辅酶Q10产量增高的Sporidiobolus ruineniae菌株的生产方法

本发明涉及辅酶Q10产量增高的Sporidiobolus ruineniae菌株的生产方法、可用此方法获得的Sporidiobolus ruineniae(S.ruineniae)的菌株、以及此类菌株用于生产泛醌10(辅酶Q10，以下称为Q10)的用途。

辅酶Q10是来自泛醌类的化合物，其化学通式如下：以上化学通式说明了Q10的化学结构：由环上发生取代的醌衍生物加上n个化学通式为-CH2-CH-C(CH3)-CH2-的异戊二烯单位的疏水链。对于某一给定的生物体的泛醌而言，上述异戊二烯单位的数目n具有特异性。

Q10是具有上述化学通式的泛醌，而Q10内异戊二烯单位的数目达n＝10(相当于50个碳原子的异戊二烯链)。自然界的生物体普遍产生Q10，尤其是人类、其他动、植物界的高等生物，各种细菌、真菌或酵母也有Q10。其他已知的泛醌为Q6(面包酵母(baker’syeast))、Q8(大肠杆菌)及Q9(荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus))。

Q10的化学结构决定了其生理和化学功能、以及在细胞内的定位。醌型结构(quinoid structure)拥有生化效应物功能，并且可进行可逆性电子摄取(被两个电子还原，对苯二酚形式)及释放(氧化，醌的形式)。此外还有一种称为半醌形式的中间阶段(仅摄取或释放一个电子)。Q10在细胞膜内的定位是疏水异戊二烯链的作用。

已知的Q10生化及生理功能包括(该摘要请参阅评论文献“辅酶Q10的生化功能”，F.L.克伦，美国营养学院期刊(2001)20：591-598)：-呼吸链里的电子载体(能量转换)。

-保护细胞膜不受氧化作用的损坏(抗氧化剂功能及其他抗氧化剂的再生作用)。

-刺激细胞生长及抑制细胞死亡。

Q10因拥有生化及生理功能而广泛应用在各个领域，如制药、食品及化妆品。

Q10在制药方面的已知用途为用于心脏衰竭及其他心血管疾病。

Q10在食品方面以维生素制剂的形式用作食品补充剂。

化妆品的皮肤乳液利用Q10作为添加剂，而Q10在牙齿保健组合物中的应用则正在测试中。

Q10的合成尚未有具成本效益的化学方法。制造Q10需从自然界的资源提取。由于一般自然资源中的Q10成分很少，因此提取方式毫无经济效益。目前仅有少数自然资源有足够高的Q10含量(例如少数微生物或蔬菜油)。因此纵然Q10需求量增加，其价格仍居高。

各种具有较高Q10产量的微生物已有详细的说明。细菌生产者包括土壤杆菌属(Agrobacterium)、红色细菌属(Rhodobacter)或丝状单胞菌属(Hyphomonas)的菌株。高Q10产量的细菌在某些案例中有记载，但其商业用途仍属未知。

已知制造Q10的酵母菌株以例如Sporobolomyces、Rhodotorula、Oosporidium及Sporidiobolus属为代表。其中特别是Sporidiobolusruineniae的菌株，自1978年(美国专利4070244)便公认为Q10的高产生产菌，其产量达每克生物量含有0.92毫克Q10，属于制造Q10的酵母菌株中的最高生产量。

虽然早期已发现Sporidiobolus ruineniae的高Q10生产菌的特质，自此之后未有能将该酵母菌株Q10生产改良作商业用途的记载。特别是尚未找到分离Q10产量增高的S.ruineniae菌株的方法，且在Q10生产发酵方法方面没有进一步发展。这意味将Sporidiobolus ruineniae开发成Q10生产菌系统面临着困难。而本发明则克服了这些难题。

本发明涉及生产经过诱变处理的Sporidiobolus ruineniae菌株的方法，该菌株的每克干生物量的Q10产量大于1.38毫克，其中a)对一Sporidiobolus ruineniae菌株通过诱变进行遗传学操作，并且b)对经过诱变处理的Sporidiobolus ruineniae菌株进行选择，其中将该经过诱变处理的Sporidiobolus ruineniae菌株培养在对a)中所用的Sporidiobolus ruineniae菌株具有生长抑制作用的条件下，所选的条件使得经过诱变处理的菌株通过产生Q10而克服该生长抑制作用，所述经过诱变处理的菌株的Q10产量与a)中使用的Sporidiobolusruineniae菌株相比是增高的，经过诱变处理的菌株在发酵培养基中生长，并且c)自所述的发酵培养基中被分离出来。

