癌症治疗
阅读：386发布：2020-05-12
专利汇可以提供癌症治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及含有包被的奥沙利铂(oxaliplatin)的脂质体和包被的奥沙利铂的制备方法。本发明也涉及包含奥沙利铂和另一抗癌药物的脂质体。本发明的脂质体用于 癌症 治疗 。，下面是癌症治疗专利的具体信息内容。
1、一种用于形成包含奥沙利铂的胶团的方法，所述方法包括将有效量的 奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂是乙醇，并以20-40％存 在。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其中所述带负电荷的磷脂酰甘油脂 是二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二己酰磷 脂酰甘油(DCPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或二油酰磷脂酰甘油 (DOPG)。
4、根据权利要求3所述的方法，其中所述带负电荷的磷脂酰甘油脂是 DPPG。
5、根据前述权利要求所述的方法，其中奥沙利铂与带负电荷的磷脂酰甘 油脂的摩尔比是1:1到2:1。
6、一种将奥沙利铂包被进脂质体的方法，其包括将权利要求1-5任一项 限定的奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
7、根据权利要求6所述的方法，其中所述预形成的脂质体或脂类包括带 负和/或正电荷脂类。
8、根据权利要求7所述的方法，其中所述脂类是磷脂或其衍生物。
9、根据权利要求8所述的方法，其中所述脂类是DDAB：二甲基双十八 烷基溴化铵；DMRIE：N-[1-(2，3-二肉豆蔻基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羟 乙基)溴化铵；DMTAP：1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷；DOGS：双十八 烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP：N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯 化铵；DOTMA：N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵；DPTAP： 1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷或DSTAP：1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙 烷。
10、根据权利要求7所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种胆固 醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰胆碱或神经酰胺。
11、根据权利要求10所述的方法，其中所述预形成的脂质体进一步包括 铵盐。
12、一种将奥沙利铂包被进脂质体的方法，其包括以下步骤：
e)将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合，形成包 含奥沙利铂的胶团，和
f)将所述奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
13、根据权利要求12所述的方法，其中所述溶剂是乙醇，并以20-40％ 存在。
14、根据权利要求12或13所述的方法，其中所述带负电荷的磷脂酰甘 油脂是DPPG、DMPG、DCPG、DSPG或DOPG。
15、根据权利要求14所述的方法，其中所述带负电荷的磷脂酰甘油脂是 DPPG。
16、根据权利要求12-15任一项所述的方法，其中奥沙利铂与带负电荷 磷脂酰甘油脂的摩尔比是1:1到2:1。
17、根据权利要求6-16任一项所述的方法，其进一步包括用聚合物包衣 脂质体膜的表面。
18、根据权利要求17所述的方法，其中配基与所述聚合物轭合。
19、根据权利要求18所述的方法，其中所述配基能使所述脂质体指向具 有可被所述配基识别的表面受体的特定细胞类型。
20、根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述配基是肽。
21、根据权利要求19所述的方法，其中所述配基选自表皮生长因子或其 表位、内皮他丁、抗凝血酶、anastellin、血管他丁、PEX或色素上皮衍生因 子。
22、根据前述权利要求所述的方法，其进一步包括将另一种抗肿瘤药物 包括进所述胶团或脂质体。
23、根据权利要求22所述的方法，其中所述药物选自顺铂、紫杉醇、 SN-38、多西他赛、依立替康、5-氟脱氧尿苷或多柔比星。
24、一种胶团，其是通过权利要求1-5所述的方法得到的。
25、一种胶团，其包括有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂。
26、根据权利要求25所述的胶团，其中所述磷脂酰甘油脂是DPPG。
27、根据权利要求25-26任一项所述的胶团，其进一步包括另一种抗肿 瘤药物。
29、根据权利要求27所述的胶团，其中所述药物选自顺铂、紫杉醇、 SN-38、多西他赛、依立替康、5-氟脱氧尿苷或多柔比星。
29、一种脂质体，其包括通过权利要求6-23任一项所述方法得到的奥沙 利铂。
30、一种脂质体，其包括有效量的奥沙利铂，其中所述脂质体的内层和 外层包括不同的脂类。
31、根据权利要求30所述的脂质体，其包括带负电荷的磷脂酰甘油脂。
32、根据权利要求31所述的胶团，其中所述磷脂酰甘油脂是DPPG。
33、根据权利要求32所述的脂质体，其进一步包括一种或多种胆固醇、 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰胆碱或神经酰胺。
34、根据权利要求30-33任一项所述的脂质体，其中所述脂质体的表面 用容许所述脂质体逃避免疫监督的包衣所包被。
35、根据权利要求34所述的脂质体，其中所述包衣是聚合物。
36、根据权利要求35所述的脂质体，其中所述聚合物是PEG。
37、根据权利要求35或权利要求36所述的脂质体，其中配基与所述聚 合物轭合。
38、根据权利要求37所述的脂质体，其中所述配基能使所述脂质体指向 具有可被所述配基识别的表面受体的特定细胞类型。
39、根据权利要求37或权利要求38所述的脂质体，其中所述配基是肽。
40、根据权利要求37所述的脂质体，其中所述配基选自表皮生长因子或 其表位、内皮他丁、抗凝血酶、anastellin、血管他丁、PEX或色素上皮衍生 因子。
41、根据权利要求28-40任一项所述的脂质体，其中所述脂质体的粒度 是80-120nm。
42、根据权利要求28-38所述的脂质体，其进一步包括有效量的另一种 抗癌药物，其特征为奥沙利铂和所述另一种药物被包被进同一脂质体。
43、根据权利要求39所述的脂质体，其中抗癌药物选自顺铂、多西他赛、 紫杉醇、吉西他滨、诺维本、多柔比星、依立替康、SN-38、吉西他滨或5- 氟脱氧尿苷。
44、根据权利要求28-38所述的脂质体，其进一步包括有效量的抗癌基 因，其特征为奥沙利铂和另一药物被包被进同一脂质体。
45、根据权利要求44所述的脂质体，其中所述抗癌基因是p53、IL-2、 IL-12、血管他丁和制瘤素。
44、根据权利要求27-45任一项所述的脂质体，其用作癌症药物。
46、根据权利要求27-45任一项所述的脂质体在生产用于治疗癌症的药 物中的用途。
47、一种治疗癌症的方法，其包括施用权利要求27-45任一项所限定的 脂质体。
48、根据权利要求46或47所述的用途或方法，其中所述脂质体通过静 脉输注3小时，每周或每两周施用，并且奥沙利铂以100-350mg/m2的剂量存 在。
49、根据权利要求48所述的用途或方法，其中所述剂量是100、150、 200、250或300mg/m2。
50、根据权利要求49所述的用途或方法，其中所述剂量是300mg/m2。
51、根据权利要求48-50所述的用途或方法，其中输注是3小时输注， 每周一次。
52、根据权利要求48-51所述的用途或方法，其中施用是2-4周期，每个 周期持续大约8周，周期之间休息1周。
53、根据权利要求48-51所述的用途或方法，其中所述癌症选自结肠癌、 胃癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、尿路上 皮癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、黑色素瘤、睾丸癌或卵 巢癌。
54、根据权利要求53所述的用途或方法，其中所述癌症是结肠癌、胃癌 或胰腺癌。
55、一种脂质体，其包括有效量的奥沙利铂和另一种抗癌药物或抗癌基 因药物以及带负电荷的磷脂酰甘油脂。
56、一种联合疗法，其包括施用脂质体，所述脂质体包被有效量的奥沙 利铂并包被另一种抗癌药物或抗癌基因药物。
57、根据权利要求55或56所述的脂质体，其中所述药物选自顺铂、紫 杉醇、SN-38、多西他赛、依立替康、5-氟脱氧尿苷或多柔比星。
58、一种联合疗法，其包括施用有效量的吉西他滨和包被有效量的顺铂 的脂质体。
60、根据权利要求58所述的联合疗法，其中吉西他滨不形成所述顺铂脂 质体的部分。
61、根据权利要求58或60所述的联合疗法，其中吉西他滨与所述顺铂 脂质体同时施用。
62、根据权利要求58或60所述的联合疗法，其中吉西他滨与顺铂脂质 体不同时施用。
63、根据权利要求58-62任一项所述的联合疗法，其中所述癌症是胰腺 癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、 睾丸癌、肠癌、膀胱癌、食管癌或尿路上皮癌。
64、根据权利要求58-63任一项所述的联合疗法，其中吉西他滨以 800-1000mg/m2的剂量施用。
65、根据权利要求64所述的联合疗法，其中吉西他滨通过静脉输注以 1000mg/m2的剂量施用。
66、根据权利要求64或65所述的联合疗法，其中吉西他滨每2周静脉 输注60分钟施用。
67、根据权利要求58-66任一项所述的联合疗法，其中所述顺铂脂质体 通过静脉输注以100-125mg/m2的剂量施用。
68、根据权利要求67所述的联合疗法，其中所述顺铂脂质体每2周静脉 输注8小时施用。
技术领域
本发明涉及含有包被的奥沙利铂(oxaliplatin)的脂质体和包被的奥沙利 铂的制备方法。奥沙利铂脂质体可应用于杀死多种人和动物恶性肿瘤的癌细 胞。本发明也涉及包含奥沙利铂和另一抗癌药物的脂质体。
背景技术
关于癌症的免疫疗法、疫苗、血管生成抑制剂、端粒酶抑制剂、凋亡诱 导剂、信号转导治疗、基因治疗和许多靶向治疗是抗击癌症有希望的方法， 但是在临床背景中还没有证实它们的功效。癌症研究经历了广泛的投入；但 是在过去的25年中，四种主要癌症(乳腺、肺、结肠和前列腺)的五年相对 存活率并没有显著改变。同一个体内的肿瘤异质性是造成靶向治疗失败的部 分原因(Miklos，2005)。因此，经典的化疗和激素疗法(对于乳腺和前列腺 癌症)连同放射和外科手术介入仍然是大多数癌症患者的主要治疗方法。
但是，纳米技术对现有化疗药物的传送和肿瘤靶向的改进，提供了替代 的治疗方法。奥沙利铂是抗肿瘤药剂，分子式为C8H14N2O4Pt，化学名称是顺 式-[(1R，2R)-1，2-环己二胺-N，N][草酸(2-)-O，O]合铂。化学结构式如下。
奥沙利铂的结构
奥沙利铂在癌症治疗中的应用促进了癌症尤其是结肠癌的治疗。奥沙利 铂的成功在于其诱导DNA损伤从而引发了大量加合物以及链内和链间的交 联的能力(Takahara等，1995)，还在于其诱导凋亡的能力(Boulikas和Vougiouka， 2003)。奥沙利铂的铂原子在两个相邻的鸟苷残基之间形成1，2链内交联，将 双螺旋向大沟弯曲了大约30度。奥沙利铂具有一个非水解的二氨基环己烷 (DACH)载体配基，其保持在药物最终的细胞毒活性代谢产物中。它与DNA 和其它大分子的反应通过草酸酯的一个或两个羧酸酯基团的水解而进行，产 生DACH合铂单加合物或双官能的DACH合铂交联。DACH合铂加合物固有 的化学和立体特征表现出，有助于与顺铂(cisplatin)交叉耐药性的缺乏(Di Francesco等的综述，2002)。奥沙利铂的碱性水解在两个连续的步骤中，产生 草酸根单配位络合物(pKa7.23)和二水奥沙利铂络合物。单配位中间物被认为 迅速与内源化合物反应(Jerremalm等，2003)与具有序列 5′-d(CCTCTGGTCTCC)的DNA十二基体(dodecamer)双螺旋结合的奥沙利 铂的晶体结构已被报道；铂原子形成在两个相邻的鸟苷残基之间形成1，2链 内交联，将双螺旋向大沟弯曲了大约30度。晶体学提供了在介导奥沙利铂和 双链DNA间相互作用中手性的重要性的结构证据(Spingler等，2001)。
但是尽管有优点，奥沙利铂的应用伴随独特模式的副作用，所述副作用 包括神经毒性、血液学毒性和胃肠道毒性。对患者存在3/4级嗜中性白血球 减少症的重大风险。恶心和呕吐通常是轻微到中度。肾毒性是轻微的，容许 无水合的奥沙利铂的给药。有时，可以观察到严重的副作用例如肾小管坏死。
而且，观察到对游离奥沙利铂的细胞抗性，妨碍了游离奥沙利铂的潜在 功效。抗性通过肿瘤细胞的无性扩增而发展，所述肿瘤细胞有优点并能在奥 沙利铂存在下生长。已提出了多个机制来解释患者肿瘤中对奥沙利铂抗性的 发展：
1.抗性细胞形成了一种限制奥沙利铂跨其细胞膜运输的机制，从而限制 了药物的细胞内水平。这是肿瘤细胞获得对奥沙利铂抗性的最重要机制。由 于脂质体包被的奥沙利铂制剂中的致融脂类DPPG和与正常细胞相比易被肿 瘤细胞吞噬的药物的纳米粒度(平均100nm)，这里描述的奥沙利铂的脂质 体包被避开了这种对奥沙利铂的抗性机制。
2.抗性细胞具有高水平的谷胱甘肽、金属硫蛋白或其它使奥沙利铂解毒 的化合物。
3.抗性细胞对奥沙利铂损害后的DNA损伤进行了较快的修复。
4.已提出的关于抗性的其它机制与线粒体或核凋亡信号转导路径有关， 所述路径负责决定受损细胞经历凋亡还是修复损伤。修复损伤的决定将导致 DNA水平上突变的积累，可进一步改变肿瘤克隆的表型(染色体断裂点导致 易位和其它染色体畸变)。
因此，游离药物奥沙利铂给药的更低毒性和更有效可选方案的开发是较 大的挑战。这些可选方案的开发能解决癌症治疗的很多问题。
脂质体是由磷脂双分子层构成的显微囊泡，能包被活性药物。脂质体药 物是药物传送的有前途的纳米载体。脂质体包被的顺铂(由Regulon Inc.， Mountain View，CA以TM 销售，US 6,511,676)已显示减少了顺铂 的肾毒性和神经毒性，而在患者系统传送后靶向肿瘤。
奥沙利铂是活性范围、作用机制和抗性不同于顺铂的药物。奥沙利铂加 合物损伤通过核苷酸剪切修复系统修复。奥沙利铂可被谷胱甘肽(GSH)相关的 酶解毒。在体外六个结肠细胞系中，ERCC1和XPA的表达是奥沙利铂敏感 性的先兆(Amould等，2003)。已报导对于结肠癌奥沙利铂比顺铂更有效。
顺铂和奥沙利铂具有明显结构差异，导致了化疗中的不同副作用。
顺铂的结构
例如，顺铂的副作用是肾毒性、外周神经病变、耳毒性和严重的胃肠道 毒性(参见McKeage MJ：Comparative adverse effect profiles of platinum drugs (铂药物副作用特征的比较).Drug Saf 13：228-44，1995，Hanigan MH和 Devarajan P：Cisplatin nephrotoxicity：molecular mechanisms(顺铂的肾毒性：分 子机制).Cancer Ther 1，47-61，2003)。
存在一种降低奥沙利铂给药困难的需要，以减少游离奥沙利铂用于治疗 时的高毒性，以及靶向肿瘤和为对化疗肿瘤抗性的患者提供有效的治疗的需 求。
而且，因为不同药物在抗击不同癌细胞和针对恶性肿瘤的位置、阶段和 解剖学中表现出更好的功效，存在一种能在联合疗法中以有效途径同时施用 多于一种药物或基因的需要。
本发明旨在通过将奥沙利铂和另一方面奥沙利铂和另一抗癌药物包被进 脂质体，来解决或至少缓解这些问题。这增加了药物的功效。
但是，纳米技术对现有化疗药物的传送和肿瘤靶向的改进，提供了替代 的治疗方法。奥沙利铂是抗肿瘤药剂，分子式为C8H14N2O4Pt，化学名称是顺 式-[(1R，2R)-1，2-环己二胺-N，N][草酸(2-)-O，O]合铂。化学结构式如下。
奥沙利铂的结构
奥沙利铂在癌症治疗中的应用促进了癌症尤其是结肠癌的治疗。奥沙利 铂的成功在于其诱导DNA损伤从而引发了大量加合物以及链内和链间的交 联的能力(Takahara等，1995)，还在于其诱导凋亡的能力(Boulikas和Vougiouka， 2003)。奥沙利铂的铂原子在两个相邻的鸟苷残基之间形成1，2链内交联，将 双螺旋向大沟弯曲了大约30度。奥沙利铂具有一个非水解的二氨基环己烷 (DACH)载体配基，其保持在药物最终的细胞毒活性代谢产物中。它与DNA 和其它大分子的反应通过草酸酯的一个或两个羧酸酯基团的水解而进行，产 生DACH合铂单加合物或双官能的DACH合铂交联。DACH合铂加合物固有 的化学和立体特征表现出，有助于与顺铂(cisplatin)交叉耐药性的缺乏(Di Francesco等的综述，2002)。奥沙利铂的碱性水解在两个连续的步骤中，产生 草酸根单配位络合物(pKa7.23)和二水奥沙利铂络合物。单配位中间物被认为 迅速与内源化合物反应(Jerremalm等，2003)与具有序列 5′-d(CCTCTGGTCTCC)的DNA十二基体(dodecamer)双螺旋结合的奥沙利 铂的晶体结构已被报道；铂原子形成在两个相邻的鸟苷残基之间形成1，2链 内交联，将双螺旋向大沟弯曲了大约30度。晶体学提供了在介导奥沙利铂和 双链DNA间相互作用中手性的重要性的结构证据(Spingler等，2001)。
但是尽管有优点，奥沙利铂的应用伴随独特模式的副作用，所述副作用 包括神经毒性、血液学毒性和胃肠道毒性。对患者存在3/4级嗜中性白血球 减少症的重大风险。恶心和呕吐通常是轻微到中度。肾毒性是轻微的，容许 无水合的奥沙利铂的给药。有时，可以观察到严重的副作用例如肾小管坏死。
而且，观察到对游离奥沙利铂的细胞抗性，妨碍了游离奥沙利铂的潜在 功效。抗性通过肿瘤细胞的无性扩增而发展，所述肿瘤细胞有优点并能在奥 沙利铂存在下生长。已提出了多个机制来解释患者肿瘤中对奥沙利铂抗性的 发展：
1.抗性细胞形成了一种限制奥沙利铂跨其细胞膜运输的机制，从而限制 了药物的细胞内水平。这是肿瘤细胞获得对奥沙利铂抗性的最重要机制。由 于脂质体包被的奥沙利铂制剂中的致融脂类DPPG和与正常细胞相比易被肿 瘤细胞吞噬的药物的纳米粒度(平均100nm)，这里描述的奥沙利铂的脂质 体包被避开了这种对奥沙利铂的抗性机制。
2.抗性细胞具有高水平的谷胱甘肽、金属硫蛋白或其它使奥沙利铂解毒 的化合物。
3.抗性细胞对奥沙利铂损害后的DNA损伤进行了较快的修复。
4.已提出的关于抗性的其它机制与线粒体或核凋亡信号转导路径有关， 所述路径负责决定受损细胞经历凋亡还是修复损伤。修复损伤的决定将导致 DNA水平上突变的积累，可进一步改变肿瘤克隆的表型(染色体断裂点导致 易位和其它染色体畸变)。
因此，游离药物奥沙利铂给药的更低毒性和更有效可选方案的开发是较 大的挑战。这些可选方案的开发能解决癌症治疗的很多问题。
脂质体是由磷脂双分子层构成的显微囊泡，能包被活性药物。脂质体药 物是药物传送的有前途的纳米载体。脂质体包被的顺铂(由Regulon Inc.， Mountain View，CA以TM 销售，US 6,511,676)已显示减少了顺铂 的肾毒性和神经毒性，而在患者系统传送后靶向肿瘤。
奥沙利铂是活性范围、作用机制和抗性不同于顺铂的药物。奥沙利铂加 合物损伤通过核苷酸剪切修复系统修复。奥沙利铂可被谷胱甘肽(GSH)相关的 酶解毒。在体外六个结肠细胞系中，ERCC1和XPA的表达是奥沙利铂敏感 性的先兆(Amould等，2003)。已报导对于结肠癌奥沙利铂比顺铂更有效。
顺铂和奥沙利铂具有明显结构差异，导致了化疗中的不同副作用。
顺铂的结构
