具有改变产物产量特性的真细菌RNA聚合酶突变体
阅读：1037发布：2020-12-08
专利汇可以提供具有改变产物产量特性的真细菌RNA聚合酶突变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有改变产物产量特性的真细菌RNA聚合酶突变体，具体地，本发明涉及一种分离的突变真细菌，其包含至少一个突变，上述突变导致了由rpoB基因编码的RNA聚合酶β-亚基中至少一个 氨 基酸发生取代，因此在同等的生长条件下，与等基因亲本株系产生的目的产物的产量相比，上述突变作用导致了目的产物的产量发生了改变，其中所述的至少一个氨基酸取代发生在SEQ ID NO：2中 位置 469、478、482、485或487中的任意一个，或者任一真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置。本发明的另一方面涉及一种在突变真细菌中生产至少一种目的产物的方法以及本发明突变真细菌在生产至少一种目的产物中的用途。，下面是具有改变产物产量特性的真细菌RNA聚合酶突变体专利的具体信息内容。
1.一种在地衣芽孢杆菌宿主细胞中生产至少一种重组分泌多肽的方法，包括：
a)提供包含至少一个突变的地衣芽孢杆菌宿主细胞，上述突变导致了由rpoB基因编码的RNA聚合酶β-亚基中至少一个氨基酸发生取代，在同等的生长条件下，与非突变的地衣芽孢杆菌宿主细胞相比，上述突变作用导致了所述至少一种重组分泌多肽的产量或产率提高，其中所述的取代为Q469R、H482R、A478V、Q469R+R485H或S487L，该取代发生在SEQ ID NO:2上，或者任何地衣芽孢杆菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置上；和b)在适当的培养基中培养所述突变地衣芽孢杆菌宿主细胞，从而产生所述重组分泌多肽。
2.根据权利要求1的方法，还包括分离或纯化所述重组分泌多肽。
3.根据权利要求1或2的方法，其中至少一个氨基酸取代为A478V。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述重组分泌多肽为一种酶。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述重组分泌多肽为选自分类系统中的下述酶类：
EC1的氧化还原酶、EC2的转移酶、EC3的水解酶、EC4的裂解酶、EC5的异构酶或EC6的连接酶。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述重组分泌多肽为选自具有下述活性的酶类：
淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和转移酶。
7.根据权利要求6的方法，其中所述重组分泌多肽为选自具有下述活性的酶类：氨肽酶、羧肽酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化物酶、葡糖氧化酶、酚氧化酶、角质酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、环式糊精糖基转移酶、转谷氨酰胺酶和β-半乳糖苷酶。
8.根据权利要求7的方法，其中所述重组分泌多肽为选自具有下述活性的酶类：过氧化氢酶和卤素过氧化物酶。
9.根据权利要求1或2的方法，其中所述重组分泌多肽为淀粉酶。
具有改变产物产量特性的真细菌RNA聚合酶突变体
[0001] 本发明申请是基于申请日为2002年12月20日，申请号为02826472.X(国际申请号为PCT/DK02/00886)，发明名称为“具有改变产物产量特性的真细菌RNA聚合酶突变体”的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种分离的真细菌突变体，其包含至少一突变，上述突变导致rpoB基因编码的RNA聚合酶β-亚基中至少一种氨基酸发生取代，因此在同等的条件下，与等基因亲本株系产生的目的产物的产量相比，上述突变作用导致了目的产物的产量发生了改变。本发明的另一方面涉及在突变真细菌中生产至少一种目的产物的方法以及使用本发明的突变真细菌生产至少一种目的产物的用途。
背景技术
[0003] 在多肽的工业化生产中，人们的兴趣是获得尽可能高的产物产量。增加产量的一条途径是增加编码目标多肽的基因的拷贝数，其可以通过将基因置于具有高拷贝数的质粒中来实现，然而在宿主细胞的培养过程中，如果没有选择压力，质粒是不稳定的，并且经常从宿主细胞中丢失。另一条增加目标基因拷贝数的途径是以多拷贝的形式将其整合到宿主细胞的染色体上。以前已经描述过在不使用抗生素标记的情况下，通过双重(double)同源重组的方法可以将基因整合到染色体上(Hone等，Microbial Pathogenesis，1988，5：407-418)；也有关于整合两个基因的描述(Novo Nordisk：WO91/09129和WO 94/14968)。将基因的多个拷贝整合到宿主细胞的染色体上导致了不稳定性。也有人描述过将空间上紧密相连的反向平行排列的两个基因整合能获得较好的稳定性(Novozymes：WO 99/41358)，并且将多基因的多拷贝整合也同样具有稳定性(Novozymes：WO 02/00907)。
[0004] 其他增加产物产量的方法可以是提高调节特异性目标基因表达的特异性启动子的启动子活性，也可以通过同时综合提高一些启动子的活性来改善产物的产量。
[0005] 在细菌的RNA聚合酶中，研究最多的是大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶，它代表了从许多细菌属中分离得到的酶，包括沙门氏菌属(Samonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌(Proteus)、气杆菌属(Aerobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)(Fukuda等，1977，Mol.Gen.Genet.154：135)。
[0006] RNA聚合酶的核心酶由α、β和β’-亚基，按2∶1∶1的比例组成，它们分别由rpoA、rpoB和rpoC基因编码。在RpoB基因内突变体提供了对多种抗生素(如利福平)的细胞抗性。
[0007] 利福平结合于β-亚基，并且在体外和体内均完全阻止了通过酶的RNA链的生产起始作用(Wehrli和Staehelin，1971，Bact.Rev.35：290)。由于β-亚基发生了改变不再与药物相结合，从而导致细胞获得了对利福平的抗性。
[0008] 利福平抗性细胞的RNA聚合酶β-亚基中的突变位于亚基中心的200个氨基酸链长中的3个单独的区域，上述区域被定义为假定的利福平结合袋(packet)(Jin和Gross，1988，J.Mol.Biol.202：45-58)。
[0009] 由rpoB基因突变所产生的利福平抗性可以产生多效表现型(Yang和Price，1995，J.Biol.Chem.270：23930-23933；Kane等，1979，J.Bacteriol.137：1028-1030)，一些情况下可以导致基因活性的增加，而在一些情况下并不产生任何效果(Kane等，1979，J.Bacteriol.137：1028-1030)。Sharipova等(1994，Microbiology 63：29-32)报道，在一些利福平抗性株系中具有较高水平的磷酸酶活性，而在另一些利福平抗性株系中则具有较低水平的磷酸酶活性。已有人报道，从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的-
利福平抗性SPO分离物中，α-淀粉酶的活性增加了100倍(Hu Xuezhi等，1991，Acta microbiologicasinica 31：268-273)。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，突变Q469R导致产生了利福平抗性，并对NusG产生了超敏性(Ingham和Furnaux，2000，Microbiology，146：3041-3049)。
利福平抗性SPO分离物中，α-淀粉酶的活性增加了100倍(Hu Xuezhi等，1991，Acta microbiologicasinica 31：268-273)。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，突变Q469R导致产生了利福平抗性，并对NusG产生了超敏性(Ingham和Furnaux，2000，Microbiology，146：3041-3049)。
发明内容
[0010] 虽然一些报道显示在利福平抗性分离物中一些基因产物的产量有所增加，但也有报道表明rpoB的突变效果具有很高的多效性，并且所观察到的产量增加从来没有联系到特定的rpoB基因中的突变。令人惊奇的是本发明的特异性突变无论是单独、还是组合，在所述rpoB-突变存在于宿主菌株时，都将导致目的产物的产量产生大幅度的改善。
[0011] 本发明的第一方面涉及一种分离的突变体真细菌，其包含至少一个突变，上述突变导致了所编码的RNA聚合酶β-亚基中至少一种氨基酸发生取代，因此与在同等的生长条件下培养的等基因亲本株系产生的目的产物的产量相比，上述突变作用导致了目的产物的产量发生了改变，其中所说的至少一种氨基酸取代发生在SEQ ID NO：2中469、478、482、485和487的任一位置处，或者发生在任何真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置上。