微生物的Q10生物合成包含了两个代谢途径，即芳香族氨基酸的合成途径及类异戊二烯(isoprenoids)代谢。泛醌的生物合成的详细说明请参阅“微生物中泛醌生物合成”，R.马格那特汉，FEMS微生物报(2001)203：131-139。

凭借对生化功能及生物合成途径的认知，有可能以创新的方法分离出Q10产量增高的菌株。本发明的方法(筛选)的原理是根据选择性细胞生长：将S.ruineniae菌株培养在通常会抑制细胞生长的条件下。所选的生长抑制条件可允许细胞通过Q10产量的增加而克服该生长抑制作用，并可再度生长。筛选过后，即使不存在生长抑制物质，仍可看到该改良的菌株的Q10产量是增加的。

使Q10产量增加的方法各式各样，但其原理一直以S.ruineniae菌株的遗传学修饰为基础。使S.ruineniae的Q10产量增加的遗传学修饰优选地是利用以下遗传学操作的方式达成的：基于诱变物质或高能量辐射对S.ruineniae基因组的作用(突变)、通过不同的S.ruineniae细胞的融合以及由此形成的遗传重组(称为“基因组洗牌(genome shuffling)”)而实现，或通过使用遗传工程方法对Q10生物合成途径进行定向干预而实现。性质改变的突变菌株，例如Q10产量增加的突变菌株，可用合适的选择条件进行识别。

适合用于诱变的物质为N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NG)、甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸二甲酯(DMS)，以及所有其他相类似的诱变物质。

基因毒害辐射是高能量、短波长的紫外线(UV)、X射线或放射性发射物。

然而，任何其他类型的基因毒害物质或辐射皆适合使基因随机改变，达成S.ruineniae突变菌株Q10产量增加的效果。

NG、EMS及UV辐射适合应用在突变的形成，特别优选的是NG和UV辐射。

在进行选择前，用于诱变的诱变剂的量优选地使进行诱变处理的S.ruineniae细胞达到30％至99％的杀伤率。诱变中优选的S.ruineniae细胞的杀伤率是40％至90％；50％至90％的S.ruineniae细胞的杀伤率尤其优选。例如这可用浓度为0.01-0.06毫克/毫升的NG而实现。

通过依据本发明的选择性细胞生长方式，可用不同方法分离Q10产量增高的突变菌株。

选择性细胞生长条件可在Q10生物合成途径层面上产生。本发明的选择条件抑制Q10生物合成途径中个别的生物合成步骤。这些包括芳香族氨基酸转变成4-羟基苯甲酸以及最后转变成酪氨酸的生物合成途径的所有步骤、以及异戊二烯侧链的生物合成途径的所有步骤。

对芳香族氨基酸的生物合成途径的抑制优选地是在莽草酸盐(shikimate)转变成分支酸盐(chorismate)阶段进行，使用此生化合成步骤的竞争性抑制剂，如N-膦酰基甲基甘氨酸(N-phosphonomthylglycine，亦称为草甘膦(glyphosate)或RoundUp)。

在3，5-二羟基-3-甲基戊酸(mevalonic acid)合成层面对异戊二烯侧链的合成进行竞争性抑制也是优选的选择。HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂(称为他汀类(statins)或降胆固醇剂)尤其适合。合适的选择性抑制剂为他汀类，如洛伐他汀(lovastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)及美伐他汀(mevastatin，compactin)，均以其分离形式或内酯形态存在，且每种类型的抑制剂通过抑制HMG-CoA还原酶起作用，例如甲羟戊酸，其影响HMG-CoA还原酶的合成(Dimster-Denk，1994)。洛伐他汀及西立伐他汀效果尤其优选。

适合用于选择Q10产量增高的S-ruineniae菌株的类异戊二烯生物合成途径中的进一步反应步骤为，但不限于，形成以下物质的反应步骤：焦磷酸香叶酯(geranyl pyrophosphate)、焦磷酸法呢酯(farnesylpyrophosphate)、鲨烯或例如八氢番茄红素(phytoene)。

Q10醌构架的生物合成包括三个甲基化步骤，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。可使用选择性试剂分离S-腺苷甲硫酸量增加的菌株(可使Q10产量增加)，例如使用乙硫氨酸(一种甲硫氨酸的类似物)。