例如，顺铂的副作用是肾毒性、外周神经病变、耳毒性和严重的胃肠道 毒性(参见McKeage MJ：Comparative adverse effect profiles of platinum drugs (铂药物副作用特征的比较).Drug Saf 13：228-44，1995，Hanigan MH和 Devarajan P：Cisplatin nephrotoxicity：molecular mechanisms(顺铂的肾毒性：分 子机制).Cancer Ther 1，47-61，2003)。
存在一种降低奥沙利铂给药困难的需要，以减少游离奥沙利铂用于治疗 时的高毒性，以及靶向肿瘤和为对化疗肿瘤抗性的患者提供有效的治疗的需 求。
而且，因为不同药物在抗击不同癌细胞和针对恶性肿瘤的位置、阶段和 解剖学中表现出更好的功效，存在一种能在联合疗法中以有效途径同时施用 多于一种药物或基因的需要。
本发明旨在通过将奥沙利铂和另一方面奥沙利铂和另一抗癌药物包被进 脂质体，来解决或至少缓解这些问题。这增加了药物的功效。
发明内容
本发明提供了包含包被的奥沙利铂和外膜和内膜具有不同脂质组成的脂 质体，以及制备这些脂质体的方法。脂质体包含带负电荷(阴离子)首基的 脂类分子。本发明也提供了具有包被的奥沙利铂和另一药物的脂质体以及制 备这些脂质体的方法。而且提供了这些脂质体在癌症治疗中的用途。
在第一方面中，本发明涉及形成包含奥沙利铂的胶团的方法，所述方法 包括将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合。
在第二方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括将根据本发明的奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在第三方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括以下步骤：
a)将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合，形成包 含奥沙利铂的胶团，和
b)将所述奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在第四方面中，本发明涉及包含有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰 甘油脂的胶团。
在第五方面中，本发明涉及包含有效量奥沙利铂的脂质体，其中脂质体 的内层和外层包含不同的脂类。本发明的其它方面涉及脂质体在癌症治疗中 的用途和通过施用所述脂质体治疗癌症的方法。
在另一方面中，本发明涉及包含有效量奥沙利铂和另一抗癌药物的脂质 体。
在另一方面中，本发明涉及包含有效量奥沙利铂和抗癌基因的脂质体。
本发明也提供了药物制剂，即本发明的脂质体的施用方案。
在涉及的另一方面中，本发明涉及联合疗法，所述联合疗法包含有效量 的吉西他滨(gemcitabine)和包被了有效量顺铂的脂质体的给药。也提供了 具有包被的顺铂的脂质体在制备用于治疗癌症侵袭的人类患者的药物中的用 途，和通过包括所述脂质体和吉西他滨给药的联合疗法来治疗癌症的方法。
在第一方面中，本发明涉及形成包含奥沙利铂的胶团的方法，所述方法 包括将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合。
在第二方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括将根据本发明的奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在第三方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括以下步骤：
a)将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合，形成包 含奥沙利铂的胶团，和
b)将所述奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在第四方面中，本发明涉及包含有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰 甘油脂的胶团。
在第五方面中，本发明涉及包含有效量奥沙利铂的脂质体，其中脂质体 的内层和外层包含不同的脂类。本发明的其它方面涉及脂质体在癌症治疗中 的用途和通过施用所述脂质体治疗癌症的方法。
在另一方面中，本发明涉及包含有效量奥沙利铂和另一抗癌药物的脂质 体。
在另一方面中，本发明涉及包含有效量奥沙利铂和抗癌基因的脂质体。
本发明也提供了药物制剂，即本发明的脂质体的施用方案。
在涉及的另一方面中，本发明涉及联合疗法，所述联合疗法包含有效量 的吉西他滨(gemcitabine)和包被了有效量顺铂的脂质体的给药。也提供了 具有包被的顺铂的脂质体在制备用于治疗癌症侵袭的人类患者的药物中的用 途，和通过包括所述脂质体和吉西他滨给药的联合疗法来治疗癌症的方法。
具体实施方式
本发明现在将被进一步描述。在下面的段落里，本发明的不同方面将被 更详细地定义。这样定义的每一方面可与其它任一方面或多方面结合，除非 明确指出不行。尤其地，任何指明优选或有利的特征可与任何其它指明优选 或有利的某一特征或某些特征结合。
本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述脂质体膜双层的内层 和外层具有不同的脂类组成。
在第一方面中，本发明涉及形成包含奥沙利铂的胶团的方法，所述方法 包括将有效量的奥沙利铂和带负电荷的脂类与溶剂溶液混合。脂类被表征为 含有带负电荷(阴离子)的首基。优选地，脂类为磷脂酰甘油脂。
优选地，溶剂为乙醇。但是其它技术人员已知的溶剂，例如碳水化合物 溶剂也可使用。甲醇可为另一种适合的溶剂。
这里用的术语奥沙利铂是指奥沙利铂和任何奥沙利铂的类似物或衍生 物。本发明的脂质体包被的奥沙利铂在这里还指它的商品名
根据本发明的术语带负电荷的磷脂酰甘油脂涉及带负电荷的磷脂酰甘油 脂或其衍生物。这些脂类被表征为含有带负电荷(阴离子)的首基。因此， 这个术语用于描述任何具有形成胶团能力和带净负电荷首基的脂类。根据本 发明不同方面的带负电荷的磷脂酰甘油脂可选自二棕榈酰磷脂酰甘油 (DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二己酰(diaproyl)磷脂酰甘油 (DCPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或二油酰磷脂酰甘油(DOPG)。在优选 的实施方案中，带负电荷的磷脂酰甘油脂为DPPG。
根据本发明的乙醇溶液优选为20-40％，优选大约30％的乙醇。奥沙利铂 对带负电荷的磷脂酰甘油脂的摩尔比是在1:1到1:2的范围内。优选地，比例 为1:1。
因此，根据本发明第一方面的一个实施方案，奥沙利铂与DPPG在20-40％ 的乙醇中以1:1到1:2的摩尔比混合，在缓冲液例如硫酸铵(10-200mM)、Tris 缓冲液(10-100mM)或磷酸钠缓冲液(10-200mM)的存在下，pH为6.5-8.0，奥 沙利铂的终浓度达到大约5mg/ml。混合物加热到30-60摄氏度，孵育20min 到3h。在这些条件下，奥沙利铂分子上带正电荷的亚氨基与DPPG分子上带 负电荷的基团相互作用，在乙醇溶液中形成反胶团。
在第二方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括将根据本发明的奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在第三方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括以下步骤：
c)将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合，形成包 含奥沙利铂的胶团，和
d)将所述奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在所述方法的一个实施方案中，胶团与预形成的脂质体混合。
预形成的脂质体或脂类应用于本发明的方法，因此本发明的脂质体可包 含带负和/或正电荷的脂类，例如磷脂。很多磷脂可用于本发明。例如，磷脂 酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌 醇、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、鞘磷脂或磷脂酸都可在本发明中使用。 也可使用神经酰胺或其它脂类衍生物。出于调节脂膜的稳定性或通透性的目 的，可加入另外的亲脂组分，例如胆固醇或其它类固醇、硬脂酰胺、磷脂酸、 双十六烷基磷酸酯、维生素E或羊毛脂提取物。
脂类可选自但不限于DDAB：二甲基双十八烷基溴化铵；DMRIE： N-[1-(2，3-二肉豆蔻基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)溴化铵；DMTAP： 1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷；DOGS：双十八烷基氨基甘氨酰精胺； DOTAP：N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵；DOTMA： N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵；DPTAP：1，2-二棕榈酰基-3- 三甲基铵丙烷；DSTAP：1，2-二硬脂酰基(disteroyl)-3-三甲基铵丙烷。
在本发明的一个实施方案中，奥沙利铂脂质体包含DPPG、胆固醇和 HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)。所述包被目的是不减少功效而减少细胞毒性 药剂的不利反应。
本发明的脂质体制品也可包含铵盐，例如氯化铵、硫酸铵或任何其它的 铵盐。
根据本发明的带负电荷的磷脂酰甘油脂，其用于形成胶团和作为脂质体 膜的部分，提供了增加药物传送进胞质的细胞膜通透性的优点。脂质体从而 可与细胞膜融合，并释放其内容物到细胞内部。这些特性定义为融合。因而， 由于这些融合特性和吞噬机制，根据本发明的奥沙利铂的脂质体制剂能够穿 过肿瘤细胞的细胞膜，并因此在奥沙利铂抗性或药物抗性的肿瘤治疗中有所 应用。
根据另一个实施方案，将带负电荷的磷脂酰甘油脂络合进奥沙利铂的同 一脂质体，产生了非常高(50-100％)的包被功效，将产品生产过程中的药物损 失最小化。
根据本发明的包被方法基于这里描述的带负电荷脂类分子与奥沙利铂之 间的反胶团形成。反胶团通过奥沙利铂的带正电荷氨基和磷脂酰甘油脂例如 DPPG的带负电荷硫酸基团之间的静电相互作用保持，使磷脂酰甘油脂的疏 水链指向乙醇溶液，从而吸入奥沙利铂分子。奥沙利铂-磷脂酰甘油脂反胶 团通过将它们与预制的脂质体或脂类混合，转化成脂质体，然后可通过透析 和挤压透膜来去除乙醇，或用水稀释，挤压通过滤器，进行或不进行高压过 滤浓缩。这样导致非常高产率地捕获和包被奥沙利铂。制备方法过程中脂质 体的脂类组成，很大程度上决定了纳米颗粒外表面的脂类组成。
在本发明不同方面的一个实施方案中，可添加能使本发明的脂质体逃避 免疫监督的包衣。优选地，这种包衣是聚合物。包衣可在脂质体阶段或者插 入后形成纳米载体时添加。因而，本发明的脂质体可包含这种包衣。根据本 发明可使用的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚 丙二醇、聚甲基丙二醇、聚羟基环氧丙烷、聚氧乙烯和聚醚胺。另外的聚合 物包括聚乙烯吡咯酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚 羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰 胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙 基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺(polyaspartamide)和透明质酸。优选的聚 合物是PEG。例如，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺可用PEG衍生得到PEG衍生的 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)。这些聚合物可用作均聚物或者作为嵌段 或无规共聚物。
本发明公布的脂质体奥沙利铂纳米载体能逃避免疫监督，因为聚合物包 衣，其能在体液内延长的时期中循环，能从组织池重分配到肿瘤内，并且能 在通过外渗穿过免疫妥协的脉管系统而静脉输注进动物和人体后优先地在实 体瘤和转移灶中聚集，在血管新生过程中所述脉管系统的内皮上存在缺陷。
本发明描述的包被方法的优点是，脂质体纳米载体中的药物将优先通过 有漏隙的肿瘤脉管系统外渗到达原发肿瘤和转移灶，从而具有增强的抗癌活 性。致融脂类DPPG增强了纳米颗粒与肿瘤细胞膜的融合，而也通过肿瘤细 胞的吞噬亲和力增强了脂质体奥沙利铂的更高摄取。
而且，配基可以与本发明脂质体的聚合物包衣结合。
例如配基可为肽，例如抗体。肽可在插入后阶段插入，例如像肽 -PEG-DSPE轭合物。根据本发明的肽包括但不限制于那些衍生自内皮他丁、 抗凝血酶、anastellin、血管他丁、PEX、色素上皮衍生因子、血小板反应蛋白 (TSP)-1和2主要结构的肽和那些能发挥双重抗癌活性的肽：通过例如对应于 内皮他丁NH2末端结构域的27个氨基酸肽与PEG-DSPE的连接来限制肿瘤 的血管生成(图17)，也发挥出了包被进同一脂质体的奥沙利铂分子的抗肿 瘤活性，所述脂质体携带抗血管生成肽。
优选的肽是内皮他丁。内皮他丁是基底膜蛋白胶原XVIII的非胶原结构 域1(NC1)的C末端20kDa蛋白水解片段，能抑制细胞增殖和迁移，是一种内 源的肿瘤血管生成和肿瘤生长的抑制剂。调解许多报道的内皮他丁体外效果 的主要问题是缺乏高亲和力的受体。对内皮他丁的慢性暴露阻断了内皮细胞 的增殖和迁移，而且诱导了内皮细胞的凋亡，从而抑制血管生成；内皮他丁 激活了培养的牛主动脉内皮细胞中，内皮一氧化氮合成酶(eNOS)在Ser116、 Ser617、Ser635和Ser1179的急性磷酸化及Thr497的去磷酸化，这些是与eNOS 激活相关的事件。一氧化氮(NO)确实促进了血管生成。因此，内皮细胞对内 皮他丁的短期暴露可能是促血管生成的(Li等，2005)，不像长期暴露是抗血管 生成的。对应于内皮他丁NH2末端结构域的27个氨基酸多肽，引出它全部的 抗血管生成活性，具有很强的抗癌活性；负责锌结合的3个组氨酸对于肽的 抗癌特性是必需的(Tjin Tham Sjin等，2005，Tjin Tham Sjin RM，Satchi-Fainaro R，Birsner AE，Ramanujam VM，Folkman J，Javaherian K)。对应于内皮他丁NH2 末端锌结合结构域的27个氨基酸合成肽，负责其抗肿瘤活性(Cancer Res.2005 年5月1日；65(9)：3656-63.Li C，Harris MB，Venema VJ，Venema RC.Endostatin induces acute endothelial nitric oxide and prostacyclin release.Biochem Biophys Res Commun(内皮他丁诱导内皮一氧化氮和前列腺环素的急性释放).2005 年4月15日；329(3)：873-8.)。
本领域技术人员可以通过配体肽文库的选择容易地衍生出肽配基，所述 配体能特异地与肽的表位相互作用，所述肽表位衍生自在肿瘤细胞表面过表 达的肿瘤特异性抗原。如图17显示的PEG末端这些肽的化学作用联结，使 得包被奥沙利铂的脂质体能指向特异的肿瘤。表1图表描述了肿瘤抗原，暴 露给细胞外表面的肽能从其衍生、合成，并用于从随机肽文库衍生对所述肿 瘤抗原具有高亲合力的肽配基。这些肽配基接着共价结合到已插入脂质体颗 粒的脂类聚合物分子，例如PEG-DSPE分子。
其它配基可选自由转铁蛋白、叶酸、透明质酸、糖链例如半乳糖或甘露 糖、单克隆抗体、磷酸吡哆醛、维生素B12、唾液酰Lewis X(Sialyl Lewis X)、 表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、血管细胞粘附分 子(VCAM-1)、细胞间粘附分子(ICAM-1)、血小板内皮粘附分子(PECAM-1)、 Arg-Gly-Asp(RGD)肽或Asp-Gly-Arg(NGR)肽和单克隆抗体的Fab’片段构成 的组。
在一个实施方案中，在脂质体奥沙利铂颗粒的表面用PEG-DSPE-叶酸酯 轭合物修饰，所述轭合物在脂质体颗粒形成后插入，从而使这些颗粒指向过 表达叶酸受体的肿瘤。
表1：配基
指向抗肿瘤抗原的肽也可在聚合物末端添加，例如PEG聚合物，使之多 功能化，从而赋予纳米颗粒靶向过表达特异表面抗原的特异肿瘤的特性。
在一个实施方案中，脂质体奥沙利铂颗粒也可用叶酸修饰，使奥沙利铂 脂类纳米颗粒指向过表达叶酸盐受体的卵巢(和其它)恶性细胞。
在其它实施方案中，脂质体奥沙利铂颗粒也可用Her2/neu配基修饰，使 奥沙利铂纳米颗粒指向过表达Her2/neu的乳腺癌细胞。
根据本发明的奥沙利铂的脂质体制剂设法避开，抗性肿瘤中药物摄取减 少导致的对游离奥沙利铂抗性的问题。从而，制剂可在奥沙利铂抗性肿瘤中 应用。在抗击人类多种实体恶性肿瘤临床试验中，根据本发明的奥沙利铂脂 质体制剂，也表现出比游离奥沙利铂药物(游离奥沙利铂)更低的毒性。而 且，因为这些奥沙利铂脂质体制剂的副作用范围与游离奥沙利铂的副作用范 围有差异，和进入肿瘤细胞的机制也不同，所以根据本发明的奥沙利铂脂质 体制剂在非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、转移前列腺癌和多种其 它实体瘤以及结肠癌和胃癌的临床应用中有优势。
在一个实施方案中，本发明的脂质体包被的奥沙利铂能降低治疗患者中 胆红素(图2)或骨转移(图3)的水平。
在另一个实施方案中，这里描述的脂质体制品可在静脉输注后使用，从 而降低奥沙利铂和其它共包被药物的副作用，尤其是胃肠道毒性。
根据本发明的脂质体制品可优先指向人类肿瘤及其转移灶。
因此在另一方面中，本发明涉及用作药剂的、包含如这里描述的奥沙利 铂的脂质体。
在另一方面中，本发明涉及具包被奥沙利铂的脂质体在生产用于治疗癌 症药物中的用途。
本发明也涉及癌症治疗的方法，所述方法包括给患者施用根据本发明具 有包被奥沙利铂的脂质体。
可以治疗不同类型的癌症，包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、非小 细胞肺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、睾丸癌、肠癌、食管或尿路上皮癌。 优选地，治疗针对结肠癌、胃癌或胰腺癌。
脂质体通过静脉输注每周以100-350mg/m2的剂量施用。优选的施用剂量 是300mg/m2，但是其它可能的剂量是100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2或 250mg/m2。在一个实施方案中，给药是2-5周期。每周期8-12周，然后是1 或2周的休息。优选的静脉每周输注是3小时。
在另一个实施方案中，给药是恰好2周。
上面描述的这些给药方案也可在奥沙利铂施作这里描述的联合疗法时使 用。
在另一方面中，本发明涉及制备包含两种抗癌药物奥沙利铂和另一种药 物的胶团和/或脂质体的方法。该方法如这里有关制备奥沙利铂脂质体所描述 的方法，但包括将另一种抗癌药物包括进胶团或脂质体的步骤。
因而，在另一方面中，本发明涉及包含包被的奥沙利铂和另一种抗癌药 物的脂质体。这些药物由此被包被进同一个脂质体。这具有它们能被一起传 送到靶上的优势。将多于一种其它的抗癌药物包括进脂质体是可能的，并且 在本发明范围内。
在一个实施方案中，具有不同作用机制的至少两种抗癌药物被包括进根 据本发明的同一脂质体。因此，肿瘤细胞能用两种独立的机制靶向，产生更 好的临床成效。
其它的抗癌药物可选自化合物例如铂化合物(例如顺铂、碳铂)、抗代 谢药物(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、喷司他丁和氨甲喋呤)、 靶向DNA的蒽环类抗生素(例如多柔比星和表柔比星)、靶向DNA的药物 或靶向拓扑异构酶的药物以及其它化疗药物。
