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癌症 治疗中的靶向脂质体

阅读：1023发布：2020-07-11

专利汇可以提供癌症治疗中的靶向脂质体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了药物组合物，其包含用于靶向递送治疗剂和诊断剂以治疗过度增殖性疾病 (hyperproliferative disease)的运载体。此运载体的靶向组分是与货物组分(carg0component)(其可以是治疗剂或诊断剂)偶联或者与包含治疗剂或诊断剂的纳米颗粒组合物偶联的胱氨酸分子。本发明也提供了通过靶向过度增殖性疾病细胞以递送治疗剂或诊断剂从而来治疗过度增殖性病症的方法。，下面是癌症治疗中的靶向脂质体专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于靶向细胞内递送治疗剂或诊断剂或这二者的运载体，所述运载体包含与货物偶联的胱氨酸分子，其中所述货物是包含治疗剂、诊断剂或这二者的脂质体组合物，其中所述诊断剂或治疗剂被包裹在所述脂质体中。
2.权利要求1的运载体，其中所述胱氨酸分子通过化学键与所述货物直接偶联。
3.权利要求1的运载体，其中所述胱氨酸分子通过连接基团与所述货物偶联。
4.权利要求3的运载体，其中所述连接基团是聚乙二醇分子。
5.权利要求1的运载体，其中所述治疗剂选自：小有机分子、无机分子、治疗性肽和蛋白质、放射性同位素、用于基因治疗的siRNA和核酸、毒物以及抗癌剂。
6.权利要求5的运载体，其中所述治疗剂选自抗体。
7.权利要求1的运载体，其中所述诊断剂选自：荧光物质、电子致密物、报告物部分、特异性结合部分和放射性物质。
8.权利要求1、2或3中任一项的运载体，其中所述治疗剂选自：小有机分子、无机分子、治疗性肽和蛋白质、放射性同位素、用于基因治疗的siRNA和核酸、毒物以及抗癌剂。
9.权利要求8的运载体，其中所述治疗剂选自抗体。
10.用于细胞内递送治疗剂、诊断剂或这二者的运载体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述运载体包含与货物偶联的胱氨酸分子以用于细胞内递送，其中所述货物是包含治疗剂、诊断剂或这二者的脂质体组合物，其中所述诊断剂或治疗剂被包裹在所述脂质体中。
11.胱氨酸分子在制备用于改善治疗或诊断组合物之细胞内递送的用于治疗患者之药物中的用途，其包括将胱氨酸分子与货物偶联以用于细胞内递送的步骤，其中所述货物是包含治疗剂或诊断剂的脂质体组合物，其中所述诊断剂或治疗剂被包裹在所述脂质体中。
12.药物制剂，其包含：
a)用于治疗剂、诊断剂或这二者之细胞内递送的运载体，所述运载体包含与货物偶联的胱氨酸分子以用于细胞内递送，其中所述货物是包含治疗剂、诊断剂或这二者的脂质体组合物；和
b)可药用载体，其中所述诊断剂或治疗剂被包裹在所述脂质体中。
13.权利要求1至9中任一项的运载体，其中所述运载体靶向至细胞，所述细胞异常表达高水平的对胱氨酸/谷氨酸转化、对所述治疗剂或任选地所述诊断剂的细胞内递送特异性的xc-系统异二聚体氨基酸转运蛋白的细胞质膜组分。
14.权利要求3的运载体，其中所述连接基团包含二酸。
15.权利要求3的运载体，其中所述连接基团包含选自戊二醛、羟基酸的二醛接头，以及氨基酸。

说明书全文

癌症 治疗中的靶向脂质体

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2011年9月8日提交的美国申请序列号61／532,430的优先权，其全部公开通过参考并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及用于治疗剂和诊断剂靶向递送的组合物和方法，包括靶向细胞内递送治疗剂和诊断剂，以及涉及过度增殖性疾病的治疗。

背景技术

[0004] 用化学疗法药物治疗过度增殖性病症的有效性(如恶性和良性肿瘤)受到一些重大障碍的限制，其包括：i)药物对于正常和肿瘤组织的非特异性毒性；ii)向靶细胞递送药物的无效率；以及iii)药物不合适的释放。因此，许多化学疗法药物被表征为具有低治疗指数，从而需要相对高的药物剂量，继而导致许多副作用。正因如此，开发另外的用于递送化学疗法药物至靶细胞的靶向递送系统会解决许多化学疗法不需要的方面。本发明通过下述方式满足了这样的需要，其通过将药物靶向至异常表达高水平的对胱氨酸／谷氨酸转化特异性的xc-系统异二聚体氨基酸转运蛋白的细胞质膜组分。

[0005] xc-系统将L-胱氨酸输入到细胞的细胞内区室，所述细胞内区室需要L-胱氨酸来合成谷胱甘肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，本文称作“GSH”)，其为在含氧量低的环境下(例如存在于肿瘤环境中的细胞)对细胞存活来说非常重要的抗氧化剂。xc-系统输入的结构由SLC7A11(赋予转运蛋白胱氨酸特异性的催化亚基)和SCL3A2(调节亚基)构成。SLC7A11和SCL3A2也在技术领域中分别以xCT和4F2hc／CD98所知。

[0006] 由于肿瘤细胞和其他异常快速分裂或分化的细胞需要更大量的GSH来应对更高水平的氧化胁迫，相比正常情况下的正常细胞，这种细胞更高地表达xc-系统组分来引入胱氨酸。正因如此，本发明通过下述方式利用了过度增殖细胞xc-系统组分的表达增加，所述方式即提供包含胱氨酸的药物和诊断递送运载体从而将递送运载体介导至靶细胞的xc-系统组分。

发明内容

[0007] 本发明提供了用于靶向递送治疗剂和诊断剂以治疗过度增殖性疾病的药物组合物。在多个实施方案中，本发明提供了用于靶向递送治疗剂或诊断剂的运载体(vehicle)，或包含靶向组分和货物(cargo)组分二者的运载体。所述靶向组分是胱氨酸分子，其偶联到可以是治疗剂或诊断剂或者这二者的货物组分，或者偶联到包含治疗剂和或诊断剂或者这二者的纳米颗粒组合物。在多个实施方案中，所述纳米颗粒组合物是脂质体包裹(liposome-encapsulated)的治疗剂或诊断剂。

[0008] 本发明还提供了治疗过度增殖性病症的方法，其通过靶向过度增殖性疾病细胞从而细胞内递送治疗剂或诊断剂或者这二者来实现。在多个实施方案中，本发明的方法施用有效量的本发明运载体来实现治疗剂或诊断剂的细胞内递送，所述运载体包含与货物偶联的胱氨酸分子用以细胞内递送，其中所述货物是治疗剂成分或者是包含治疗剂或诊断剂或这二者的组合物。附图说明

[0009] 图1描绘了缀合了胱氨酸的脂质体所包裹的柔红霉素(DNR)的结构。该图描绘了胱氨酸分子的Natta投影(Natta projection)。

[0010] 图2描绘了纳米颗粒(例如，癌组织中的脂质体)的渗透性和保持力(retention)增强。(1)描绘了在健康组织中不能渗透入血管内皮的纳米颗粒。(2)描绘了正常内皮。(3)和(4)描述了纳米颗粒从肿瘤组织中血管的外渗。

[0011] 图3描绘了xc-胱氨酸／谷氨酸转运系统的功能性示意图。(1)代表转运蛋白的SLC3A2亚基，(2)代表通过转运蛋白的胱氨酸的细胞输入，(3)代表转运蛋白的SLC7A11亚基，以及(4)代表通过转运蛋白的谷氨酸输出。

[0012] 图4显示了对于A549细胞的DNR标准曲线(吸光度相对DNR浓度)。

[0013] 图5A显示了A549细胞对(1)游离DNR；(2)脂质体DNR；以及(3)胱氨酸脂质体DNR任一形式的10μm和5μm的DNR的相对细胞摄取的柱状图，其基于如流式细胞术分析所测定的荧光强度。该图表示了以流式细胞术数据为基础的不同形式DNR制剂的平均荧光强度(MFI)。细胞DNR摄取以相对于10μM游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度来表示。显示了平均值和S.E.M(平均标准误)(＊＊＊胱氨酸-脂质体DNR相对游离DNR于5μM和10μM浓度p<
0.001，n=3；+++胱氨酸-脂质体DNR相对脂质体DNR于5μM和10μM浓度p<0.001)。

[0014] 图5B显示了A549细胞对DNR摄取的图(histogram)，A549细胞经下述处理：(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)非胱氨酸-脂质体DNR；(3)游离DNR；或(4)无。所有的DNR制剂都包含10μm DNR(n=3)。DNR的细胞摄取与荧光强度相关联。

[0015] 图5C显示了A549细胞对DNR摄取的图，A549细胞经下述处理：(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)游离DNR；(3)非胱氨酸-脂质体DNR；或(4)无。所有的DNR制剂都包含5μm DNR(n=3)。DNR的细胞摄取与荧光强度相关联。

[0016] 图6A展示了A549细胞与(1)10μM DNR；(2)10μM DNR等量的胱氨酸脂质体DNR；(3)10μM DNR等量的脂质体DNR；或者(4)在谷氨酸存在下的10μM DNR等量的胱氨酸脂质体DNR在37℃孵育6个小时的荧光显微图像。

[0017] 图6B展示了A549细胞与(1)5μM DNR；(2)5μMDNR等量的胱氨酸脂质体DNR；(3)5μM DNR等量的脂质体DNR；或者(4)在谷氨酸存在下的5μM DNR等量的胱氨酸脂质体DNR在37℃孵育6个小时的荧光显微镜图像。

