procoli A，Mariotti A，Corallo M，Prisco MG，Eramo A，Napoletano C，Gallo D，Perillo A，Nuti M，Pierelli L，Testa U，Scambia G，Ferrandina G(2009).Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors.Clin Cancer Res 15，4299-4311.[0489] Saito T，Arifin MT，Hama S，Kajiwara Y，Sugiyama K，Yamasaki F，Hidaka T，Arita K，Kurisu K(2007).Survivin subcellular localization in high-grade astrocytomas：simultaneous expression in both nucleus and cytoplasm is negative prognostic marker.J Neurooncol.82，193-198.
[0490] Sasaki T，Lopes MB，Hankins GR，Helm GA(2002).Expression of survivin，an inhibitor of apoptosis protein，in tumors of the nervous system.Acta Neuropathol.104，105-109.
[0491] Seeger FH，Schirle M，Gatfield J，Arnold D，Keilholz W，Nickolaus P，Rammensee HG，Stevanovic S(1999).The HLA-A*6601 peptide motif：prediction by pocket structure and verification by peptide analysis.Immunogenetics 49，571-576.
[0492] Shapiro GI(2006).Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment.J Clin Oncol 24，1770-1783.
[0493] Singh SK，Clarke ID，Terasaki M，Bonn VE，Hawkins C，Squire J，Dirks PB(2003).Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.Cancer Res.63，5821-5828.
[0494] Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，Squire JA，Bayani J，Hide T，Henkelman RM，Cusimano MD，Dirks PB(2004).Identification of human brain tumour initiating cells.Nature 432，396-401.
[0495] Smith LM，Nesterova A，Ryan MC，Duniho S，Jonas M，Anderson M，Zabinski RF，Sutherland MK，Gerber HP，Van Orden KL，Moore PA，Ruben SM，Carter PJ(2008).CD133/prominin-1 is a potential therapeutic target for antibody-drug conjugates in hepatocellular and gastric cancers.Br.J Cancer 99，100-109.
[0496] Stemmann O，Zou H，Gerber SA，Gygi SP，Kirschner MW(2001).Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase.Cell 107，715-726.
[0497] Suetsugu A，Nagaki M，Aoki H，Motohashi T，Kunisada T，Moriwaki H(2006).Characterization of CD133+hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.351，820-824.
[0498] Sun Y，Song M，Stevanovic S，Jankowiak C，Paschen A，Rammensee HG，Schadendorf D(2000).Identification of a new HLA-A(*)0201-restricted T-cell epitope from the tyrosinase-related protein 2(TRP2)melanoma antigen.Int.J.Cancer 87，399-404.
[0499] Suva ML，Riggi N，Stehle JC，Baumer K，Tercier S，Joseph JM，Suva D，Clement V，Provero P，Cironi L，Osterheld MC，Guillou L，Stamenkovic I(2009).Identification of Cancer Stem Cells in Ewing′s Sarcoma.Cancer Res.
[0500] Sylvester RK(2002).Clinical applications of colony-stimulating factors：a historical perspective.Am J Health Syst.Pharm.59，S6-12.
[0501] Takaishi S，Okumura T，Tu S，Wang SS，Shibata W，Vigneshwaran R，Gordon SA，Shimada Y，Wang TC(2009).Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.Stem Cells 27，1006-1020.
[0502] Tirino V，Camerlingo R，Franco R，Malanga D，La RA，Viglietto G，Rocco G，Pirozzi G(2009).The role of CD133 in the identification and characterisation of tumour-initiating cells in non-small-cell lung cancer.Eur.J Cardiothorac.Surg 36，446-453.
[0503] Todaro M，Alea MP，Di Stefano AB，Cammareri P，Vermeulen L，Iovino F，Tripodo C，Russo A，Gulotta G，Medema JP，Stassi G(2007).Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4.Cell Stem Cell 1，389-402.
[0504] Uematsu M，Ohsawa I，Aokage T，Nishimaki K，Matsumoto K，Takahashi H，Asoh S，Teramoto A，Ohta S(2005).Prognostic significance of the immunohistochemical index of survivin in glioma：a comparative study with the MIB-1 index.J Neurooncol.72，231-238.
[0505] Walter S，Herrgen L，Schoor O，Jung G，Wernet D，Buhring HJ，Rammensee HG，Stevanovic S(2003).Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J.Immunol.171，4974-4978.
[0506] Wicks SJ，Grocott T，Haros K，Maillard M，ten DP，Chantry A(2006).Reversible ubiquitination regulates the Smad/TGF-beta signalling pathway.Biochem.Soc Trans.34，761-763.
[0507] Wicks SJ，Haros K，Maillard M，Song L，Cohen RE，Dijke PT，Chantry A(2005).The deubiquitinating enzyme UCH37 interacts with Smads and regulates TGF-beta signalling.Oncogene 24，8080-8084.
[0508] Xie D，Zeng YX，Wang HJ，Wen JM，Tao Y，Sham JS，Guan XY(2006).Expression of cytoplasmic and nuclear Survivin in primary and secondary human glioblastoma.Br.J Cancer 94，108-114.
[0509] Yang L，Anderson DE，Baecher-Allan C，Hastings WD，Bettelli E，Oukka M，Kuchroo VK，Hafler DA(2008).IL-21 and TGF-beta are required for differentiation of human T(H)17cells.Nature.
[0510] Yasui W，Ayhan A，Kitadai Y，Nishimura K，Yokozaki H，Ito H，Tahara E(1993).Increased expression of p34cdc2 and its kinase activity in human gastric and colonic carcinomas.Int J Cancer 53，36-41.
[0511] Yin S，Li J，Hu C，Chen X，Yao M，Yan M，Jiang G，Ge C，Xie H，Wan D，Yang S，Zheng S，Gu J(2007).CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity.Int.J Cancer 120，1444-1450.
[0512] Zhang X，Kedl RM，Xiang J(2009).CD40 ligation converts TGF-beta-secreting tolerogenic CD4-8-dendritic cells into IL-12-secreting immunogenic ones.Biochem.Biophys.Res Commun.379，954-958.
[0513] Zhao C，Chen A，Jamieson CH，Fereshteh M，Abrahamsson A，Blum J，Kwon HY，Kim J，Chute JP，Rizzieri D，Munchhof M，Vanarsdale T，Beachy PA，Reya T(2009).Hedgehog signalling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia.Nature.Zhen HN，Zhang X，Hu PZ，Yang TT，Fei Z，Zhang JN，Fu LA，He XS，Ma FC，Wang XL(2005).Survivin expression and its relation with proliferation，apoptosis，and angiogenesis in brain gliomas.Cancer 104，2775-
2783.
2783.
[0514] Zhou L，Lopes JE，Chong MM，Ivanov II，Min R，Victora GD，Shen Y，Du J，Rubtsov YP，Rudensky AY，Ziegler SF，Littman DR(2008).TGF-beta-induced Foxp3 inhibits T(H)17cell differentiation by antagonizing RORgammat function.Nature 453，236-240.
[0515] Zhu KJ，Cen JP，Lou JX，Wang Q，Zhang X，Xu Y，Chen XZ，Cheng H(2009).Imiquimod inhibits the differentiation but enhances the maturation of human monocyte-derived dendritic cells.Int Immunopharmacol.9，412-417.
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