在优选的实施方案中，另一药物选自顺铂、多西他赛、紫杉醇、吉西他 滨、诺维本、多柔比星、依立替康(irrinotecan)、SN-38、吉西他滨或5-氟 脱氧尿苷。
通过将两种药物包括进同一脂质体，可能使用比每种药物单独施用时更 低的剂量。两种药物可以协同的方式作用，从而在较低的副作用下更多地破 坏肿瘤细胞。
在另一个优选的实施方案中，顺铂和奥沙利铂共包被进同一脂质体纳米 载体。因而，同一肿瘤细胞可被顺铂和奥沙利铂两者同时贴附。顺铂的副作 用(肾毒性、神经毒性和恶心/呕吐)不同于脂质体顺铂的副作用(血液学毒 性)。奥沙利铂的副作用也不同于脂质体奥沙利铂的副作用(神经病变)。 因而，同一肿瘤细胞能通过至少两个独立的机制靶向，否则(如果不包被进 同一脂质体给药)两种药物(顺铂和奥沙利铂)很有可能各自靶向不同的细 胞。另外，施用包被进同一脂质体的不同药物的并用，可能用更低的达到功 效剂量从而避免或减少药物毒性。更尤其地，发明人已发现，通过降低奥沙 利铂的剂量限制了神经毒性的副作用，同时通过降低顺铂的剂量限制了骨髓 中毒性的副作用。结果是，分别改善了施用的脂质体奥沙利铂和脂质体顺铂 的神经毒性和骨髓中毒性特征，但是同时也可能在系统给药后对肿瘤产生同 样或更大的破坏性。因而，顺铂和奥沙利铂的混合进同一脂质体，在脂质体 药物的副作用更加减小的条件下，允许了每种所述药物以更低的剂量施用。
在另一个实施方案中，本发明脂质体包被的奥沙利铂与药物多柔比星 (DOX)并用，所述多柔比星像本发明方法中描述的奥沙利铂一样被包被进同 一脂质体奥沙利铂颗粒。令人惊奇地，发明人发现这样可以降低奥沙利铂的 剂量并因此降低施用的脂质体奥沙利铂的神经毒性，同时也降低了DOX的剂 量。这样减少了DOX的心脏毒性和其它副作用，同时给予肿瘤同样或更高的 破坏。
在另一个实施方案中，脂质体包含奥沙利铂和5-氟尿嘧啶。奥沙利铂与 5-氟尿嘧啶的并用最近被批准用于治疗转移的结肠癌。但是主要因为任一药 物的重要副作用，在这些药物给药中存在严重的问题，所述副作用通过药物 在本发明描述的脂质体包被中被减到最少。而且通过这里描述的并用药物， 增加了治疗的功效。
本发明也涉及奥沙利铂和抗癌基因在同一脂质体内的包被。因而，根据 本发明的脂质体可包含奥沙利铂和抗癌基因。使用的抗癌基因包括但不限制 于p53、IL-2、IL-12、血管他丁和制瘤素。
在另一方面中，本发明涉及联合疗法，其中奥沙利铂与如这里指明的另 一药物或基因一起给药，其中两种药物都包被进同一脂质体。因而，包含奥 沙利铂和另一种抗癌药物或基因的脂质体，能应用于治疗癌症的药物生产或 治疗癌症的方法。而且，本发明涉及混合脂质体的第一医疗用途。
本领域技术人员可理解的是，给药方案和成分的剂量会根据存在的另一 药物而变化。对于奥沙利铂，可以使用这里描述的剂量和剂量范围。而且并 用脂质体的给药方案可为这里针对奥沙利铂描述的方案。
在一个实施方案中，本发明脂质体包被的奥沙利铂作为单一疗法每周(第 1、8和15日)给癌症患者施用150-300mg/m2共12周，或者在21天周期内的 第1、8日与1g/m2吉西他滨并用，或与多西他赛、紫杉醇、依立替康并用。
在涉及方面中，本发明指向脂质体包被的顺铂，其中顺铂与如这里描述 的另一种抗癌药物混合包被。顺铂能因此与紫杉醇、多西他赛、依立替康、 SN-38、吉西他滨和5-氟脱氧尿苷中的任一种抗癌药物混合进同一脂质体颗 粒。优点是，同一肿瘤细胞同时被顺铂和一种其它的药物攻击，由于涉及两 种独立的分子机制，因此能达到更有效的杀伤。例如，顺铂引发线粒体和核 的凋亡信号传导以及阻止复制的DNA交联，而多西他赛将在微管蛋白聚合时 作用。
有利地，脂质体包被的顺铂用这里描述的方法，与吉西他滨混合一起包 被进同一脂质体。
另一方面，包含本发明脂质体的奥沙利铂可与另一种药物一起给药，但 另一药物不形成同一脂质体的部分。另一药物是如这里描述的，并优选自顺 铂、多西他赛、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、多柔比星、依立替康、SN-38、 吉西他滨或5-氟脱氧尿苷。
而且，在独立的方面中，本发明涉及与吉西他滨并用给药。 因而和吉西他滨的联合疗法是本发明的一个目的。也提供了 在制备用于治疗人类癌症患者的药物中的用途，所述治疗通过施 用包括和另一种没包被进同一脂质体的药物的联合疗法。
另一药物可与同时或不同时给药。
优选地，另一药物是吉西他滨，给药引起临床的改善。优选地，治疗的 癌症是胰腺癌，但是也可治疗其它癌症例如结肠癌、胃癌、乳腺癌、非小细 胞肺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、睾丸癌、肠癌、膀胱癌、食管或尿路 上皮癌。吉西他滨的使用剂量是800-1000mg/m2，优选1000mg/m2。Lipoplatin 的剂量是100-125mg/m2，优选100mg/m2。
和吉西他滨是静脉给药。优选每两周(第1和第 15天)8小时静脉输注给药。吉西他滨优选每两周60分钟静脉输注给药。化 合物的给药是4周的周期。
参考附图和实施例，进一步示例说明本发明。实施例显示奥沙利铂脂质 体给药引起了临床的改善，即在癌症治疗中有临床疗效。实施例II显示， 和吉西他滨给药提供了临床的好处，因而引起了临床的改善。
本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述脂质体膜双层的内层 和外层具有不同的脂类组成。
在第一方面中，本发明涉及形成包含奥沙利铂的胶团的方法，所述方法 包括将有效量的奥沙利铂和带负电荷的脂类与溶剂溶液混合。脂类被表征为 含有带负电荷(阴离子)的首基。优选地，脂类为磷脂酰甘油脂。
优选地，溶剂为乙醇。但是其它技术人员已知的溶剂，例如碳水化合物 溶剂也可使用。甲醇可为另一种适合的溶剂。
这里用的术语奥沙利铂是指奥沙利铂和任何奥沙利铂的类似物或衍生 物。本发明的脂质体包被的奥沙利铂在这里还指它的商品名
根据本发明的术语带负电荷的磷脂酰甘油脂涉及带负电荷的磷脂酰甘油 脂或其衍生物。这些脂类被表征为含有带负电荷(阴离子)的首基。因此， 这个术语用于描述任何具有形成胶团能力和带净负电荷首基的脂类。根据本 发明不同方面的带负电荷的磷脂酰甘油脂可选自二棕榈酰磷脂酰甘油 (DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二己酰(diaproyl)磷脂酰甘油 (DCPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或二油酰磷脂酰甘油(DOPG)。在优选 的实施方案中，带负电荷的磷脂酰甘油脂为DPPG。
根据本发明的乙醇溶液优选为20-40％，优选大约30％的乙醇。奥沙利铂 对带负电荷的磷脂酰甘油脂的摩尔比是在1:1到1:2的范围内。优选地，比例 为1:1。
因此，根据本发明第一方面的一个实施方案，奥沙利铂与DPPG在20-40％ 的乙醇中以1:1到1:2的摩尔比混合，在缓冲液例如硫酸铵(10-200mM)、Tris 缓冲液(10-100mM)或磷酸钠缓冲液(10-200mM)的存在下，pH为6.5-8.0，奥 沙利铂的终浓度达到大约5mg/ml。混合物加热到30-60摄氏度，孵育20min 到3h。在这些条件下，奥沙利铂分子上带正电荷的亚氨基与DPPG分子上带 负电荷的基团相互作用，在乙醇溶液中形成反胶团。
在第二方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括将根据本发明的奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在第三方面中，本发明涉及将奥沙利铂包被进脂质体的方法，所述方法 包括以下步骤：
c)将有效量的奥沙利铂和带负电荷的磷脂酰甘油脂与溶剂混合，形成包 含奥沙利铂的胶团，和
d)将所述奥沙利铂胶团与预形成的脂质体或脂类混合。
在所述方法的一个实施方案中，胶团与预形成的脂质体混合。
预形成的脂质体或脂类应用于本发明的方法，因此本发明的脂质体可包 含带负和/或正电荷的脂类，例如磷脂。很多磷脂可用于本发明。例如，磷脂 酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌 醇、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、鞘磷脂或磷脂酸都可在本发明中使用。 也可使用神经酰胺或其它脂类衍生物。出于调节脂膜的稳定性或通透性的目 的，可加入另外的亲脂组分，例如胆固醇或其它类固醇、硬脂酰胺、磷脂酸、 双十六烷基磷酸酯、维生素E或羊毛脂提取物。
脂类可选自但不限于DDAB：二甲基双十八烷基溴化铵；DMRIE： N-[1-(2，3-二肉豆蔻基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)溴化铵；DMTAP： 1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷；DOGS：双十八烷基氨基甘氨酰精胺； DOTAP：N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵；DOTMA： N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵；DPTAP：1，2-二棕榈酰基-3- 三甲基铵丙烷；DSTAP：1，2-二硬脂酰基(disteroyl)-3-三甲基铵丙烷。
在本发明的一个实施方案中，奥沙利铂脂质体包含DPPG、胆固醇和 HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)。所述包被目的是不减少功效而减少细胞毒性 药剂的不利反应。
本发明的脂质体制品也可包含铵盐，例如氯化铵、硫酸铵或任何其它的 铵盐。
根据本发明的带负电荷的磷脂酰甘油脂，其用于形成胶团和作为脂质体 膜的部分，提供了增加药物传送进胞质的细胞膜通透性的优点。脂质体从而 可与细胞膜融合，并释放其内容物到细胞内部。这些特性定义为融合。因而， 由于这些融合特性和吞噬机制，根据本发明的奥沙利铂的脂质体制剂能够穿 过肿瘤细胞的细胞膜，并因此在奥沙利铂抗性或药物抗性的肿瘤治疗中有所 应用。
根据另一个实施方案，将带负电荷的磷脂酰甘油脂络合进奥沙利铂的同 一脂质体，产生了非常高(50-100％)的包被功效，将产品生产过程中的药物损 失最小化。
根据本发明的包被方法基于这里描述的带负电荷脂类分子与奥沙利铂之 间的反胶团形成。反胶团通过奥沙利铂的带正电荷氨基和磷脂酰甘油脂例如 DPPG的带负电荷硫酸基团之间的静电相互作用保持，使磷脂酰甘油脂的疏 水链指向乙醇溶液，从而吸入奥沙利铂分子。奥沙利铂-磷脂酰甘油脂反胶 团通过将它们与预制的脂质体或脂类混合，转化成脂质体，然后可通过透析 和挤压透膜来去除乙醇，或用水稀释，挤压通过滤器，进行或不进行高压过 滤浓缩。这样导致非常高产率地捕获和包被奥沙利铂。制备方法过程中脂质 体的脂类组成，很大程度上决定了纳米颗粒外表面的脂类组成。
在本发明不同方面的一个实施方案中，可添加能使本发明的脂质体逃避 免疫监督的包衣。优选地，这种包衣是聚合物。包衣可在脂质体阶段或者插 入后形成纳米载体时添加。因而，本发明的脂质体可包含这种包衣。根据本 发明可使用的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚 丙二醇、聚甲基丙二醇、聚羟基环氧丙烷、聚氧乙烯和聚醚胺。另外的聚合 物包括聚乙烯吡咯酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚 羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰 胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙 基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺(polyaspartamide)和透明质酸。优选的聚 合物是PEG。例如，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺可用PEG衍生得到PEG衍生的 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)。这些聚合物可用作均聚物或者作为嵌段 或无规共聚物。
本发明公布的脂质体奥沙利铂纳米载体能逃避免疫监督，因为聚合物包 衣，其能在体液内延长的时期中循环，能从组织池重分配到肿瘤内，并且能 在通过外渗穿过免疫妥协的脉管系统而静脉输注进动物和人体后优先地在实 体瘤和转移灶中聚集，在血管新生过程中所述脉管系统的内皮上存在缺陷。
本发明描述的包被方法的优点是，脂质体纳米载体中的药物将优先通过 有漏隙的肿瘤脉管系统外渗到达原发肿瘤和转移灶，从而具有增强的抗癌活 性。致融脂类DPPG增强了纳米颗粒与肿瘤细胞膜的融合，而也通过肿瘤细 胞的吞噬亲和力增强了脂质体奥沙利铂的更高摄取。
而且，配基可以与本发明脂质体的聚合物包衣结合。
例如配基可为肽，例如抗体。肽可在插入后阶段插入，例如像肽 -PEG-DSPE轭合物。根据本发明的肽包括但不限制于那些衍生自内皮他丁、 抗凝血酶、anastellin、血管他丁、PEX、色素上皮衍生因子、血小板反应蛋白 (TSP)-1和2主要结构的肽和那些能发挥双重抗癌活性的肽：通过例如对应于 内皮他丁NH2末端结构域的27个氨基酸肽与PEG-DSPE的连接来限制肿瘤 的血管生成(图17)，也发挥出了包被进同一脂质体的奥沙利铂分子的抗肿 瘤活性，所述脂质体携带抗血管生成肽。
优选的肽是内皮他丁。内皮他丁是基底膜蛋白胶原XVIII的非胶原结构 域1(NC1)的C末端20kDa蛋白水解片段，能抑制细胞增殖和迁移，是一种内 源的肿瘤血管生成和肿瘤生长的抑制剂。调解许多报道的内皮他丁体外效果 的主要问题是缺乏高亲和力的受体。对内皮他丁的慢性暴露阻断了内皮细胞 的增殖和迁移，而且诱导了内皮细胞的凋亡，从而抑制血管生成；内皮他丁 激活了培养的牛主动脉内皮细胞中，内皮一氧化氮合成酶(eNOS)在Ser116、 Ser617、Ser635和Ser1179的急性磷酸化及Thr497的去磷酸化，这些是与eNOS 激活相关的事件。一氧化氮(NO)确实促进了血管生成。因此，内皮细胞对内 皮他丁的短期暴露可能是促血管生成的(Li等，2005)，不像长期暴露是抗血管 生成的。对应于内皮他丁NH2末端结构域的27个氨基酸多肽，引出它全部的 抗血管生成活性，具有很强的抗癌活性；负责锌结合的3个组氨酸对于肽的 抗癌特性是必需的(Tjin Tham Sjin等，2005，Tjin Tham Sjin RM，Satchi-Fainaro R，Birsner AE，Ramanujam VM，Folkman J，Javaherian K)。对应于内皮他丁NH2 末端锌结合结构域的27个氨基酸合成肽，负责其抗肿瘤活性(Cancer Res.2005 年5月1日；65(9)：3656-63.Li C，Harris MB，Venema VJ，Venema RC.Endostatin induces acute endothelial nitric oxide and prostacyclin release.Biochem Biophys Res Commun(内皮他丁诱导内皮一氧化氮和前列腺环素的急性释放).2005 年4月15日；329(3)：873-8.)。
本领域技术人员可以通过配体肽文库的选择容易地衍生出肽配基，所述 配体能特异地与肽的表位相互作用，所述肽表位衍生自在肿瘤细胞表面过表 达的肿瘤特异性抗原。如图17显示的PEG末端这些肽的化学作用联结，使 得包被奥沙利铂的脂质体能指向特异的肿瘤。表1图表描述了肿瘤抗原，暴 露给细胞外表面的肽能从其衍生、合成，并用于从随机肽文库衍生对所述肿 瘤抗原具有高亲合力的肽配基。这些肽配基接着共价结合到已插入脂质体颗 粒的脂类聚合物分子，例如PEG-DSPE分子。
其它配基可选自由转铁蛋白、叶酸、透明质酸、糖链例如半乳糖或甘露 糖、单克隆抗体、磷酸吡哆醛、维生素B12、唾液酰Lewis X(Sialyl Lewis X)、 表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、血管细胞粘附分 子(VCAM-1)、细胞间粘附分子(ICAM-1)、血小板内皮粘附分子(PECAM-1)、 Arg-Gly-Asp(RGD)肽或Asp-Gly-Arg(NGR)肽和单克隆抗体的Fab’片段构成 的组。
在一个实施方案中，在脂质体奥沙利铂颗粒的表面用PEG-DSPE-叶酸酯 轭合物修饰，所述轭合物在脂质体颗粒形成后插入，从而使这些颗粒指向过 表达叶酸受体的肿瘤。
表1：配基
指向抗肿瘤抗原的肽也可在聚合物末端添加，例如PEG聚合物，使之多 功能化，从而赋予纳米颗粒靶向过表达特异表面抗原的特异肿瘤的特性。
在一个实施方案中，脂质体奥沙利铂颗粒也可用叶酸修饰，使奥沙利铂 脂类纳米颗粒指向过表达叶酸盐受体的卵巢(和其它)恶性细胞。
在其它实施方案中，脂质体奥沙利铂颗粒也可用Her2/neu配基修饰，使 奥沙利铂纳米颗粒指向过表达Her2/neu的乳腺癌细胞。
根据本发明的奥沙利铂的脂质体制剂设法避开，抗性肿瘤中药物摄取减 少导致的对游离奥沙利铂抗性的问题。从而，制剂可在奥沙利铂抗性肿瘤中 应用。在抗击人类多种实体恶性肿瘤临床试验中，根据本发明的奥沙利铂脂 质体制剂，也表现出比游离奥沙利铂药物(游离奥沙利铂)更低的毒性。而 且，因为这些奥沙利铂脂质体制剂的副作用范围与游离奥沙利铂的副作用范 围有差异，和进入肿瘤细胞的机制也不同，所以根据本发明的奥沙利铂脂质 体制剂在非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、转移前列腺癌和多种其 它实体瘤以及结肠癌和胃癌的临床应用中有优势。
在一个实施方案中，本发明的脂质体包被的奥沙利铂能降低治疗患者中 胆红素(图2)或骨转移(图3)的水平。
在另一个实施方案中，这里描述的脂质体制品可在静脉输注后使用，从 而降低奥沙利铂和其它共包被药物的副作用，尤其是胃肠道毒性。
根据本发明的脂质体制品可优先指向人类肿瘤及其转移灶。
因此在另一方面中，本发明涉及用作药剂的、包含如这里描述的奥沙利 铂的脂质体。
在另一方面中，本发明涉及具包被奥沙利铂的脂质体在生产用于治疗癌 症药物中的用途。
本发明也涉及癌症治疗的方法，所述方法包括给患者施用根据本发明具 有包被奥沙利铂的脂质体。
可以治疗不同类型的癌症，包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、非小 细胞肺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、睾丸癌、肠癌、食管或尿路上皮癌。 优选地，治疗针对结肠癌、胃癌或胰腺癌。
脂质体通过静脉输注每周以100-350mg/m2的剂量施用。优选的施用剂量 是300mg/m2，但是其它可能的剂量是100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2或 250mg/m2。在一个实施方案中，给药是2-5周期。每周期8-12周，然后是1 或2周的休息。优选的静脉每周输注是3小时。
在另一个实施方案中，给药是恰好2周。
上面描述的这些给药方案也可在奥沙利铂施作这里描述的联合疗法时使 用。
在另一方面中，本发明涉及制备包含两种抗癌药物奥沙利铂和另一种药 物的胶团和/或脂质体的方法。该方法如这里有关制备奥沙利铂脂质体所描述 的方法，但包括将另一种抗癌药物包括进胶团或脂质体的步骤。
因而，在另一方面中，本发明涉及包含包被的奥沙利铂和另一种抗癌药 物的脂质体。这些药物由此被包被进同一个脂质体。这具有它们能被一起传 送到靶上的优势。将多于一种其它的抗癌药物包括进脂质体是可能的，并且 在本发明范围内。
在一个实施方案中，具有不同作用机制的至少两种抗癌药物被包括进根 据本发明的同一脂质体。因此，肿瘤细胞能用两种独立的机制靶向，产生更 好的临床成效。
其它的抗癌药物可选自化合物例如铂化合物(例如顺铂、碳铂)、抗代 谢药物(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、喷司他丁和氨甲喋呤)、 靶向DNA的蒽环类抗生素(例如多柔比星和表柔比星)、靶向DNA的药物 或靶向拓扑异构酶的药物以及其它化疗药物。