[0018] 图7A显示了以下柱状图：谷氨酸(5mM)对于经含5μm或10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。该图表示了以流式细胞术数据为基础的不同形式DNR制剂的平均荧光强度(MFI)。细胞DNR摄取以相对于10μm游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度来表示。显示了平均值和S.E.M(平均标准误)(*显示了胱氨酸-脂质体DNR相对脂质体DNR于5μM和10μM浓度下p<0.05，n=3)。柱(1)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后的DNR摄取。柱(2)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后在谷氨酸存在下的DNR摄取。柱(3)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后的DNR摄取。柱(4)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后在谷氨酸存在下的DNR摄取。

[0019] 图7B显示了以下图：谷氨酸对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)胱氨酸-脂质体DNR和谷氨酸；以及(3)无中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0020] 图7C显示了以下图：谷氨酸对于经含5μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)胱氨酸-脂质体DNR和谷氨酸；以及(3)无中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。所有DNR制剂包含5μm的DNR(n=3)。

[0021] 图8A显示了以下图：低温对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)冷条件(4℃)下的胱氨酸-脂质体DNR；以及(3)无中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度。所有DNR制剂包含10μm的DNR(n=3)。

[0022] 图8B显示了以下图：低温对于经含5μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)冷条件(4℃)下的胱氨酸-脂质体DNR；以及(3)无中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度。所有DNR制剂包含5μm的DNR(n=3)。

[0023] 图9A显示了以下柱状图：细胞松弛素(100μM)对于经含5μm或10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。该图表示了以流式细胞术数据为基础的不同形式的DNR制剂的平均荧光强度。细胞DNR摄取以相对于10μM游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度来表示。显示了平均值和S.E.M(平均标准误)。柱(1)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后的DNR摄取。柱(2)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后在细胞松弛素存在下的DNR摄取。柱(3)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后的DNR摄取。柱(4)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后在细胞松弛素存在下的DNR摄取。

[0024] 图9B显示了以下图：细胞松弛素对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)无；(2)胱氨酸-脂质体DNR；以及(3)胱氨酸-脂质体DNR和细胞松弛素；其中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0025] 图9C显示了以下图：细胞松弛素对于经含5μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)无；(2)胱氨酸-脂质体DNR和细胞松弛素；或(3)胱氨酸-脂质体DNR中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0026] 图10A显示了以下柱状图：氯丙嗪(100μg／ml)对于经含5μm或10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。该图表示了以流式细胞术数据为基础的不同形式DNR制剂的平均荧光强度。细胞DNR摄取以相对于10μM游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度来表示。显示了平均值和S.E.M(平均标准误)。柱(1)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后的DNR摄取。柱(2)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后在氯丙嗪存在下的DNR摄取。柱(3)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后的DNR摄取。柱(4)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后在氯丙嗪存在下的DNR摄取。

[0027] 图10B显示了以下图：氯丙嗪对于经含5μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)无；(2)胱氨酸-脂质体DNR；和(3)胱氨酸-脂质体DNR和氯丙嗪；中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0028] 图10C显示了以下图：氯丙嗪对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR和氯丙嗪；(2)胱氨酸-脂质体DNR；或(3)无；中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0029] 图11A显示了以下柱状图：阿米洛利(amiloride)(3mM)对于经含5μm或10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。该图表示了以流式细胞术数据为基础的不同形式的DNR制剂的平均荧光强度。细胞DNR摄取以相对于10μM游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度来表示。显示了平均值和S.E.M(平均标准误)(*胱氨酸-脂质体DNR相对胱氨酸-脂质体DNR和阿米洛利于5μM和10μM浓度下p<0.05，n=3)。柱(1)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后的DNR摄取。柱(2)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后在阿米洛利存在下的DNR摄取。柱(3)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后的DNR摄取。柱(4)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后在阿米洛利存在下的DNR摄取。

[0030] 图11B显示了以下图：阿米洛利对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR和阿米洛利；(2)胱氨酸-脂质体DNR；或(3)无；中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0031] 图11C显示了以下图：阿米洛利对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)无；(2)胱氨酸-脂质体DNR和阿米洛利；和(3)胱氨酸-脂质体DNR；中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0032] 图12A显示了以下柱状图：制霉菌素(nystatin)(100μg／ml)对于经含5μm或10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。该图表示了以流式细胞术数据为基础的不同形式DNR制剂的平均荧光强度。细胞DNR摄取以相对于10μM游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度来表示。显示了平均值和S.E.M(平均标准误)(*胱氨酸-脂质体DNR相对胱氨酸-脂质体DNR和制霉菌素以5μM浓度为基础p<0.05，n=3)。柱(1)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后的DNR摄取。柱(2)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入10μm量的DNR后在制霉菌素存在下的DNR摄取。柱(3)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后的DNR摄取。柱(4)显示了以胱氨酸-脂质体DNR形式加入5μm量的DNR后在制霉菌素存在下的DNR摄取。

[0033] 图12B显示了以下图：制霉菌素对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)胱氨酸-脂质体DNR和制霉菌素；或(3)无中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0034] 图12C显示了以下图：制霉菌素对于经含10μm剂量DNR的胱氨酸脂质体DNR制剂处理的细胞摄取DNR的影响。显示了用(1)胱氨酸-脂质体DNR；(2)胱氨酸-脂质体DNR和制霉菌素；或(3)无中任一处理的A549细胞的细胞计数相对于荧光强度(n=3)。

[0035] 图13A显示了以下线形图：针对游离DNR和胱氨酸-脂质体DNR的A549细胞生长抑制曲线。(1)胱氨酸-脂质体DNR，(2)脂质体DNR，和(3)游离DNR的IC50DNR浓度分别为4.435μM、10.25μM以及15.25μM。

[0036] 图13B显示了以下柱状图：用含有相当于5μM或10μM DNR之DNR剂量的(1)游离DNR，(2)脂质体DNR，或(3)胱氨酸-脂质体DNR制剂处理后存活的A549细胞的百分比。(+++p<0.001基于胱氨酸-脂质体DNR的5μM和10μM的DNR制剂相对游离DNR的5μM和10μMDNR制剂，+p<0.01基于脂质体DNR的5μM和10μM DNR制剂相对游离DNR的5μM和10μM DNR制剂，＊＊p<
0.01基于胱氨酸脂质体DNR的10μMDNR制剂相对脂质体DNR的10μM DNR制剂，以及＊＊＊p<
0.001基于胱氨酸脂质体DNR的5μM DNR制剂相对脂质体DNR的5μM DNR制剂。)显示了平均值和S.E.M(平均标准误)。(n=3)。

[0037] 图14A显示了以下线形图：谷氨酸对由胱氨酸-脂质体DNR介导的A549细胞生长抑制的作用。IC50DNR的浓度对于(1)胱氨酸-脂质体DNR，和(2)胱氨酸-脂质体DNR分别为4.435μM、以及7.947μM。

[0038] 图14B显示了以下柱状图：在含有相当于10μM或5μM DNR的DNR剂量的胱氨酸-脂质体DNR制剂和(2)胱氨酸-脂质体DNR制剂处理后存活的A549细胞的百分比。(＊＊＊基于胱氨酸-脂质体DNR的5μM DNR制剂相对胱氨酸-脂质体DNR的5μM DNR制剂加谷氨酸，p<0.001。)显示了平均值和S.E.M(平均标准误)(n=3)。

[0039] 图15显示了以下柱状图：以脂质体DNR的形式加入的DNR的量与处理72小时后细胞存活(cell viability)的相关性。柱(1)表示0.0001μM脂质体DNR，柱(2)表示2.5μM脂质体DNR，柱(3)表示5μM脂质体DNR，柱(4)表示10μM脂质体DNR，柱(5)表示15μM脂质体DNR。

[0040] 图16显示了将DNR递送到咽囊期(pharyngula-Stage)斑马鱼胚胎胃中使之摄取胱氨酸脂质体DNR(A)相对于斑马于胚胎使之摄取脂质体DNR(B)的荧光图像，。图16A中的箭头指向留在斑马鱼胃内的DNR。

[0041] 图17A显示了下列DNR制剂在Pan02细胞体内肿瘤模型中随时间对肿瘤体积的作用：(1)PEG化的胱氨酸脂质体DNR；(2)胱氨酸脂质体DNR；(3)脂质体DNR；(4)游离DNR；以及(5)盐水。

[0042] 图17B显示了下列线性图：图17A的DNR制剂作用的更多细节。(1)胱氨酸脂质体DNR；(2)PEG化的胱氨酸脂质体DNR；(3)游离DNR；以及(4)脂质体DNR。

[0043] 图17C显示了图17A的基于脂质体的DNR制剂的抗肿瘤作用。(1)脂质体DNR；(2)胱氨酸脂质体DNR；以及(3)加入PEG化的胱氨酸脂质体DNR。

[0044] 图17D显示了(1)盐水；(2)游离DNR；(3)脂质体DNR；(4)胱氨酸脂质体DNR；以及(5)PEG化的胱氨酸脂质体DNR对体重的作用。

[0045] 附表说明

[0046] 表1展示了游离DNR、脂质体DNR、胱氨酸脂质体DNR以及谷氨酸存在下胱氨酸脂质体DNR的IC50(μM DNR)浓度。浓度值来自于图12A和13A的细胞存活曲线。