[0012] 本发明的第二方面涉及在突变真细菌中产生至少一种目的产物的方法，包括在适当的培养基中培养上述突变真细菌，并产生上述目的产物。
[0013] 本发明的第三方面涉及使用本发明的突变真细菌来生产至少一种目的产物的用途，包括在适当的培养基中培养上述突变真细菌，并产生上述目的产物。
[0014] 具体地，本发明涉及如下方面：
[0015] 1.一种不同等基因的亲本真细菌之分离的突变体，其包含至少一个突变，上述突变导致了由rpoB基因编码的RNA聚合酶β-亚基中至少一个氨基酸发生取代，，与同等的条件下培养的等基因亲本株系的产量或生产率相比，上述突变作用导致了目的产物的产量或生产率得到了改善，其中所述的至少一个氨基酸取代发生在SEQ ID NO：2中位置469、478、482、485或487中的任何位置，或者任何真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置；其条件为，所述的突变真细菌不是其中由Q469K或Q469R组成的至少一个氨基酸取代的枯草芽孢杆菌。
[0016] 2.根据项1所述的分离的突变真细菌，其中至少一个氨基酸取代包括Q469R、A478D、A478V、H482R、H482P、R485H或S487L。
[0017] 3.根据项1所述的分离的突变真细菌，其中至少一个氨基酸取代包括在SEQ ID NO：2中位置469或478处的任何随机取代，或在任何真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置所发生的取代。
[0018] 4.根据项1所述的分离的突变真细菌，其中至少一个氨基酸取代包括在SEQ ID NO：2中位置469、478、和/或487处的任何随机取代，或在任何真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置所发生的取代。
[0019] 5.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中至少一个氨基酸取代包括Q469R、A478D、和/或S487L。
[0020] 6.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中至少一个氨基酸取代包括Q469R或A478D。
[0021] 7.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中来源于细菌的RpoB蛋白与SEQ ID NO：2第461到500位置处氨基酸序列所述蛋白之等价区域具有至少80％的同源性。
[0022] 8.根据项7所述的分离的突变真细菌，其中来源于细菌的RpoB蛋白与SEQ ID NO：2第461到500位点处氨基酸序列所述蛋白的等价区域具有至少90％的同源性。
[0023] 9.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中所述细菌包括了革兰氏阳性菌。
[0024] 10.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中所述细菌包括了芽孢杆菌的各个种。
[0025] 11.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其包括了嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
[0026] 12.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其包括了迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
[0027] 13.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中所述细菌为地衣芽孢杆菌。
[0028] 14.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中目的产物是基因产物或代谢途径的产物。
[0029] 15.根据项14所述的分离的突变真细菌，其中基因包含在操纵子中。
[0030] 16.根据项14或15所述的分离的突变真细菌，其中基因是突变真细菌外源或内源基因。
[0031] 17.根据项14-16中任何所述的分离的突变真细菌，其中基因以至少两个拷贝的形式存在。
[0032] 18.根据项14-17中任何所述的分离的突变真细菌，其中基因以至少十个拷贝的形式存在。
[0033] 19.根据项14-18中任何所述的分离的突变真细菌，其中基因以至少100个拷贝的形式存在。
[0035] 21.根据项20所述的分离的突变真细菌，其中目的产物是一种多肽，优选是一种酶。
[0036] 22.根据项21所述的分离的突变真细菌，其中酶选自分类系统中的下述酶类：氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)。
[0037] 23.根据项21或22所述的分离的突变真细菌，其中酶选自具有下述活性的酶类：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环式糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。
[0038] 24.根据项23所述的分离的突变真细菌，其中酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。
[0040] 26.根据项20所述的分离的突变真细菌，其中目的产物是碳水化合物，优选透明质酸。
[0041] 27.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中真细菌是重组真细菌。
[0042] 28.根据项27所述的分离的突变真细菌，其中目的产物是重组多肽。
[0043] 29.根据项28所述的分离的突变真细菌，其中编码多肽的基因被整合到突变真细菌的宿主染色体上，但在整合位点处并未留有任何抗生素抗性标记基因。
[0044] 30.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中目的产物产量的改变与生长在等同条件下的等基因亲本株系正常水平相比，其产量至少增长5％到1000％。
[0045] 31.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中目的产物产量的改变与生长在等同条件下的等基因亲本株系正常水平相比，其产量至少增长5％到500％。
[0046] 32.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中目的产物产量的改变与生长在等同条件下的等基因亲本株系正常水平相比，其产量至少增长5％到250％。
[0047] 33.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中目的产物产量的改变包括改善产量或改善生产力。
[0048] 34.根据上述任何项所述的分离的突变真细菌，其中目的产物是分泌型、膜结合型或存在于细胞内。
[0049] 35.一种在突变真细菌中生产至少一种目的产物的方法，包括在适当的培养基中培养项1-34中任意之一所定义的突变真细菌，由此产生所述目的产物。
[0050] 36.根据项35所述的方法，其进一步包含分离或纯化目的产物。
[0051] 37.项1-34中任意之一所述的突变真细菌在生产至少一种目的产物中的用途，其中包括了在适当的培养基中培养上述突变真细菌，由此产生所述目的产物。
[0053] 附图1中对比序列的第一行显示了地衣芽孢杆菌RpoB蛋白的40个氨基酸片段，对应于SEQ ID NO：2中第461到500的位置。第二行显示了克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)RpoB蛋白的同源的40个氨基酸片段，对应于(incl.)序列4中第462到501的位置，上述位置与SEQ ID NO：2中的相应位置进行了比对。上述两个片段与已公布的不同细菌的RpoB蛋白序列进行了比对，结果显示在附图1中，粗体字母表示与顶端两个芽孢杆菌属RpoB蛋白序列存在差异的野生型序列。附图中每一个来源编号对应的同源片段，其微生物来源如下：
[0054] 来 源 1)B oor 等，Genetic and transcriptional organization of the regionencoding the beta subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase.J.Biol.Chem.270：20329(1995)。
[0055] 来 源 2)Kaneko 等，Sequence analysis of the genome of theunicellularcyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC6803.II.Sequence determinationof the entire genome and assignment of potential protein-coding regions.DNARes.3：109(1996)。
