技术领域
[0001] 本
发明属于细胞分离与培养领域，特别涉及一种分离和培养人脂肪干细胞的方法。
背景技术
[0002] 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是干细胞的一个分支，是一类具有自我复制和多向分化能
力的细胞，广泛存在于多种组织中，如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等。间充质干细胞有三个显著的特点：1.体外的培养的间充质干细胞是贴壁生长的；2.间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD14、 CD19和CD11b等标志物；3.在合适的刺激因素下，间充质干细胞能分
化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种组织的细胞。
[0003] 脂肪间充质干细胞，又叫脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs)是从脂肪组织分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究证明脂肪干细胞在特定的培养条件下能够分化成脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等多种类型的细胞。脂肪干细胞具有很低的免疫原性，因此移植异体的脂肪干细胞不会引起强烈的免疫排斥，为同种异体移植脂肪干细胞提供了有利条件。脂肪干细胞来源广泛，使用抽脂或者
切除脂肪的方法可以获得脂肪组织，使用脂肪干细胞不存在伦理上的问题。脂肪干细胞在体外有很强的扩增能力，可以通过体外培养的方法得到大量的脂肪干细胞。脂肪干细胞在丰胸、除皱等美容和整形等行业有很广泛的应用，而且在医疗领域脂肪干细胞也发挥着越来越多的作用。
[0004] 脂肪干细胞在制备和培养过程中会出现以下问题：1.在分离脂肪干细胞的过程中会混入一些杂细胞，会影响脂肪干细胞的贴壁与生长。2.在分离脂肪干细胞的过程中，如果酶解时间太长，会对脂肪干细胞造成损伤。3.多数科研或医疗机构仍然使用动物血清培养脂肪干细胞，但是不同批次的血清
质量差别很大，其成分和功能不能保持一致；而且动物血清含有低
水平的抑制细胞生长的物质，以及潜在的病毒和支原体污染。4.脂肪干细胞在培养过程中存在一定程度的分化。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，该方法一方面能够快速和有效的从脂肪组织中解离细胞，不但提高了干细胞的产量，缩短了分离细胞的时间，还最大程度的保持了细胞的活性；另一方面培养基成分明确，不含任何外源血清成分，能显著的提高脂肪干细胞的贴壁能力和增殖能力，有利于脂肪干细胞在体外扩增和保持其干性，具有良好的应用前景。
[0006] 本发明的一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，包括：
[0007] (1)采用由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和ACCUTASE组成的混合消化酶溶液消化脂肪抽吸物，消化结束后中和消化酶，离心、过滤，然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞；
[0008] (2)采用无血清培养基培养脂肪干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：
[0009] 重组人胰岛素：1～10μg/ml；
[0010] 重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；
[0011] 重组人
碱性
成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；
[0012] 重组人转化生长因子-β：1～50ng/ml；
[0013] 重组人血小板衍生生长因子-BB：10～50ng/ml；
[0014] 氢化可的松：0.5～10μg/ml；
[0015] 维生素C：10～100μg/ml；
[0017] 重组人转
铁蛋白：0.5～10μg/ml；
[0020] 辅酶A：1～50μg/ml；
[0021] 重组人凝血酶：1～10U/ml；
[0022] 庆大霉素：1～100μg/ml；
[0023] 亚硒酸钠：1～100ng/ml；
[0025] 所述步骤(1)中的混合消化酶溶液由0.1％～0.4％(m/v)的胶原酶Ⅰ、0.1％～0.4％(m/v) 的胶原酶Ⅱ和1/4～1/2×ACCUTASE(STEMCELL Technologies)组成。
[0026] 所述步骤(1)中的混合消化酶溶液与脂肪抽吸物的体积比为1:1。
[0027] 所述步骤(1)中的消化