具体实施方式

[0047] 本发明提供了用于靶向递送治疗剂和诊断剂的运载体和方法。更特别地，本发明的运载体包含一个或更多个偶联至货物的胱氨酸分子，所述货物包括治疗剂或诊断剂或这二者，从而形成“本发明的运载体”。本发明的运载体可递送到表达胱氨酸特异的xc-系统异二聚体氨基酸转运蛋白之组分的靶细胞，所述转运蛋白由SLC7A11和SLC3A2亚基的异源二聚体形成，此后称之为“转运蛋白”。通常，在异常氧化胁迫条件下细胞更高地表达转运蛋白，例如对于过度增殖细胞来说经常存在的条件，因此，其对于基于胱氨酸和转运蛋白特异性相互作用的本发明运载体来说是有效的疾病细胞靶标。货物可以是治疗剂或诊断剂或者是包含治疗剂、诊断剂或其组合的组合物。

[0048] 在多个实施方案中，本发明的运载体把治疗剂或诊断剂递送到细胞内区室中。不希望受任何特定理论的限制，来自于本发明运载体的治疗剂或诊断剂的细胞摄取可通过本发明运载体的一个或更多个胱氨酸与转运蛋白的相互作用实现。在多个实施方案中，本发明运载体的胱氨酸与转运蛋白的相互作用启动一系列的细胞事件，其引起靶细胞内吞本发明的运载体或运载体的多种组分，如治疗剂或诊断剂。在本发明的某些实施方案中，由本发明运载体的胱氨酸与转运蛋白之间相互作用发动的内吞事件是能量依赖性胞饮事件。

[0049] 胱氨酸组分

[0050] 如本文所使用的，胱氨酸理解为由共价连接的形成二硫键的两个半胱氨酸残基氧化形成的二聚氨基酸。在本发明的多个实施方案中，胱氨酸是L-胱氨酸。可以通过使用本领域内已知的方法将胱氨酸连接到货物上，包括对货物进行修饰以包含与胱氨酸有反应型的官能团，(例如，可氧化脂质体货物分子，以及通过进行还原胺化反应(reductive amination reaction)将胱氨酸连接到脂质体表面)。通过化学键直接将胱氨酸连接到本发明运载体的货物组分的方法可见于Hermanson，G，“BioconjugateTechniques,”st nd1 ed.Academic Press(1996)和Hermanson，G“Bioconjjugate Techniques,”2 ed.Elsevier Inc.(2008)，其全部并入本文。

[0051] 在本发明多个其他实施方案中，胱氨酸也可间接地通过连接基团连接到货物上，比如但不限于聚乙二醇(PEG)，二酸接头如琥珀酸、丁二酸等；二醛如戊二醛、羟基酸(hydroxy acid)，其中羟基酸的羟基集团与胱氨酸的羧酸形成酯，以及接头的羧酸与PEG羟基形成酯，以及氨基酸接头，如e-氨基己酸，其中接头的氨基与胱氨酸的羧酸形成酰胺(amide)而接头的羧酸与PEG羟基形成酯。此外，胱氨酸的氨基可用于与接头形成共价键，如PEG或任何其他接头分子。除了将胱氨酸连接到本发明运载体的货物组分上，PEG分子还允许缀合来避免本发明的运载体被治疗接受者的免疫系统清除。更具体地说，可通过将PEG整合入运载体中来逃过单核巨噬细胞系统。本发明不特别地限制PEG的分子量，但是连接到本发明的运载体的PEG分子通常的分子量从约400到约10,000Dalton。然而，本发明可以适应大到100,000Dalton或更大的PEG分子。

[0052] 货物组分

[0053] 如上所述，本发明运载体的货物也可以是包含治疗剂的组合物。例如，作为本发明货物的组合物可以是包含治疗剂的纳米颗粒，其是具有下述原料的组合物，比如但不限于：脂质(如脂质体)；环糊精(cyclodextrin)；生物相容性聚合物(如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，以及在FDAGRAS列表清单上指明的聚合物，其通过参考并入，乳酸／羟基乙酸共聚物(PLGA))；或生物材料(如白蛋白)。

[0054] 关于脂质成分，本发明并不特别限制提供的脂质成分的选择。然而，脂质的实例选自但不限于胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、硬脂酰胺、阳离子脂质(cationic lipid)、组织来源的磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、乳糖神经酰胺(lactosylceramide)、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、具有含邻位羟基(vicinal hydroxyl)的易氧化高锰酸盐成分的脂质、以及糖脂。根据施用途径，本发明的脂质体也可包含可药用稳定剂和／或抗氧化剂。稳定剂的非限制性例子包括糖类，如甘油、甘露醇、山梨醇、乳糖和蔗糖。当甾醇(如胆固醇)用于膜的额外脂质成分时，这类甾醇也作为稳定剂。

[0055] 除了稳定剂，根据施用途径，本发明的脂质体货物组合物还可包含可药用添加剂。这类添加剂的例子包括水、生理盐水、可药用有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、干酪素、明胶、琼脂、二酰甘油(diglycerin)、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、PBS、体内可降解的聚合物、无血清培养基(serum-free medium)、可药用表面活性剂以及其任意组合。

[0056] 术语“装载”，如本文所理解的，主要用来指定下述状态，即在该状态下治疗剂被包裹在脂质体的封闭空间中。然而，其也包括以下状态：即一部分的治疗剂局限于膜中的状态或者治疗剂连接到膜外表面的状态。装载于即包裹于脂质体中的治疗剂的需要量根据药物类型的不同有所变化。

[0057] 在多个实施方案中，本发明运载体的货物是脂质体包裹的治疗剂，其中可通过连接亲水性大分子来修饰脂质体的表面。这样的修饰可以通过连接PEG的衍生物(如磷脂衍生物或胆固醇衍生物)的反应来完成。例如，可以将PEG衍生物或PEG衍生物水溶液添加到脂质体分散系(liposome dispersion)来产生仅在脂质体外表面上具有PEG链的脂质体。作为替代地，可通过下述方式来产生经修饰的脂质体，所述方式即通过本领域内通常使用的方法产生具有反应性官能团的含膜组成脂质(membrane-constituting lipid)(例如磷脂)的脂质体，其后将具有一个活化末端的PEG添加到脂质体的外部溶液(exterior solution)从而使得此PEG与具有官能团的膜组成脂质(例如磷脂)相结合。在上述过程中，多种技术可用来产生具有所需尺寸的脂质体(“Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques”2nd edition，edited by G.Gregoriadis，V0l.I-III，CRC Press)，其通过引用并入本文。

[0058] 关于包含货物的本发明运载体，所述货物包括包裹治疗剂的组合物，此类纳米颗粒基于治疗剂分子通过产生低能化学键将自身与一个或更多个环糊精分子相结合的能力，因此，所述化学键是非共价的例如形成包合配合物(inclusion complex)。该配合物的存在源于a)游离状态的治疗剂和环糊精与b)包合配合物之间平衡的形成。这通过其稳定常数来定量地表征。

[0059] 本发明没有特别限定能包含在本发明的运载体的货物中的聚合物成分的选择。然而，本发明提供了至少一种或更多种聚合物，其选自但不限于聚阳离子聚合物、聚阴离子聚合物或非离子聚合物。聚阳离子或聚阴离子聚合物有至少一个分别带有正电或负电的位点(site)。适于本发明运载体之货物组分的非限制性聚合物组包括但不限于环状寡糖(cyclicaloligosaccharide)，特别地，来自环糊精，其可以是中性或带电的，天然的(环糊精α、β、γ、δ和ε)、分枝的或聚合的，或者甚至经化学修饰的，例如，通过用基团(如烷基、芳基、芳基烷基、糖苷基团)替代一个或多个羟丙基，或通过与醇、脂肪酸进行醚化、酯化作用。

[0060] 本发明的含环糊精聚合物可以是线状、分枝或接枝的(grafted)。当本文所用时，术语“线状含环糊精聚合物”是指包含(α、β、γ、δ和ε)环糊精分子的聚合物，或其插入聚合物链的衍生物。

[0061] 关于包含有包括白蛋白的货物组分的本发明运载体，本发明通常提供人血清白蛋白(HSA)。HSA是高度可溶的球状蛋白质，Mr为65k，由585个氨基酸组成。HSA是血浆里最丰富的蛋白质，且占人血浆胶体渗透压的70-80％。HSA的氨基酸序列含有总计17个二硫桥、1个游离巯基(Cys34)以及单个色氨酸(Trp214)。人血清白蛋白(HSA)有许多疏水结合位点(对于HAS内源性配体脂肪酸来说总计8个)且结合多种药物，特别是中性和带负电荷的疏水化合物(Goodman et al.，ThePharmacological Basis0f Therapeutics，Twelfth ed，McGraw-Hill NewYork(2011))。在HSA的IIA和IIIA亚结构域中已提出两个高亲和力结合位点，其是非常长的疏水袋(hydrophobic pocket)，靠近表面有带电荷的赖氨酸和精氨酸残基，其用作极性配体特征的连接点(参见，如Fehskeet al.，Biochem.Pharmc0l.，30，687-92(1981)，Vorum，Dan.Med.Bull.，46，379-99(1999)，Kragh-Hansen，Dan.Med Bull.，1441，131-40(1990)，Curryet al.，Nat.Struct.Bi0l.，5，827-35(1998)，Sugio et al.，Protein.Eng.，12，439-46(1999)，He et al.，Nature，358，209-15(1992)，和Carter et TM
al.，Adv.Protein.Chem.，45，153-203(1994))。紫杉醇(Abraxane )和异丙酚已显示出与HSA结合(参见，如Paal et al.，Eur.J.Biochem.，268(7)，2187-91(2001)，Purcell et al.，Biochim.Biophys.Acta，1478(1)，61-8(2000)，Altmayer et al.，
Arzneimittelforschung，45，1053-6(1995)，and Garrido etal.，
Rev.Esp.Anestesti0l.Reanim.，41，308-12(1994))。此外，多烯紫杉醇已显示出与人血清白蛋白结合(参加，如Urien et al.，Invest.New Drugs，14(2)，147-51(1996))。不希望受任何具体理论的限制，认为在组合物中包含蛋白质(例如白蛋白)以形成本发明运载体的货物组分可导致减少与施用治疗剂相关的副作用，其至少部分是由于人血清白蛋白与组合物中存在的任何游离药物结合。