[0056] 来 源 3)Parkhill 等，Complete DNA sequence of a serogroup A strain ofNeisseria menigitidis Z2491.Nature 404：502(2000)。
[0057] 来源4)Aboshikiwa等，Cloning and physical mapping of theStaphylococcus aureus rplL，rpoB and rpoC genes，encoding ribosomal proteinL7/L12 and RNA polymerase subunits beta and beta’.J.Gen.Microbiol.138：1875(1992)。
[0058] 来 源 5)Ovchinnikov 等，The primary structure of Escherichia coli RNApolymerase.Nucleotide sequence of the rpoB gene and amino-acid sequence ofthe beta-subunit.Eur.J.Biochem.116：621(1981)。
[0059] 来 源 6)Fleischmann 等，Whole-genome random sequencing and assemblyof Haemophilus influenzae Rd.Science 269：496(1995)。
[0060] 来 源 7)Kalman 等，Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C.trachomatis.Nat.Genet.21：385(1999)。
[0061] 来源8)Mollet等，Determination of Coxiella burnetii rpoB sequence and itsuse for phylogenetic analysis.Gene 207：97(1998)。
[0062] 来源9)Stover等，Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosaPAO1，an opportunistic pathogen.Nature 406：959(2000)。
[0063] 来 源 10)Borodin 等，Nucleotide sequence of the rpoB gene coding for thebeta-subunit of RNA polymerase in Pseudomonas putida.Lokl.Biochem.302：1261(1998)。
[0064] 来 源 11)Sverdlov 等，Nucleotide sequence of the rpoB gene of SamonellatyPhimurium coding for the beta-subunit of RNA polymerase.Dokl.Biochem.287：62(1986)。
[0065] 来 源 12)Honore 等，Nucleotide sequence of the first cosmid from theMycobacterium leprae genome project：structure and function of the Rif-Strregions.Mol.Microbiol.7：207(1993)。
[0066] 来 源 13)Alekshun 等，Molecular cloning and characterization of Borreliaburgdorferi rpoB.Gene 186：227(1997)。
[0067] 来 源 14)Laigret 等，The unique organization of the rpoB region ofSpiroplasma citri：a restriction and modification system gene is adjacent to rpoB.Gene 171：95(1996)。
[0068] 来 源 15)Parkhill 等，The genome sequence of the food-borne pathogenCampylobacter jejuni reveals hypervariable seqyences.Nature 403：665(2000)。
[0069] 来源16)Deckert等，The complete genome of the hyperthermophilicbacterium Aquifex aeolicus.Nature 392：353(1998)。
[0070] 来源17)Palm等，The DNA-dependent RNA-polymerase of Thermotogamaritima；characterisation of the enzyme and the DNA-sequence of the genes forthe large subunits.Nucelic Acids Res.21：4904(1993)。
[0071] 来源18)Takaki等，Sequence analysis of a 32-kb region including themajor ribosomal protein gene clusters from alkaliphilic Bacillus sp.strain C-125.Biosci.Biotechnol.Biochem.63：452(1999)。
[0072] 来 源 19)Simpson 等，The genome sequence of the plant pathogen Xylellafastidiosa.Nature 406：151(2000)。
[0073] 来 源 20)Drancourt，M.Klebsiella ornithinolytica，Klebsiella taxonomy.Submitted(FEB-1999)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0074] 来 源 21)Drancourt and Raoult，Calymmatobacterium granulomatis rpoB.Submitted(DEC-1999)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0075] 来 源 22)Mollet 等，(Serratia marcescens)RNA polymerase beta-subunit.Submitted(NOV-1996)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0076] 来 源 23)Nakasone 等，Isolation of rpoB and rpoC genes from deep-seapiezophilic bacterium Shewanella violacea and its overexpression in Escherichiacoli.Submitted(JUL-2000)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0077] 来 源 24)Padayachee and Klugman，Molecular basis forrifampicin resistantStreptococcus pneumoniae isolates from South Africa.Submitted(FEB-1999)tothe EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0078] 来 源 25)Nielsen 等，Legionella pneumophila RNA polymerase B-subunit(rppB)gene.Submitted(DEC-1998)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0079] 来 源 26)White 等，Genome sequence of the radioresistantbacteriumDeinococcus radiodurans R1.Science 286：1571(1999)。
[0080] 来源27)Streptomyces coelicolor，Seeger and Harris，Submitted(MAR-2000)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0081] 来 源 28)Helicobacter pylori(Campylobacter pylori)，Hocking 等，Submitted(JAN-1997)to the EMBL/GenBank/DDBJ databases。
[0082] 定义