在优选的实施方案中，另一药物选自顺铂、多西他赛、紫杉醇、吉西他 滨、诺维本、多柔比星、依立替康(irrinotecan)、SN-38、吉西他滨或5-氟 脱氧尿苷。
通过将两种药物包括进同一脂质体，可能使用比每种药物单独施用时更 低的剂量。两种药物可以协同的方式作用，从而在较低的副作用下更多地破 坏肿瘤细胞。
在另一个优选的实施方案中，顺铂和奥沙利铂共包被进同一脂质体纳米 载体。因而，同一肿瘤细胞可被顺铂和奥沙利铂两者同时贴附。顺铂的副作 用(肾毒性、神经毒性和恶心/呕吐)不同于脂质体顺铂的副作用(血液学毒 性)。奥沙利铂的副作用也不同于脂质体奥沙利铂的副作用(神经病变)。 因而，同一肿瘤细胞能通过至少两个独立的机制靶向，否则(如果不包被进 同一脂质体给药)两种药物(顺铂和奥沙利铂)很有可能各自靶向不同的细 胞。另外，施用包被进同一脂质体的不同药物的并用，可能用更低的达到功 效剂量从而避免或减少药物毒性。更尤其地，发明人已发现，通过降低奥沙 利铂的剂量限制了神经毒性的副作用，同时通过降低顺铂的剂量限制了骨髓 中毒性的副作用。结果是，分别改善了施用的脂质体奥沙利铂和脂质体顺铂 的神经毒性和骨髓中毒性特征，但是同时也可能在系统给药后对肿瘤产生同 样或更大的破坏性。因而，顺铂和奥沙利铂的混合进同一脂质体，在脂质体 药物的副作用更加减小的条件下，允许了每种所述药物以更低的剂量施用。
在另一个实施方案中，本发明脂质体包被的奥沙利铂与药物多柔比星 (DOX)并用，所述多柔比星像本发明方法中描述的奥沙利铂一样被包被进同 一脂质体奥沙利铂颗粒。令人惊奇地，发明人发现这样可以降低奥沙利铂的 剂量并因此降低施用的脂质体奥沙利铂的神经毒性，同时也降低了DOX的剂 量。这样减少了DOX的心脏毒性和其它副作用，同时给予肿瘤同样或更高的 破坏。
在另一个实施方案中，脂质体包含奥沙利铂和5-氟尿嘧啶。奥沙利铂与 5-氟尿嘧啶的并用最近被批准用于治疗转移的结肠癌。但是主要因为任一药 物的重要副作用，在这些药物给药中存在严重的问题，所述副作用通过药物 在本发明描述的脂质体包被中被减到最少。而且通过这里描述的并用药物， 增加了治疗的功效。
本发明也涉及奥沙利铂和抗癌基因在同一脂质体内的包被。因而，根据 本发明的脂质体可包含奥沙利铂和抗癌基因。使用的抗癌基因包括但不限制 于p53、IL-2、IL-12、血管他丁和制瘤素。
在另一方面中，本发明涉及联合疗法，其中奥沙利铂与如这里指明的另 一药物或基因一起给药，其中两种药物都包被进同一脂质体。因而，包含奥 沙利铂和另一种抗癌药物或基因的脂质体，能应用于治疗癌症的药物生产或 治疗癌症的方法。而且，本发明涉及混合脂质体的第一医疗用途。
本领域技术人员可理解的是，给药方案和成分的剂量会根据存在的另一 药物而变化。对于奥沙利铂，可以使用这里描述的剂量和剂量范围。而且并 用脂质体的给药方案可为这里针对奥沙利铂描述的方案。
在一个实施方案中，本发明脂质体包被的奥沙利铂作为单一疗法每周(第 1、8和15日)给癌症患者施用150-300mg/m2共12周，或者在21天周期内的 第1、8日与1g/m2吉西他滨并用，或与多西他赛、紫杉醇、依立替康并用。
在涉及方面中，本发明指向脂质体包被的顺铂，其中顺铂与如这里描述 的另一种抗癌药物混合包被。顺铂能因此与紫杉醇、多西他赛、依立替康、 SN-38、吉西他滨和5-氟脱氧尿苷中的任一种抗癌药物混合进同一脂质体颗 粒。优点是，同一肿瘤细胞同时被顺铂和一种其它的药物攻击，由于涉及两 种独立的分子机制，因此能达到更有效的杀伤。例如，顺铂引发线粒体和核 的凋亡信号传导以及阻止复制的DNA交联，而多西他赛将在微管蛋白聚合时 作用。
有利地，脂质体包被的顺铂用这里描述的方法，与吉西他滨混合一起包 被进同一脂质体。
另一方面，包含本发明脂质体的奥沙利铂可与另一种药物一起给药，但 另一药物不形成同一脂质体的部分。另一药物是如这里描述的，并优选自顺 铂、多西他赛、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、多柔比星、依立替康、SN-38、 吉西他滨或5-氟脱氧尿苷。
而且，在独立的方面中，本发明涉及与吉西他滨并用给药。 因而和吉西他滨的联合疗法是本发明的一个目的。也提供了 在制备用于治疗人类癌症患者的药物中的用途，所述治疗通过施 用包括和另一种没包被进同一脂质体的药物的联合疗法。
另一药物可与同时或不同时给药。
优选地，另一药物是吉西他滨，给药引起临床的改善。优选地，治疗的 癌症是胰腺癌，但是也可治疗其它癌症例如结肠癌、胃癌、乳腺癌、非小细 胞肺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、睾丸癌、肠癌、膀胱癌、食管或尿路 上皮癌。吉西他滨的使用剂量是800-1000mg/m2，优选1000mg/m2。Lipoplatin 的剂量是100-125mg/m2，优选100mg/m2。
和吉西他滨是静脉给药。优选每两周(第1和第 15天)8小时静脉输注给药。吉西他滨优选每两周60分钟静脉输注给药。化 合物的给药是4周的周期。
参考附图和实施例，进一步示例说明本发明。实施例显示奥沙利铂脂质 体给药引起了临床的改善，即在癌症治疗中有临床疗效。实施例II显示， 和吉西他滨给药提供了临床的好处，因而引起了临床的改善。
附图说明
图1：脂质体奥沙利铂用黄色矩形表示。脂类分子用球形的亲水头部表 示。颗粒表面上的红色随机链代表PEG分子，所述PEG分子赋予颗粒逃避 在肝中巨噬细胞破坏、在血液中的调理作用(与血清蛋白和其它大分子相互 作用)的能力和系统传送后外渗进实体瘤和转移灶中的能力(也包括其100nm 的小尺寸)。
图2：患结肠癌和肝转移灶的患者(TK)中胆红素的降低。由于血液中 非常高水平的胆红素(50mg/100ml)，患者患有肝病。在第1日、8日、15日 和22日以200mg/m2的剂量注射脂质体奥沙利铂，引起了总胆红素从50到 12mg/m2的逐步降低。这种降低最有可能缘自阻塞胆管的肝转移灶的减少。 而且第31日和37日的治疗没有如胆红素水平推论的阻止疾病的发展。
图3：使用脂质体奥沙利铂的单一疗法减少了骨转移灶。患有胃癌和骨 转移灶的患者(EK)用每7天150mg/m2的剂量治疗10周。产生了显著的生命 质量的改善，少得多的疼痛、更少镇痛药的使用以及患者能进行日常工作。
图4：顺铂和奥沙利铂共包被进同一脂质体颗粒，进一步在插入后用肽 -PEG-脂类轭合物修饰颗粒，以使这些颗粒指向具有由肽或配基识别的表面受 体的特异细胞类型。图还描述了在PEG分子末端添加肽链(红色)，使脂质 体颗粒多功能化和对特异肿瘤的优先指向。在这种情况下，特异的肿瘤抗原 被脂质体表面的肽部分识别。例如，表皮生长因子肽表位能结合暴露到外表 面的EGFR部分，使所述脂质体指向过表达EGFR的肿瘤。
图5A：显示脂质体包被奥沙利铂注射后最高水平约14mg总铂/ml血浆 对比奥沙利铂注射后约8mg总铂/ml血浆，脂质体包被的奥沙利铂在20分钟 和奥沙利铂在10分钟达到这些水平。
图5B：显示游离奥沙利铂注射后约100小时大鼠血浆中的总铂水平达到 零。
图6A：显示也用治疗的动物中大鼠血浆中总铂的水平。
图7A：显示治疗5小时的动物肾脏组织中总铂的水平和图7B显示治疗 190小时的动物肾脏组织中总铂的水平。
图8A：显示治疗5小时的动物肝脏组织中总铂的水平和图8B显示治疗 190小时的动物肝脏组织中总铂的水平。
图9A和图9B：显示治疗190小时的动物脾脏组织中总铂的水平。
图10A：显示用游离奥沙利铂和脂质体包被的奥沙利铂治疗5小时的动 物大鼠组织中总铂的分布和图10B
图11A和11B是用脂质体包被的奥沙利铂重复治疗(11次)的大鼠的图 表。
图12是用脂质体包被的奥沙利铂重复治疗(6次)的大鼠的图表。
图13：Lipoxal能在以16mg/Kg的剂量4天间隔6次静脉注射后，引发 小鼠中人类乳腺癌的全部消失。奥沙利铂在其MTD(最大耐受剂量)时只能 导致小鼠中人类乳腺癌的缩小而不是消失。
图14：脂质体奥沙利铂(Lipoxal)16mg/Kg的剂量是根除小鼠异种移植物 中乳腺癌最有效的。最大耐受剂量4mg/Kg的奥沙利铂在小鼠模型中具有较 低的抗癌功效，其次是5mg/Kg剂量的Lipoxal。
图15和16显示脂质体包被的奥沙利铂的临床试验的结果。
图17：偶联肽到PEG-DSPE上的化学过程。
实施例
实施例I
脂质体制备
奥沙利铂与DPPG(二棕榈酰磷脂酰甘油)或其它带负电荷的脂类分子 在30％乙醇和0.1M Tris HCl，pH为7.5中以1:1的比例混合，奥沙利铂的终 浓度为5mg/ml，在浓度为20-40％乙醇溶液存在下，温度条件是30-60摄氏 度，在硫酸铵(10-200mM)、Tris缓冲液(10-100mM)或磷酸钠缓冲液(10-200 mM)的存在下，pH为6.5-8.0，孵育20min到3h。在这些条件下，奥沙利铂分 子上带正电荷的亚氨基与DPPG分子上带负电荷的基团相互作用，在乙醇溶 液中形成反胶团(也见Lipoplatin美国专利6,511,676)。得到的奥沙利铂-DPPG 反胶团通过与预制的由胆固醇、磷脂酰胆碱、mPEG-DSPE(聚乙二醇-二硬 酯酰磷脂酰乙醇胺)构成的脂质体快速混合，而被转化成脂质体包被的奥沙利 铂-DPPG单层，然后通过盐水渗析和挤压透膜来将颗粒的直径降到80-120 nm。所添加脂质体的脂类组成决定了最终奥沙利铂制剂的外膜组成(图1)。
实施例II
A.用脂质体包被的奥沙利铂的初步临床经验
I.A.动物研究
在美国、法国、瑞士和希腊(Pasteur研究所，雅典)从2003年5月到 2004年12月独立实验室对小鼠异种移植物进行的动物研究显示，与仅奥沙 利铂相比脂质体包被的奥沙利铂具有更好的治疗功效以及更低的毒性，而且 与游离药物奥沙利铂比较在小鼠和大鼠中表现出更好的耐受。而且在6-8次 静脉输注后的小鼠中，脂质体包被的奥沙利铂能引起多种人类癌症的完全消 失或缩小，比奥沙利铂的治疗更有效和毒性更低。
以16mg/Kg的剂量，间隔4天6次静脉输注后的小鼠中，显示脂质体包 被的奥沙利铂能引起人类乳腺癌的完全消失。另一方面，MTD(最大耐受剂 量)的游离药物奥沙利铂只能导致肿瘤的缩小，而非消失。
5mg/Kg游离奥沙利铂注射的小鼠死于毒性，剂量降低到4mg/Kg。脂质 体包被的奥沙利铂的剂量是16mg/Kg i.v.，毒性比4mg/Kg游离奥沙利铂更 低。在携带人类肿瘤的动物中，4mg/Kg游离奥沙利铂的抗癌功效比16mg/Kg 脂质体包被的奥沙利铂更低。
在所述研究动物中，脂质体包被的奥沙利铂的研究被报道。给大鼠腹腔 (i.p.)注射脂质体包被的奥沙利铂或作为对照的游离奥沙利铂，用于研究注射 后10分钟到7天的组织生物扰动。注射剂量为15mg/Kg的脂质体包被的奥 沙利铂后，总铂(Pt)在血浆中的最大水平是14.0mg/ml血浆，对比注射游离奥 沙利铂后是7.5mg/ml血浆；这些水平是在注射后10-15分钟达到的。肾组织 中也观察到类似于血浆的药物代谢动力学行为；在全部组织中，注射后最初 20分钟期间内血浆和肾脏具有最高水平的奥沙利铂。与相同剂量水平的脂质 体包被的奥沙利铂相比，游离奥沙利铂治疗后，在注射后40-190小时的延长 时期内，脾脏组织表现出超过2倍高水平的铂。11次重复施用脂质体包被的 奥沙利铂至大鼠后，在全部被检查的组织中，脾脏达到异常高水平的总铂(80 mg/g组织)。肝脏表现出类似的铂积累的药物代谢动力学，作为游离奥沙利铂 对比脂质体包被的奥沙利铂治疗后的时间函数。与脂质体包被的奥沙利铂比 较，在大鼠肾脏中10分钟到7天内，表现出类似的药物代谢动力 学行为，但是到4小时时两种药物在肝脏的药物代谢动力学是类似的，在7 天的时期内与比较脂质体包被的奥沙利铂能被更高地积累。大鼠 全生化和血细胞计数表明，与游离奥沙利铂比较脂质体包被的奥沙利铂表现 出更低的骨髓中毒性。大鼠中SGOT转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素、肌酐、 血尿素和血尿酸水平是持续正常的，没有来自脂质体包被的奥沙利铂的肝或 肾毒性。与其脂质体PEG化制剂一致，数据显示出脂质体包被的奥沙利铂在 大鼠组织中更长的贮留和更低的毒性。
用脂质体包被的奥沙利铂注射大鼠的药物代谢动力学研究
20只平均体重150g、2-3月龄的Wistar雌性大鼠用于药物代谢动力学研 究。用3mg/ml的脂质体包被的奥沙利铂悬浮液腹腔注射大鼠，终剂量为15 mg/Kg。每个时间点用两只动物。大鼠在注射后7分钟、20分钟、1.5小时、 3.75小时、24小时、40小时、90小时和170-180小时处死。血液收集到肝素 化的Eppendorf管里离心。用炉原子吸收(AA700 Perkin Elmer)测定血浆中总铂 的水平。
用脂质体包被的奥沙利铂重复注射大鼠进行组织学研究。我们对于确定 脂质体包被的奥沙利铂重复注射大鼠到其最大耐受剂量后对各种组织的损伤 有兴趣。
关于来自脂质体包被的奥沙利铂的毒性的大鼠中生化和血液学分析
用3mg/ml的脂质体包被的奥沙利铂悬浮液腹腔注射大鼠，终剂量为15 或30mg/Kg。用于血浆药物代谢动力学研究的大鼠血液(注射后7天)，也 经由独立的微生物学实验室用于分析骨髓、肾脏、肝脏和胃肠的功能。检查 的参数为血红素、血细胞比容、白细胞、粒细胞、血小板、SGOT转氨酶、 SGPT转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、尿素、尿酸和肌酐。
结果
大鼠中脂质体包被的奥沙利铂的毒理学
用游离奥沙利铂或脂质体包被的奥沙利铂注射大鼠，终剂量为15或30 mg/Kg。30mg/Kg奥沙利铂组严重影响食欲，表现出严重的体重减轻；30 mg/Kg奥沙利铂组治疗后7天，体重减轻33％；7天后全部动物的平均体重 从150g降到平均100g。作为对比，用同样剂量30mg/Kg脂质体包被的奥沙 利铂注射的动物表现出只有10％体重的减少(从平均150g到7天时最终 135g)。
注射后7天，从15mg/Kg治疗的动物抽取血液进肝素化或非肝素化的离 心管，经由独立的临床实验室进行全生化和血液学分析。每组使用两只动物。 表1显示两种测量的平均值。15mg/Kg奥沙利铂组的白细胞表现出下降到 800,000/mm3(根据WHO 4级毒性)，对比用脂质体包被的奥沙利铂治疗的 组为3,400,000/mm3(1级毒性)。因此，脂质体包被的奥沙利铂与游离奥沙 利铂比较，没有导致白细胞计数的大幅减少。与脂质体包被的奥沙利铂比较， 奥沙利铂也更高程度降低了血小板的水平。两种治疗的血红素水平都接近正 常。因此，两种药物的骨髓中毒性表现出更多指向白细胞和血小板而不是红 细胞生成的过程。两种药物都能升高SGOT转氨酶，具2级肝毒性；但是没 有影响SGPT转氨酶和碱性磷酸酶的水平；也没有影响胆红素、血尿素和肌 酐的水平(尽管血尿素的水平下降了)，与大鼠腹腔施用游离奥沙利铂或脂 质体包被的奥沙利铂没有引起肾毒性一致。
表2大鼠腹腔注射脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂后，骨髓、肝 和肾功能的变化。
大鼠的药物代谢动力学
大鼠直接腹腔注射3mg/ml脂质体包被的奥沙利铂或3mg/ml游离奥沙利 铂5％葡萄糖的储液，至终剂量为腹腔15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂或奥 沙利铂。在注射后的不同时间点取血，分离血浆，测量总铂水平用于药物代 谢动力学研究。图5A显示脂质体包被的奥沙利铂注射后20分钟，总铂达到 最高水平约14mg/ml血浆，对比游离奥沙利铂注射后10分钟，总铂达到最 高水平约8mg/ml血浆。在大约45分钟时，两组的总铂表现出相似的水平(约 5mg总铂/ml血浆)，然而注射脂质体包被的奥沙利铂后4-5小时获得总铂的 水平低于1mg/ml血浆，对比注射游离奥沙利铂后获得的总铂水平为约2mg/ml 血浆。注射脂质体包被的奥沙利铂40小时大鼠血浆中总铂的水平降到零，而 注射游离奥沙利铂的是约1mg总铂/ml血浆；注射游离奥沙利铂后约100小 时后，大鼠血浆中的总铂水平降到零(图5B)。
表3
根据15mg/Kg剂量的脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂， 计算总铂的平均药物代谢动力学参数，在表2中显示。
用线性梯形法外推到无穷确定AUC(Gibaldi等，1982 Gibaldi M，Perrier D： Noncompartmental analysis based on the statistical moment theory(基于统计矩理 论的非房室模型分析).In Pharmacokinetics，Gibaldi M，Perrier D(编)，pp 409-417，第2版.Marcel Dekker：New York，1982.)，脂质体包被的奥沙利铂的 AUC是53.7mg.h/ml，奥沙利铂的是74.4mg.h/ml。
对于脂质体包被的奥沙利铂，血浆达到的总铂最大浓度是14.0mg/ml， 游离奥沙利铂的是7.6mg/ml。对于脂质体包被的奥沙利铂，总身体清除率(Cl) 是0.28ml/g.h，游离奥沙利铂的是0.20ml/g.h。这是由Cl＝Di.v./AUC计算出 来的，其中Di.v.是脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂的腹腔注射剂量， AUC是这个特定剂量曲线下的相对面积。
脂质体包被的奥沙利铂的清除速率常数(Kel)是0.07h-1。这是用公式Kel＝ [Ln(Cp1)-Ln(Cp2)]/(t2-t1)通过对数血浆浓度-时间曲线的线性回归分析计算 出来，其中t1和t2是测量开始和终止的时间点，Cp1和Cp2分别是血清总铂 在t1和t2的开始和终止浓度。
脂质体包被的奥沙利铂的清除半衰期(t1/2)是10.2h。这是通过公式t1/2＝ 0.693(1/Kel)计算出来的。1/Kel是平均滞留时间(MRT)，统计矩类推到半衰期 t1/2(Gibaldi等，1982)。
用Lipoplatin治疗的动物中也测定了大鼠血浆的总铂水平，Lipoplatin 是一种不同的脂质体铂药物，目前处于三期评估中(Stathopoulos等，2005)。 Lipoplatin是一种脂质体顺铂，30mg/Kg i.p.用药。30mg/Kg Lipoplatin注射 后20分钟达到总铂最大水平～17mg/ml，与脂质体包被的奥沙利铂具有类似 的时帧(图6A)。也给大鼠腹腔注射最大耐受剂量5mg/Kg的顺铂作为对照； 顺铂注射后10分钟达到总铂最大水平～7.5mg/ml，与奥沙利铂具有类似的时 帧。全部四种药物在注射后～1.5小时，引起平行的药物代谢动力学行为；但 是，注射5小时产生～2.5mg总铂/ml血浆，随后奥沙利铂产生2.0 mg总铂/ml血浆，顺铂产生～1.5mg总铂/ml血浆，和脂质体包被的奥沙利铂 产生～1.0mg总铂/ml血浆。
脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂腹腔注射后，大鼠组织中总铂的 生物扰动
因为用原子吸收法检测铂的结果精确性和相对容易，研究铂药物在小鼠 或大鼠组织中的分布是很有用的。肾脏中的铂水平：15mg/Kg脂质体包被的 奥沙利铂注射后，肾脏中总铂的最大量为13.7mg/g组织，对比15mg/Kg奥 沙利铂注射后为～10.5mg/g组织，在注射后7-20分钟内达到(图7A)。但是 大约奥沙利铂注射后4小时后，肾脏中的铂水平达到4.8mg/g组织的最小值， 167小时轻微升高到6.9mg/g组织。肾脏中脂质体包被的奥沙利铂治疗后， 也有～1mg/g组织总铂的最小值，在注射后～20小时达到，188小时轻微升高 到2.5mg/g组织。因而，奥沙利铂对比同样剂量的脂质体包被的奥沙利铂治 疗，在注射后～7天肾脏表现出约3倍高水平的铂(图7B)。
作为比较，在肾脏中注射30mg/Kg Lipoplatin后达到最高水平为34mg/g 组织，对比注射5mg/Kg顺铂后为10mg/g组织。
Lipoplatin和脂质体包被的奥沙利铂在肾脏中的药物代谢动力学表现出 类似的行为。30mg/Kg Lipoplatin和15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂的最大 值分别为34和14mg/g组织。这点支持了两种药物在肾脏中的生物扰动的相 似性，所述两种药物具有共同的外壳但药物不同，药物限制在其内部和它们 靶向的肿瘤内。30mg/Kg Lipoplatin注射后120小时肾脏中总铂的水平是5 mg/g组织，对比15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂注射后是～2.5mg/g组织(图 3B)。15mg/Kg游离奥沙利铂注射后～140小时总铂为～7mg/g组织，对比5 mg/Kg顺铂注射后为～4mg/g组织(图3B)。