[0062] 治疗剂

[0063] 如上所述，根据本发明的货物可以是治疗剂本身或是包含治疗剂的组合物，其中所述治疗剂可通过将其连接到至少一个胱氨酸而引入细胞。所述治疗剂可以是单个治疗剂或可以是不同治疗剂的组合。如在一个实施方案中了解的，治疗剂(即药物)包括但不限于小有机分子、无机分子、治疗性肽和蛋白质、抗体、放射性同位素、用于基因治疗的siRNA和核酸、在细胞内区室中为功能性的毒物，以及其可用来治疗、诊断、抑制或防止疾病(即影响人体的异常情况，包括过度增殖性疾病如癌症和非恶性肿瘤)进展。因此，在多个实施方案中，本发明的运载体包含化学治疗剂。

[0064] 本发明提供的治疗剂类别的例子包括但不限于(i)激酶抑制剂，例如伊马替尼(GlivecTM)、ZD-1839／吉非替尼(IressaTM)、Bay43-9006(索拉非尼、NexavarTM)、SU111248／舒尼替尼(SutentTM)或OSI-774／埃罗替尼(TarcevaTM)、达沙替尼(SprycelTM)、拉帕替尼(TykerbTM)或者参见下文，瓦他拉尼、凡德他尼(ZactimaTM)或帕唑帕尼；(ii)蛋白酶体抑制TM剂，如PS-341／硼替佐米(Velcade )；(iii)热休克蛋白90抑制剂，如17-烯丙氨基格尔德霉素(17-AAG)；(iv)血管靶向剂(VTAs)，如考布他汀A4磷酸酯或AVE8062／AC7700以及抗血管新生药物，像VEGF抗体、如贝伐单抗(AvastinTM)，或者KDR络氨酸激酶抑制素如PTK787／ZK222584(瓦他拉尼)或凡德他尼(ZactimaTM)或帕唑帕尼；(v)单克隆抗体如曲妥珠单抗TM TM TM
(Herceptin )或利妥昔单抗(MabThera/Rituxan )或阿仑单抗(Campath )或托西莫单抗(BexxarTM)或C225／西妥昔单抗(ErbituxTM)或阿瓦斯丁(参见上文)或帕尼单抗以及单克隆抗体的突变体和缀合物，例如吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)(MylotargTM)或替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(ZevalinTM)和抗体片段；(vi)基于寡核苷酸的治疗剂，如G-3139／奥利美生(GenasenseTM)；(vii)Toll样受体(Toll-like receptor)／TLR9激动剂如PromuneTM，TLR7激动剂如咪喹莫特(AldaraTM)或艾沙托立宾及其类似物，或TLR7／8激动剂如瑞喹莫德和作为TLR7／8激动剂的免疫刺激活性的RNA；(viii)蛋白酶抑制剂；(ix)激素治疗剂，如抗雌激素(如他莫西酚或雷普洛芬)、抗雄激素(如氟他米特或康士德)、LHRH类似物(如亮丙瑞林、戈舍瑞林或曲普瑞林)以及芳香酶抑制剂。

[0065] 本发明提供的特别的治疗剂的例子包括但不限于5FU、放线菌素D、阿巴瑞克(Abarelix)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克拉霉素(Aclarubicin)、阿达帕林(Adapalene)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、六甲蜜胺(Altretamine)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、氨普利糖(Amiprilose)、氨柔比星(Amrubicin)、阿那曲唑(Anastrozole)、安西他滨(Ancitabine)、青蒿素(Artemisinin)、咪唑硫嘌呤(Azathioprine)、巴利昔单抗(Basiliximab)、苯达莫司汀(Bendamustine)、贝伐单抗(Bevacizumab)、托西莫单抗(Bexxar)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、争光霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、溴脲苷(Broxuridine)、白消安(Busulfan)、阿仑单抗(Campath)、希罗达(Capecitabine)、卡铂(Carboplatin)、卡波醌(Carboquone)、卡莫司汀(Carmustine)、西曲瑞克(Cetrorelix)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、双氯乙基甲胺(Chlormethine)、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、氯米芬(Clomifane)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、达利珠单抗(Daclizumab)、更生霉素(Dactinomycin)、达沙替尼(Dasatinib)、柔红霉素(Daunorubicin)、地西他滨(Decitabine)、地洛瑞林(Deslorelin)、右丙亚胺(Dexrazoxane)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、柔红霉素(Doxorubicin)、屈洛昔芬(Droloxifene)、屈他雄酮(Drostanolone)、依地福新(Edelfosine)、依洛尼塞(Eflornithine)、乙嘧替氟(Emitefur)、表柔比星(Epirubicin)、环硫雄醇(Epitiostan0l)、依铂(Eptaplatin)、爱必妥(Erbitux)、埃罗替尼(Erlotinib)、雌氮芥(Estramustine)、依托泊苷(Etoposide)、依西美坦(Exemestane)、法倔唑(Fadrozole)、非那雄胺(Finasteride)、氟尿苷(Floxuridine)、氟胞嘧啶(Flucytosine)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟他米特(Flutamide)、福美司坦(Formestane)、膦甲酸(Foscarnet)、磷雌酚(Fosfestr0l)、福莫司汀(Fotemustine)、氟维司群(Fulvestrant)、吉非替尼(Gefitinib)、Genasense、吉西他滨(Gemcitabine)、格列卫(Glivec)、戈舍瑞林(Goserelin)、胍立莫司(Gusperimus)、赫赛汀(Herceptin)、伊达比星(Idarubicin)、碘苷(Idoxuridine)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊马替尼(Imatinib)、英丙舒凡(Improsulfan)、英夫利昔(Infiiximab)、伊立替康(Irinotecan)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、兰瑞肽(Lanreotide)、拉帕替尼(Lapatinib)、来曲唑(Letrozole)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、洛铂(Lobaplatin)、环己亚硝脲(Lomustine)、Luprolide、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、美妥替哌(Meturedepa)、米铂(Miboplatin)、米非司酮(Mifepristone)、米替福新(Miltefosine)、米立司亭(Mirimostim)、米托胍腙(Mitoguazone)、二溴卫矛醇(Mitolact0l)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、咪唑立宾(Mizoribine)、莫特沙芬(Motexafin)、吉妥单抗(Mylotarg)、那托司亭(Nartograstim)、Nebazumab、奈达铂(Nedaplatin)、尼鲁米特(Nilutamide)、尼莫司汀(Nimustine)、奥曲肽(Octreotide)、奥美昔芬(Ormeloxifene)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕土匹龙(Patupilone)、帕唑帕尼(Pazopanib)、培门冬酶
(Pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、培美曲塞(Pemetrexed)、喷曲肽(Pentetreotide)、喷司他丁(Pentostatin)、培磷酰胺(Perfosfamide)、嗪消安(Piposulfan)、吡柔比星(Pirarubicin)、普卡霉素(Plicamycin)、波尼莫司汀(Prednimustine)、甲苄肼(Procarbazine)、丙帕锗(Propagermanium)、丙螺氯胺(ProspidiumChloride)、雷洛昔芬(Raloxifen)、雷替曲塞(Raltitrexed)、雷莫司汀(Ranimustine)、豹蛙酶(Ranpirnase)、拉布立酶(Rasburicase)、雷佐生(Razoxane)、利妥昔单抗(Rituximab)、利福平(Rifampicin)、利曲舒凡(Ritrosulfan)、罗莫肽(Romurtide)、鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)、沙格司亭(Sargramostim)、塞特铂(Satraplatin)、雷帕霉素(Sirolimus)、索布佐生(Sobuzoxane)、索拉非尼(Sorafenib)、螺莫司汀(Spiromustine)、链脲霉素(Streptozocin)、舒尼替尼(Sunitinib)、三苯氧胺(Tamoxifen)、他索尔明(Tasonermin)、喃氟啶(Tegafur)、替莫泊芬(Temoporfin)、替莫唑胺(Temozolomide)、替莫泊苷(Teniposide)、睾内酯(Testolactone)、塞替派(Thiotepa)、胸腺法新(Thymalfasin)、硫米嘌呤(Tiamiprine)、拓扑替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、Trail、曲妥单抗(Trastuzumab)、苏消安(Treosulfan)、三亚胺醌(Triaziquone)、三甲曲沙
(Trimetrexate)、曲普瑞林(Triptorelin)、曲磷胺(Trofosfamide)、乌瑞替派(Uredepa)、戊柔比星(Valrubicin)、瓦他拉尼(Vatalanib)、凡德他尼(Vandetanib)、维替泊芬(Verteporfin)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、伏氯唑(Vorozole)和泽娃灵(Zevalin)。

[0066] 用于向患者施用以治疗或预防疾病的包含治疗剂的本发明运载体的量会随药物种类而变化，且会包含其治疗有效量。用来治疗多种病症的治疗剂剂量在本领域内是公知的。就这点的说明，例如，Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis0f Therapeutics，2011，Twelfth Edition，McGraw-Hill，New York。

[0067] 诊断剂

[0068] 如上文所述，本发明的运载体也可包含一种或更多种不同的诊断剂，即诊断标记物。在多个实施方案中，本发明的运载体包含一种或更多种诊断剂与一种或更多种治疗剂的组合。

[0069] 在多个实施方案中，本发明的运载体包含荧光物质，例如，本发明的荧光物质可选自但不限于异硫氰酸酯荧光素(FITC)、罗丹明、FAM、发光物质如鲁米诺、萤光素、光泽精或荧光药物化合物(如蒽环类药物，如柔红霉素)或其任意组合。