[0083] 在讨论本发明的具体实施方案之前，首先提供关于本发明主要方面的特定术语的定义。在本发明的说明书和权利要求书中，使用了传统的单个字母核苷酸代码和传统的单个字母和三个字母氨基酸残基代码。为了便于参考使用了下列命名法：
[0084] 原始氨基酸 位点 取代氨基酸
[0085] 按照这种命名法，具体实例为，天冬酰胺在位置30处取代丙氨酸以表示为：
[0086] Ala 30 Asn 或 A30N
[0087] 在同一位置处的丙氨酸缺失表示为：
[0088] Ala 30* 或 A30*
[0089] 插入额外的氨基酸残基，例如赖氨酸，表示为：
[0090] Ala 30 AlaLys 或 A30AK
[0091] 缺失氨基酸残基的连续区段，30-33位置处的氨基酸残基为例，可以表示为(30-33)*。
[0092] 在含有缺失(例如缺失氨基酸残基)的特异性多肽与其同源多肽进行相比处，如果在上述位置发生插入，可以表示为：
[0093] *36Asn 或 *36N
[0094] 表明了在位置36处插入了天冬酰胺。
[0095] 多突变采用加号来表示，例如：
[0096] Ala 30 Asn+Glu 34 Ser 或 A30N+E34S
[0097] 代表了在位置30和34处发生了取代(天冬酰胺和丝氨酸分别取代了丙氨酸和谷氨酸)。
[0098] 在一个给定的位置处可以插入一个或更多个可选择的氨基酸残基时，表示为：
[0099] A30N，E 或 A30N或A30E
[0100] 此外，当一个适合于修饰的位置没有给出具体的修饰方式时，可以理解为其它任何氨基酸残基都可以取代该位置上的氨基酸残基(例如可以从A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中选择不同于通常在所研究该位置上的其它任一氨基酸残基)。因此，例如在位置202处发生甲硫氨酸的修饰作用(取代)，M202，但并没有给出具体的修饰方式，可以理解为其它任一氨基酸残基都可以取代甲硫氨酸，例如可以从A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y和V中选择其它任何氨基酸残基。
[0101] 真细菌：本发明中的术语“真细菌”是指具有细胞壁的单细胞原核微生物，细胞可以是杆菌、球菌(cocci)或螺旋菌，多数种类的细菌是通过一个或多个鞭毛来实现运动的。真细菌与原始细菌的区别之处在于其拥有肽聚糖细胞壁和由酯类相连的脂质。
[0102] 突变真细菌：本发明中的术语“突变真细菌”是指不同的等基因(otherwise isogenic)亲本真细菌，它是通过在RNA聚合酶β-亚基上述5个位置中的至少1个发生突变而获得的。
[0103] 取代：本发明中的术语“取代”是指一个氨基酸被另一个氨基酸替代。
[0104] β-亚基：本发明中的术语“β-亚基”是指rpoB基因编码的RpoB蛋白，其被包含在RNA聚合酶中，所述RNA聚合酶由α、β和β’-亚基组成，按2∶1∶1的比例组成，它们分别由rpoA、rpoB和rpoC基因编码。
[0105] rpoB基因：本发明中的术语“rpoB基因”是指编码RNA聚合酶中β-亚基的基因。
[0106] β-亚基家族成员：本发明中的术语“β-亚基家族成员”不是指通常分类学意义上的包含相同属成员的家族，而是指由α、β和β’3个亚基组成，并按上述比例组成的原核(真细菌)RNA聚合酶，其中β-亚基氨基酸序列包含了40个连续的氨基酸，这40个连续的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2中RpoB蛋白序列第461到500处位置进行比对，并且至少具有75％的同源性。
[0107] 等基因亲本株系：本发明中的术语“等基因亲本株系”是指在突变体中，除所述突变体的rpoB基因至少一个突变外，该菌株遗传上等同于的突变体菌株或突变体的后代。
[0108] 等价位置：本发明中的术语“等价位置”是指与SEQ ID NO：2中461到500位置片断相比对后的位置，附图1和实施例3中也进行了解释。
[0109] 同源性：本发明中的术语“同源性”是指同源的多核苷酸或多肽。如果两个或更多个多核苷酸或两个或更多个多肽具有同源性，这就意味着同源的多核苷酸或多肽至少具有60％的同一性，优选至少70％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％。可以通过已有技术中公知的计算机程序对两个序列进行对比来确定上述两个多核苷酸或多肽序列是否具有足够高的同一性以达到所定义的同源性程度，此种计算机程序例如GCG程序包中提供的“GAP”程序(Program Manual for the WisconsinPackage，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。在使用GAP程序对DNA序列进行比较时，采用下述设定：GAP生成罚分(creation penalty)为5.0，GAP延伸罚分(extension penalty)为0.3。
[0110] 代谢途径：本发明中的术语“代谢途径”是指活细胞中由酶催化的生物化学反应链条，例如将一种化合物转换为另一种化合物，或由较小的单元组建成较大的高分子，或分解化合物释放出了利用的能量。
[0111] 外源的：本发明中的术语“外源的”是指在自然情况下，通常不存在于宿主生物体中的物质，例如基因。
[0112] 内源的：本发明中的术语“内源的”是指来源于宿主生物体体内的物质，例如基因。
[0113] 操纵子：本发明中的术语“操纵子”是指包括一些基因的多核苷酸，这些基因成簇的，并且可能转录在多顺反子mRNA中，例如编码代谢途径中酶的基因。操纵子的转录可以起始于启动子区域，并且由相邻的调控基因进行调控，其编码一种调控蛋白，反过来结合于操纵子的操作子序列上，进而分别对转录进行抑制或增强。
[0114] 改变产物产量：本发明中的术语“改变产物产量”是指或者产物的产量发生了改变，其意味着每增加一定数量的底物，终产物的产量发生了改变，或者通过缩短或延长培养周期可以获得相同数量的终产物。改变产物产量可以是增加产物的产量，也可以是增加生产力，然而也可以是降低产物的产量或降低某种产物的生产力。
[0115] 核酸构建体：此处所说的术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或已经过修饰作用而包含了自然界中并不存在的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”具有相同的含义。
[0116] 调控序列：此处所说的术语“调控序列”是指包含了表达本发明多肽所必需的或有利于表达本发明多肽的所有成份。对编码多肽的核酸序列而言，每一种调控序列可以是同源的，也可以是异源的。上述调控序列包括，但并不局限于前导序列、多聚腺苷酸序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最小程度上，调控序列包括了启动子、转录和翻译终止信号。调控序列中可以提供接头而有目的地引入特异性限制性位点，从而方便于调控序列与编码多肽的核酸序列中的编码区域进行连接。
[0117] 操作性连接：此处所说的术语“操作性连接”是指一种结构，在该结构中调控序列被放置在相对于DNA序列中的编码序列而言为恰当的位置处，从而保证调控序列可以行使对多肽表达的指导作用。
[0118] 编码序列：此处所说的术语“编码序列”是意欲包括一种核酸序列，其直接说明的是其蛋白产物的氨基酸序列。编码序列的界限通常为开放阅读框确定，其通常起始于起始密码子ATG。典型的编码序列包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
[0119] 表达：此处所说的术语“表达”包括了产生多肽的任何步骤，其中包括了，但并不局限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0120] 表达载体：此处所说的术语“表达载体”包括了线性的或环状的DNA分子，其包括了编码本发明多肽的片段，上述片段操作性地与提供其转录的其它片段相连。
[0121] 宿主细胞：此处所说的术语“宿主细胞”包括了任何适于用核酸构建体转化的细胞类型。
具体实施方式
[0122] 如前所述大肠杆菌中导致利福平抗性的突变体具有多种效果。大肠杆菌中的这种抗性来源于rpoB基因中的点突变(Jin和Gross，1988，J.Mol.Biol.202：45-58)，上述点突变处于该蛋白的3个独立区域。在一些报道中突变也造成了特异性蛋白表达水平发生了改变。在来自不同的细菌的已知rpoB基因中进行测序，发现了很高程度的同源性。
[0123] 我们已经测定出地衣芽孢杆菌中RpoB蛋白的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌中RpoB蛋白具有约95％的同源性。在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的β-亚基中拥有四个非常相似的共线性序列区，其中包括了一旦改变将产生利福平抗性的保守区域。本发明分离了地衣芽孢杆菌的rpoB突变体，并且检测了目的产物的产量。可以采用已有技术中已知的方法来获得RpoB突变体，例如定点突变或随机突变。如前所述RpoB蛋白中还存在有其它一些位置，如果上述位置发生突变将导致产生利福平抗性。