结论：
在7天时全部大鼠组织中肾脏中的铂水平是最高的，随后是肝脏和脾脏。
肝脏中的铂水平
15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后～7-10分钟，肝脏中的总铂 是3.5mg/g组织，20分钟时突然下降到2.5mg/g组织，此后这个水平维持了 5小时(图8A)。相反，用同样剂量的游离奥沙利铂腹腔注射大鼠在肝脏中 产生类似的总铂水平(3.0-3.5mg/g组织)，所述水平在注射后约30分钟达到， 维持了2小时，接着在5小时逐渐下降到1.5mg/g组织(图4A)。脂质体包 被的奥沙利铂和游离奥沙利铂治疗后170-190小时，不像血浆中的铂水平在 约40小时后下降到零，肝聚集铂为～2mg/g组织(图8B)。
作为比较，注射后肝脏中总铂的水平是7mg/g组织， 维持了～5小时(图8A)，在～12小时降到4.5mg/g组织，在24小时升高到 6.5mg/g组织，在120小时逐渐下降到3.5mg/g组织(图4B)。顺铂也表现出 与类似的模式，20分钟时达到最大水平2.5mg/g组织，维持了5 小时(图4A)，然后从24到150小时逐渐降到1(图8B)。
脾脏中的总铂：15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂施用后，脾脏中总铂的 最大量是3.2mg/g组织，对比15mg/Kg奥沙利铂施用后为～5.2mg/g组织，而 且在注射的15-20分钟达到(图9A)。脂质体包被的奥沙利铂与奥沙利铂施 用后，到注射后～5小时分别轻微下降～2和～4mg/g组织。此后注射脂质体包 被的奥沙利铂的脾脏中总铂的水平升高，在～45小时达到～4.5mg/g组织，随 后在190小时下降到～2mg/g组织。相反，游离奥沙利铂注射后脾脏中总铂水 平持续积累，在168小时达到18.5mg/g组织(图9B)。这伴随着在7天时 脾脏重量的巨大减少，推测由于游离奥沙利铂的毒性引发脾细胞的凋亡。事 实上，研究前小鼠的平均体重是150g，7天时终体重是109g，脾脏的重量是 0.188g。
用脂质体包被的奥沙利铂治疗动物的脾脏中有瘀血(血液聚集)。
但是，游离奥沙利铂治疗约1小时后，肾脏中的铂水平高于脂质体包被 的奥沙利铂治疗；它们在12-24小时达到最小值(奥沙利铂注射后是5mg/g 组织，脂质体包被的奥沙利铂注射后是1mg/g组织)，而且又开始升高；注 射奥沙利铂后170小时肾脏组织表现出7mg铂/g组织，而注射脂质体包被 的奥沙利铂后是2.5mg铂/g组织(图5B)。
脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂注射后，检查的所有大鼠组织中 总铂的比较测量在图10中总结。15mg/Kg奥沙利铂注射后20分钟，全部组 织中血浆总铂水平达到最高(14.2mg/ml)；脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后 ～10分钟，肾脏组织达到相对高的水平(13.8mg/ml)(图10A)。下一个水平包 括奥沙利铂注射后肾脏中的铂和奥沙利铂注射后血浆中的铂。脾脏表现为下 一个较高的水平(15mg/Kg奥沙利铂注射后5mg/g组织)，所述水平持续升 高，24小时后变得最高，170小时甚至达到更高(18.5mg/g组织)。因此总 体上，奥沙利铂注射后脾脏最终积累了最高水平的铂。在这个方面，游离奥 沙利铂或脂质体包被的奥沙利铂注射后脾脏中铂积累之间的差异是明显的 (图10B)。
4种药物腹腔注射后，大鼠组织中最大水平的铂(以mg铂/ml血浆或每g 组织表示)(ND，未测定)
脂质体包 奥沙利铂 顺铂
药物&剂量
被的奥沙 15mg/Kg 30mg/Kg 5mg/Kg
利铂
15mg/Kg
肾脏 13.7 10.5 33.2 10.2
血浆 14.0 7.6 16.6 7.5
肝脏 3.5 3.1 6.9 2.7
脾脏 3.1 5.1 3.5 1.1
肺 3.7 3.2 7.5 2.0
心脏 1.8 1.1 4.5 0.8
脑 ND ND 1.7 0.3
5小时
脂质体包 奥沙利铂 顺铂
药物&剂量
被的奥沙 15mg/Kg 30mg/Kg 5mg/Kg
利铂 估计
15mg/Kg
估计
肾脏 2.0 5.0 4.2 6.8
血浆 0.9 1.7 2.4 1.1
肝脏 2.4 1.5 6.8 2.4
脾脏 1.8 3.8 2.7 1.2
肺 0.8 1.7 0.6 0.7
心脏 0.3 0.8 0.2 0.2
脑 ND ND 0.1 0.1
5-7天
脂质体包 奥沙利铂 顺铂
药物&剂量
被的奥沙 15mg/Kg 30mg/Kg 5mg/Kg
利铂
15mg/Kg
肾脏 2.5 6.9 5.2 4.1
血浆 0 0 0.1 0.1
肝脏 2.2 1.8 3.5 1.1
脾脏 2.3 18.5 4.9 1.5
肺 0.4 2.4 0.2 0.3
心脏 0.6 0.5 0.1 0.1
脑 ND ND 0.1 0
表4脂质体奥沙利铂、游离奥沙利铂、脂质体顺铂和游离顺铂注射后7-20 分钟、5小时和5-7天时，不同大鼠组织中总铂水平的比较
脂质体包被的奥沙利铂治疗后5-7天肾脏、脾脏和肝脏具有显著的铂水 平。
游离奥沙利铂治疗后5-7天脾脏、肾脏、肺和肝脏具有显著的铂水平。
治疗后5-7天肾脏、脾脏和肝脏具有显著的铂水平。
顺铂治疗后5-7天肾脏、脾脏和肝脏具有显著的铂水平。
数据显示15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后与15mg/Kg游离 奥沙利铂比较：
1.脂质体包被的奥沙利铂注射后总铂的血浆水平是14mg/ml血浆，奥沙 利铂注射后总铂的血浆水平是7.6mg/ml血浆
腹腔注射约7-20分钟内达到最大值
这表示脂质体包被的奥沙利铂与奥沙利铂相比具有更长的循环。
2.脂质体包被的奥沙利铂(14mg/g组织)与游离奥沙利铂(11mg/g)相比， 在注射后最初的15分钟肾脏中的水平更高，但是在1.5小时和此后肾脏中的 水平变成游离奥沙利铂(6.7mg/g组织)比在1.5小时时脂质体包被的奥沙利铂 (2.3mg/g)的更高。
3.游离奥沙利铂(3.8mg/g组织)与脂质体包被的奥沙利铂(1.8mg/g)比较， 注射后1.5小时脾脏中的水平更高。
4.两种药物心脏中的水平相当并且是低的
血浆中的铂水平：15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后，血浆中 的总铂最大值是14mg/ml，与15mg/Kg奥沙利铂注射后是～7.5mg/ml组织比 较，这些值在注射后7-20分钟内达到(图10A)。但是约1小时后，来自游 离奥沙利铂比来自脂质体包被的奥沙利铂治疗的血浆中铂水平变得更高，而 且维持贯穿剩下的曲线直到50小时，此时脂质体包被的奥沙利铂的水平变为 零，到100小时时游离奥沙利铂的水平变为零。
肾脏中的铂水平：15mg/Kg Lipoxal注射后，肾脏中的总铂最大值是13.5 mg/g组织，与15mg/Kg奥沙利铂注射后是～10.5mg/g组织比较，这些值在注 射后15-20分钟内达到(图10A)。但是约4小时后，游离奥沙利铂注射后 的肾脏中的铂水平达到最小为4.8mg/g组织，167小时轻微升高到6.9mg/g 组织。脂质体包被的奥沙利铂治疗后，肾脏中总铂也达到最小为～1mg/g组织， 是在注射后～20小时达到，188小时轻微升高到2.5mg/g组织。因而游离奥沙 利铂治疗注射后～7天，肾脏表现出比同样剂量的脂质体包被的奥沙利铂治疗 约3倍高水平的铂。在全部大鼠组织中，肾脏中铂的水平是最高的，然后是 肝脏和脾脏。
脾脏中的铂水平：15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂注射后，脾脏中的总 铂最大值是14mg/ml，与15mg/Kg游离奥沙利铂注射后是～7mg/g组织比较， 这些值在注射后15-20分钟内达到(图10A)。但是约1小时后，来自游离 奥沙利铂比来自脂质体包被的奥沙利铂治疗的肾脏中铂水平变得更高，它们 在大约12-24小时显示最小(奥沙利铂注射后是5mg/g组织，脂质体包被的 奥沙利铂注射后是1mg/g组织)，又开始升高；游离奥沙利铂注射后170小 时，肾脏组织显示7mg铂/g组织，而脂质体包被的奥沙利铂显示2.5mg铂 /g组织(图10A)。
药物治疗导致体重差异和组织尺寸减小
用脂质体包被的奥沙利铂(15mg/kg)和游离奥沙利铂(15mg/kg)治疗的动 物，在药物腹腔注射后7.8和7天处死，在总体重减轻和单个器官重量上表 现出巨大的差异。
表5奥沙利铂治疗后恶病质(cahexia)导致体重减少。用同等剂量的脂质 体奥沙利铂治疗的动物表现出更小的总重量或器官重量减少。脾脏显示为被 游离奥沙利铂影响最大的组织。
用游离奥沙利铂治疗的动物在用药后7天表现出巨大的重量减轻，所述 减轻在治疗时被估计为超过40gr总体重。而且，脾脏组织的尺寸显著减小， 是铂浓度极其高的值(18.5mg铂/g组织)的反映。
游离奥沙利铂用药后食欲的降低和药物毒性导致重量减轻和脾脏尺寸减 小；这些现象在用药7天后处死动物中观察到，因此显示出游离奥沙利铂腹 腔注射后7天组织图表中的高铂浓度值。
对于其它组织也可考虑同样的影响，只要全部游离奥沙利铂组织图表(肝 脏、肺、心脏、脾脏和肾脏)中的铂浓度值在时间点(7天)表现出升高。
用5mg/Kg奥沙利铂注射的小鼠死于毒性，剂量降低到4mg/Kg。Lipoxal 的剂量是16mg/Kg i.v.，毒性比4mg/Kg奥沙利铂更低。对于携带人类肿瘤的 动物，4mg/Kg奥沙利铂的抗癌功效比16mg/Kg Lipoxal更低。
实施例2B
I期临床研究
研究的目的是a)评估脂质体包被的奥沙利铂的不利反应和检测剂量限 制性毒性(DLT)以及最大耐受剂量(MTD)。患者和方法：研究总共包括27名 晚期疾病患者。根据既定的指导方针，用标准化疗预治疗全部患者。在进入 目前试验时，全部处于复发或进行性的疾病中。全部患者患有胃肠癌IV期(结 肠、胃和胰腺癌)。我们设定了6个不同剂量水平的脂质体包被的奥沙利铂， 每个水平至少包括3名患者。剂量水平是：1)100mg/m22)150mg/m23)200 mg/m24)250mg/m25)300mg/m26)350mg/m2。8名另外的患者用300mg/m2 作为MTD治疗。治疗每周一次，连续3周，每4周重复。结果：前4个剂量 水平(100-250mg/m2)没有观察到严重的副作用。水平5和6观察到轻微的骨 髓中毒性和恶心。最常见的不利反应是II级外周神经病变，在全部4名350 mg/m2治疗的患者中观察到。因此我们认为350mg/m2水平是DLT，300mg/m2 水平是MTD。27名患者中，3名显示部分反应，18名患者具有4个月的稳定 疾病，中值范围(2-9)。结论：在目前I期研究中我们发现，300mg/m2和350 mg/m2剂量水平的最常见毒性是外周神经病变。脂质体包被的奥沙利铂被良 好耐受，显著减少了游离奥沙利铂的全部其它副作用，尤其是骨髓中毒性和 胃肠道毒性。这些初步的结果显示了在预治疗患者中的适当功效。
所述研究是用脂质体包被的奥沙利铂()进行的临床试验，具有以 下首要目的：a)确定每周Lipoxal用药的提高剂量的剂量限制性毒性(DLT)和 最大耐受剂量(MTD)，b)检测预治疗晚期胃肠癌患者中，lipoxal单一疗法的毒 性特征和药物代谢动力学。第二目的是功效和存活率。
患者和方法
研究是I期群组，脂质体包被的奥沙利铂剂量升高试验。研究方法经我 们的机构审查委员会审查和批准。患者阅读了满足全部机构要求的通知同意 文件，签字作为注册的一个条件。
合格标准
全部患者需要符合以下标准：确认癌症的组织学或细胞学诊断，至少一 种二维可测或可评估的疾病，WHO体力状态为0-2，平均寿命预期超过3个 月，用标准或第一线化疗预治疗和进入时对任何细胞毒素治疗具顽固性。如 果患者具有2或3项前面的条件就是合格的，条件是他们断开治疗至少3周。
评估
合格的患者超过18岁，要求具有由下述确定的足够的血液、肾和肝功能： 白细胞计数3.5 x 109/l、绝对中性粒细胞计数1.5 x 109/l，血小板计数100 x 109/l， 血红素水平9g/dl，总胆红素水平1.5mg/dl，ALT和AST是无肝转移灶时正 常上限2倍或证明有肝转移灶的情况下正常上限的5倍，肌酐水平1.5mg/dl。 治疗前完成病史、体检、生命体征的评估、心电图、胸和腹的计算机断层成 像(或超声波检查)。治疗期间(每个疗程前1天)完成血细胞计数、血尿 素和血糖、血清肌酐和尿素测试以及ECG。至少每周8次药物注射后或疾病 发展早期进行CT扫描评估。
治疗
药物特性：以3mg/ml、每玻璃管50ml、每玻璃管150mg奥沙利铂的形 式提供。脂质体包被的奥沙利铂4摄氏度、避光储存。脂质体药物的特性： 脂质体包被的奥沙利铂稀释在1升5％葡萄糖中，每周一次3小时静脉输注连 续8周。有副作用尤其是骨髓中毒性或神经毒性时，治疗给药将延迟1周进 行。不需要提前或之后水合。没有计划预防性施用其他药物例如antihemetic 或抗过敏药。有恶心或呕吐时，给予止吐药(昂丹司琼(Ondasetron))或抗过敏 药(地塞米松)的支持。
前面进行的动物研究中，大约400mg/m2到600mg/m2被定义为MTD。 人类中我们决定从100mg/m2剂量开始作为剂量1。剂量的提高被决定为50 mg/m2每水平。表1呈现了每组患者脂质体包被的奥沙利铂的剂量提高。
评估治疗每周期的药物相关毒性和根据WHO标准进行评级。DLT被定 义为任一3或4级毒性，50％的患者观察到与长于72小时持续发热相关的中 性粒细胞计数<500mm2。如果在至少50％的患者中观察到其它3级毒性尤其 是神经毒性也被认为是DLT。低于DLT的一个剂量水平被定义为MTD。每 个剂量水平安排最少3名患者的群组进入。全部3名患者接受第一周期前面 剂量的治疗后，而且每人至少被观察3周，没有DLT的迹象，剂量才升高到 下一个更高的水平。如果某个水平的第一个患者在3周治疗的第一个时期经 历了DLT，将另外两个患者加入所述剂量水平。中断DLT发生的治疗，患者 在更低的水平继续治疗。
药物代谢动力学
用于药物代谢动力学研究的患者在以下时刻取血。0(药物注射前)和注 射开始后2、4、8、24、48、72、120(5天)和168(7天)小时。3ml血液 抽取进含有EDTA或肝素的管中，然后离心，2℃致冷，最后送往实验室分析 总铂水平。使用5名患者的样品。用原子吸收法(Perkin Elmer AA 700Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometer(石墨炉原子吸收光谱仪)at Regulon A.E.)测量铂水平(总的和血清超滤液)。在某一剂量水平(200mg和300 mg/m2)：血浆浓度-时间曲线(AUC)下面的面积，Cmax(血清中总铂的最大 浓度)。总身体清除率(Cl)是由CL＝Div/AUC计算出来的，其中Div是 Lipoplatin的静脉内剂量，AUC是特定剂量曲线下的相对面积。Kel(清除速 率常数)是用公式Kel＝[Ln(Cp1)-Ln(Cp2)]/(t2-t1)通过对数血浆浓度-时间曲 线的线性回归分析计算出来，其中t1和t2是测量开始和终止的时间点，Cp1 和Cp2分别是血清总铂在t1和t2的开始和终止浓度。
t1/2(清除半衰期)是通过公式t1/2＝0.693(1/Kel)计算出来的。1/Kel是 MRT(平均滞留时间)，统计矩类推到半衰期t1/2(Gibaldi等，1982)。实际上， MRT代表清除用药剂量63.2％的时间。
结果
患者
表5显示患者的特征。总共登记了27名患者。年龄32-78，中值年龄62， 男性18名，女性9名，P.S.0-2。全部患者用化疗预治疗。预治疗每肿瘤。
毒性
脂质体包被的奥沙利铂的胃肠道毒性可忽略不计。不用止吐药 (Ondosetron)会观察到恶心或轻微呕吐。但是用Ondosetron没有观察到恶心呕 吐。也没有腹泻。轻微或1级骨髓中毒性(中性粒细胞减少)只在最高剂量 (350mg/m2)用药的2名患者(％)中发现。没有发现肝毒性、肾毒性、心脏 毒性和脱发。3名患者出现了轻微衰弱。
主要副作用是神经毒性，至少3次药剂注射后被发现，第三和第四水平 时是1级，第五水平时是2级，第六水平的100％患者是2级。
在这些结果的基础上，认为3级是剂量限制性毒性，在用350mg/m2脂 质体包被的奥沙利铂治疗的100％患者中观察到。低于300mg/m2的一个剂量 被定义为最大耐受剂量(MTD)。表5显示的是脂质体包被的奥沙利铂的剂 量升高和用六种水平中的每个治疗的患者数目。
药物代谢动力学：结果在表7、图15和16中表示。发现在血浆浓度中 奥沙利铂的半衰期是24小时，7天内整合到尿排泄。
治疗的顺应性
施用总数为104次注射(周期)，中值是每名患者4周期(范围2-15)。 周期间的中值间隔是7天。剂量强度是计划的100％。因为没有检测到血液 学3或4级的毒性，没有患者发生治疗延迟。只有用350mg/m2剂量的患者在 最多4或5次注射(周期)后间隔了2周，然后分类到300mg/m2的低剂量。 某些患者由于4-6周期后疾病发展停止了治疗。这点应用于17名病人(62.9％)。 12名病人(44.4％)仍然在研究终止时存活。死亡的原因是疾病发展。
治疗反应
在意向治疗的基础上分析反应。没有完全的反应。27名中的3名患者(11.1 ％)表现出部分反应。这些患者中2名胃癌患者，1名有胸腔积液和另一名有 骨骼转移灶；第三名患者有来自结肠癌的肝转移灶。部分反应的检测基于对 第一名患者的CT扫描，第二名患者的骨骼扫描和第三名患者的CT扫描和胆 红素血清水平检测。两张图代表：图1第二名患者治疗前和治疗后的骨骼扫 描，以及第三名患者的胆红素血清水平曲线。异常地，我们治疗第三名患者 时，其血清胆红素水平是51mg/dl，两个疗程后其水平下降到8mg/dl，持续 了5周。
对于每名患者反应的持续时间分别是4、7和2个月。18名患者(66.66％) 表现出稳定的疾病，中值持续时间是4个月(范围是2-9个月)。根据不再 有效的分类，5名患者可被分类为较小反应。6名患者表现出疾病发展。全部 3名有反应者中存在50％或更多标志物CA-19-9的减少。而且全部3名有反 应者的体力状态从2提高到1。
结论
作为具胃肠系统晚期癌症患者的单一疗法(单个治疗)，在当前试验(实 施例)中检测了脂质体包被的奥沙利铂。全部患者用标准治疗预治疗，全部 包括结肠患者也用游离奥沙利铂治疗。用脂质体包被的奥沙利铂治疗只在临 床前研究中被检测。目前没有其它临床试验完成。本试验基于临床前研究的 数据和非脂质体(游离)奥沙利铂的经验和数据。最后主要帮助我们目前的 试验集中在评估脂质体包被的奥沙利铂与裸露的(游离)奥沙利铂的相似性 或差异。显示大大降低了胃肠道和血液学副作用。保持无任何差异-任何减 少的唯一的副作用是神经毒性。经常看到神经毒性类似地随药剂剂量的增加 而或多或少地增加，作为定义剂量限制性毒性的唯一或主要标准。MTD定义 的剂量是每周用药300mg/m2。附加的神经毒性也会出现，用非脂质体奥沙利 铂时也会发生(参考)。在功效方面，在预治疗难治的目前已建立肿瘤的患 者中观察到11％的反应率，对于在联合化疗模式的将来试验有某种意义。
这种研究已确立了MTD，需要进一步考察，尤其是混用其它药剂。
结果，这个实施例显示脂质体奥沙利铂是一种耐受良好的药剂。剂量300 mg/m2被定义为MTD。与奥沙利铂的裸露形式比较，胃肠道和骨髓毒性被大 大降低。唯一保留的不利反应是神经毒性，被定义为DLT。
表6 脂质体包被的奥沙利铂剂量升高
表7 基线患者的特征
剂量 (mg/m2) Cmax (μgPt/ml) AUC (μgPt*h/ml) Cl (L/h*m2) Kel (l/h) t1/2 (h) Vss (L/m2) 250 9.175 424.4 0.289 0.028 24.3 9.7 350 12.087 782.3 0.219 0.020 35.5 10.9
表8对于患者Lipoxal血浆药物代谢动力学参数的评估(见参数定义的 文字)
参考文献
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CRF Lipoxal
200mg/m2每周
参与者的名字(或编码)：—Psa.Ath.