本发明针对选择Q10产量增高的S.ruineniae菌株的进一步优选的方法是通过Q10的生化功能而实现的。根据Q10的抗氧化作用，所有产生氧化应激的条件皆适用于本发明的选择方法。产生氧化应激的试剂有活性氧分子，例如过氧化氢，包括所有可能从过氧化氢衍生的过氧化物，以及由过氧化氢与其他物质作用而原位产生的所有活性氧分子。例如过氧化氢与亚麻酸，或与一般的不饱和脂肪酸的结合。由单或多不饱和脂肪酸产生的活性过氧化脂质的说明，请参阅杜等人，美国科学院院刊(1996)93：7534-7539所述。该活性氧分子中亦有超氧化物自由基，和适用于产生超氧化物自由基的化合物如百草枯(paraquat)(1，1′-二甲基-4，4′-双吡啶二氯化物，也称为甲基紫精(Methyl viologen)或gramoxone)。同属此类的是羟自由基及适合形成羟自由基的化合物。另外，让细胞经过热休克也可能对细胞产生氧化应激。

用于氧化应激选择方法的优选的试剂为过氧化氢、其衍生的过氧化物、通过过氧化氢与其他物质组合所产生的活性氧分子、能形成超氧化物自由基的百草枯，以及不饱和脂肪酸如亚麻酸。氧化应激选择方法中的特别优选的试剂为过氧化氢、百草枯与亚麻酸，以及其他单或多不饱和脂肪酸或这些试剂的组合。

适合用于本发明的选择Q10产量增高的S.ruineniae菌株所用的进一步优选的方法中的Q10的第二项生化功能在于Q10在呼吸链中电子载体功能。有了这种功能，使得可损伤呼吸链功能的抑制剂适合用于选择Q10产量增高的细胞。Q10在呼吸链中一方面充当复合体I与II之间的电子载体(摄入电子)，另一方面则充当复合体III的电子载体(释放电子)。有关呼吸链中Q10的功能，请参阅综述文献“辅酶Q10的生化功能”，F.L.克兰，美国营养学院期刊(2001)20：591-598。

目前已知有不同的化合物可作为抑制剂以损伤呼吸链功能(请参阅“线粒体”，作者A.特扎高尔富，92-95页，1982 Plenum出版公司，纽约，国际书号0-306-40778-7)。除了一般抑制剂外，例如氰化物或一氧化碳，特别适合本发明选择方法用以分离Q10产量增高的S.ruineniae菌株的是Q10的结构类似物。合适的呼吸链抑制剂，例如抗霉素、特别是抗霉素A、鱼藤酮、异戊巴比妥、辣椒素(capsaicin)、MPP+、粘噻唑菌醇(myxothiazole)、螺粘液杀菌素(mucidin)、2-甲萘醌(维生素K3)或粉蝶霉素(piericidin)。优选的抑制剂为2-甲萘醌、鱼藤酮、抗霉素A及粉蝶霉素。特别优选的抑制剂为2-甲萘醌、抗霉素A及粉蝶霉素。

用于分离Q10产量增高的S.ruineniae菌株的上述选择剂可用所有可能的浓度及可能的组合来使用。

该选择剂优选的使用浓度为0.005％(w/v)至1％(w/v)(百草枯、过氧化氢)、5mM至500mM(亚麻酸)，0.001mM至1mM(抗霉素A、粉蝶霉素A、2-甲萘醌)。

选择剂特别优选的使用浓度为0.01％(w/v)至0.3％(w/v)(百草枯)、20mM至300mM(亚麻酸)，0.01mM至0.5mM(抗霉素A、粉蝶霉素A、2-甲萘醌)。

按照上述优选的浓度范围调配的选择剂的优选的组合为过氧化氢+百草枯、过氧化氢+亚麻酸、百草枯+亚麻酸、百草枯+亚麻酸+粉蝶霉素A、百草枯+抗霉素A、和百草枯+粉蝶霉素。

按照上述特别优选的浓度范围调配的选择剂的优选的组合为过氧化氢+百草枯、过氧化氢+亚麻酸、百草枯+亚麻酸、百草枯+亚麻酸+粉蝶霉素A。

Q10产量增高的S.ruineniae突变体由以下本发明的方法分离出。S.ruineniae用上述的方式进行诱变处理。在本发明的选择条件下生长的突变体则被选出进一步培养。接着在摆动烧瓶中培养以进行比较测验，选择Q10产量增高的突变体。