[0124] 本发明获得了地衣芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌的利福平抗性RpoB突变体，并且检测了不同RpoB突变个体对目的产物产量的改变情况。
[0125] 通过对分离的突变体进行研究表明，地衣芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌的利福平抗性是由于rpoB基因的点突变，在实施例4和5中还进一步鉴定了增加了特异性目的产物产量的特异性突变体。
[0126] 在多数情况下，如果RpoB蛋白5个特异性位置中的一个发生了单氨基酸取代就将导致目的产物的产量发生改善，同时也可能存在两个或更多个特异性突变之间的协同效果。
[0127] 因此，本发明的第一方面涉及一种分离的真细菌突变体，其包含至少一个突变，上述突变导致了由rpoB基因编码的RNA聚合酶β-亚基中至少一种氨基酸发生取代，因此在同等的生长条件下，与等基因亲本株系产生的目的产物的产量相比，上述突变作用导致了目的产物的产量发生了改变，其中所说的至少一种氨基酸取代发生在SEQ ID NO：2中469、478、482、485和487的任一位置处，或者发生在任一真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置上。
[0128] 在另一个实施方案中，产物产量的改变是指产量改进。
[0129] 在分离的突变体DNA序列中，本发明鉴定出一些至少是一个氨基酸发生了取代的特异性突变，上述特异性突变提高了目的产物的产量。因此在本发明的一个实施方案中，涉及在由rpoB基因编码的RNA聚合酶的β-亚基中至少有一个氨基酸发生了取代，上述至少一个氨基酸所发生的至少一个取代包括了Q469R、A478D、A478V、H482R、H482P、R485H或S487L，在与SEQ ID NO：2进行比对时，上述位置对应于不同来源的β-亚基的等价位置。
[0130] 一旦确定了可以导致产物产量发生改善的相关位置后，本领域技术人员就可以在此相同的位置试着进行随机突变。本发明的进一步实施方案涉及了本发明第一方面所提到的分离的突变真细菌，在上述突变真细菌中，所说的至少一个氨基酸取代包括了在SEQ ID NO：2中位置469或478处的任何随机取代；或者包括了在SEQ ID NO：2中位置469、478和/或487处的任何取代；或者在任一真细菌RNA聚合酶β-亚基家族成员的等价位置所发生的取代。
[0131] 在本发明的一个特定实施方案中，涉及了上述定义的分离突变真细菌，其中所发生的至少一个氨基酸取代包括了Q469R、A478D和/或S487L；或者优选包括Q469R或A478D；其中在与SEQ ID NO：2进行比对时，上述位置对应于这些β-亚基的等价位置。
[0132] 按照本发明，分离细菌应包含由α、β和β’3个亚基按上述比例组成的RNA聚合酶，上述β-亚基氨基酸序列中包含40个连续的氨基酸，这40个连续的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2中RpoB蛋白第461到500处位置进行比对，并且至少具有75％的同源性。
[0133] 在一个特定的实施方案中，上述同源性至少为80％，在另外两个特定的实施方案中，上述同源性分别为85％和90％。
[0134] 在一些细菌种类中，例如大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonetla)、奈瑟氏菌属(Neiseria)和假单胞菌属(Pseudomonas)等一些革兰氏阴性菌，与地衣芽孢杆菌(SEQ ID NO：2)位置478处相等价的位置处通常是由丝氨酸(S)而不是丙氨酸(A)。如附图1所示，地衣芽孢杆菌SEQ ID NO：2中461到500位置处的氨基酸片段均可与已公布的各种细菌RpoB蛋白相应序列进行比对。
[0135] 由于丝氨酸和丙氨酸在结构上非常相似，因此用丝氨酸来替代丙氨酸或用丙氨酸来替代丝氨酸而不影响RpoB蛋白的功能并不足以为奇。
[0136] 因此本发明所说的在478位置处发生的氨基酸取代，例如A478D或A478V或A478的任一随机取代，应该包括S478D或S478V或S478的任一随机取代。
[0137] 在本发明的第一方面，细菌是分离的突变真细菌。在其中的一个实施例中，分离的突变真细菌是革兰氏阳性菌。可用的革兰氏阳性菌包括了，但不局限于芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
[0138] 在另一个实施例中，所说细菌包括迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
[0139] 在本发明的另一个实施例中，所说细菌是地衣芽孢杆菌。
[0140] 按照本发明，目的产物包括基因产物或代谢途径中的产物，由于rpoB基因编码的RNA聚合酶的β-亚基中至少一个氨基酸发生了至少一次的取代作用，从而导致上述产物的产量得到了改善。
[0141] 本发明的一个优选实施方案中涉及了第一方面的突变体，该突变体中的目的产物是基因产物或代谢途径中的产物，优选编码目的产物的基因包含在操纵子中；更优选该基因是突变真细菌的外源或内源基因；最优选该基因以至少2个拷贝的形式存在或至少10个拷贝或甚至至少100个拷贝。
[0142] 可以通过能够稳定保持的合适质粒来携带基因或操纵子，例如在宿主细胞中能够稳定自主复制的质粒(对质粒的选择主要依靠该质粒与要引入的宿主细胞之间是否具有稳定的兼容性)或其可携带在宿主的染色体上。上述基因可以与宿主细胞具有内源性，在这种情况下，目的产物是宿主细胞产生的天然蛋白，并且大多数情况下，该基因处于其在染色体的通常位置处。如果编码目的产物的基因是一种外源基因，可以用合适的质粒携带该基因或将该基因整合到宿主的染色体上。在本发明的一个实施方案中，真细菌是一种重组真细菌。在其它的实施方案中目的产物也可以是一种重组蛋白。
[0143] 可以采用本领域技术人员公知的一些技术对编码目的产物的基因进行整合。该基因可以在染色体上存在一个、两个或更多个拷贝。
[0144] WO 91/09129和WO 94/14968(Novo Nordisk)对整合两个基因进行了描述，上述内容一并作为参考。WO 99/41358描述了对空间上紧密相连的反向平行排列的两个基因进行整合具有较好的稳定性(Novo Nordisk)，上述内容一并作为参考。WO 02/00907描述了基因的稳定染色体多拷贝整合(Novozymes A/S)，上述内容一并作为参考。
[0145] 编码目的产物的基因以多拷贝的形式存在可以进一步改善上述产物的产量。整合在宿主细胞染色体上的基因可以每条染色体上一个、两个或更多个拷贝的形式存在。携带于质粒中的基因可以在每个宿主细胞中以上百个拷贝的形式存在。在本发明的一个实施方案中，上述基因以至少两个拷贝的形式存在。在另一个实施方案中，上述基因以至少十个拷贝的形式存在。在另一个实施例中，上述基因以至少100个拷贝的形式存在。
[0146] 为了方便对染色体整合的选择，导致使用了选择性标记，例如抗生素抗性标记。然而应当尽量避免使用抗生素标记基因。WO 01/90393描述了一种将基因整合到宿主细胞染色体上而在菌株中并未留有抗生素抗性标记的方法，上述内容一并作为参考。
[0147] 在本发明的另一个实施方案中，涉及了对上述定义的分离的突变真细菌，在该突变真细菌中编码目的产物的基因被整合到突变真细菌的宿主染色体上，但在整合位点处并未留有任何抗生素抗性标记。
[0148] 本发明也涉及了包含编码目的产物的核苷酸序列的核酸构建体，其可以操作性地连接于一个或更多个调控序列上，上述调控序列在合适的宿主细胞中、在与其相兼容的条件下，对编码序列的表达进行指导。
[0149] 可以采用多种途径对编码目标多肽的核苷酸序列进行调控以使其表达目标多肽。根据表达载体，在将核苷酸序列插入表达载体之前，对其进行调控是比较合理或必需的。采用重组DNA方法对核苷酸序列进行修饰的技术已为本领域人员所公知。
[0150] 调控序列可以是适当的启动子序列，其为宿主细胞所识别的能够表达目标核苷酸序列的核苷酸序列。启动子序列中包含有可以调节多肽表达的转录调控序列。启动子可以是任何在宿主细胞中具有转录活性的核苷酸序列，包括了突变、截短和杂交启动子，其可以来源于与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。
[0151] 适于调节本发明核酸构建体转录的启动子实例，特别是在细菌宿主细胞中，可以是来源于大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的琼脂糖基因(dagA)，枯草芽孢杆菌的蔗糖6-果糖基转移酶基因(sacB)，地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌的青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌的xylA和xylB基因及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。 在“Usefulproteins from recombinant bacteria” 于 Scientific American，1980，242：74-94和Sambrook等，1989，同上中也描述了一些其它启动子。