温度为37℃，消化时间为半小时之内。
[0028] 所述步骤(1)中的中和消化酶采用等体积的含有10％FBS的培养基。
[0029] 所述步骤(1)中的过滤具体为分别用直径100微米和40微米的过滤网过滤。
[0030] 在所述步骤(2)培养脂肪干细胞之前用1～10μg/mL的重组人纤连蛋白包被培养瓶。
[0031] 所述培养瓶在4℃的条件下包被过夜。
[0032] 所述步骤(2)中的无血清培养基为DMEM-F12。
[0033] 在所述步骤(2)培养脂肪干细胞之后细胞传代过程中使用TrypLETM消化细胞。
[0034] 具体的，首先，用无血清的DMEM-F12培养基配制含有0.3％(m/v)的胶原酶Ⅰ和0.3％ (m/v)的胶原酶Ⅱ溶液，再把两种胶原酶溶液的
混合液和ACCUTASE(STEMCELL Technologies)以1:1的体积混合；最终得到的混合消化酶溶液含有0.15％的胶原酶Ⅰ、
0.15％的胶原酶Ⅱ以及1/2×ACCUTASE。
[0035] 把用生理盐水洗涤过的脂肪抽吸物和混合消化酶溶液以1:1的体积混合，在37℃的恒温摇床中消化15分钟左右，摇床的转速是100rpm。消化结束后，加入等体积的含有10％FBS 的培养基中和消化酶。然后以400g的转速离心十分钟，收集细胞沉淀。
[0036] 用生理盐水重悬细胞，让细胞悬液先后通过直径为100微米和40微米的过滤网，得到单个细胞的悬液。为了进一步去除杂细胞，把细胞悬液加到淋巴细胞分离液上方，以400g的转速离心30分钟，直接收集最上面的液体层和分离液之间的细胞层。
[0037] 用生理盐水洗细胞两次，离心后丢弃上清，用新鲜的培养基重悬细胞，把细胞放入培养瓶培养。培养24小时后，换液，用生理盐水洗去没有贴壁的细胞。在随后的培养过程中根据细胞的实际生长情况换液或者传代。
[0038] 本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基含有多种生长因子和营养物质，这能促使干细胞在无血清培养条件下正常的生长和代谢：
[0039] 纤连蛋白是一种细胞外基质蛋白，能介导细胞之间、细胞和细胞外基质的粘附。用纤连蛋白包被培养瓶能促使细胞更好的贴壁。本发明使用重组人纤连蛋白包被培养瓶。
[0040] 重组人胰岛素可以提高细胞的合成
代谢能力，刺激细胞的生长。
[0041] 表皮生长因子是一种具有多种功能的生长因子，对细胞有强烈的促分裂作用。
[0042] 碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β和血小板衍生生长因子-BB都是具有促进
细胞增殖和分裂的生长因子，这三种因子的组合已被证明能够显著促进间充质干细胞的增殖和增强干细胞的分化能力。
[0043] 氢化可的松是一种糖皮质
激素，具有促进糖原异生和提高
蛋白质分解代谢等作用。
[0044] 维生素C是一种抗
氧化剂，能保护细胞免受自由基的威胁，而且维生素C还参与细胞的代谢，可以显著的促进各种间充质干细胞的增殖。
[0045] 还原型谷胱甘肽是含有巯基(SH)的三肽类化合物，在人体内具有活化氧化还原系统，激活SH酶、解毒作用等重要生理活性。还原型谷胱甘肽还参与三
羧酸循环和糖代谢，起到辅酶的作用。
[0046] 转铁蛋白是细胞中的主要铁传递蛋白，转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性并为细胞代谢提供铁元素。
[0047] 乙醇胺参与磷脂类代谢，是细胞生长必须的营养物质。
[0048] L-谷氨酰胺是细胞生长的重要
能量来源，参与蛋白质和脂类的合成与代谢，还能提高细胞的抗氧化能力。L-谷氨酰胺不够稳定，在配制培养基之前会补加L-谷氨酰胺。
[0049] 辅酶A是
机体乙酰化反应的辅酶，在糖、脂类和蛋白质代谢中起着非常重要的作用。
[0050] 凝血酶能促使间充质干细胞分泌纤连蛋白，从而增强间充质干细胞贴壁和促进细胞增殖。
[0051] 庆大霉素是一种广谱的抗生素。
[0052] 亚硒酸钠是细胞生长中的必须微量元素，在细胞代谢中起着抗氧化的作用。
[0053] 生物素又称维生素H，是
水溶性维生素，也属于维生素B族。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可缺少的物质。
[0054] 有益效果
[0055] (1)本发明中所使用的混合消化液是一种经过优化的消化酶组合，使用这种混合酶溶液只需要15分钟就能把脂肪组织里面的细胞都解离出来，明显少于常规酶解方法所耗费的时间。这不但能提高干细胞的产量，还最大程度的保持了干细胞的活性。
[0056] (2)临床级别的干细胞培养首先避免使用动物血清，因为动物来源的血清存在有病原体污染的
风险，而且成分复杂，批次之间会有很大的差异。本发明使用无血清培养基培养干细胞，在培养基中加入多种生长因子和
营养元素，能有效的促进细胞贴壁和显著的提高细胞的增殖能力，有很好的临床应用价值和潜力。