经分离的突变体在生长基质中进行浸没培养以产生生物量。分离生物量并使用已知方式提取出Q10。Q10的量则使用高压液相层析法(HPLC)定量，或任何定量方法皆合适。

将起始菌株的Q10产量与各种突变体比较，以选出有最高Q10产量的突变体；使选出的菌株再次进行新的诱变处理及所述的选择。新的诱变处理及选择条件是依据以上定义的优选条件而选择的。使用此方法可能会分离出本发明的S.ruineniae菌株，其适合用生物技术的方法生产Q10，并且与现有技术相比较有显著的进步。要获得这样的菌株，优选地进行1至10次的诱变处理及选择；特别优选地进行2至6次的诱变处理及选择。

因此通过本发明的方法可能获得令Q10产量显著改善的S.ruineniae菌株。令Q10产量显着改善的S.ruineniae菌株的定义是：其Q10产量至少比US 4,070,244中公开的现有技术的产量(0.92毫克Q10/克生物量)增加50％的菌株。这些菌株所拥有的Q10产量大于1.38毫克Q10/克生物量。如此，本发明还涉及一种Q10产量大于1.38毫克Q10/克生物量的S.ruineniae菌株，该菌株可用本发明的诱变处理及选择方法获得。

用于上述对菌株进行改良的方法中的菌株为Sporidiobolusruineniae Sr-1(依据布达佩斯条约以编号DSM 15553保藏在德国微生物及细胞培养物保藏中心，D-38142不伦瑞克)。

本发明的进一步的目标是要提供一种改良的Q10生产方法。该目标可通过一种方法而实现，其中将依据本发明而Q10产量增高的S.ruineniae菌株细胞在培养基中培养，并于细胞生长70至150小时后将其分离。选出的菌株则在培养基中培养并制造生物量以生产Q10。培养工作以本领域人员熟知的方式，用实验室级摇动锥形瓶或发酵方式进行。

本领域人员熟知的培养基在文献(美国专利US 4,070,244)中有详述：培养基通常包含碳源(C源)、氮源、(N源)及添加物如维生素、盐及微量元素(使细胞生长最佳化)。S.ruineniae可使用碳源来形成生物量。这些包括葡萄糖、右旋糖、麦芽糖、乙酸盐(乙酸)、甘油及乙醇。现有技术中已知有可用来培养Sporidiobolus属菌株的碳源。例如荷兰菌株保藏中心CBS(“Centraalbureau voorSchimmelcultures”)网址(www.cbs.knaw.nl/cbshome.html)就提供了一项调查结果。

用来培养Sporidiobolus属菌株的优选的碳源为葡萄糖、淀粉、麦芽糊精、甘油、麦芽糖、乙酸及其盐类、蔗糖、糖蜜、柠檬酸及其盐类。

Sporidiobolus ruineniae可用氮源来制造生物量。这些包括气态氨或液态NH4OH，或是铵盐形式，例如硫酸铵、氯化铵或硝酸铵。另外适合作为氮源的有已知的硝酸盐，例如KNO3、NaNO3、硝酸铵、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2，以及其他氮源如尿素。氮源也包括复合氨基酸混合物如酵母提取物(包括技术性酵母提取，例如Quest的HYYest444)、 蛋白胨(proteose peptone)、麦芽提取物、大豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆(corn steep liquor)、以及NZ胺类和酵母氮源。

培养可用“分批”模式进行，其中在培养基中接种Sporidiobolusruineniae起始菌使细胞生长，而不再进一步以营养源料进行补料。

培养亦可用“补料-分批”模式进行，其中在分批模式中的初始生长阶段后将用营养源料(饲料)加以补料以补偿其消耗。补料的营养源料包含碳源、氮源及两者的混合物。另外也可在营养源料中加入特别使Q10产量增加的其他培养基成分及添加物。

补料-分批模式的培养方法是优选的。

优选的补料碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麦芽糖或乙酸盐。

优选的补料氮源为气态氨或液态NH4OH，或是铵盐如硫酸铵、氯化铵、KNO3、NaNO3、硝酸铵、酵母提取物、HY Yest444、 蛋白胨、麦芽提取物、大豆蛋白胨、氨基酸、玉米浆，以及NZ胺类和酵母氮源。

特别优选的补料氮源为氨、或铵盐、酵母提取物、大豆蛋白胨、麦芽提取物或玉米浆。

在培养基中也可添加特别适合增加Q10产量的成分(所谓的诱导物)。这些包括化合物如对-羟基苯甲酸及其盐和乙醚(US4,070,244)、异戊烯基(US 4,220,719)、酪氨酸及其生化前体物质，如莽草酸或分支酸及不饱和脂肪酸，如油酸(R.A.哈格尔曼等人，自由基研究(2002)36：485-490)。