[0152] 调控序列也可以是适当的转录终止子序列，该序列为宿主细胞识别以终止转录。终止子序列可操作性地连接于编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在宿主细胞中具有功能的终止子都可以在本发明中使用。
[0153] 调控序列也可以是适当的前导序列，其是对宿主细胞翻译起重要作用的mRNA的非翻译区。前导序列可操作性地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在宿主细胞中具有功能的前导序列都可以在本发明中使用。
[0154] 调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是一种可操作性地连接于核苷酸序列3’末端的序列，并且在转录过程中，可以被宿主细胞识别作为信号在转录形成的mRNA上加载多聚腺苷酸残基。任何在宿主细胞中具有功能的多聚腺苷酸化序列都可以在本发明中使用。
[0155] 调控序列也可以是一种信号肽编码区，该区域编码的氨基酸序列与多肽的氨基末端相连，并指导所编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的5’末端编码序列天然包含一种信号肽编码区，其通常与翻译阅读框相连，编码区的片段可以编码分泌型多肽。或者编码序列的5’末端包含与编码序列异源的信号肽编码区。在天然编码序列中不包含信号肽编码区时需要异源信号肽编码区简单地替代天然信号肽编码区。或者为了增加多肽的分泌，可以用异源信号肽编码区简单替换天然的信号肽编码区。然而任何可以指导表达多肽进入宿主细胞分泌途径的信号肽编码区都可以在本发明中使用。
[0156] 对细菌宿主细胞而言，有效的信号肽编码区可以是来源于芽孢杆菌属NCIB11837麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因的信号肽编码区。在Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137中也描述了一些其它的信号肽。
[0157] 调控序列也可以是前肽编码区，其编码的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。由此产生的多肽被称为酶或前多肽(在一些情况下也被称为酶原(zymogen))。通常前多肽是不具有活性的，可以通过催化作用或自主催化作用从前多肽中切除前肽而转变成成熟的有活性的多肽。前肽编码区可以来源于枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶基因(nprT)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的天冬氨酸蛋白酶基因和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)的漆酶基因(WO 95/33836)。
[0158] 在多肽的氨基末端存在信号肽和前肽区，前肽区的位置靠近多肽的氨基末端，而信号肽区的位置靠近前肽区的氨基末端。
[0159] 增加调节序列也是十分必要的，因为这些调节序列可以随着宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例可以是那些对化学或物理刺激以及调节化合物发生反应并开启或关闭基因表达的序列。原核系统的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。也可以采用酵母的ADH2或GAL1系统。在真核系统中，调节系统包括了在甲氨蝶呤存在时能够扩增的二氢叶酸还原酶基因和在重金属存在时能够扩增的金属硫蛋白基因。在上述情况下，编码多肽的核酸序列可操作性地与调节序列相连接。
[0160] 表达载体
[0161] 本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。上述的各种核酸和调控序列可以连接在一起，从而产生了重组表达载体，该重组表达载体中包括了一个或更多个限制性酶切位点，保证了在上述位点处方便地插入或取代编码多肽的核酸序列。或者也可以通过将核苷酸序列或含有该核苷酸序列的核酸构建体插入适当的表达载体来表达本发明的核苷酸序列。在构建的表达载体中，编码序列位于载体中以便于将编码序列操作性地与表达的调控序列相连接。
[0162] 重组表达载体可以是任何便于对重组DNA进行操作并使核酸序列进行表达的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择主要依靠于载体与载体将要引入的宿主细胞之间的兼容性。载体可以是线性或闭环质粒。
[0163] 载体可以是能够自主复制的载体，例如存在于染色体之外的载体，它的复制与染色体的复制相独立，实例有质粒、染色体外成份、微型染色体或人工染色体。
[0164] 为了保证自主复制，载体可以包含任何成份。或者将载体引入宿主细胞时，载体可以与基因组整合在一起，与其插入的染色体一起进行复制。此外，可以将含有全长DNA的单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒引入宿主细胞的基因组中，或是使用转座子。
[0165] 本发明的载体优选包含一个或更多个选择标记，上述选择标记允许对转化细胞进行容易的选择。选择标记可以是一种基因，其产物可以提供生物杀灭剂或病毒抗性、对重金属的抗性、原养型微生物对营养缺陷体的抗性等。
[0166] 细菌性选择标记的实例有来源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者可以提供抗生素抗性的标记，例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。
[0167] 本发明的载体优选含有能够允许将载体稳定整合到宿主细胞基因组或载体能够在宿主细胞中独立于基因组进行自主复制的元件。
[0168] 为了能够整合到宿主细胞基因组中，载体可以根据编码多肽的核苷酸序列或其它任何能够通过同源重组或非同源重组而将载体稳定整合到基因组中的元件。或者载体中含有额外的可以指导通过同源重组而将载体整合到宿主细胞中的核苷酸序列。上述额外核苷酸序列可以将载体精确地整合到宿主细胞基因组中确定的染色体位置上。为了增加精确整合的可能性，整合元件优选含有足够数量的核苷酸，例如100到1500个碱基对，优选400到1500个碱基对，最优选800到1500个碱基对，上述碱基对与相应的靶序列具有高度的同源性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中目标序列相同源的序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，载体也可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0169] 为了保证载体能够在所研究宿主细胞中进行自主复制，载体还要含有复制起点。细菌中复制起点的实例可以是质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的允许在大肠杆菌中进行复制，pUB110、pE194、pTA1060，pAMβ1允许在芽孢杆菌中进行复制。复制起点中还可以含有突变，上述突变在宿主细胞中产生了温度敏感功能(例如参考Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75：1433)。
[0170] 可以将超过一个拷贝的本发明核苷酸序列插入到宿主细胞中以增加基因产物的产量。可通过向宿主细胞基因组中整合至少核苷酸序列的一个额外拷贝来增加核酸序列的拷贝数，或者通过包括核苷酸序列与扩增性选择标记基因来增加核酸序列的拷贝数，其中细胞含有可选择标记基因的扩增拷贝，其中通过在有适当选择试剂存在的情况下培养细胞，可以获得该核酸序列的额外拷贝数。
[0171] 本领域人员已经广泛熟悉了连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法(例如参考Sambrook等，1989，同上)。
[0172] 宿主细胞
[0173] 本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞，其优先在重组生产多肽中使用。将包含本发明核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中，从而保证了如前所述的载体能够作为染色体的元件进行复制或能够在染色体之外进行自主复制。宿主细胞可以是单细胞(unicelluar)微生物，例如原核微生物，也可以是非单细胞微生物，例如真核微生物。
[0174] 可以采用的单核细胞可以是细菌细胞，例如革兰氏阳性菌，其中包括，但并不局限于芽孢杆菌细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或者链霉菌细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或者革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌和假单胞菌。在优选实施例中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另外一个优选实施例中，杆状细菌细胞是嗜碱芽孢杆菌。