[0070] 在多个实施方案中，本发明的运载体包含电子致密物质(electron dense substance)。例如，本发明的电子致密物质可选自但不限于铁蛋白、胶体金或胶体超顺磁性珠。

[0071] 在多个实施方案中，本发明的运载体包含报告分子。例如，本发明的报告分子可选自但不限于允许在低浓度下直接或间接检测化合物的取代基。合适的报告分子部分包括但不限于(1)酶，其产生可检测信号，例如通过显色、荧光或发光，比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；(2)发色团，如荧光、发光或染料化合物；(3)具有可通过电子显微镜或者通过其电学特征检测(例如电导、电流分析、伏安法或阻抗测量)的电子密度的基团；和(4)可使用光学方法(如衍射、表面等离子体共振或接触角变化)或者物理方法(如原子力光谱或隧道效应)检测的基团。其他合适的报告分子部分包括但不限于，生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、肽、蛋白质、抗体、糖蛋白和糖类。作为本发明诊断剂的特异性结合部分的例子包括抗原结合结构域、生长因子、配体或寡核苷酸。

[0072] 在多个实施方案中，本发明的运载体包含放射性物质。例如，本发明的放射性物质可选自但不限于3H、14C、32p、33p、35S、123I、125I和131I。治疗方法

[0073] 如上文所述，根据本发明的治疗方法施用治疗有效量的运载体，如上文所描述，从而以治疗疾病为目的细胞内递送治疗剂至个体。在多个实施方案中，本发明的方法治疗过度增殖性病症。如本文所理解的，“过度增殖性病症”指以细胞的异常或病理性增殖为特征的病症，例如包括但不限于肿瘤、癌症、瘤性组织和其他恶化前的和非肿瘤的或非恶性的过度增殖性病症。可通过本发明治疗的肿瘤、癌症和瘤性组织的例子包括但不限于恶性病症，如乳腺癌、骨肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤和其他肉瘤；白血病；淋巴瘤；窦瘤；卵巢、尿道、膀胱、前列腺和其他泌尿生殖系统癌症；结肠、食道和胃癌以及其他胃肠癌症；肺癌；骨髓癌；胰腺癌；肝癌；肾癌；内分泌相关癌症；皮肤癌；以及脑或中枢和周围神经系统(CNS)恶性或良性的肿瘤，包括神经胶质瘤和成神经细胞瘤。

[0074] 恶化前的和非瘤性或非恶性的过度增殖性病症的例子包括但不限于骨髓增生病症；子宫颈原位癌；家族性肠息肉病如加德纳综合征；口腔粘膜白斑病；组织细胞增生症；瘢痕瘤；血管瘤；过度增殖性动脉狭窄、炎性关节炎；表皮角化病和包括关节炎在内的鳞屑状出疹。也包括病毒引起的过度增殖性疾病，如疣和EBV诱导的疾病(即传染性单核细胞增多症)、疤痕形成等。本文公开的治疗方法可用于已知或怀疑携带有本文所定义的过度增生性病症或具有发展成本文所定义的过度增生性病症的风险的任何对象。

[0075] 在本文中使用时，过度增生性病症的“治疗”指的是杀死、抑制或减缓过度增殖细胞团或群的生长或尺寸增加或者肿瘤或癌生长减少过度增殖细胞的数量，或者防止散布到其他解剖学部位，以及降低过度增殖性生长大小或过度增殖细胞数量的方法。“治疗”也包括通过递送诊断剂至靶细胞以允许用本领域已知的检测方法来鉴定靶细胞的过度增殖性病症的诊断。如本文所使用的，“治疗”不一定意在暗示治愈或完全消除过度增生性生长。如本文所使用的，治疗剂的治疗有效量是指这样的量，其有效地导致杀死过度增殖细胞、减缓过度增殖细胞的生长速率、降低过度增殖细胞团的大小、或减少过度增殖细胞的数量以及其组合。

[0076] 本发明的治疗方法还包括联合治疗，其包括以下实施方案：其中本发明的两种或更多种运载体分别包含不同治疗剂或治疗剂组合，且共施用患者。在另一些实施方案中，本发明的运载体或本发明运载体的组合可以与另一种治疗联合施用。除了与任何药物(包括上文所提供的药物和药物类别)共施用之外，本发明的运载体也可以与其他类型的治疗联合施用，如辅助治疗和新辅助治疗(如，在主要治疗(primary therapy)之后进行的治疗来增加长期无病生存的机会)、生物治疗(如，免疫疗法、生物疗法或生物反应调节物疗法)、骨髓移植和外周血干细胞移植、癌症疫苗治疗、冷冻手术、基因治疗、激素治疗、激光疗法(如，高强度光来治疗癌症)、光动力疗法、放射治疗、预防性乳房切除手术、放射治疗、或其他本领域技术人员已知的靶向癌症疗法。

[0077] 术语“治疗”还包括通过将诊断标记物运进细胞内部区室来诊断疾病的组合物和方法。更特别的说，可以通过连接到本领域的技术人员认为对于通过本发明的方法检测和诊断的特定疾病来说是合适的可检测标记物部分(例如荧光标签、电子致密物、报告部分、特异性或非特异性结合部分、放射性或其他本领域已知的可检测部分)对本发明的运载体进行可检测标记。为诊断目的而施用的本发明运载体的量应包含用于既定目的的有效量诊断标签。此量可根据经验来确定，且在领域内也是公知的。

[0078] 诊断方法

[0079] 在多个实施方案中，用诊断标记物标记本发明运载体的胱氨酸组分，而在另一些实施方案中，用诊断标记物标记所述运载体的货物组分。在另一些实施方案中，用相同或不同的诊断标记物标记所述运载体的胱氨酸和货物组分。

[0080] 可应用本发明诊断方法的组织的例子包括但不限于：癌细胞，其包括中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、肝癌、肺、头颈癌、淋巴癌、白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肾肿瘤、肉瘤、结肠和其他胃肠癌、转移(metastases)和黑素瘤。更详细的说，本发明可应用于肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、眼癌；白血病，如急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓细胞性白血病(原粒细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)；慢性白血病(慢性骨髓性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏疾病和非霍奇金氏疾病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血病以及重链病。

[0081] 可用于实施本发明的检测方法包括但不限于磁共振、超导量子干涉器件(squid)、光学成像、正电子放射断层成像技术、平面闪烁扫描或单光子发射计算机化断层成像(SPECT)。其他可替代的检测方法包括gamma计数、闪烁计数、扫描射线成像(scanning radiogram)、密度计量、荧光照相以及电子显微镜成像。这些检测方法可在施用本发明的肽复合物之后的诊断或成像中或在诊断或成像后的一段有效时间间隔后使用。这样的有效时间间隔在本领域内是公知的，或者能够通过使用例如本文所公开的方法的常规实验所确定。

[0082] 制剂

[0083] 如上文所描述，根据需要，本发明的运载体可配制成药物剂量形式并施用于需要治疗的对象，例如哺乳动物，如人患者，其为适于所选施用途径的多种形式，例如，经口、经胃肠、经粘膜、经皮肤、胃肠外、静脉内、肌内、皮下、皮内、关节内、鞘内以及通过输注(infusion)或注射的腹膜内，包括用本领域技术人员可利用的泵进行的连续输注或间歇输注或者直接注射进过度增殖性组织或细胞。

[0084] 所述药物组合物可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，可以被压成片剂，或者可直接与患者的食物合并。对于经口治疗施用，本发明的运载体可与一种或更多种赋形剂组合，并且以可摄取片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片(wafer)等形式使用。本发明的运载体可以与细惰性粉末载体组合并被对象吸入或吹入。

[0085] 片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下：粘合剂例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸氢钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或调味剂如胡椒薄荷、冬青油、或樱桃调味剂可以添加。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可包含液态载体(carrier)，例如植物油或聚乙二醇。多种其它材料可以以包衣形式存在或者以其他方式修饰固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等进行包衣。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果攘作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂如樱桃或橙子香料。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是可药用的，并且在所用的量上是基本上无毒的。此外，本发明的运载体可加入到持续释放制剂和装置中。

[0086] 本发明运载体的溶液可在水中制备，可选地与无毒的表面活性剂混合。分散体也可在甘油、液态聚乙二醇、乙酸甘油酯和其混合物以及在油中制备。在储存和使用的常规条件下，这些制剂可含有防腐剂来防止微生物的生长。

[0087] 适合于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其包含适于临时制备无菌注射或输注溶液或分散体的的本发明运载体。不论什么情况，最终的剂型应为无菌的、流动的且在制造和储存环境下稳定的。液态载体可以是溶剂或液态分散介质，包括如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯和其合适的混合物。适当的流动性可通过下述方式维持，例如：i)如果本发明运载体的货物包含脂质体，则为脂质体的形成；(ii)在分散体或通过使用表面活性剂的情况下，通过维持所需的微粒尺寸。可通过多种抗菌剂和抗真菌剂发生(例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来防止微生物的作用。在许多情况下，包含等渗剂(例如，糖类、缓冲液或氯化钠)是优选的。可通过在组合物中使用延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)来产生可注射组合物的延长吸收。

[0088] 根据需要，通过将合适溶剂中所需量的本发明运载体与上面列举的其他成分合并然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其生成活性成分的粉末加之前无菌过滤溶液中存在的任何其他所需成分的粉末。