进行培养的条件为适合Sporidiobolus ruineniae生长及制造Q10的pH值及温度。合适的pH范围是pH4至pH10。优选的pH范围是pH4至pH9。特别优选的pH范围是pH5.0至pH8.5。

S.ruineniae生长的优选温度范围是20℃至40℃。特别优选的温度范围是25℃至35℃。

S.ruineniae生长需要足够的氧气。使用压缩空气或纯氧才能确保氧气补给充分。

S.ruineniae能够生产Q10的生长时间为10小时至200小时之间。优选的生长时间为30小时至120小时。特别优选的生长时间为40小时至100小时。

用上述培养方法获得的S.ruineniae细胞含有Q10。Q10可自这些细胞提取出并加以分离。该细胞亦可经直接处理后做进一步使用而不必分离Q10。

分离Q10的方法(US 4,070,244)是已知的，且包括一提取步骤，其中必须将Q10与细胞膜分开。此步骤可用机械方式(磨碎)或化学方式(溶剂)破坏细胞结构。随后将Q10提取至有机溶剂，加以纯化并去除污染成分，此可用沉淀方法、层析法或特定的复合法(如环糊精)进行。鉴别分离的Q10有不同的分析方法，包括质谱法、核磁共振(NMR)、紫外线/可见光(UV/Vis)吸收光谱法、HPLC或这些方法的组合。

优选的Q10分析方法为HPLC。

处理培养物中的Sporidiobolus ruineniae细胞供进一步直接使用，而不事先纯化其中所含的Q10的方法为：冷冻干燥、喷雾干燥、热干燥，以及磨碎与筛出获得的干生物量。在合适的条件下，用此方法处理的Q10可直接供进一步应用。

以下实施例进一步解说本发明。

实施例实施例1：Q10的分离分离Q10而不以机械方式破坏S.ruineniae细胞：该方法曾在筛选Q10产量增高突变体时使用。将Sporidiobolusruineniae Sr-1(DSM 15553)接种于50毫升YPGC培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、5％甘油、2％玉米浆)，并在轨道式摇床(Infors，每分钟140转)以28℃孵育120小时。随后将该批菌转移至50毫升的离心管(Falcan离心管)，将S.ruineniae细胞离心至下层(HeraeusMegafuge，1.0R，每分钟3000，10分钟)。之后以30毫升去离子水洗涤，使其再悬浮于5毫升去离子水并转移至50毫升的圆底烧瓶中。接着把细胞悬浮液以最均衡方式用乙醇/干冰混合将其冷冻并干燥(Christ“alpha 2-4”冷冻干燥机)。将200毫克经称重的干燥物加入12毫升玻璃管，与10毫升乙醇混合后用氮气覆盖。随后在40℃过夜以卧式摇动进行提取。接着将悬浮液离心后用氮气覆盖上清液。进行二次提取时则将8至10毫升乙醇加入沉淀物，覆盖氮气后均匀混合并在40℃卧式摇动2小时。该程序在第三次提取中重复，并将悬浮液在40℃卧式摇动1小时。三次提取后的上清液经合并后与5毫升去离子水及10毫升正庚烷混合并离心，以便分开。将上层有色的正庚烷相移入50毫升圆底烧瓶，并将10毫升正庚烷加入下层再次摇动提取，经离心后分离正庚烷相。随后将正庚烷相合并，用旋转蒸发机去除溶剂。呈红色的残余物在加入1毫升四氢叶酸(THF)后用校正过的HPLC定量。