癌症类型：胃、4期
Lipoxal治疗前
骨髓功能
血细胞(gr/dl)13.0
白细胞(1,000/mm3)3.7
血小板(1,000/mm3)207
肾脏功能
血尿素(mg％)22
肌酐(mg％)0.4
尿酸(mg％)4.3
第4次注射Lipoxal后7天
取血进行生化检验的日期2/11/2004
骨髓功能
血细胞(gr/dl)12.3
白细胞(1,000/mm3)7.1
血小板(1,000/mm3)315
肾脏功能
血尿素(mg％)...15
肌酐(mg％)0.5
尿酸(mg％)4.1
第9次Lipoxal注射后7天
骨髓功能
血细胞(gr/dl)9.8
白细胞(1,000/mm3)2.6
血小板(1,000/mm3)277
肾脏功能
血尿素(mg％)...17
肌酐(mg％)0.40
尿酸(mg％)3.5
第12次Lipoxal注射后7天
骨髓功能
血细胞(gr/dl)8.6
白细胞(1,000/mm3)...3.0
血小板(1,000/mm3)...236
肾脏功能
血尿素(mg％)18
肌酐(mg％)0.41
尿酸(mg％)3.7
第16次Lipoxal注射后7天
骨髓功能
血细胞(gr/dl)11.1
白细胞(1,000/mm3)...6.1
血小板(1,000/mm3)263
肾脏功能
血尿素(mg％)29
肌酐(mg％)0.51
尿酸(mg％)4.8
实施例III
在预治疗的晚期胰腺癌患者中，脂质体顺铂与吉西他滨并用：1-2期研究
目的：目前描述的试验是1-2期研究，所述研究基于新型脂质体包被的 顺铂(商标，由Mountain View，CA的regulon Inc.生产)。目前 临床前和临床数据(1期药物代谢动力学)引发对于包括和吉西 他滨的联合治疗模式的研究。
患者和方法：吉西他滨的剂量保持标准在1000mg/m2，lipoplatin的剂量 从25mg/m2升高到125mg/m2。对晚期预治疗的胰腺癌患者施用治疗，所述 患者对目前包括吉西他滨的化疗表现顽固。
结果：125mg/m2被定义为剂量限制性毒性(DLT)，100mg/m2 被定义为与1000mg/m2的吉西他滨并用的最大耐受剂量(MTD)。初步目标反 应率数据显示了在2/24名患者(8.3％)有部分反应，14名患者(58.3％)的疾病稳 定，中值持续时间3个月(范围2-7个月)，8名患者(33.3％)临床有益。
结论：脂质体包被的顺铂是裸露的顺铂的无毒替代药剂。与吉西他滨并 用时，MTD为100mg/m2，在难治胰腺癌中表现出有潜力的功效。
顺铂(顺式-PtCl2(NH3)2)世界范围内用于治疗睾丸癌和卵巢癌和膀胱、 头、颈癌、肺和胃肠肿瘤癌以及很多其它的癌症(1-7)。尽管顺铂抗击这些 肿瘤非常有效，但是与包括肾毒性(8)、耳毒性、神经毒性、恶心和呕吐(7-9) 的严重副作用相关。碳铂是一种顺铂的类似物，对肾脏和神经系统的毒性比 顺铂显著降低，引发的恶心和呕吐也减少，然而大体上(确定对卵巢癌和非 小细胞肺癌)保留了等效的抗肿瘤活性。但是用碳铂比顺铂在血液学的不利 影响更经常(10，11)。
吉西他滨(商标，EIi Lily，Indianapolis，IN)是一种核苷酸类似物， 与顺铂并用施药作为患不能手术的、局部晚期(3A或3B期)或转移(4期) 非小细胞肺癌患者的第一线治疗，而且作为局部晚期(非可切除3期)或转 移(3B、4期)胰腺癌患者的前线治疗(12-14)。主要的不利反应是骨髓中 毒性。使用混合的吉西他滨和铂的优势归结为铂-DNA加合物修复涉及的 DNA合成路径的抑制。吉西他滨和顺铂协同作用，增加了铂-DNA加合物的 形成，诱导卵巢癌细胞系中核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸池的依赖于浓度和 混合的变化(15)。
关于(Regulon Inc.，Mountain View，CA)的目前研究显示：低毒 性、在肿瘤中聚集和逃避免疫细胞和巨噬细胞的能力、肾脏缓慢的清除率、 在体液中长期循环的特性、血液中36小时的半衰期和有潜力的治疗功效 (16)。在目前1-2期的研究中，我们试图探索Lipoplatin-吉西他滨并用的 治疗功效和毒性，给晚期预治疗的胰腺癌患者每14天用药。我们的首要目标 是决定毒性和最大耐受剂量(MTD)，我们的第二目标是决定反应率和临床益 处。
患者和方法
患者大于18岁，患组织学或细胞学确认的胰腺癌和二维可测的疾病，所 述患者经过化疗预治疗，患有复发的或非反应的疾病，登记加入研究。其它 合格的标准包括世界卫生组织(WHO)体力状态(PS)为0-2，平均寿命预 期至少3个月，足够的骨髓储备(粒细胞计数≥1,500/dl，血小板计数≥ 120,000/dl)、正常的肾脏(血浆肌酐浓度<1.2mg/dl)和肝功能检测(总血 清胆红素浓度<3mg/dl，条件是血清转氨酶和血清蛋白是正常的)、正常的 心脏功能前6个月没有临床不稳定性心绞痛、心肌梗塞或充血性心力衰竭的 病史、无中枢神经系统并发症。先前的手术是允许的，条件是至少发生在3 周前。从研究中排除患主动侵染、营养不良或第二种原发肿瘤(除了非黑色 素皮肤上皮癌或原位宫颈癌)的患者。全部患者交出了他们的书面通知同意 书而参与研究。
治疗计划
计划是将与吉西他滨并用。施用由Regulon Inc.提供的 ，在1和15日进行8小时静脉输注；选择8小时是基于我们在1 期临床中的经验，为了能控制可能的不利影响。吉西他滨在500ml正常盐水 中在1和15日60分钟静脉输注给药，剂量为1000mg/m2，周期是每4周重 复(28天)。在1和15日的注射被认为是1周期。条件是患者已经从药物相 关的副作用中充分恢复，给全部患者施用标准的昂丹司琼(ondansetron)止 吐药治疗。不允许重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的预防性用药。中性 白细胞减少症3级的情况下，这些患者将接受随后的在第6或7天培非司亭 6mg注射，推迟治疗1周。实施治疗至少3周期或直到疾病发展。研究是1/2 期群组，和吉西他滨的剂量升高试验。目的是决定并用的剂量限 制性毒性(DLT)和定义最大耐受剂量(MTD)作为2期的推荐剂量，收集对于患 胰腺癌预治疗患者药物功效的初步数据。单独药剂的骨髓中毒性 在目前1期研究中被认为是非常轻微的(16)。我们以低剂量开 始，并用骨髓毒性药剂吉西他滨，主要是决定骨髓不利反应的程度。 的开始剂量是25mg/m2，每个剂量水平增加25mg/m2(表1)。 方法经医院的伦理和科学委员会批准。
剂量调整标准基于血液学参数。在3或4级发热性中性白细胞减少症的 情况下，如上所述用培非司亭预防性用药重复随后的周期。在发热性中性白 细胞减少症或3或4级中性白细胞减少症的情况下，尽管施用rhG-CSF，在 随后的注射治疗中吉西他滨和Lipoplatin的剂量减少25％。在3或4级血小 板减少症持续超过5天的情况下，两种药物的剂量也都减少25％。根据WHO 指导方针给毒性评级。
患者评估
预治疗评估包括完整的医疗史和体检、全血细胞计数包括分化的白细胞 和血小板计数、标准生化特征(和必要时的肌酐清除)、血清癌胚抗原(CEA) 和CA 19-9测定、心电图、胸透、上腹超声波检查和胸腔、上和下腹的计算 机断层(CT)扫描。在临床适应症上完成附加的成像研究。每周进行有分化 的全血细胞计数；在3或4级中性白细胞减少症或4级血小板减少症情况下， 每天评估有分化的全血细胞计数，直到绝对粒细胞计数>1,000/dl，而且血小 板计数>75,000/dl。为了记录疾病的症状和治疗毒性，治疗的每个疗程前进行 详细的医学和身体检查。每6周进行生化检测、ECG、血清CEA和CA19-9 测定和胸透，通过临床检查进行神经系统的评估。每个周期后测量损伤，如 果损伤通过体检或胸透可查到；3个化疗周期后，可检查的损伤通过超声波 检查或CT扫描进行评估。
反应的定义
完全反应(CR)被定义为可测量或评估的疾病、征象和症状以及与肿瘤相 关的生化变化至少消失4周，在所述时间内没有新的损伤出现。部分反应(PR) 被定义为全部可测量损伤的垂直直径的乘积之和比预治疗的测量有>50％的 减少，持续至少4周，在所述时间内没有新的损伤出现或没有现存的损伤扩 大。对于肝损伤，从锁骨线肋骨边缘和剑突到肝脏边缘所测量的距离之和需 要>30％的减少。稳定疾病(SD)被定义为全部测量损伤的两个垂直直径乘 积之和<50％的减少和<25％的增加，而且没有新的损伤出现持续8周。发展 的疾病(PD)被定义为任何可测量损伤的两个垂直直径乘积比进入研究时的 尺寸或者对于有反应的病人，是最大退行时刻和恶性疾病新面积出现时的尺 寸增加>25％。内窥镜逆行胆总管胰腺造影术(ERCP)或导管组后没有恢复而 胆红素升高，被认为是疾病发展。体力状态的两步恶化，预治疗重量>10％ 的减少或症状增加本身不构成疾病的发展；但是，这些症状的出现后要对疾 病的程度进行新的评估。全部反应必须维持至少4周，由独立的放射科医师 小组确认。
结果
患者人口统计
从2003年1月到2004年12月，24名患者(11名男性，13名女性；中 值年龄66岁，范围是47-80岁)登记进入研究。患者的特征如表2显示。4.2％ 患者的WHO体力状态是0，45.8％的是1，50％的是2。绝大多数患者是4期 (79.2％)。全部患者经历了之前的化疗：11名患者用吉西他滨作为单一药剂治 疗，13名用吉西他滨和伊立替康(irinotecan)并用治疗。
剂量强度
患者共接受36个疗程(每2周108次注射)治疗，疗程的中值数目是2 (范围1-5)。24名患者中，10名完成了3个疗程。任一药物没有剂量减少， 患者接受了每种药物99.5％的计划剂量强度(范围93-100％)，直到第四个 剂量水平。
毒性
没有观察到神经毒性或肾毒性。在注射开始时，10/24名患者 中观察到持续2-4分钟的短期腹痛，可自愈。在第五个剂量水平，4名患者中 2名被观察到3级骨髓中毒性。没有观察到发热性中性白细胞减少症。毒性 如表3和4显示。第五个剂量水平(125mg/m2lipoplatin和1000mg/m2吉西他 滨)被认为是DLT和剂量水平4为MTD。4名附加患者用第四剂量水平治疗。
治疗的反应
两名独立的放射学工作者和两名有经验的肿瘤学专家，用计算机断层成 像完成可测量反应的决定。没有检测到完全反应。2名患者(8.3％)在6和5个 月期间完成了PR。14名患者(58.3％)被观察到中值持续时间3个月(范围2-7 个月)的稳定疾病。8名患者(33.3％)被观察到主要由于疼痛减轻的临床有益。 在研究终止时，7名患者(29.2％)仍然存活。从二线治疗开始，中值存活率是 4个月(范围2-8+个月)。
结论
这种新的脂质体包被的顺铂()主要目的在于避免在顺铂用药 中常见的肾毒性，并且同时产生类似的功效。正如在动物研究中以及患者的 临床试验中显示的，的药物代谢动力学不同于顺铂(16)。当 作为单一药剂施用时显示，没有毒性是一个很大的优势。目前的 1-2期试验中，通过和吉西他滨并用来研究毒性和功效，吉西他滨 的毒性被很好地定义了，尤其当与其它药剂并用时(5)。顺铂-吉西他滨并 用可类似地用于非小细胞肺癌、尿路上皮癌和胰腺癌的治疗(5，7，12)。 看来目前试验的数据显示了非常低毒性的优势。当吉西他滨保持在标准剂量 1000mg/m2时，每2周施用的并用药物被良好耐受到剂量100mg/m2 。在125mg/m2剂量时，骨髓中毒性达到3和4级，因 此这个剂量被认为是DLT。100mg/m2和1gr/m2吉西他滨被认为 是MTD。药物并用在8.33％患者中实现了目标反应，疾病稳定的是58.3％和 疼痛减轻的是33.3％。考虑到之前包括吉西他滨的治疗时，全部患者是难治 的或在疾病发展中，这里得出的反应率应该归功于的加入。
脂质体包被的顺铂与吉西他滨并用，在晚期预治疗的胰腺癌患者中每2 周施药，MTD分别为100mg/m2和1000mg/m2。这是耐受良好的治疗，而且 有功效的潜力征象。
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表1 和吉西他滨剂量升高。剂量水平患者数量 吉西他滨(mg/m2/周)(mg/m2/周)第一4 25 1000，第二4 50 1000，第三4 75 1000，第四4+4 100 1000，第五4 125 1000。
表2患者在基线的特征。数量％登记的患者数量24100年龄(岁)中 值66范围47-80性别男性11 45.8女性13 54.2体力状态(WHO)0 14.2 1 11 45.82 12 50.0疾病III期5 20.8IV 19 79.2组织学良好分化3 12.5中 等分化12 50.0低分化9 37.5之前治疗吉西他滨1克/m2天1、8、15/每 四周11 45.8吉西他滨900mg/m2+天1、8/每三周+13 54.2依立替康 300mg/m2天8/每三周
表3 血液学毒性
剂量水平患者数量吉西他滨毒性最大毒性 mg/m2mg/m2患者数量毒性(等级)类型第一25 1000，第二50 1000，第 三75 1000，第四100 10002/4*2-3中性白细胞减少症，第五125 1000 2/4 3-4中性白细胞减少症*最初4例患者。
表4 非血液学毒性剂量
1级2级3级4级水平n(％)n(％)n(％)n(％)恶心5(20.8)呕 吐14(58.3)疲劳8(33.3)腹泻2(8.3)心脏毒性神经毒性3(12.5)肾毒性 血栓发作4(16.7)
图2：患结肠癌和肝转移灶的患者(TK)中胆红素的降低。由于血液中 非常高水平的胆红素(50mg/100ml)，患者患有肝病。在第1日、8日、15日 和22日以200mg/m2的剂量注射脂质体奥沙利铂，引起了总胆红素从50到 12mg/m2的逐步降低。这种降低最有可能缘自阻塞胆管的肝转移灶的减少。 而且第31日和37日的治疗没有如胆红素水平推论的阻止疾病的发展。
图3：使用脂质体奥沙利铂的单一疗法减少了骨转移灶。患有胃癌和骨 转移灶的患者(EK)用每7天150mg/m2的剂量治疗10周。产生了显著的生命 质量的改善，少得多的疼痛、更少镇痛药的使用以及患者能进行日常工作。
图4：顺铂和奥沙利铂共包被进同一脂质体颗粒，进一步在插入后用肽 -PEG-脂类轭合物修饰颗粒，以使这些颗粒指向具有由肽或配基识别的表面受 体的特异细胞类型。图还描述了在PEG分子末端添加肽链(红色)，使脂质 体颗粒多功能化和对特异肿瘤的优先指向。在这种情况下，特异的肿瘤抗原 被脂质体表面的肽部分识别。例如，表皮生长因子肽表位能结合暴露到外表 面的EGFR部分，使所述脂质体指向过表达EGFR的肿瘤。
图5A：显示脂质体包被奥沙利铂注射后最高水平约14mg总铂/ml血浆 对比奥沙利铂注射后约8mg总铂/ml血浆，脂质体包被的奥沙利铂在20分钟 和奥沙利铂在10分钟达到这些水平。
图5B：显示游离奥沙利铂注射后约100小时大鼠血浆中的总铂水平达到 零。
图6A：显示也用治疗的动物中大鼠血浆中总铂的水平。
图7A：显示治疗5小时的动物肾脏组织中总铂的水平和图7B显示治疗 190小时的动物肾脏组织中总铂的水平。
图8A：显示治疗5小时的动物肝脏组织中总铂的水平和图8B显示治疗 190小时的动物肝脏组织中总铂的水平。
图9A和图9B：显示治疗190小时的动物脾脏组织中总铂的水平。
图10A：显示用游离奥沙利铂和脂质体包被的奥沙利铂治疗5小时的动 物大鼠组织中总铂的分布和图10B
图11A和11B是用脂质体包被的奥沙利铂重复治疗(11次)的大鼠的图 表。
图12是用脂质体包被的奥沙利铂重复治疗(6次)的大鼠的图表。
图13：Lipoxal能在以16mg/Kg的剂量4天间隔6次静脉注射后，引发 小鼠中人类乳腺癌的全部消失。奥沙利铂在其MTD(最大耐受剂量)时只能 导致小鼠中人类乳腺癌的缩小而不是消失。
图14：脂质体奥沙利铂(Lipoxal)16mg/Kg的剂量是根除小鼠异种移植物 中乳腺癌最有效的。最大耐受剂量4mg/Kg的奥沙利铂在小鼠模型中具有较 低的抗癌功效，其次是5mg/Kg剂量的Lipoxal。
图15和16显示脂质体包被的奥沙利铂的临床试验的结果。
图17：偶联肽到PEG-DSPE上的化学过程。
实施例
实施例I
脂质体制备
奥沙利铂与DPPG(二棕榈酰磷脂酰甘油)或其它带负电荷的脂类分子 在30％乙醇和0.1M Tris HCl，pH为7.5中以1:1的比例混合，奥沙利铂的终 浓度为5mg/ml，在浓度为20-40％乙醇溶液存在下，温度条件是30-60摄氏 度，在硫酸铵(10-200mM)、Tris缓冲液(10-100mM)或磷酸钠缓冲液(10-200 mM)的存在下，pH为6.5-8.0，孵育20min到3h。在这些条件下，奥沙利铂分 子上带正电荷的亚氨基与DPPG分子上带负电荷的基团相互作用，在乙醇溶 液中形成反胶团(也见Lipoplatin美国专利6,511,676)。得到的奥沙利铂-DPPG 反胶团通过与预制的由胆固醇、磷脂酰胆碱、mPEG-DSPE(聚乙二醇-二硬 酯酰磷脂酰乙醇胺)构成的脂质体快速混合，而被转化成脂质体包被的奥沙利 铂-DPPG单层，然后通过盐水渗析和挤压透膜来将颗粒的直径降到80-120 nm。所添加脂质体的脂类组成决定了最终奥沙利铂制剂的外膜组成(图1)。
实施例II
A.用脂质体包被的奥沙利铂的初步临床经验
I.A.动物研究
在美国、法国、瑞士和希腊(Pasteur研究所，雅典)从2003年5月到 2004年12月独立实验室对小鼠异种移植物进行的动物研究显示，与仅奥沙 利铂相比脂质体包被的奥沙利铂具有更好的治疗功效以及更低的毒性，而且 与游离药物奥沙利铂比较在小鼠和大鼠中表现出更好的耐受。而且在6-8次 静脉输注后的小鼠中，脂质体包被的奥沙利铂能引起多种人类癌症的完全消 失或缩小，比奥沙利铂的治疗更有效和毒性更低。
以16mg/Kg的剂量，间隔4天6次静脉输注后的小鼠中，显示脂质体包 被的奥沙利铂能引起人类乳腺癌的完全消失。另一方面，MTD(最大耐受剂 量)的游离药物奥沙利铂只能导致肿瘤的缩小，而非消失。
5mg/Kg游离奥沙利铂注射的小鼠死于毒性，剂量降低到4mg/Kg。脂质 体包被的奥沙利铂的剂量是16mg/Kg i.v.，毒性比4mg/Kg游离奥沙利铂更 低。在携带人类肿瘤的动物中，4mg/Kg游离奥沙利铂的抗癌功效比16mg/Kg 脂质体包被的奥沙利铂更低。
在所述研究动物中，脂质体包被的奥沙利铂的研究被报道。给大鼠腹腔 (i.p.)注射脂质体包被的奥沙利铂或作为对照的游离奥沙利铂，用于研究注射 后10分钟到7天的组织生物扰动。注射剂量为15mg/Kg的脂质体包被的奥 沙利铂后，总铂(Pt)在血浆中的最大水平是14.0mg/ml血浆，对比注射游离奥 沙利铂后是7.5mg/ml血浆；这些水平是在注射后10-15分钟达到的。肾组织 中也观察到类似于血浆的药物代谢动力学行为；在全部组织中，注射后最初 20分钟期间内血浆和肾脏具有最高水平的奥沙利铂。与相同剂量水平的脂质 体包被的奥沙利铂相比，游离奥沙利铂治疗后，在注射后40-190小时的延长 时期内，脾脏组织表现出超过2倍高水平的铂。11次重复施用脂质体包被的 奥沙利铂至大鼠后，在全部被检查的组织中，脾脏达到异常高水平的总铂(80 mg/g组织)。肝脏表现出类似的铂积累的药物代谢动力学，作为游离奥沙利铂 对比脂质体包被的奥沙利铂治疗后的时间函数。与脂质体包被的奥沙利铂比 较，在大鼠肾脏中10分钟到7天内，表现出类似的药物代谢动力 学行为，但是到4小时时两种药物在肝脏的药物代谢动力学是类似的，在7 天的时期内与比较脂质体包被的奥沙利铂能被更高地积累。大鼠 全生化和血细胞计数表明，与游离奥沙利铂比较脂质体包被的奥沙利铂表现 出更低的骨髓中毒性。大鼠中SGOT转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素、肌酐、 血尿素和血尿酸水平是持续正常的，没有来自脂质体包被的奥沙利铂的肝或 肾毒性。与其脂质体PEG化制剂一致，数据显示出脂质体包被的奥沙利铂在 大鼠组织中更长的贮留和更低的毒性。
用脂质体包被的奥沙利铂注射大鼠的药物代谢动力学研究
20只平均体重150g、2-3月龄的Wistar雌性大鼠用于药物代谢动力学研 究。用3mg/ml的脂质体包被的奥沙利铂悬浮液腹腔注射大鼠，终剂量为15 mg/Kg。每个时间点用两只动物。大鼠在注射后7分钟、20分钟、1.5小时、 3.75小时、24小时、40小时、90小时和170-180小时处死。血液收集到肝素 化的Eppendorf管里离心。用炉原子吸收(AA700 Perkin Elmer)测定血浆中总铂 的水平。
用脂质体包被的奥沙利铂重复注射大鼠进行组织学研究。我们对于确定 脂质体包被的奥沙利铂重复注射大鼠到其最大耐受剂量后对各种组织的损伤 有兴趣。
关于来自脂质体包被的奥沙利铂的毒性的大鼠中生化和血液学分析