[0089] 对于表面(topical)施用来说，本发明的运载体可以以纯的形式应用。然而，将它们以与皮肤可接受的载体(carrier)(其可以是固体或液体)相组合之制剂的形式施用于皮肤通常是理想的。有用的固体载体包括细颗粒固体，如云母、黏土、微晶纤维素、硅石、氧化铝等。其他固体载体包括无毒的聚合纳米颗粒或微粒。有用的液体载体包括水、醇或乙二醇或水／醇／乙二醇混合物，其中本发明的运载体可以以有效水平溶解或分散，可选地借助于无毒表面活性剂。可加入例如芳香剂和额外抗微生物剂的助剂以优化给定应用的性质。所得的液体组合物可从吸收垫(absorbent pad)应用，用以浸渗绷带和其他敷料，或者使用泵式或气溶胶喷雾器喷在受影响区域。

[0090] 为了直接施用于使用者的皮肤，还可将增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质与液态载体一起使用以形成可涂布的糊剂、凝胶、膏、皂等。可用来向皮肤递送本发明运载体的有用皮肤病学组合物的实例是本领域已知的；例如，见Jacquet et al.(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)Smithet a1.(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。

[0091] 可以通过比较本发明运载体的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定它们的有用剂量。将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，见美国专利号4,938,949。治疗需要的本发明运载体的量随所选的特定治疗剂、组合物(如果有组合物的话，其包含治疗剂)、施用途径、治疗病况的性质及患者年龄和状况而变化，并且最终会由住院医师(attendant physician)或临床医师决定。

[0092] 治疗有效量可通过本领域技术人员已知的常规过程根据经验来确定。参见，如，The Pharmacological Basis0f Therapeutics，Goodman and Gilman，eds.，Macmillan Publishing Co.，New York。例如，最初可在细胞培养测定或合适的动物模型中估计有效剂量。动物模型也可用来确定合适的浓度范围和施用途径。然后这类信息可用来确定在人中的有用剂量和施用途径。也可通过可比较的治疗剂的剂量类推的方法来选择治疗剂量。

[0093] 特定的施用模式和给药方案会由主治医师考虑病例的细节(如对象、疾病、有关的疾病状态以及治疗是否是预防性的)来选择。治疗可以涉及数天至数月或者甚至几年时间段内每日或每日多次(multi-daily)化合物的剂量。

[0094] 实施例

[0095] 实施例1.装载柔红酶素(DNR)的脂质体的制备

[0096] 通过薄膜水化法由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和胆固醇12∶1∶5比例总重20mg的脂质混合物制备脂质体。脂质混合物溶解于5至8ml的氯仿中，然后于室温真空条件在圆底烧瓶中旋转蒸发来产生薄脂质膜。向产生的脂质膜添加2至3ml的缓冲溶液，其为20mM的硼酸钠和0.15M的NaCl，pH为8.4。使经缓冲的溶液与脂质膜一起放置15分钟。然后将经缓冲的溶液-脂质膜混合物涡旋混合，通过超声匀浆2分钟，然后用迷你挤出器通过具有100nm WhatmanTM柱孔滤膜(GE Healthcare)的聚碳酸酯膜挤出10次。在挤出工序进行完后，脂质体溶液在-80℃冷冻并冻干。然后冻干的空脂质体在-20℃储存直至使用。

[0097] 通过以下方式用DNR装载空脂质体：将11.56mg已经溶解于500μl无菌PBS中的柔红霉素盐酸盐添加至冻干的脂质体粉末，在37℃孵育DNR-脂质体混合物1小时，然后将无菌PBS中的混合物稀释到总体积为2ml，以及在37℃额外孵育1个小时。在脂质体-DNR混合物中的最终DNR浓度为10mM。通过用移液器抽吸来混合脂质悬液从而分散脂质体，随后以13,000rpm离心40分钟来移除未包裹的DNR。在离心步骤后，上清液被移除然后向沉淀中加入
2ml的无菌PBS，通过移液器抽吸对沉淀进行重悬浮。

[0098] 通过使用Nicomp TM380微粒粒径检测仪(Particle Sizing Systems，Santa Barbara，CA)测量DNR-脂质体颗粒的尺寸。为了制备用于尺寸测量的脂质体，将1mg的脂质体DNR在1mlPBS中进行超声处理大约1-2分钟，然后用PBS稀释至体积为2ml。然后，根据厂家说明通过NicompTM微粒粒径检测仪测量PBS悬浮的脂质体。

[0099] 通过直接测量脂质体中的DNR来评估在特定脂质体DNR制剂中的DNR量，测量通过在455nm 波长使用UV-VIS分光光度计(UVShinandzu)以及将吸光度与吸光度相对DNR浓度的标准曲线来进行，其显示在图4中。基于DNR-脂质体制剂中存在的DNR量，然后根据下式计算包裹效率：包裹效率(％)=Ft／Fi×100，其中Ft是在氯仿∶甲醇∶水(2∶1∶0.05)组成的有机溶剂混合物中溶解后脂质体中DNR的浓度，而Fi是在包裹前DNR在介质中的初始浓度。通常，脂质体DNR的包裹效率为20％至25％。

[0100] 实施例2.胱氨酸脂质体DNR的制备

[0101] 如在实施例1中所描述，通过挤出步骤制备了空脂质体。在挤出脂质体后，将4ml的0.6M高碘酸钠溶液添加到脂质体悬液中，于黑暗中将混合物放置使之反应30分钟。这个步骤氧化了脂质体表面的糖脂部分。在高碘酸钠反应步骤后，将高碘酸钠-脂质体混合物装入透析管(M.W14,000KD，Spectrum labs)中，在4℃相对于水透析12小时以此来移除任何未反应的高碘酸钠。通过如下所述进行的还原胺化反应将胱氨酸分子缀合到t高碘酸盐氧化的脂质体表面。首先，将60mg的胱氨酸溶解在如实施例1描述的经缓冲溶液中(20mM硼酸钠和
0.1SM NaCl，pH为8.4)至10mg／ml浓度。将透析后的脂质体悬液和胱氨酸溶液混合并放置使之反应以形成希夫碱(Schiff-base)。然后，将每ml混合物10μl的2M氰基硼氢化硼(cyanoboronhydride)溶液被加入到脂质体悬液-胱氨酸溶液混合物中，总混合物放置在室温下过夜反应，接下来使用14,000KD M.w透析管在4℃再一次针对水透析12小时来除掉未缀合的胱氨酸。透析后的脂质体悬液在-80℃冷冻并在冷冻干燥机中冻干。冻干的空胱氨酸缀合脂质体在-20℃储存并在使用前重构。如实施例1中针对脂质体的DNR装载所述地，进行胱氨酸-脂质体的DNR装载步骤以及颗粒粒径和DNR装载效率分析。通常，胱氨酸脂质体DNR的包裹效率为15％至20％。

[0102] 实施例3.添加游离DNR、脂质体DNR或胱氨酸脂质体DNR后DNR的细胞摄取[0103] 使用荧光激活细胞分选术(FACS)和荧光显微镜法检测经游离DNR、脂质体DNR或胱氨酸脂质体DNR处理的A549人肺癌细胞系细胞中的荧光化合物DNR。A549细胞高度表达xc-转运蛋白，因此，非常适合胱氨酸介导的摄取研究(Gatti&Zunino，2005)。A549细胞在补加有10％热灭活的FBS和1％抗生素(青霉素／链霉素)的RPMI1640培养基中于37℃5％二氧化碳的潮湿气氛下在25cm2组织培养瓶中进行培养。根据标准的组织培养程序以单层形式培养A549细胞并每周进行两次传代直到细胞用于实验。

[0104] 对于DNR摄取实验，如上文所述，对在25cm2组织培养瓶中培养的A549细胞进行胰蛋白酶消化、洗涤并通过将悬浮在2ml RPMI1640培养基的3×105个细胞放置在每个孔中重新接种入6孔组织培养板，所述培养基补加有10％热灭活的FBS和1％抗生素。在上文描述的培养环境下使细胞休息24小时后，用下面的方式处理细胞。通过向培养基加入下面的DNR制剂对一式三份的孔进行处理：1)含10μM DNR的胱氨酸脂质体DNR；2)含5μM DNR的胱氨酸脂质体DNR；3)含10μM DNR的脂质体DNR；4)含5μM DNR的胱氨酸脂质体DNR；5)10μM的游离DNR；以及6)5μM的游离DNR。将细胞与DNR制剂一起在37℃5％二氧化碳的潮湿气氛下孵育5小时。
然后用FACS和荧光显微镜法来确定细胞的DNR摄取。

[0105] FACS分析。在用游离DNR、脂质体DNR或胱氨酸脂质体DNR处理A549细胞结束后，孔内的培养基被抽出以及用无菌PBS溶液洗涤。为了使细胞脱离瓶，将100μl至200μl的胰蛋白酶(0.25％w／v)添加至细胞，将细胞在胰蛋白酶溶液中孵育大约1至3分钟，其后将1ml的生长培养基添加到每个孔中来停止胰蛋白酶反应。将每个孔中的所得细胞悬液以2000rpm在4℃离心3分钟。抽出上清液，然后将细胞沉淀在500μl的无菌冰冷的PBS溶液中重悬浮。然后，将细胞悬液转移至无菌聚苯乙烯管中。通过检测FL3通道的荧光信号来量化DNR的细胞摄取。也确定了平均荧光强度值。未接收DNR或脂质体的A549细胞用作阴性对照。图5A显示了不同形式DNR制剂的平均荧光强度(MFI)。细胞DNR摄取表示为相对于10μM游离DNR的不同形式DNR制剂的平均荧光强度。显示了平均值和S.E.M(平均标准误差)(＊＊＊p<0.001为胱氨酸-脂质体DNR相对游离DNR于5μM和10μM浓度下，n=3；+++p<0.001为胱氨酸-脂质体DNR相对脂质体于5μM和10μM浓度下)。与用来计算图5A所示MFI的荧光强度相关联的细胞计数的数量分别在图5B和图5C中对于10μM和5μM DNR的量以图(histogram)的形式报告。用两因素ANNOVA和单因素ANOVA来确定统计比较，并分别使用Bonferonni事后检验和Tukey事后检验进行配对分析。使用Graphpad Prism TM5(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)进行全部计算。P值小于0.05的差异被认为是统计学上显著的。