以机械方式破坏S.ruineniae细胞的Q10分离法：此方法曾供取自发酵罐的样品做Q10定量用。将发酵的25毫升细胞悬浮液(请参见实施例6及7)转移至50毫升离心管(Falcon离心管)，并将S.ruineniae细胞离心至下层(Heraeus Megafuge，1.0R，每分钟3000转，10分钟)后用水洗涤细胞沉淀物一次。用10毫升水使细胞沉淀物悬浮，并以定量方式将其转移至称重过的50毫升圆底玻璃烧瓶。接着将细胞悬浮液冷冻、过夜冷冻干燥(Christ“alpha2-4”冷冻干燥机)，然后将干生物量称重定量。随后用除细胞膜仪(Braun，Melsungen)以机械方式破坏细胞。方法是将300毫克的干生物量放入除细胞膜仪的3毫升Teflon槽、加入直径5毫米的钢珠，盖上Teflon槽盖子后以液态氮冷冻。接着将冷冻的Teflon槽夹入除细胞膜仪并以每分钟2000次摇动2分钟。将以此机械方法破坏的200毫克干生物量经称重后放入12毫升的玻璃管，与8毫升正庚烷混合并在40℃过夜摇动。该批培养菌离心后(Heraeus离心机，每分钟3000转，10分钟)，将其有机相转移至100毫升圆底玻璃烧瓶。用正庚烷重复提取两次(每次40℃摇动2小时)。将正庚烷相合并后用回转蒸发机去除溶剂。呈红色的余留物在加入1毫升四氢叶酸后用校正过的HPLC定量。

用校正过的HPLC做Q10产量的定量：对含有Q10样品进行定量使用的是校正过的HPLC。配有EliteHy-纯度C18管柱(由Phenomenex制造)的Agilent 1100 HPLC，其移动相(平衡状态)的组成为71％(v/v)乙腈、22％(v/v)二氯甲烷、4％(v/v)甲醇、2％水及1％(v/v)丙酸。流速为每分钟2毫升。层析柱温度为室温。所注入的体积为5微升。检测器为HP二极管阵列检测器(惠普Hewlett Packard)结合了一种整合器，以便量化峰值面积。所用的测量波长为280纳米。校正使用的标准液是0.2毫克Q10/毫升四氢叶酸(Sigma)。按照所述的条件，Q10滞留时间为10.3分钟。峰值的紫外线光谱则用来识别并测定样品产品峰值的纯度，以便定量。Q10量以定量测定：将Q10标准液的峰值面积与未知样品的Q10峰值面积比较。由定量式HPLC分离测定便可测出Q10体积产量(毫克Q10/升培养基)及Q10产量(毫克Q10/克干生物量)。实施例2：使用紫外线辐射或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)对Sporidiobolus ruineniae进行诱变处理在YPD培养皿上以紫外线进行诱变：将Sporidiobolus ruineniae Sr-1用YPD基质(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)在摇动锥形瓶中以28℃培养48小时。随后将培养菌稀释成OD600光学密度0.1，并取0.1毫升接种在YPD琼脂平面培养皿(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％琼脂)。接着将培养皿暴露于紫外线(紫外线来源：法国Vilber Lourmat的TFP 20M紫外灯，6×15W，213nm)。达到所需的Sporidiobolus ruineniae细胞杀伤率的辐射剂量(暴露时间及强度)已在初步测试中测定。杀伤率应介于50％与99％之间。用紫外线进行诱变处理的细胞以28℃孵育2至5天，直到看见菌落为止。YPD培养皿含有对Sporidiobolus ruineniae造成选择压力的添加物，并且使得过量产生Q10的突变体菌株具有生长优势。该YPD培养皿被应用于平行菌批中(请参阅实施例3及以紫外线促使悬浮细胞产生突变：将Sporidiobolus ruineniae Sr-1用YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)在摇动锥形瓶中以28℃培养48小时。在新鲜的YPD培养基中注入预培养物并以相同条件进一步培养，直到S.ruineniae细胞的光学密度为0.4(OD600)。将0.5毫升该细胞悬浮液离心，随后使其重新在2毫升的0.9％NaCl溶液中悬浮，并且在无菌培养皿中暴露于紫外线，分别为20、30及40秒(紫外线来源：法国Vilber Lourmat的TFP 20M紫外灯，6×15W，213纳米)。将产生突变的细胞在YPD培养皿上以28℃孵育2至5天，直到看见菌落为止。YPD培养皿含有对Sporidiobolus ruineniae造成选择压力的添加物，并且使得过量产生Q10的突变菌株具有生长优势。该YPD培养皿被应用于平行菌批中(猜参阅实施例3及实施例4)。