用3mg/ml的脂质体包被的奥沙利铂悬浮液腹腔注射大鼠，终剂量为15 或30mg/Kg。用于血浆药物代谢动力学研究的大鼠血液(注射后7天)，也 经由独立的微生物学实验室用于分析骨髓、肾脏、肝脏和胃肠的功能。检查 的参数为血红素、血细胞比容、白细胞、粒细胞、血小板、SGOT转氨酶、 SGPT转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、尿素、尿酸和肌酐。
结果
大鼠中脂质体包被的奥沙利铂的毒理学
用游离奥沙利铂或脂质体包被的奥沙利铂注射大鼠，终剂量为15或30 mg/Kg。30mg/Kg奥沙利铂组严重影响食欲，表现出严重的体重减轻；30 mg/Kg奥沙利铂组治疗后7天，体重减轻33％；7天后全部动物的平均体重 从150g降到平均100g。作为对比，用同样剂量30mg/Kg脂质体包被的奥沙 利铂注射的动物表现出只有10％体重的减少(从平均150g到7天时最终 135g)。
注射后7天，从15mg/Kg治疗的动物抽取血液进肝素化或非肝素化的离 心管，经由独立的临床实验室进行全生化和血液学分析。每组使用两只动物。 表1显示两种测量的平均值。15mg/Kg奥沙利铂组的白细胞表现出下降到 800,000/mm3(根据WHO 4级毒性)，对比用脂质体包被的奥沙利铂治疗的 组为3,400,000/mm3(1级毒性)。因此，脂质体包被的奥沙利铂与游离奥沙 利铂比较，没有导致白细胞计数的大幅减少。与脂质体包被的奥沙利铂比较， 奥沙利铂也更高程度降低了血小板的水平。两种治疗的血红素水平都接近正 常。因此，两种药物的骨髓中毒性表现出更多指向白细胞和血小板而不是红 细胞生成的过程。两种药物都能升高SGOT转氨酶，具2级肝毒性；但是没 有影响SGPT转氨酶和碱性磷酸酶的水平；也没有影响胆红素、血尿素和肌 酐的水平(尽管血尿素的水平下降了)，与大鼠腹腔施用游离奥沙利铂或脂 质体包被的奥沙利铂没有引起肾毒性一致。
表2大鼠腹腔注射脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂后，骨髓、肝 和肾功能的变化。
大鼠的药物代谢动力学
大鼠直接腹腔注射3mg/ml脂质体包被的奥沙利铂或3mg/ml游离奥沙利 铂5％葡萄糖的储液，至终剂量为腹腔15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂或奥 沙利铂。在注射后的不同时间点取血，分离血浆，测量总铂水平用于药物代 谢动力学研究。图5A显示脂质体包被的奥沙利铂注射后20分钟，总铂达到 最高水平约14mg/ml血浆，对比游离奥沙利铂注射后10分钟，总铂达到最 高水平约8mg/ml血浆。在大约45分钟时，两组的总铂表现出相似的水平(约 5mg总铂/ml血浆)，然而注射脂质体包被的奥沙利铂后4-5小时获得总铂的 水平低于1mg/ml血浆，对比注射游离奥沙利铂后获得的总铂水平为约2mg/ml 血浆。注射脂质体包被的奥沙利铂40小时大鼠血浆中总铂的水平降到零，而 注射游离奥沙利铂的是约1mg总铂/ml血浆；注射游离奥沙利铂后约100小 时后，大鼠血浆中的总铂水平降到零(图5B)。
表3
根据15mg/Kg剂量的脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂， 计算总铂的平均药物代谢动力学参数，在表2中显示。
用线性梯形法外推到无穷确定AUC(Gibaldi等，1982 Gibaldi M，Perrier D： Noncompartmental analysis based on the statistical moment theory(基于统计矩理 论的非房室模型分析).In Pharmacokinetics，Gibaldi M，Perrier D(编)，pp 409-417，第2版.Marcel Dekker：New York，1982.)，脂质体包被的奥沙利铂的 AUC是53.7mg.h/ml，奥沙利铂的是74.4mg.h/ml。
对于脂质体包被的奥沙利铂，血浆达到的总铂最大浓度是14.0mg/ml， 游离奥沙利铂的是7.6mg/ml。对于脂质体包被的奥沙利铂，总身体清除率(Cl) 是0.28ml/g.h，游离奥沙利铂的是0.20ml/g.h。这是由Cl＝Di.v./AUC计算出 来的，其中Di.v.是脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂的腹腔注射剂量， AUC是这个特定剂量曲线下的相对面积。
脂质体包被的奥沙利铂的清除速率常数(Kel)是0.07h-1。这是用公式Kel＝ [Ln(Cp1)-Ln(Cp2)]/(t2-t1)通过对数血浆浓度-时间曲线的线性回归分析计算 出来，其中t1和t2是测量开始和终止的时间点，Cp1和Cp2分别是血清总铂 在t1和t2的开始和终止浓度。
脂质体包被的奥沙利铂的清除半衰期(t1/2)是10.2h。这是通过公式t1/2＝ 0.693(1/Kel)计算出来的。1/Kel是平均滞留时间(MRT)，统计矩类推到半衰期 t1/2(Gibaldi等，1982)。
用Lipoplatin治疗的动物中也测定了大鼠血浆的总铂水平，Lipoplatin 是一种不同的脂质体铂药物，目前处于三期评估中(Stathopoulos等，2005)。 Lipoplatin是一种脂质体顺铂，30mg/Kg i.p.用药。30mg/Kg Lipoplatin注射 后20分钟达到总铂最大水平～17mg/ml，与脂质体包被的奥沙利铂具有类似 的时帧(图6A)。也给大鼠腹腔注射最大耐受剂量5mg/Kg的顺铂作为对照； 顺铂注射后10分钟达到总铂最大水平～7.5mg/ml，与奥沙利铂具有类似的时 帧。全部四种药物在注射后～1.5小时，引起平行的药物代谢动力学行为；但 是，注射5小时产生～2.5mg总铂/ml血浆，随后奥沙利铂产生2.0 mg总铂/ml血浆，顺铂产生～1.5mg总铂/ml血浆，和脂质体包被的奥沙利铂 产生～1.0mg总铂/ml血浆。
脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂腹腔注射后，大鼠组织中总铂的 生物扰动
因为用原子吸收法检测铂的结果精确性和相对容易，研究铂药物在小鼠 或大鼠组织中的分布是很有用的。肾脏中的铂水平：15mg/Kg脂质体包被的 奥沙利铂注射后，肾脏中总铂的最大量为13.7mg/g组织，对比15mg/Kg奥 沙利铂注射后为～10.5mg/g组织，在注射后7-20分钟内达到(图7A)。但是 大约奥沙利铂注射后4小时后，肾脏中的铂水平达到4.8mg/g组织的最小值， 167小时轻微升高到6.9mg/g组织。肾脏中脂质体包被的奥沙利铂治疗后， 也有～1mg/g组织总铂的最小值，在注射后～20小时达到，188小时轻微升高 到2.5mg/g组织。因而，奥沙利铂对比同样剂量的脂质体包被的奥沙利铂治 疗，在注射后～7天肾脏表现出约3倍高水平的铂(图7B)。
作为比较，在肾脏中注射30mg/Kg Lipoplatin后达到最高水平为34mg/g 组织，对比注射5mg/Kg顺铂后为10mg/g组织。
Lipoplatin和脂质体包被的奥沙利铂在肾脏中的药物代谢动力学表现出 类似的行为。30mg/Kg Lipoplatin和15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂的最大 值分别为34和14mg/g组织。这点支持了两种药物在肾脏中的生物扰动的相 似性，所述两种药物具有共同的外壳但药物不同，药物限制在其内部和它们 靶向的肿瘤内。30mg/Kg Lipoplatin注射后120小时肾脏中总铂的水平是5 mg/g组织，对比15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂注射后是～2.5mg/g组织(图 3B)。15mg/Kg游离奥沙利铂注射后～140小时总铂为～7mg/g组织，对比5 mg/Kg顺铂注射后为～4mg/g组织(图3B)。
结论：
在7天时全部大鼠组织中肾脏中的铂水平是最高的，随后是肝脏和脾脏。
肝脏中的铂水平
15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后～7-10分钟，肝脏中的总铂 是3.5mg/g组织，20分钟时突然下降到2.5mg/g组织，此后这个水平维持了 5小时(图8A)。相反，用同样剂量的游离奥沙利铂腹腔注射大鼠在肝脏中 产生类似的总铂水平(3.0-3.5mg/g组织)，所述水平在注射后约30分钟达到， 维持了2小时，接着在5小时逐渐下降到1.5mg/g组织(图4A)。脂质体包 被的奥沙利铂和游离奥沙利铂治疗后170-190小时，不像血浆中的铂水平在 约40小时后下降到零，肝聚集铂为～2mg/g组织(图8B)。
作为比较，注射后肝脏中总铂的水平是7mg/g组织， 维持了～5小时(图8A)，在～12小时降到4.5mg/g组织，在24小时升高到 6.5mg/g组织，在120小时逐渐下降到3.5mg/g组织(图4B)。顺铂也表现出 与类似的模式，20分钟时达到最大水平2.5mg/g组织，维持了5 小时(图4A)，然后从24到150小时逐渐降到1(图8B)。
脾脏中的总铂：15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂施用后，脾脏中总铂的 最大量是3.2mg/g组织，对比15mg/Kg奥沙利铂施用后为～5.2mg/g组织，而 且在注射的15-20分钟达到(图9A)。脂质体包被的奥沙利铂与奥沙利铂施 用后，到注射后～5小时分别轻微下降～2和～4mg/g组织。此后注射脂质体包 被的奥沙利铂的脾脏中总铂的水平升高，在～45小时达到～4.5mg/g组织，随 后在190小时下降到～2mg/g组织。相反，游离奥沙利铂注射后脾脏中总铂水 平持续积累，在168小时达到18.5mg/g组织(图9B)。这伴随着在7天时 脾脏重量的巨大减少，推测由于游离奥沙利铂的毒性引发脾细胞的凋亡。事 实上，研究前小鼠的平均体重是150g，7天时终体重是109g，脾脏的重量是 0.188g。
用脂质体包被的奥沙利铂治疗动物的脾脏中有瘀血(血液聚集)。
但是，游离奥沙利铂治疗约1小时后，肾脏中的铂水平高于脂质体包被 的奥沙利铂治疗；它们在12-24小时达到最小值(奥沙利铂注射后是5mg/g 组织，脂质体包被的奥沙利铂注射后是1mg/g组织)，而且又开始升高；注 射奥沙利铂后170小时肾脏组织表现出7mg铂/g组织，而注射脂质体包被 的奥沙利铂后是2.5mg铂/g组织(图5B)。
脂质体包被的奥沙利铂或游离奥沙利铂注射后，检查的所有大鼠组织中 总铂的比较测量在图10中总结。15mg/Kg奥沙利铂注射后20分钟，全部组 织中血浆总铂水平达到最高(14.2mg/ml)；脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后 ～10分钟，肾脏组织达到相对高的水平(13.8mg/ml)(图10A)。下一个水平包 括奥沙利铂注射后肾脏中的铂和奥沙利铂注射后血浆中的铂。脾脏表现为下 一个较高的水平(15mg/Kg奥沙利铂注射后5mg/g组织)，所述水平持续升 高，24小时后变得最高，170小时甚至达到更高(18.5mg/g组织)。因此总 体上，奥沙利铂注射后脾脏最终积累了最高水平的铂。在这个方面，游离奥 沙利铂或脂质体包被的奥沙利铂注射后脾脏中铂积累之间的差异是明显的 (图10B)。
4种药物腹腔注射后，大鼠组织中最大水平的铂(以mg铂/ml血浆或每g 组织表示)(ND，未测定)
脂质体包 奥沙利铂 顺铂
药物&剂量
被的奥沙 15mg/Kg 30mg/Kg 5mg/Kg
利铂
15mg/Kg
肾脏 13.7 10.5 33.2 10.2
血浆 14.0 7.6 16.6 7.5
肝脏 3.5 3.1 6.9 2.7
脾脏 3.1 5.1 3.5 1.1
肺 3.7 3.2 7.5 2.0
心脏 1.8 1.1 4.5 0.8
脑 ND ND 1.7 0.3
5小时
脂质体包 奥沙利铂 顺铂
药物&剂量
被的奥沙 15mg/Kg 30mg/Kg 5mg/Kg
利铂 估计
15mg/Kg
估计
肾脏 2.0 5.0 4.2 6.8
血浆 0.9 1.7 2.4 1.1
肝脏 2.4 1.5 6.8 2.4
脾脏 1.8 3.8 2.7 1.2
肺 0.8 1.7 0.6 0.7
心脏 0.3 0.8 0.2 0.2
脑 ND ND 0.1 0.1
5-7天
脂质体包 奥沙利铂 顺铂
药物&剂量
被的奥沙 15mg/Kg 30mg/Kg 5mg/Kg
利铂
15mg/Kg
肾脏 2.5 6.9 5.2 4.1
血浆 0 0 0.1 0.1
肝脏 2.2 1.8 3.5 1.1
脾脏 2.3 18.5 4.9 1.5
肺 0.4 2.4 0.2 0.3
心脏 0.6 0.5 0.1 0.1
脑 ND ND 0.1 0
表4脂质体奥沙利铂、游离奥沙利铂、脂质体顺铂和游离顺铂注射后7-20 分钟、5小时和5-7天时，不同大鼠组织中总铂水平的比较
脂质体包被的奥沙利铂治疗后5-7天肾脏、脾脏和肝脏具有显著的铂水 平。
游离奥沙利铂治疗后5-7天脾脏、肾脏、肺和肝脏具有显著的铂水平。
治疗后5-7天肾脏、脾脏和肝脏具有显著的铂水平。
顺铂治疗后5-7天肾脏、脾脏和肝脏具有显著的铂水平。
数据显示15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后与15mg/Kg游离 奥沙利铂比较：
1.脂质体包被的奥沙利铂注射后总铂的血浆水平是14mg/ml血浆，奥沙 利铂注射后总铂的血浆水平是7.6mg/ml血浆
腹腔注射约7-20分钟内达到最大值
这表示脂质体包被的奥沙利铂与奥沙利铂相比具有更长的循环。
2.脂质体包被的奥沙利铂(14mg/g组织)与游离奥沙利铂(11mg/g)相比， 在注射后最初的15分钟肾脏中的水平更高，但是在1.5小时和此后肾脏中的 水平变成游离奥沙利铂(6.7mg/g组织)比在1.5小时时脂质体包被的奥沙利铂 (2.3mg/g)的更高。
3.游离奥沙利铂(3.8mg/g组织)与脂质体包被的奥沙利铂(1.8mg/g)比较， 注射后1.5小时脾脏中的水平更高。
4.两种药物心脏中的水平相当并且是低的
血浆中的铂水平：15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂腹腔注射后，血浆中 的总铂最大值是14mg/ml，与15mg/Kg奥沙利铂注射后是～7.5mg/ml组织比 较，这些值在注射后7-20分钟内达到(图10A)。但是约1小时后，来自游 离奥沙利铂比来自脂质体包被的奥沙利铂治疗的血浆中铂水平变得更高，而 且维持贯穿剩下的曲线直到50小时，此时脂质体包被的奥沙利铂的水平变为 零，到100小时时游离奥沙利铂的水平变为零。
肾脏中的铂水平：15mg/Kg Lipoxal注射后，肾脏中的总铂最大值是13.5 mg/g组织，与15mg/Kg奥沙利铂注射后是～10.5mg/g组织比较，这些值在注 射后15-20分钟内达到(图10A)。但是约4小时后，游离奥沙利铂注射后 的肾脏中的铂水平达到最小为4.8mg/g组织，167小时轻微升高到6.9mg/g 组织。脂质体包被的奥沙利铂治疗后，肾脏中总铂也达到最小为～1mg/g组织， 是在注射后～20小时达到，188小时轻微升高到2.5mg/g组织。因而游离奥沙 利铂治疗注射后～7天，肾脏表现出比同样剂量的脂质体包被的奥沙利铂治疗 约3倍高水平的铂。在全部大鼠组织中，肾脏中铂的水平是最高的，然后是 肝脏和脾脏。
脾脏中的铂水平：15mg/Kg脂质体包被的奥沙利铂注射后，脾脏中的总 铂最大值是14mg/ml，与15mg/Kg游离奥沙利铂注射后是～7mg/g组织比较， 这些值在注射后15-20分钟内达到(图10A)。但是约1小时后，来自游离 奥沙利铂比来自脂质体包被的奥沙利铂治疗的肾脏中铂水平变得更高，它们 在大约12-24小时显示最小(奥沙利铂注射后是5mg/g组织，脂质体包被的 奥沙利铂注射后是1mg/g组织)，又开始升高；游离奥沙利铂注射后170小 时，肾脏组织显示7mg铂/g组织，而脂质体包被的奥沙利铂显示2.5mg铂 /g组织(图10A)。
药物治疗导致体重差异和组织尺寸减小
用脂质体包被的奥沙利铂(15mg/kg)和游离奥沙利铂(15mg/kg)治疗的动 物，在药物腹腔注射后7.8和7天处死，在总体重减轻和单个器官重量上表 现出巨大的差异。
表5奥沙利铂治疗后恶病质(cahexia)导致体重减少。用同等剂量的脂质 体奥沙利铂治疗的动物表现出更小的总重量或器官重量减少。脾脏显示为被 游离奥沙利铂影响最大的组织。
用游离奥沙利铂治疗的动物在用药后7天表现出巨大的重量减轻，所述 减轻在治疗时被估计为超过40gr总体重。而且，脾脏组织的尺寸显著减小， 是铂浓度极其高的值(18.5mg铂/g组织)的反映。
游离奥沙利铂用药后食欲的降低和药物毒性导致重量减轻和脾脏尺寸减 小；这些现象在用药7天后处死动物中观察到，因此显示出游离奥沙利铂腹 腔注射后7天组织图表中的高铂浓度值。
对于其它组织也可考虑同样的影响，只要全部游离奥沙利铂组织图表(肝 脏、肺、心脏、脾脏和肾脏)中的铂浓度值在时间点(7天)表现出升高。
用5mg/Kg奥沙利铂注射的小鼠死于毒性，剂量降低到4mg/Kg。Lipoxal 的剂量是16mg/Kg i.v.，毒性比4mg/Kg奥沙利铂更低。对于携带人类肿瘤的 动物，4mg/Kg奥沙利铂的抗癌功效比16mg/Kg Lipoxal更低。
实施例2B
I期临床研究
研究的目的是a)评估脂质体包被的奥沙利铂的不利反应和检测剂量限 制性毒性(DLT)以及最大耐受剂量(MTD)。患者和方法：研究总共包括27名 晚期疾病患者。根据既定的指导方针，用标准化疗预治疗全部患者。在进入 目前试验时，全部处于复发或进行性的疾病中。全部患者患有胃肠癌IV期(结 肠、胃和胰腺癌)。我们设定了6个不同剂量水平的脂质体包被的奥沙利铂， 每个水平至少包括3名患者。剂量水平是：1)100mg/m22)150mg/m23)200 mg/m24)250mg/m25)300mg/m26)350mg/m2。8名另外的患者用300mg/m2 作为MTD治疗。治疗每周一次，连续3周，每4周重复。结果：前4个剂量 水平(100-250mg/m2)没有观察到严重的副作用。水平5和6观察到轻微的骨 髓中毒性和恶心。最常见的不利反应是II级外周神经病变，在全部4名350 mg/m2治疗的患者中观察到。因此我们认为350mg/m2水平是DLT，300mg/m2 水平是MTD。27名患者中，3名显示部分反应，18名患者具有4个月的稳定 疾病，中值范围(2-9)。结论：在目前I期研究中我们发现，300mg/m2和350 mg/m2剂量水平的最常见毒性是外周神经病变。脂质体包被的奥沙利铂被良 好耐受，显著减少了游离奥沙利铂的全部其它副作用，尤其是骨髓中毒性和 胃肠道毒性。这些初步的结果显示了在预治疗患者中的适当功效。
所述研究是用脂质体包被的奥沙利铂()进行的临床试验，具有以 下首要目的：a)确定每周Lipoxal用药的提高剂量的剂量限制性毒性(DLT)和 最大耐受剂量(MTD)，b)检测预治疗晚期胃肠癌患者中，lipoxal单一疗法的毒 性特征和药物代谢动力学。第二目的是功效和存活率。
患者和方法
研究是I期群组，脂质体包被的奥沙利铂剂量升高试验。研究方法经我 们的机构审查委员会审查和批准。患者阅读了满足全部机构要求的通知同意 文件，签字作为注册的一个条件。
合格标准
全部患者需要符合以下标准：确认癌症的组织学或细胞学诊断，至少一 种二维可测或可评估的疾病，WHO体力状态为0-2，平均寿命预期超过3个 月，用标准或第一线化疗预治疗和进入时对任何细胞毒素治疗具顽固性。如 果患者具有2或3项前面的条件就是合格的，条件是他们断开治疗至少3周。
评估
合格的患者超过18岁，要求具有由下述确定的足够的血液、肾和肝功能： 白细胞计数3.5 x 109/l、绝对中性粒细胞计数1.5 x 109/l，血小板计数100 x 109/l， 血红素水平9g/dl，总胆红素水平1.5mg/dl，ALT和AST是无肝转移灶时正 常上限2倍或证明有肝转移灶的情况下正常上限的5倍，肌酐水平1.5mg/dl。 治疗前完成病史、体检、生命体征的评估、心电图、胸和腹的计算机断层成 像(或超声波检查)。治疗期间(每个疗程前1天)完成血细胞计数、血尿 素和血糖、血清肌酐和尿素测试以及ECG。至少每周8次药物注射后或疾病 发展早期进行CT扫描评估。
治疗
药物特性：以3mg/ml、每玻璃管50ml、每玻璃管150mg奥沙利铂的形 式提供。脂质体包被的奥沙利铂4摄氏度、避光储存。脂质体药物的特性： 脂质体包被的奥沙利铂稀释在1升5％葡萄糖中，每周一次3小时静脉输注连 续8周。有副作用尤其是骨髓中毒性或神经毒性时，治疗给药将延迟1周进 行。不需要提前或之后水合。没有计划预防性施用其他药物例如antihemetic 或抗过敏药。有恶心或呕吐时，给予止吐药(昂丹司琼(Ondasetron))或抗过敏 药(地塞米松)的支持。