[0106] 荧光显微镜法。在用游离DNR、脂质体DNR或胱氨酸脂质体DNR处理A549细胞结束时，在A549细胞中通过荧光显微镜分析观察细胞内DNR。用荧光显微镜在亮光或加了绿色滤镜的荧光下观察细胞。对于荧光成像，获取了用天然荧光药物DNR染色的细胞图像。通过使TM用NikonEclipse Ti系列倒置显微镜(Nikon Instruments，Inc.Melville，NY)分析DNR的荧光，以及通过使用NIS ElementsTM 软件(Nikon Instruments，Inc.Melville，NY)获取图像。

[0107] 与上述FACS的结果、分析相一致的，相比于用游离DNR或脂质体DNR处理的细胞，用胱氨酸脂质体DNR处理的细胞中荧光显微图像显示相对高的荧光。而且，与游离DNR的荧光相比，脂质体DNR的荧光未显示任何差异。荧光显微和流式细胞仪数据也一致，其显示与脂质体DNR和游离DNR相比胱氨酸脂质体DNR的细胞摄取增强。对于分别用游离DNR、脂质体DNR或胱氨酸脂质体DNR形式的10μM和5μM DNR处理的细胞的荧光显微图像，参见图6A和图6B。

[0108] 实施例4.用谷氨酸预处理细胞抑制胱氨酸介导的从胱氨酸脂质体DNR之DNR细胞摄取

[0109] 为了证明xc-转运蛋白在从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取中所起的潜在作用，在引入胱氨酸脂质体DNR前用谷氨酸(其是通过xc-转运蛋白摄取胱氨酸的特异性抑制剂)预处理A549细胞。为了进行这些摄取抑制研究，将A549细胞一式三份地放在6孔板的孔中，并用包含10μm或5μm量DNR的胱氨酸脂质体DNR进行处理，如上文实施例3所述，区别仅在于在引入DNR制剂前用5mM浓度的谷氨酸(Sigma-Aldrich)预处理30分钟。DNR摄取的FACS分析根据实施例3中描述的方案进行。FACS分析的结果显示用5mM谷氨酸预处理在分别用10μM和5μM胱氨酸脂质体DNR形式的DNR处理的细胞中减少了大约1.3至2.1倍的DNR细胞摄取。参见图7A，其显示了谷氨酸未处理和处理的10μM和5μM胱氨酸脂质体DNR的DNR荧光的MFI，其中细胞DNR摄取表示为相对于以用10μM游离DNR处理的A549细胞为基础的荧光强度。在这些谷氨酸处理研究中，细胞计数相对于荧光强度之间的关系针对用含10μM和5μM DNR的胱氨酸脂质体DNR处理的A549细胞在图7B和7C中分别显示。

[0110] 实施例5.低温对胱氨酸脂质体DNR之DNR细胞摄取的影响。

[0111] 检测了低温对从胱氨酸脂质体DNR之DNR细胞摄取的影响，以确定胱氨酸脂质体DNR的摄取是否是能量依赖性内吞过程。为了进行这些温度研究，将A549细胞一式三份地放在6孔板的孔中，并用包含10μM或5μM量DNR的胱氨酸脂质体DNR进行处理，如上文实施例3所述，区别仅在于对于受到低温的细胞，在4℃进行与装载了DNR的胱氨酸脂质体制剂一起的5小时孵育。DNR摄取的FACS分析根据实施例3中描述的方案进行。如图8A和8B中用10μM和5μM装载了DNR的胱氨酸脂质体制剂处理的A549细胞分别所示的，与在37℃条件下相比，在4℃条件下DNR的摄入减少了。因此，这些数据提出从胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取是能量依赖性过程。

[0112] 实施例6.抑制胞膜窖介导型内吞对从胱氨酸脂质体DNR之DNR细胞摄取的影响。

[0113] 考虑到实例5描述的低温研究提出从胱氨酸脂质体DNR中摄取DNR涉及内吞，接下来进行下述DNR摄取研究：检验内吞作用特定机制的某些抑制物抑制从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取之能力的研究。这些研究首先尝试确定从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取机制是否包含胞膜窖(caveolae)介导的内吞作用。更特别地，细胞松弛素(cytochalastin)D(胞膜窖介导的内吞作用的特异性摄取抑制物)用于在与胱氨酸脂质体DNR一起进行细胞培养前处理A549细胞。为了进行这些摄取抑制研究，将A549细胞一式三份地放在6孔板的孔中，并用包含10μM或5μM量DNR的胱氨酸脂质体DNR进行处理，如上文实施例3所述，区别仅在于在引入DNR制剂前用100μM浓度的细胞松弛素D(Sigma-Aldrich)对细胞预处理30分钟。DNR摄取的FACS分析根据实施例3中描述的方案进行。

[0114] FACS分析的结果显示用100μM的细胞松弛素D进行预处理并未显著地减少经10μM或5μM的胱氨酸脂质体DNR处理细胞的DNR细胞摄取。参见图9A，其显示了在细胞松弛素D未处理和处理的已接受10μM或5μM胱氨酸脂质体DNR的A549细胞中的DNR荧光MFI。更特别地，单因素方差分析(ANOVA)显示DNR的相对平均荧光强度显示处理的显著性差异(F3，8=588.73；P<0.001)。进一步用Tukey事后检验分析图9A中的数据，显示对于两种浓度(10μM和
5μM)，相比于未处理的胱氨酸脂质体DNR，经细胞松弛素处理的胱氨酸脂质体DNR的相对平均荧光强度没有显著性差异。相比于经细胞松弛素D预处理的细胞对从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取，从单独施用的胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取也没有任何差异，无论是加入10μM还是5μM量的DNR。参见图9B和9C。

[0115] 实施例7.抑制网格蛋白介导的内吞作用对从胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取的影响。

[0116] 接着实施例6中关于鉴定从装载了DNR的胱氨酸脂质体的DNR细胞摄取中所涉及内吞机制的讨论，氯丙嗪(网格蛋白介导的内吞作用的特异性抑制物)用于下述DNR摄取研究中以确定从胱氨酸脂质体DNR之DNR摄取机制是否包括网格蛋白介导的内吞作用。通过将A549细胞一式三份地放在6孔板的孔中进行这些研究，并用包含10μM或5μM量DNR的胱氨酸脂质体DNR处理，如上文实施例3所述，区别仅在于在引入DNR制剂前用100μg／ml浓度的氯丙嗪(Sigma-Aldrich)将细胞预处理30分钟。DNR摄取的FACS分析根据实施例3中描述的方案进行。

[0117] FACS分析的结果显示用10μg的氯丙嗪进行预处理仅引起经10μM的胱氨酸脂质体DNR处理的细胞中DNR细胞摄取的轻微减少，并且在经5μM的胱氨酸脂质体DNR处理的细胞中DNR摄取未显著减少。参见图10A，其显示了在细胞松弛素D未处理和处理的已接受10μM或5μM胱氨酸脂质体DNR的A549细胞中的DNR荧光MFI。单因素方差分析显示DNR的相对平均荧光强度显示处理的显著性差异(F3，8=85.74；P<0.001)。用Tukey事后检验对图10A中数据的进一步分析显示与10μM的胱氨酸脂质体DNR相比，氯丙嗪处理的10μM胱氨酸脂质体DNR的相对平均荧光强度有轻微显著增加(P<0.05)。相比于经氯丙嗪预处理的细胞对从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取，从单独施用的胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取没有任何差异，无论是添加10μM还是5μM量的DNR。参见图10B和10C。

[0118] 实施例8.抑制大胞饮对胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取的影响。

[0119] 接着实施例6中关于鉴定从装载了DNR的胱氨酸脂质体的DNR细胞摄取中所涉及内吞机制的讨论，阿米洛利(大胞饮的特异性抑制物)用于下述DNR摄取研究以确定从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取机制是否包括大胞饮。通过将A549细胞一式三份地放在6孔板的孔中进行这些研究，并用包含10μM或5μM量DNR的胱氨酸脂质体DNR处理，如上文实施例3所述，区别仅在于细胞在引入DNR制剂前用3mM浓度的阿米洛利(Sigma-Aldrich)预处理30分钟。DNR摄取的FACS分析根据实施例3中描述的方案进行。

[0120] FACS分析的结果显示用3mM的阿米洛利进行预处理引起经10μM或5μM的胱氨酸脂质体DNR处理的细胞的DNR细胞摄取显著减少。参见图11A，其显示了在细胞松弛素D未处理和处理的已接受10μM或5μM胱氨酸脂质体DNR的A549细胞中的DNR荧光MFI。单因素方差分析显示DNR的相对平均荧光强度表现出处理之间的显著性差异(F3，8=98.53；P<0.001)。用Tukey事后检验对图11A中数据的进一步分析显示经10μM胱氨酸脂质体DNR处理的细胞在还经阿米洛利预处理时相比于仅接受胱氨酸脂质体DNR时相对平均荧光强度显著减少(P<0.05)。经5μM胱氨酸脂质体DNR处理的细胞在还经阿米洛利预处理时相比于仅接受胱氨酸脂质体DNR时相对平均荧光强度也显著减少。图11b和11C以图形式显示了，相比于仅仅经胱氨酸脂质体DNR处理的细胞，经阿米洛利预处理的分别经10μM或5μM胱氨酸脂质体DNR处理的细胞的DNR细胞摄取减少(所用数据来自n=3中最好的)。