[0175] 将载体引入细菌宿主细胞可以采用的有效方法例如原生质体转化(例如参见Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、采用感受态细胞(例如参见Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56：209-221)、电转化(例如参见Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、结合(conjugation)(例如参见Koehler和Thorne，1987，Journal ofBacteriology 169：5771-5278)。
[0176] 目的产物可以是任何基因的产物或者代谢途径的产物，上述产物可以在工业上使用，并且可以在例如真细菌的细菌细胞中生产。在本发明的一个实施方案中，目的产物包括了多肽、维生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性剂。
[0177] 本发明的一个优选实施例是关于本发明第一方面的突变体，通过上述突变体产生的目的产物包括了多肽、维生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性剂；目的产物优选多肽；其中优选酶类；更优选选自酶分类系统中的下述酶类：氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)和连接酶(EC 6)。
[0178] 在本发明的其它实施例中，酶类可以是选自具有下述活性的酶类：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环式糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶(invertase)、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶(phytase)、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或者木聚糖酶，其中优选淀粉酶或甘露聚糖酶。
[0179] 在本发明的另一个实施方案中，多肽产物包括了纤维素结合区、淀粉结合区、抗体、杀微生物肽、激素或者融合蛋白。优选的目的产物是包含纤维素结合区、淀粉结合区、抗体、杀微生物肽、激素或融合蛋白的多肽。目的产物也优选碳水化合物，优选透明质酸。
[0180] 在宿主细胞中，本发明的特异性突变改变了目的产物的产量。目的产物产量的改变可以是如上所述的改善产量或改善生产力。
[0181] 在本发明的一个实施方案中，产量的改变是指与生长在等同条件下的等基因亲本株系相比，其产量至少增长5％到1000％。在本发明的另一个实施方案中，产量的改变在5％到500％之间，在另一个实施方案中，在5％到250％之间，在另一个实施方案中，产量的改变在5％到50％之间。
[0182] 本发明的宿主细胞在适当的营养培养基中、在适于生产目标多肽的条件下进行培养，培养完成后，产生的多肽任选从培养细胞或培养基中进行回收。
[0183] 用于培养细胞的培养基可以是任一适于生长宿主细胞的传统培养基，例如进行了适当添加的基本或复合培养基。适合的培养基可以从商业上获得或按照已公开的配方进行制备(例如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)。培养基可以采用现有技术中已知的方法进行制备(例如参见references for bacteria and yeast；Bennett，J.W. 和 LaSure，L. 编，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。
[0184] 如果多肽分泌到营养培养基中，可以从培养基中直接回收多肽。如果多肽没有分泌到培养基中，可从细胞裂解物中回收多肽。可以采用传统的方法从培养基中回收多肽，其中根据具体的多肽种类包括了采用离心或过滤的方法从培养基中分离宿主细胞，沉淀上清的蛋白成分或采用硫酸铵等盐类进行过滤，采用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析以及相似的各种层析方法进行纯化。
[0185] 可以采用现有技术中已知的特异方法对多肽进行检测，上述方法包括了使用特异性抗体、形成一种酶产物或一种酶底物消失。例如可以采用一种酶实验对多肽的活性进行检测。
[0186] 可以采用现有技术中已知的各种方法对本发明的多肽进行纯化，其中包括了，但并不限制于：层析方法(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)，电泳方法(例如制备等电位聚焦电泳(IEF))、差异溶解度(如硫酸铵沉淀)或抽提方法(例如参见Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
[0187] 在本发明的一个实施方案中，目的产物分泌到营养培养基中。在另一个实施方案中，目的产物附着在细胞膜上。在另一个实施方案中，目的产物存在于细胞中。
[0188] 本发明的第二方面涉及在突变真细菌中生产至少一种目的产物的方法，包括在适当的培养基中培养本发明第一方面任一实施例所定义的突变真细菌，由此所述产物产生于培养基中。用于培养的适合的培养基以及纯化或分离目的产物的方法如上所述，其中纯化或分离是完成本发明额外的任选步骤。
[0189] 在本发明的生产方法中，采用现有技术中已知的方法、在适于生产多肽的营养培养基中对细胞进行培养。例如可以在适当的培养基中、在适于多肽表达和/或分离的条件下，采用摇瓶培养或在实验室或工业发酵器中进行小规模或大规模发酵培养(包括连续发酵、分批发酵、补料分批(fed-batch)发酵或固态发酵)宿主细胞。在包含碳源、氮源和无机盐的适当营养培养基中，采用现有技术中已知的方法进行培养。适合的培养基可以从商业上获得或按照已公开的配方进行制备(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，可以从培养基中直接回收多肽。如果多肽没有分泌到培养基中，可从细胞裂解物中回收多肽。
[0190] 可以采用现有技术中已知的特异方法对多肽进行检测，上述方法包括了使用特异性抗体、形成一种酶产物或消耗一种酶底物。例如可以采用一种酶实验对多肽的活性进行检测。
[0192] 可以采用现有技术中已知的各种方法对本发明的多肽进行纯化，其中包括了，但并不限制于：层析方法(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)，电泳方法(例如制备等电位聚焦)、差异溶解度(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提方法(例如参见Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
[0193] 本发明的第三方面涉及使用本发明第一方面任一实施例所定义的突变真细菌生产至少一种目的产物的方法，其中包括了在适当的培养基中培养上述突变真细菌，由此目的产物得以产生，并且任选使用分离或纯化目的产物的步骤。
[0194] 下面的实施例对本发明进行了进一步的解释说明，然而并不对本发明的保护范围构成限制。前面描述的特征和下面的实施例既可以相互独立，也可以相互结合，它们是以不同的形式来解释本发明。
[0195] 实施例
[0196] 实施例1
[0197] 来源于地衣芽孢杆菌rpoB基因的DNA序列
[0198] 从包含有地衣芽孢杆菌染色体DNA片段的质粒克隆中，采用标准技术确定了地衣芽孢杆菌rpoB基因的DNA序列。包含有地衣芽孢杆菌克隆的质粒文库来源于保藏ATCC14580。DNA序列显示于SEQ ID NO：1。
[0199] 实施例2
[0200] 地衣芽孢杆菌RpoB蛋白
[0201] 从SEQ ID NO：1DNA序列的开放阅读框中翻译的地衣芽孢杆菌RpoB蛋白显示于SEQ ID NO：2。
[0202] 实施例3
[0203] DNA聚合酶片段比对
[0204] 采用BLAST搜索对SEQ ID NO：2中位置461到500处的40个地衣芽孢杆菌RpoB蛋白片段与已发表的不同细菌来源的RpoB蛋白序列进行了比对。结果显示于附图1中，其中第一行为地衣芽孢杆菌RpoB蛋白序列。
[0205] 实施例4
[0206] 特异rpoB突变体产量/生产力的改善
[0207] 材料和方法：
[0208] 正如WO 91/09129和WO 99/41358中所记载的，表达盒的一个或更多个拷贝被整合到下列株系的染色体中。
[0209] 株系：
[0210] JA 677：能够过量生产内源α-淀粉酶变体的地衣芽孢杆菌(BLA)。
[0211] JA 678：JA 677的rpoB突变，导致氨基酸改变Q469R。
[0212] JA 688：能够过量生产嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶突变体的地衣芽孢杆菌(BSG)。
[0213] JA 689：JA 688的rpoB突变，导致氨基酸改变Q469R。
[0214] JA 690：JA 688的rpoB突变，导致氨基酸改变H482R。
[0215] JA 684：能够过量生产解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(BAN)。