前面进行的动物研究中，大约400mg/m2到600mg/m2被定义为MTD。 人类中我们决定从100mg/m2剂量开始作为剂量1。剂量的提高被决定为50 mg/m2每水平。表1呈现了每组患者脂质体包被的奥沙利铂的剂量提高。
评估治疗每周期的药物相关毒性和根据WHO标准进行评级。DLT被定 义为任一3或4级毒性，50％的患者观察到与长于72小时持续发热相关的中 性粒细胞计数<500mm2。如果在至少50％的患者中观察到其它3级毒性尤其 是神经毒性也被认为是DLT。低于DLT的一个剂量水平被定义为MTD。每 个剂量水平安排最少3名患者的群组进入。全部3名患者接受第一周期前面 剂量的治疗后，而且每人至少被观察3周，没有DLT的迹象，剂量才升高到 下一个更高的水平。如果某个水平的第一个患者在3周治疗的第一个时期经 历了DLT，将另外两个患者加入所述剂量水平。中断DLT发生的治疗，患者 在更低的水平继续治疗。
药物代谢动力学
用于药物代谢动力学研究的患者在以下时刻取血。0(药物注射前)和注 射开始后2、4、8、24、48、72、120(5天)和168(7天)小时。3ml血液 抽取进含有EDTA或肝素的管中，然后离心，2℃致冷，最后送往实验室分析 总铂水平。使用5名患者的样品。用原子吸收法(Perkin Elmer AA 700Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometer(石墨炉原子吸收光谱仪)at Regulon A.E.)测量铂水平(总的和血清超滤液)。在某一剂量水平(200mg和300 mg/m2)：血浆浓度-时间曲线(AUC)下面的面积，Cmax(血清中总铂的最大 浓度)。总身体清除率(Cl)是由CL＝Div/AUC计算出来的，其中Div是 Lipoplatin的静脉内剂量，AUC是特定剂量曲线下的相对面积。Kel(清除速 率常数)是用公式Kel＝[Ln(Cp1)-Ln(Cp2)]/(t2-t1)通过对数血浆浓度-时间曲 线的线性回归分析计算出来，其中t1和t2是测量开始和终止的时间点，Cp1 和Cp2分别是血清总铂在t1和t2的开始和终止浓度。
t1/2(清除半衰期)是通过公式t1/2＝0.693(1/Kel)计算出来的。1/Kel是 MRT(平均滞留时间)，统计矩类推到半衰期t1/2(Gibaldi等，1982)。实际上， MRT代表清除用药剂量63.2％的时间。
结果
患者
表5显示患者的特征。总共登记了27名患者。年龄32-78，中值年龄62， 男性18名，女性9名，P.S.0-2。全部患者用化疗预治疗。预治疗每肿瘤。
毒性
脂质体包被的奥沙利铂的胃肠道毒性可忽略不计。不用止吐药 (Ondosetron)会观察到恶心或轻微呕吐。但是用Ondosetron没有观察到恶心呕 吐。也没有腹泻。轻微或1级骨髓中毒性(中性粒细胞减少)只在最高剂量 (350mg/m2)用药的2名患者(％)中发现。没有发现肝毒性、肾毒性、心脏 毒性和脱发。3名患者出现了轻微衰弱。
主要副作用是神经毒性，至少3次药剂注射后被发现，第三和第四水平 时是1级，第五水平时是2级，第六水平的100％患者是2级。
在这些结果的基础上，认为3级是剂量限制性毒性，在用350mg/m2脂 质体包被的奥沙利铂治疗的100％患者中观察到。低于300mg/m2的一个剂量 被定义为最大耐受剂量(MTD)。表5显示的是脂质体包被的奥沙利铂的剂 量升高和用六种水平中的每个治疗的患者数目。
药物代谢动力学：结果在表7、图15和16中表示。发现在血浆浓度中 奥沙利铂的半衰期是24小时，7天内整合到尿排泄。
治疗的顺应性
施用总数为104次注射(周期)，中值是每名患者4周期(范围2-15)。 周期间的中值间隔是7天。剂量强度是计划的100％。因为没有检测到血液 学3或4级的毒性，没有患者发生治疗延迟。只有用350mg/m2剂量的患者在 最多4或5次注射(周期)后间隔了2周，然后分类到300mg/m2的低剂量。 某些患者由于4-6周期后疾病发展停止了治疗。这点应用于17名病人(62.9％)。 12名病人(44.4％)仍然在研究终止时存活。死亡的原因是疾病发展。
治疗反应
在意向治疗的基础上分析反应。没有完全的反应。27名中的3名患者(11.1 ％)表现出部分反应。这些患者中2名胃癌患者，1名有胸腔积液和另一名有 骨骼转移灶；第三名患者有来自结肠癌的肝转移灶。部分反应的检测基于对 第一名患者的CT扫描，第二名患者的骨骼扫描和第三名患者的CT扫描和胆 红素血清水平检测。两张图代表：图1第二名患者治疗前和治疗后的骨骼扫 描，以及第三名患者的胆红素血清水平曲线。异常地，我们治疗第三名患者 时，其血清胆红素水平是51mg/dl，两个疗程后其水平下降到8mg/dl，持续 了5周。
对于每名患者反应的持续时间分别是4、7和2个月。18名患者(66.66％) 表现出稳定的疾病，中值持续时间是4个月(范围是2-9个月)。根据不再 有效的分类，5名患者可被分类为较小反应。6名患者表现出疾病发展。全部 3名有反应者中存在50％或更多标志物CA-19-9的减少。而且全部3名有反 应者的体力状态从2提高到1。
结论
作为具胃肠系统晚期癌症患者的单一疗法(单个治疗)，在当前试验(实 施例)中检测了脂质体包被的奥沙利铂。全部患者用标准治疗预治疗，全部 包括结肠患者也用游离奥沙利铂治疗。用脂质体包被的奥沙利铂治疗只在临 床前研究中被检测。目前没有其它临床试验完成。本试验基于临床前研究的 数据和非脂质体(游离)奥沙利铂的经验和数据。最后主要帮助我们目前的 试验集中在评估脂质体包被的奥沙利铂与裸露的(游离)奥沙利铂的相似性 或差异。显示大大降低了胃肠道和血液学副作用。保持无任何差异-任何减 少的唯一的副作用是神经毒性。经常看到神经毒性类似地随药剂剂量的增加 而或多或少地增加，作为定义剂量限制性毒性的唯一或主要标准。MTD定义 的剂量是每周用药300mg/m2。附加的神经毒性也会出现，用非脂质体奥沙利 铂时也会发生(参考)。在功效方面，在预治疗难治的目前已建立肿瘤的患 者中观察到11％的反应率，对于在联合化疗模式的将来试验有某种意义。
这种研究已确立了MTD，需要进一步考察，尤其是混用其它药剂。
结果，这个实施例显示脂质体奥沙利铂是一种耐受良好的药剂。剂量300 mg/m2被定义为MTD。与奥沙利铂的裸露形式比较，胃肠道和骨髓毒性被大 大降低。唯一保留的不利反应是神经毒性，被定义为DLT。
表6 脂质体包被的奥沙利铂剂量升高
表7 基线患者的特征
剂量 (mg/m2) Cmax (μgPt/ml) AUC (μgPt*h/ml) Cl (L/h*m2) Kel (l/h) t1/2 (h) Vss (L/m2) 250 9.175 424.4 0.289 0.028 24.3 9.7 350 12.087 782.3 0.219 0.020 35.5 10.9
表8对于患者Lipoxal血浆药物代谢动力学参数的评估(见参数定义的 文字)
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CRF Lipoxal
200mg/m2每周
参与者的名字(或编码)：—Psa.Ath.
癌症类型：胃、4期
Lipoxal治疗前
骨髓功能
血细胞(gr/dl)13.0
白细胞(1,000/mm3)3.7
血小板(1,000/mm3)207
肾脏功能
血尿素(mg％)22
肌酐(mg％)0.4
尿酸(mg％)4.3
第4次注射Lipoxal后7天
取血进行生化检验的日期2/11/2004
骨髓功能
血细胞(gr/dl)12.3
白细胞(1,000/mm3)7.1
血小板(1,000/mm3)315
肾脏功能
血尿素(mg％)...15
肌酐(mg％)0.5
尿酸(mg％)4.1
第9次Lipoxal注射后7天
骨髓功能
血细胞(gr/dl)9.8
白细胞(1,000/mm3)2.6
血小板(1,000/mm3)277
肾脏功能
血尿素(mg％)...17
肌酐(mg％)0.40
尿酸(mg％)3.5
第12次Lipoxal注射后7天
骨髓功能
血细胞(gr/dl)8.6
白细胞(1,000/mm3)...3.0
血小板(1,000/mm3)...236
肾脏功能
血尿素(mg％)18
肌酐(mg％)0.41
尿酸(mg％)3.7
第16次Lipoxal注射后7天
骨髓功能
血细胞(gr/dl)11.1
白细胞(1,000/mm3)...6.1
血小板(1,000/mm3)263
肾脏功能
血尿素(mg％)29
肌酐(mg％)0.51
尿酸(mg％)4.8
实施例III
在预治疗的晚期胰腺癌患者中，脂质体顺铂与吉西他滨并用：1-2期研究
目的：目前描述的试验是1-2期研究，所述研究基于新型脂质体包被的 顺铂(商标，由Mountain View，CA的regulon Inc.生产)。目前 临床前和临床数据(1期药物代谢动力学)引发对于包括和吉西 他滨的联合治疗模式的研究。
患者和方法：吉西他滨的剂量保持标准在1000mg/m2，lipoplatin的剂量 从25mg/m2升高到125mg/m2。对晚期预治疗的胰腺癌患者施用治疗，所述 患者对目前包括吉西他滨的化疗表现顽固。
结果：125mg/m2被定义为剂量限制性毒性(DLT)，100mg/m2 被定义为与1000mg/m2的吉西他滨并用的最大耐受剂量(MTD)。初步目标反 应率数据显示了在2/24名患者(8.3％)有部分反应，14名患者(58.3％)的疾病稳 定，中值持续时间3个月(范围2-7个月)，8名患者(33.3％)临床有益。
结论：脂质体包被的顺铂是裸露的顺铂的无毒替代药剂。与吉西他滨并 用时，MTD为100mg/m2，在难治胰腺癌中表现出有潜力的功效。
顺铂(顺式-PtCl2(NH3)2)世界范围内用于治疗睾丸癌和卵巢癌和膀胱、 头、颈癌、肺和胃肠肿瘤癌以及很多其它的癌症(1-7)。尽管顺铂抗击这些 肿瘤非常有效，但是与包括肾毒性(8)、耳毒性、神经毒性、恶心和呕吐(7-9) 的严重副作用相关。碳铂是一种顺铂的类似物，对肾脏和神经系统的毒性比 顺铂显著降低，引发的恶心和呕吐也减少，然而大体上(确定对卵巢癌和非 小细胞肺癌)保留了等效的抗肿瘤活性。但是用碳铂比顺铂在血液学的不利 影响更经常(10，11)。
吉西他滨(商标，EIi Lily，Indianapolis，IN)是一种核苷酸类似物， 与顺铂并用施药作为患不能手术的、局部晚期(3A或3B期)或转移(4期) 非小细胞肺癌患者的第一线治疗，而且作为局部晚期(非可切除3期)或转 移(3B、4期)胰腺癌患者的前线治疗(12-14)。主要的不利反应是骨髓中 毒性。使用混合的吉西他滨和铂的优势归结为铂-DNA加合物修复涉及的 DNA合成路径的抑制。吉西他滨和顺铂协同作用，增加了铂-DNA加合物的 形成，诱导卵巢癌细胞系中核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸池的依赖于浓度和 混合的变化(15)。
关于(Regulon Inc.，Mountain View，CA)的目前研究显示：低毒 性、在肿瘤中聚集和逃避免疫细胞和巨噬细胞的能力、肾脏缓慢的清除率、 在体液中长期循环的特性、血液中36小时的半衰期和有潜力的治疗功效 (16)。在目前1-2期的研究中，我们试图探索Lipoplatin-吉西他滨并用的 治疗功效和毒性，给晚期预治疗的胰腺癌患者每14天用药。我们的首要目标 是决定毒性和最大耐受剂量(MTD)，我们的第二目标是决定反应率和临床益 处。
患者和方法
患者大于18岁，患组织学或细胞学确认的胰腺癌和二维可测的疾病，所 述患者经过化疗预治疗，患有复发的或非反应的疾病，登记加入研究。其它 合格的标准包括世界卫生组织(WHO)体力状态(PS)为0-2，平均寿命预 期至少3个月，足够的骨髓储备(粒细胞计数≥1,500/dl，血小板计数≥ 120,000/dl)、正常的肾脏(血浆肌酐浓度<1.2mg/dl)和肝功能检测(总血 清胆红素浓度<3mg/dl，条件是血清转氨酶和血清蛋白是正常的)、正常的 心脏功能前6个月没有临床不稳定性心绞痛、心肌梗塞或充血性心力衰竭的 病史、无中枢神经系统并发症。先前的手术是允许的，条件是至少发生在3 周前。从研究中排除患主动侵染、营养不良或第二种原发肿瘤(除了非黑色 素皮肤上皮癌或原位宫颈癌)的患者。全部患者交出了他们的书面通知同意 书而参与研究。
治疗计划
计划是将与吉西他滨并用。施用由Regulon Inc.提供的 ，在1和15日进行8小时静脉输注；选择8小时是基于我们在1 期临床中的经验，为了能控制可能的不利影响。吉西他滨在500ml正常盐水 中在1和15日60分钟静脉输注给药，剂量为1000mg/m2，周期是每4周重 复(28天)。在1和15日的注射被认为是1周期。条件是患者已经从药物相 关的副作用中充分恢复，给全部患者施用标准的昂丹司琼(ondansetron)止 吐药治疗。不允许重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的预防性用药。中性 白细胞减少症3级的情况下，这些患者将接受随后的在第6或7天培非司亭 6mg注射，推迟治疗1周。实施治疗至少3周期或直到疾病发展。研究是1/2 期群组，和吉西他滨的剂量升高试验。目的是决定并用的剂量限 制性毒性(DLT)和定义最大耐受剂量(MTD)作为2期的推荐剂量，收集对于患 胰腺癌预治疗患者药物功效的初步数据。单独药剂的骨髓中毒性 在目前1期研究中被认为是非常轻微的(16)。我们以低剂量开 始，并用骨髓毒性药剂吉西他滨，主要是决定骨髓不利反应的程度。 的开始剂量是25mg/m2，每个剂量水平增加25mg/m2(表1)。 方法经医院的伦理和科学委员会批准。
剂量调整标准基于血液学参数。在3或4级发热性中性白细胞减少症的 情况下，如上所述用培非司亭预防性用药重复随后的周期。在发热性中性白 细胞减少症或3或4级中性白细胞减少症的情况下，尽管施用rhG-CSF，在 随后的注射治疗中吉西他滨和Lipoplatin的剂量减少25％。在3或4级血小 板减少症持续超过5天的情况下，两种药物的剂量也都减少25％。根据WHO 指导方针给毒性评级。
患者评估
预治疗评估包括完整的医疗史和体检、全血细胞计数包括分化的白细胞 和血小板计数、标准生化特征(和必要时的肌酐清除)、血清癌胚抗原(CEA) 和CA 19-9测定、心电图、胸透、上腹超声波检查和胸腔、上和下腹的计算 机断层(CT)扫描。在临床适应症上完成附加的成像研究。每周进行有分化 的全血细胞计数；在3或4级中性白细胞减少症或4级血小板减少症情况下， 每天评估有分化的全血细胞计数，直到绝对粒细胞计数>1,000/dl，而且血小 板计数>75,000/dl。为了记录疾病的症状和治疗毒性，治疗的每个疗程前进行 详细的医学和身体检查。每6周进行生化检测、ECG、血清CEA和CA19-9 测定和胸透，通过临床检查进行神经系统的评估。每个周期后测量损伤，如 果损伤通过体检或胸透可查到；3个化疗周期后，可检查的损伤通过超声波 检查或CT扫描进行评估。
反应的定义
完全反应(CR)被定义为可测量或评估的疾病、征象和症状以及与肿瘤相 关的生化变化至少消失4周，在所述时间内没有新的损伤出现。部分反应(PR) 被定义为全部可测量损伤的垂直直径的乘积之和比预治疗的测量有>50％的 减少，持续至少4周，在所述时间内没有新的损伤出现或没有现存的损伤扩 大。对于肝损伤，从锁骨线肋骨边缘和剑突到肝脏边缘所测量的距离之和需 要>30％的减少。稳定疾病(SD)被定义为全部测量损伤的两个垂直直径乘 积之和<50％的减少和<25％的增加，而且没有新的损伤出现持续8周。发展 的疾病(PD)被定义为任何可测量损伤的两个垂直直径乘积比进入研究时的 尺寸或者对于有反应的病人，是最大退行时刻和恶性疾病新面积出现时的尺 寸增加>25％。内窥镜逆行胆总管胰腺造影术(ERCP)或导管组后没有恢复而 胆红素升高，被认为是疾病发展。体力状态的两步恶化，预治疗重量>10％ 的减少或症状增加本身不构成疾病的发展；但是，这些症状的出现后要对疾 病的程度进行新的评估。全部反应必须维持至少4周，由独立的放射科医师 小组确认。
结果
患者人口统计
从2003年1月到2004年12月，24名患者(11名男性，13名女性；中 值年龄66岁，范围是47-80岁)登记进入研究。患者的特征如表2显示。4.2％ 患者的WHO体力状态是0，45.8％的是1，50％的是2。绝大多数患者是4期 (79.2％)。全部患者经历了之前的化疗：11名患者用吉西他滨作为单一药剂治 疗，13名用吉西他滨和伊立替康(irinotecan)并用治疗。
剂量强度
患者共接受36个疗程(每2周108次注射)治疗，疗程的中值数目是2 (范围1-5)。24名患者中，10名完成了3个疗程。任一药物没有剂量减少， 患者接受了每种药物99.5％的计划剂量强度(范围93-100％)，直到第四个 剂量水平。
毒性
没有观察到神经毒性或肾毒性。在注射开始时，10/24名患者 中观察到持续2-4分钟的短期腹痛，可自愈。在第五个剂量水平，4名患者中 2名被观察到3级骨髓中毒性。没有观察到发热性中性白细胞减少症。毒性 如表3和4显示。第五个剂量水平(125mg/m2lipoplatin和1000mg/m2吉西他 滨)被认为是DLT和剂量水平4为MTD。4名附加患者用第四剂量水平治疗。
治疗的反应
两名独立的放射学工作者和两名有经验的肿瘤学专家，用计算机断层成 像完成可测量反应的决定。没有检测到完全反应。2名患者(8.3％)在6和5个 月期间完成了PR。14名患者(58.3％)被观察到中值持续时间3个月(范围2-7 个月)的稳定疾病。8名患者(33.3％)被观察到主要由于疼痛减轻的临床有益。 在研究终止时，7名患者(29.2％)仍然存活。从二线治疗开始，中值存活率是 4个月(范围2-8+个月)。
结论
这种新的脂质体包被的顺铂()主要目的在于避免在顺铂用药 中常见的肾毒性，并且同时产生类似的功效。正如在动物研究中以及患者的 临床试验中显示的，的药物代谢动力学不同于顺铂(16)。当 作为单一药剂施用时显示，没有毒性是一个很大的优势。目前的 1-2期试验中，通过和吉西他滨并用来研究毒性和功效，吉西他滨 的毒性被很好地定义了，尤其当与其它药剂并用时(5)。顺铂-吉西他滨并 用可类似地用于非小细胞肺癌、尿路上皮癌和胰腺癌的治疗(5，7，12)。 看来目前试验的数据显示了非常低毒性的优势。当吉西他滨保持在标准剂量 1000mg/m2时，每2周施用的并用药物被良好耐受到剂量100mg/m2 。在125mg/m2剂量时，骨髓中毒性达到3和4级，因 此这个剂量被认为是DLT。100mg/m2和1gr/m2吉西他滨被认为 是MTD。药物并用在8.33％患者中实现了目标反应，疾病稳定的是58.3％和 疼痛减轻的是33.3％。考虑到之前包括吉西他滨的治疗时，全部患者是难治 的或在疾病发展中，这里得出的反应率应该归功于的加入。
脂质体包被的顺铂与吉西他滨并用，在晚期预治疗的胰腺癌患者中每2 周施药，MTD分别为100mg/m2和1000mg/m2。这是耐受良好的治疗，而且 有功效的潜力征象。
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表1 和吉西他滨剂量升高。剂量水平患者数量 吉西他滨(mg/m2/周)(mg/m2/周)第一4 25 1000，第二4 50 1000，第三4 75 1000，第四4+4 100 1000，第五4 125 1000。
表2患者在基线的特征。数量％登记的患者数量24100年龄(岁)中 值66范围47-80性别男性11 45.8女性13 54.2体力状态(WHO)0 14.2 1 11 45.82 12 50.0疾病III期5 20.8IV 19 79.2组织学良好分化3 12.5中 等分化12 50.0低分化9 37.5之前治疗吉西他滨1克/m2天1、8、15/每 四周11 45.8吉西他滨900mg/m2+天1、8/每三周+13 54.2依立替康 300mg/m2天8/每三周
表3 血液学毒性
剂量水平患者数量吉西他滨毒性最大毒性 mg/m2mg/m2患者数量毒性(等级)类型第一25 1000，第二50 1000，第 三75 1000，第四100 10002/4*2-3中性白细胞减少症，第五125 1000 2/4 3-4中性白细胞减少症*最初4例患者。
表4 非血液学毒性剂量
1级2级3级4级水平n(％)n(％)n(％)n(％)恶心5(20.8)呕 吐14(58.3)疲劳8(33.3)腹泻2(8.3)心脏毒性神经毒性3(12.5)肾毒性 血栓发作4(16.7)
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