[0121] 实施例9.去除细胞膜胆固醇对从胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取的影响。

[0122] 接着实施例6中关于鉴定从装载了DNR的胱氨酸脂质体的DNR细胞摄取中所涉及内吞机制的讨论，制霉菌素(nystatin)(抑制胆固醇依赖性细胞摄取的药物)用于下述DNR摄取研究中以确定从胱氨酸脂质体DNR的DNR摄取机制是否涉及细胞膜胆固醇。通过将A549细胞一式三份地放在6孔板的孔中进行这些研究，并用包含10μM或5μM量DNR的胱氨酸脂质体DNR处理，如上文实施例3所述，区别仅在于细胞在引入DNR制剂前用100μg／ml浓度的制霉菌素(Sigma-Aldrich)预处理30分钟。DNR摄取的FACS分析根据实施例3中描述的方案进行。

[0123] FACS分析的结果显示用100μg／ml的制霉菌素进行预处理未引起经10μM DNR，或5μM的胱氨酸脂质体DNR处理细胞的DNR细胞摄取的显著减少。参见图12A，其显示了在制霉菌素未处理和处理的已接受10μM或5μM胱氨酸脂质体DNR的A549细胞中的DNR荧光MFI。单因素方差分析显示DNR的相对平均荧光强度表现出处理之间的显著性差异(F3，8=271.8；P<0.001)。用Tukey事后检验对图12A中数据的进一步分析显示用10μM胱氨酸脂质体DNR处理的细胞在还经制霉菌素预处理时相比于仅接受胱氨酸脂质体DNR的相对平均荧光强度无显著性差异。另外，显示了，相比于仅经10μM胱氨酸脂质体DNR处理的细胞，经制霉菌素预处理的经10μM胱氨酸脂质体DNR处理的细胞的相对平均荧光强度有轻微显著减少(p<0.05)。图
12B和12C显示了，相比于仅仅经胱氨酸脂质体DNR处理的细胞，经制霉菌素预处理的从10μM或5μM胱氨酸脂质体DNR的DNR细胞摄取轻微减少。

[0124] 实施例10.用胱氨酸脂质体DNR处理后的DNR介导细胞毒性

[0125] 因为DNR是细胞毒性化合物，所以通过依靠细胞毒性测量以作为DNR摄取的度量从而评估胱氨酸脂质体DNR作为细胞内递送系统的有效性。胱氨酸脂质体DNR的对照包括游离DNR和不包含胱氨酸的脂质体DNR。如下所示在A549细胞中测量细胞毒性：向细胞内加入前述DNR制剂，接着经过一段孵育期，之后通过使用MTS测定来测量细胞毒性。简要地说，MTS检测是四唑化合物(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑，内盐；MTS)和电子耦合试剂吩嗪硫酸甲酯(PMS)的非放射性细胞增殖检测。MTS被细胞利用代谢活性细胞中存在的还原酶生物还原为甲躜化合物。甲躜化合物的吸光度可在490nm波长下测量，且直接与活细胞数量成比例。使用剂量反应曲线确定IC50来测定毒性。
IC50是将细胞的光吸收能力降低50％所需的检测化合物的浓度。

[0126] 通过将20％MTS和1％PMS溶液在体积为8ml的RPMI1640培养基中混合来制备MTS试剂。在从孔中去除生长培养基之后，将100μl这种所制备的MTS试剂加入到每个孔中，并于37℃5％CO2的潮湿气氛下孵育4小时。活细胞将MTS还原成有色的甲躜产物并且其溶解于培养基中。甲躜的量在490nm波长下进行测量。

[0127] 通过以下方式产生装载了DNR的脂质体制剂的剂量-反应曲线：将悬浮在100μl RPMI1640培养基的5×103个细胞放置在96孔板的每个孔中，并于37℃5％CO2的潮湿气氛下孵育24小时。孵育后，如实施例4所描述，细胞用5mM的胱氨酸摄取抑制物谷氨酸预处理30分钟。谷氨酸添加的对照孔用仅仅50μl的RPMI培养基代替。在37℃5％CO2的潮湿气氛下孵育半小时。装载了DNR的胱氨酸脂质体、游离DNR和脂质体DNR被连续稀释使得稀释系列的最终DNR浓度整体为2.5μM DNR、5μMDNR、10μM DNR和15μM DNR，其以200μl／孔悬浮在3个重复孔中72小时。培养板每边的第一行未装有细胞并不在检测中使用，而是代之以装入100μl的TMPBS来减少任何污染或蒸发。剂量反应曲线使用Prism 软件(San Diego，CA)来绘制。每个实验都独立进行两次。IC50数据在图13A中进行了报告。图13B显示了在用游离DNR、脂质体DNR或胱氨酸脂质体DNR处理72小时后A549细胞的存活。

[0128] 表1显示了对于游离DNR、胱氨酸脂质体DNR和装载了DNR的脂质体的IC50浓度。游离DNR、脂质体DNR和胱氨酸脂质体DNR的IC50浓度分别为15.25μM、10.25μM和4.44μM。也可参见图13A。脂质体DNR的IC50比游离DNR的IC50低1.5倍，这意味着脂质体DNR比游离DNR更有细胞毒性。胱氨酸脂质体DNR的IC50分别比游离DNR的IC50和脂质体DNR低3.5倍和2.3倍，这与细胞毒性的增加相关。

[0129] 当如实施例4所描述的用5mM谷氨酸预处理A549细胞时，胱氨酸脂质体DNR的IC50浓度显著增加。参见表1和图14A。图14B中所示图显示在不存在和存在5mM谷氨酸预处理的情况下经10μM和5μM浓度的游离DNR、脂质体DNR和胱氨酸脂质体DNR处理的细胞的存活。＊＊＊p<.0.001是5μM的胱氨酸脂质体DNR相对于5μM的胱氨酸脂质体+谷氨酸。

[0130] 表1

[0131]

[0132] 两因素方差分析显示浓度的显著性作用(F1，12=25.99；p<0.001)以及游离DNR、装载了DNR的脂质体和装载了DNR的胱氨酸脂质体制剂的显著性作用(F2，12=49.52；p<0.001)。在以脂质体DNR形式加入的DNR量与细胞存活之间无显著相关性。特别地，在用脂质体DNR制剂处理72小时后，0.0001、2.5、5、10和15μM浓度的脂质体DNR对A549细胞的细胞存活也没有影响。参见图15。在脂质体DNR与游离DNR之间对于两个浓度(10μM和5μM)也有显著性差异(p<0.05)。

[0133] 实施例11.斑马鱼研究

[0134] 胱氨酸脂质体DNR体内递送DNR的能力通过在允许摄取胱氨酸脂质体DNR或脂质体DNR的咽囊期斑马鱼胃肠道内追踪DNR进行评估。图16A中的箭头指向保持在斑马鱼胃内的DNR。

[0135] 实施例12.体内肿瘤研究

[0136] 考虑到SLC7A11在胰腺、肺、前列腺和胃来源的癌细胞中上调的事实，如下所述实施胱氨酸脂质体DNR递送DNR至肿瘤细胞的潜能。雌性的C57BL/6J野生型8周龄小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。动物在无病原体设施中饲养，其可以随意地接近食物和水，而在其被纳入研究之前使其顺应(acclimate)一个星期。通过使用27号针皮下注射1×106同系胰腺肿瘤细胞系(Pan02，NCI，Frederick，MD)细胞至小鼠的右胁来建立皮下肿瘤。
当肿瘤变地可触及时，将小鼠随机分入n=7的5个处理组。每组小鼠肿瘤尺寸的范围是相当的。在研究的第一天，五组小鼠在尾静脉中分别注射入：1)盐水；2)游离的5mg DNR/kg体重；
3)脂质体DNR(5mg DNR/kg体重)；4)胱氨酸脂质体DNR(5mg DNR/kg体重)；或5)PEG化胱氨酸脂质体DNR(5mg DNR/kg体重)。肿瘤大小自处理那天起每2至3天进行测量，共17天，测量使用数字游标卡尺在两个维度上进行。在本检测的第20天处死小鼠，且肿瘤再一次进行测量。
2
肿瘤体积用下面的公式进行计算：V=π／6x L x w ，其中L=最长尺寸，而w=最短尺寸。所有数据用两因素方差分析和Bonferroni事后检验进行分析来在组间进行比较(n=7)。

[0137] 与用脂质体DNR或非包裹(游离)DNR处理相比，用胱氨酸脂质体DNR处理肿瘤显著地减小了动物体内的肿瘤尺寸。见图17A-C。PEG化胱氨酸脂质体DNR获得甚至更加显著的肿瘤尺寸减小。添加PEG化胱氨酸脂质体DNR的PEG组分来避免吞噬细胞的识别。通过使用后插入技术(post insertion technique)制得PEG化胱氨酸脂质体。简要的说，将1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE)-mPEG2000(Avanti Polar Lipids Inc.Alabaster,AL，USA)的溶液与胱氨酸脂质体混合，并放置孵育几个小时以使得将DSPE-mPEG2000插入到预先形成的脂质体中。悬液然后使用LIPEX挤出器挤出12次、冻干并在-80℃下冷冻直至使用。

[0138] 在测量肿瘤时也进行体重的测量，其用来作为动物整体健康的指标。如在整个研究过程中基于小鼠体重所进行的判断，脂质体制剂(即脂质体DNR、胱氨酸脂质体DNR和PEG化胱氨酸脂质体DNR)的副作用与游离DNR的副作用相比是减小的。参见图17D。

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