使用NG进行诱变处理：将Sporidiobolus ruineniae Sr-1用YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)在摇动锥形瓶中以28℃培养48小时。在新鲜的YPD培养基中注入此预培养物，并以相同条件进一步培养，直到S.ruineniae细胞在OD600的光密度达到1.0。将10毫升细胞悬浮液离心后以10毫升柠檬酸缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH5.5)洗涤，并且以1毫升份量的用含有不同量的NG(0.01至0.06毫克/毫升)的柠檬酸缓冲液在试管中以28℃孵育一小时。细胞经离心后以1毫升磷酸缓冲液(0.1M KH2PO4，pH7.0，以NaOH调整)洗涤，并以不同倍数稀释在YPD培养皿上。将培养皿以28℃孵育2至5天、直到看见菌株为止。YPD培养皿含有对Sporidiobolus ruineniae造成选择压力的添加物，并且使得过量产生Q10的突变菌株具有生长优势。该YPD培养皿被应用于平行菌批中(请参阅实施例3及实施例4)。

此处描述的方法通用于分离Q10产量增高的突变Sporidiobolusruineniae。此方法特别适合以多次重复诱变处理及选择方式显著提升S.ruineniae的Q10产量。其中Q10产量增高的突变菌株经选出后再当作下次诱变处理及选择的起始菌株(请看随后的实施例)。

实施例3：选择Q10产量增高的Sporidiobolus ruineniae突变菌株如实施例2所述产生S.ruineniae突变菌株，并在选择条件下加以培养。所选的选择生长条件有利于预先分离特定突变菌株，即由于Q10的代谢突变而使Q10产量增加的突变菌株。

所使用的选择试剂浓使得用于诱变处理的起始菌株生长率下降50至90％。除非另有说明，该选择试剂被混合在YPD培养皿上，如实施例2中所产生的经过诱变处理的细胞则被接种在此培养皿上。

所选出的特定选择条件如下：将百草枯以0.1-0.5％(w/v)的浓度加入YPD培养皿。再将2-甲萘醌以3微克/毫升、20微克/毫升、50微克/毫升或100微克/毫升的浓度加入YPD培养皿。抗霉素则以5至100μM之间的浓度、杀粉蝶菌素A以20、50、或100μM浓度混合在YPD培养皿中。

实施例4：使用各种添加物的组合来选择Sporidiobolus ruineniae突变菌株亦使用各种选择试剂的组合来分离经过诱变处理的、Q10产量增高的Sporidiobolus ruineniae细胞。

使用百草枯与亚麻酸组合的选择：如实施例2所述将S.ruineniae Sr-1细胞以NG使其突变，然后采取摇动培养按照选择条件以28℃孵育4小时。摇动培养菌用添加了选择试剂的组合的YPD培养基，所述的组合为0.01％百草枯及50mM或100mM的亚麻酸。经28℃孵育4小时后将细胞接种在YPD培养皿上。

使用百草枯、亚麻酸与杀粉蝶菌素A组合的选择：如实施例2所述将S.ruineniae Sr-1细胞以NG使其突变，然后采取摇动培养按照选择条件以28℃孵育4小时。摇动培养菌用添加了选择试剂的组合的YPD培养基，所述的组合为0.01％百草枯及50mM或100mM的亚麻酸。经28℃孵育4小时后将细胞接种在YPD培养皿上；该培养皿另含有50uM的杀粉蝶菌素A。

将已种入按所述方式事先处理的S.ruineniae细胞的YPD培养皿，用28℃孵育2至5天。以此方法所产生的S.ruineniae突变菌株的单一菌落经选出后接种在新鲜的YPD培养皿上，并且再次孵育。每次的诱变处理以此方法分离出400个突变菌株，随后加以研究其Q10产量的增加(请参阅实施例5)。

实施例5：分析Sporidiobolus ruineniae突变菌株的Q10产量Sporidiobolus ruineniae突变菌株经由实施例的所述的诱变处理及实施例3与实施例4的选择方法分离出。接着进行两次筛选。每次筛选选出400个突变菌株，并在YPD培养皿上培养以做后续Q10分析。Q10分析是将突变菌株在摇动锥形瓶中培养，然后测定Q10产量。

在50毫升的YPGC培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、5％甘油、2％玉米浆)中分别接种一种突变菌株，并且以28℃、每分钟140转的摇动速度孵育120小时。将细胞离心后用30毫升去离子水洗涤，并重新以5毫升去离子水悬浮，再转移至经称重的50毫升圆底瓶。细胞悬浮液尽可能以均匀方式在乙醇/干冰混合体中冷冻并加以干燥。冷冻干燥的生物量重量则以干燥物测定。将200毫克干燥物与10毫升乙醇混合后用氮气覆盖。Q10的提取按照实施例1所述进行(无机械式破坏的Q10分离法)。接着测定Q10体积产量(毫克Q10/升)及Q10比产量(specific Q10 production)(毫克Q10/克生物量)。每次筛选系列中，将进行诱变处理所用的起始菌株当作对照。每次用重复实验方式，从400个突变菌株中选出具有最高Q10体积产量的菌株，再将其当作下次筛选的起始菌株。