[0216] JA 687：JA 684的rpoB突变，导致氨基酸改变A478D。
[0217] SJ 4671：能够过量生产内源α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(BLA)。
[0218] SJ 4671 rif10：SJ 4671的rpoB突变，导致氨基酸改变A478V。
[0219] SJ 4490：能够过量生产内源α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌。
[0220] JA 675：SJ 4490的rpoB突变，导致氨基酸改变Q469R和R485H。
[0221] SJ 6129：能够过量生产芽孢杆菌属α-淀粉酶突变体的地衣芽孢杆菌(WO00/60060中公布)；(纠正-实际的国际参考号为SJ 6093)。
[0222] SJ 6129 rif10：SJ 6129(SJ 6093)的rpoB突变，导致氨基酸改变S487L。
[0223] 培养基：
[0224] LB琼脂：
[0225] 10g/l来源于酪蛋白的蛋白胨；5g/l酵母抽提物；10g/l氯化钠；12g/lBacto-琼脂，用50KAN调整pH到6.8-7.2，其中50KAN为含有50mg/l卡那霉素的LB琼脂。M-9缓冲液(使用去离子水)：磷酸氢二钠·2H2O 8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁·7H2O 0.2g/l。
[0226] Med-F摇瓶培养基(于去离子水混匀后达到既定浓度)：
[0227] A部分：麦芽糊精11g/l；酪胨6.2g/l；细菌用蛋白胨0.5；酵母抽提物0.5g/l；硫酸镁·7H2O 0.5g/l；氯化钙0.1g/l；柠檬酸50mg/l；痕量金属(硫酸锌·H2O 2.5mg/l；硫酸亚铁·7H2O 9.9mg/l；硫酸铜·5H2O 1.0mg/l；氯化锌1.0mg/l)；Pluronic 0.1g/l；调整pH为6.7。
[0228] B部分：5g/l磷酸二氢钾，用氢氧化钠调整pH为6.7。
[0229] A部分和B部分在121℃下灭菌20分钟后，按1∶1的比例进行混合。
[0230] 摇瓶评估菌株的步骤：
[0231] 首先，菌株在37℃下、在琼脂中斜面培养1天。(SJ4671、SJ4671 rif10、SJ4490、JA675在LB琼脂中培养；JA677、JA678、JA688、JA689、JA690、JA684、JA687在含有50KAN的LB中培养)。然后，琼脂用M-9缓冲液清洗，并且在650nm(OD650nm)下测定获得的细胞悬浮液的光学密度。
[0232] 基于OD650nm的测定结果，每一个摇瓶中采用相同数量的细胞进行培养。此处采用的接种强度为OD×ml细胞悬浮液＝0.1。每一菌株分别在3个摇瓶中进行培养。培养条件为37℃、300rpm，分别培养1、2和3天后，收集样品。测定pH、OD650nm和α-淀粉酶活性，并且确定每一菌株的相对活性，依次计算出每一rpoB突变菌株其亲本菌株的相对活性，结果显示于表1。从上述结果可以清楚看出上述rpoB突变对酶的生产力/产量具有重大的效果。
[0233] 表1：rpoB突变菌株的相对淀粉酶活性(相对于亲本菌株的％)
[0234]1天 2天 3天
BLA淀粉酶突变体JA677相对于JA678(Q469R) 142 161 168
BSG淀粉酶突变体JA688相对于JA689(Q469R) 67 114 107
BSG淀粉酶突变体JA688相对于JA690(H482R) 195 256 197
BAN淀粉酶JA684相对于JA687(A478D) 162 154 151
BLA淀粉酶SJ4671相对于SJ4671rif10(A478V) 121 114 112
BLASJ4490相对于JA675(Q469R+R485H) N/A N/A 135
突变体淀粉酶SJ6093相对于SJ6129(S487L) 149 122 114
BLA淀粉酶突变体JA677相对于JA678(Q469R) 142 161 168
BSG淀粉酶突变体JA688相对于JA689(Q469R) 67 114 107
BSG淀粉酶突变体JA688相对于JA690(H482R) 195 256 197
BAN淀粉酶JA684相对于JA687(A478D) 162 154 151
BLA淀粉酶SJ4671相对于SJ4671rif10(A478V) 121 114 112
BLASJ4490相对于JA675(Q469R+R485H) N/A N/A 135
突变体淀粉酶SJ6093相对于SJ6129(S487L) 149 122 114
[0235] 实施例5
[0236] 来源于克劳氏芽孢杆菌部分rpoB基因的DNA序列
[0237] 从包含有克劳氏芽孢杆菌染色体DNA片段的质粒克隆中，采用标准技术确定了克劳氏芽孢杆菌部分rpoB基因的DNA序列。包含有克劳氏芽孢杆菌克隆的质粒文库来源于保藏NCIB 10309。部分DNA序列显示于SEQ IDNO：3。
[0238] 实施例6
[0239] 克劳氏芽孢杆菌RpoB蛋白
[0240] 从SEQ ID NO：3DNA序列的开放阅读框中翻译的克劳氏芽孢杆菌RpoB蛋白显示于SEQ ID NO：4。
[0241] 实施例7
[0242] DNA聚合酶片段比对
[0243] 采用BLAST搜索对SEQ ID NO：4中位置462到501处的40个克劳氏芽孢杆菌RpoB蛋白片段与已发表的不同细菌来源的RpoB蛋白序列进行了比对，其中上述蛋白片段在RpoB蛋白的位置上与地衣芽孢杆菌同源和等价。结果显示于附图1中，其中第一行为地衣芽孢杆菌RpoB蛋白序列，上数第二行为克劳氏芽孢杆菌RpoB蛋白序列。
[0244] 实施例8
[0245] 特异rpoB突变体产量/生产力的改善
[0246] 材料与方法：
[0247] 采用天然表达系统进行表达。
[0248] 株系：
[0249] NCIB 10309：克劳氏芽孢杆菌(产生其内源蛋白，BCP)。
[0250] PP143：NCIB 10309的典型突变体，其在编码显示于SEQ ID NO：4中位置462到501处的40个克劳氏芽孢杆菌RpoB蛋白氨基酸片段的DNA区域中没有发生突变，其蛋白片段与SEQ ID NO：2中位置461到500处显示的地衣芽孢杆菌RpoB蛋白同源。
[0251] NN49201：PP143的rpoB基因突变，导致SEQ ID NO：4中位置462到501处的40个克劳氏芽孢杆菌RpoB蛋白氨基酸片段发生氨基酸取代A479D。SEQ ID NO：4中的取代A479D对应于SEQ ID NO：2中的等价取代A478D，可从附图1中最上端两行的比对中清楚地看出。
[0252] 培养基：
[0253] 琼脂：例如B3-琼脂等适于支持克劳氏芽孢杆菌良好生长的适当琼脂。
[0254] 蛋白胨6g/l；肽酶4g/l；酵母抽提物3g/l；肉类提取物1.5g/l；葡萄糖·1H2O1g/l；使用去离子水的琼脂20g/l，用氢氧化钠/盐酸调整pH到7.35，在121℃下灭菌40分钟。冷却到40-50℃后，加入经过滤灭菌的pH为9的10％v/v的1M碳酸氢钠和经121℃灭菌
40分钟的用去离子水溶解的10％w/v干脱脂牛奶的10％v/v。
40分钟的用去离子水溶解的10％w/v干脱脂牛奶的10％v/v。
[0255] M-9缓冲液(使用去离子水)：磷酸氢二钠·2H2O 8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁·7H2O 0.2g/l。
[0256] Med-F摇瓶培养基(于去离子水最终混匀后达到既定浓度)：
[0257] A部分：麦芽糊精11g/l；酪胨6.2g/l；细菌用蛋白胨0.5；酵母抽提物0.5g/l；硫酸镁·7H2O 0.5g/l；氯化钙0.1g/l；柠檬酸50mg/l；痕量金属(硫酸锌·H2O 2.5mg/l；硫酸亚铁·7H2O 9.9mg/l；硫酸铜·5H2O 1.0mg/l；氯化锌1.0mg/l)；Pluronic 0.1g/l；调整pH为6.7，于121℃下灭菌20分钟。
[0258] B部分：5g/l磷酸二氢钾，28.6g/l碳酸钠；8.4g/l碳酸氢钠，用磷酸调整pH为9.0，该溶液经过滤灭菌后立即使用。
[0259] A部分和B部分灭菌后进行混合。
[0260] 摇瓶评估菌株的步骤：
[0261] 首先，菌株在37℃下、在琼脂中斜面培养1天。然后，琼脂用M-9缓冲液清洗，并且在650nm(OD650nm)下测定获得的细胞悬浮液的光学密度。
[0262] 基于OD650nm的测定结果，每一个摇瓶中采用相同数量的细胞进行培养。此处采用的接种强度为OD×ml细胞悬浮液＝0.1。每一菌株在2个摇瓶中进行培养。培养条件为37℃、300rpm，分别培养1、2和3天后，收集样品。测定pH、OD650nm和蛋白酶活性，并且确定每一菌株的相对活性，依次计算出每一rpoB突变菌株其亲本菌株的相对活性，结果显示于表2。从上述结果可以清楚看出上述rpoB突变对酶的生产力/产量具有重大的效果。
[0263] 表2：rpoB突变菌株的相对蛋白酶活性(相对于亲本菌株的％)
[0264]1天 2天 3天
[0265]BCP蛋白酶突变体PP143相对于NN49201(A479D) 159 144 159
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