[0057] (3)传统的培养方法使用胰酶消化细胞。虽然胰酶消化细胞的效率很高，但是如果消化力度掌握不好会对细胞造成很大的损伤。而且胰酶一般是来源于猪或者
牛组织，胰酶的活性要用胎牛血清中止，这样在细胞培养过程中还是引入了动物成分。TrypLETM是一种基因工程酶，不含动物来源的成分。TrypLETM可以有效和更加温和的解离贴壁细胞，这样细胞在消化中不容易损伤，很好的保证了细胞的活力。而且TrypLETM的活性不需要胎牛血清中止，只需用生理盐水或者培养基稀释即可。
附图说明
[0058] 图1是脂肪干细胞在
实施例1的无血清培养基中和常规有血清培养中的生长曲线；
[0059] 图2是P1代的脂肪干细胞在使用实施例1的无血清培养基条件下的形态图。
具体实施方式
[0060] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或
修改，这些等价形式同样落于本
申请所附
权利要求书所限定的范围。
[0061] 实施例1
[0062] 一、配制消化脂肪的混合消化酶溶液：
[0063] 用无血清的DMEM-F12培养基配制含有0.3％(m/v)的胶原酶Ⅰ和0.3％(m/v)的胶原酶Ⅱ溶液，并用孔径为0.2μM的过滤膜除菌。再把两种胶原酶的混合液和ACCUTASE solution (STEMCELL Technologies)以1:1的体积混合，最终得到的混合消化酶溶液含有0.15％的胶原酶Ⅰ、0.15％的胶原酶Ⅱ以及1/2×ACCUTASE solution。
[0064] 二、用纤连蛋白包被细胞培养瓶：
[0065] 在使用本实施例提供的无血清培养基的时候，每个培养瓶都要提前用重组人纤连蛋白包被。以T75培养瓶为例，描述包被的过程：在一个T75的培养瓶中加入5毫升用生理盐水稀释的浓度为5.0μg/ml的重组人纤连蛋白溶液，4℃包被过夜(大约12～16个小时)。在加入细胞之前，吸走纤连蛋白溶液。
[0066] 三、分离和培养脂肪干细胞：
[0067] 把脂肪抽吸物加入到250毫升的离心管中，然后加入等体积的生理盐水；用力摇晃离心管几次，然后让离心管静置几分钟，脂肪组织会浮在生理盐水上面；吸走生理盐水，再重新加入新鲜的生理盐水，用同样的操作重复洗脂肪几次直到脂肪里面的血液被洗掉。
[0068] 脂肪抽吸物和混合消化酶溶液以1:1的体积混合，在37℃的恒温摇床中消化15分钟左右，摇床的转速是100rpm。消化结束后，加入等体积的含有10％FBS的培养基中和消化酶。然后以400g的转速离心十分钟，收集细胞沉淀。
[0069] 用生理盐水重悬细胞沉淀，让细胞先后通过直径为100微米和40微米的过滤网，收集单个细胞。
[0070] 在一个干净的50毫升的离心管中加入20毫升的淋巴细胞分离液Ficoll，再把细胞悬液缓慢的加入到分离液上面。关掉离心机的减速
阀，用400g的转速离心30分钟，收集上面液体层和分离液之间的白色细胞层。
[0071] 用2倍体积的生理盐水重悬细胞，以300g的转速离心10分钟，丢掉上清。用生理盐水再次清洗细胞，离心后丢掉上清，用新鲜的培养基重悬细胞，把细胞放入培养瓶培养。培养 24小时后，换液，用生理盐水洗去没有贴壁的细胞。
[0072] 本实施例所提供的无血清培养中包含以下营养物质：10μg/ml重组人胰岛素、20ng/ml 重组人表皮生长因子、20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml重组人转化生长因子-β、20ng/ml重组人血小板衍生生长因子-BB、10ng/ml重组人干细胞因子、0.5μg/ml氢化可的松、50μg/ml维生素C、2mM还原型谷胱甘肽、5μg/ml重组人转铁蛋白、1μg/ml乙醇胺、2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml辅酶A、5U/ml重组人凝血酶、10μg/ml庆大霉素、10μg/ml 的生物素和5ng/ml亚硒酸钠。在随后的培养过程中根据细胞的实际生长情况换液或者传代。当细胞的融合度达到70～80％的时候，用TrypLETM消化细胞传代，细胞的传代比例是1:
3。四、比较本实施例的无血清培养基和有血清培养基的扩增能力：
[0073] 用本实施例分离的脂肪干细胞分别用两种培养基培养：本实施例的无血清培养基和常规的有血清培养基(DMEM-F12+10％FBS)。在P2代的时候，消化细胞，仍然分别用无血清培养基和有血清培养基把细胞制成悬液加到六孔板里面。每个六孔板的单孔里面有2毫升培养基，起始细胞数量都是6000；两组细胞都有5
块平行接种的六孔板。把六孔板放回
培养箱。每2天从培养箱里面取出一块六孔板，消化里面的细胞和细胞计数。在第7天的时候对剩下的细胞全部换液，细胞增殖实验会持续到第10天。
[0074] 如图1所示，两组细胞的增殖速度展示出明显的差异，p<0.01。脂肪干细胞在本实施例提供的无血清培养基中的增殖速度明显高于在常规有血清培养基中的增殖速度。