表1显示从第一次筛选中选出突变菌株的Q10产量，该菌株生产方法如同实施例1、2及3所述，并与起始菌株比较后鉴定出其Q10产量显著改善。第一次筛选使用紫外线对S.ruineniae进行诱变处理。

表1：Sporidiobolus ruineniae Sr-1(DSM 15553)及Q10产量增高的突变菌株。

自第一次筛选中选出Sr-220菌株用于第二次筛选。第二次筛选中使用了NG促使Sr-220突变菌株的形成。突变菌株则以百草枯与亚麻酸的组合选出。表2列出Q10产量显著改善的突变菌株。

表2：Sporidiobolus ruineniae菌株Sr220及Q10产量改善的突变菌株。

第二次筛选中选出了Sr220-159菌株以建立S.ruineniae发酵的方法(请参阅实施例6及实施例7)。将S.ruineniae野生菌株Sr-1与Sr 220-159突变菌株比较时显示可用此新的菌株改良方法使S.ruineniae的Q10产量显著改善。历经两次诱变处理及选择的菌株Q10产量(毫克Q10/克生物量)与体积产量(毫克Q10/升培养基)各约增加了300％。

实施例6：S.ruineniae菌株发酵分批发酵使用了Biostat M发酵罐(Braun，Melsungen)。培养槽总容量为2升。可使用容量为1升。该发酵罐另配有电极，以测量pO2及pH。发酵的pH为6.0并以氢氧化铵及磷酸控制。压缩空气以每分钟1.6升进入发酵罐。发酵温度为28℃，且搅拌速度为每分钟900转。该发酵罐另配有泡沫感应器，并用水以1∶5倍数稀释来控制Structol J 647抗泡沫的计量(Schili und Seilacher)。发酵罐中加入了1升的无菌YPGC培养基(请参阅实施例1)。发酵用的接种源是以同样的培养基、在28℃及每分钟140转(lnfors摇床)培养四天产生的Sporidiobolus ruineniae Sr220-159菌株的第一预培养物。将5毫升第一预培养物接种入50毫升YPGC培养基中以培养出第二预培养物。接着将第二预培养物以28℃、每分钟140转过夜摇动。再将第二预培养物按照无菌条件接种入发酵罐并开始发酵，发酵时间达96小时。发酵完成后便按照实施例1所述测定干生物量及Q10。经干燥的生物量为25克/升，以及Q10比产量为0.89毫克Q10/克干生物量。

实施例7：S.ruineniae的补料-分批发酵补料-分批发酵使用了Biostat M发酵罐(Braun，Melsungen)。培养槽总容量为2升。可使用容量为1升。该发酵罐另配有电极，以测量pO2及pH。发酵的pH为6.0并以及氢氧化铵及磷酸控制。压缩空气以每分钟1.6升进入发酵罐。

发酵温度为28℃，且搅拌适度为每分钟900转，该发酵罐另配有泡沫感应器，并用水以1∶5倍数稀释控制Structol J 647抗泡沫的计量(Schill und Seilacher)。发酵罐中加入了1升的无菌YPGC培养基(请参阅实施例1)。发酵用的接种源是以同样的培养基、在28℃及每分钟140转(lnfors摇床)培养四天产生的Sporidiobolus ruineniaeSr220-159菌株的第一预培养物。将5毫升第一预培养物接种入50毫升YPGC培养基中以培养出第二预培养物。接着将第二预培养物以28℃、每分钟140转过夜摇动。再将第二预培养物按照无菌条件种入发酵罐并开始发酵。发酵时间达96小时。补料于发酵开始24小时后进行。补料溶液含有75％(v/v)甘油及2％(w/v)酵母提取物。发酵开始后24至48小时之间的补料速度为每小时12毫升；自48小时至发酵结束(96小时)的补料速度为每小时6毫升。其间则在不同时刻取得发酵罐培养基，以便定量测定Q10产量，Q10测定使用的是除细胞膜仪方法(请参阅实施例1)。发酵结束时生物量为73.6克/升，以及Q10产量为3.12毫克/克干生物量。与分批发酵方法及现有技术的Sporidiobolus ruineniae(US 4070244，Q10产量为0.92毫克/克，生物量18克/升)比较，这表示Q10产量显着增加。