抗CD26抗体与其它抗癌剂组合而成的癌症治疗用组合物
阅读：906发布：2024-02-28
专利汇可以提供抗CD26抗体与其它抗癌剂组合而成的癌症治疗用组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的目的在于提供安全性高的新型间皮瘤 治疗 法。CD26在间皮瘤中过表达，被认为安全性较高。本发明发现，通过将抗CD26 抗体 与标准疗法顺氯 氨 铂‑培美曲塞合用进行组合，可增强间皮瘤的增殖抑制效果。另外，对人源化CD26抗体与吉西他滨的合用对于间皮瘤细胞株的增殖的效果进行研究的结果发现，通过将抗CD26抗体与吉西他滨合用，可提供治疗效果高、安全性优异的间皮瘤治疗方法。进一步，在使用抗CD26抗体的合用疗法中利用二价交联剂使抗CD26抗体(YS110)和雷公藤甲素结合的结果，成功地得到了对于CD26阳性恶性间皮瘤细胞的效果非常高的新型抗体药物 复合体 (Y‑TR1)。，下面是抗CD26抗体与其它抗癌剂组合而成的癌症治疗用组合物专利的具体信息内容。
1.抗CD26抗体或其片段与雷公藤甲素结合形成的复合体。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中，抗CD26抗体或其片段为人源化抗体或其片段。
3.根据权利要求2所述的复合体，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求2所述的复合体，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据权利要求2所述的复合体，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条重链、及包含与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条轻链。
6.根据权利要求2所述的复合体，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列中第20～465位的氨基酸序列的至少一条重链、及包含SEQ ID NO:
18所示的氨基酸序列中第21～234位的氨基酸序列的至少一条轻链。
7.根据权利要求2～6中任一项所述的复合体，其中，所述人源化抗体或其片段与选自SEQ ID NO:19～28中的一个以上肽结合。
8.根据权利要求2所述的复合体，其中，所述人源化抗体由具有美国菌种保藏中心(ATCC)的保藏号PTA-7695、被命名为s604069.YST-pABMC148(x411)的株产生。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的复合体，其中，所述片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv及F(ab’)2。
10.药物组合物，其含有权利要求1～9中任一项所述的复合体作为有效成分。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其是恶性间皮瘤的治疗用药物组合物。
12.恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂，其包含权利要求1～9中任一项所述的复合体。
13.恶性间皮瘤细胞的溶解剂，其包含权利要求1～9中任一项所述的复合体。
14.权利要求1～9中任一项所述的复合体在恶性间皮瘤的治疗用药物组合物的制造中的用途。
15.药物组合物，其含有抗CD26抗体或其片段、和抗肿瘤剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中，抗肿瘤剂为选自顺氯氨铂、培美曲塞、吉非替尼及吉西他滨中的一种以上药剂。
17.根据权利要求15或16所述的药物组合物，其中，抗CD26抗体或其片段为人源化抗体或其片段。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
20.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条重链、及包含与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条轻链。
21.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述人源化抗体或其片段含有：包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列中第20～465位的氨基酸序列的至少一条重链、及包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列中第21～234位的氨基酸序列的至少一条轻链。
22.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述人源化抗体或其片段与选自SEQ ID NO:19～28中的一个以上肽结合。
23.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述人源化抗体由具有美国菌种保藏中心(ATCC)的保藏号PTA-7695、被命名为s604069.YST-pABMC148(x411)的株产生。
24.根据权利要求15～23中任一项所述的药物组合物，其中，所述片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv及F(ab’)2。
25.根据权利要求15～24中任一项所述的药物组合物，其为恶性间皮瘤的治疗用药物组合物。
26.恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂，其包含权利要求15～24中任一项所述的药物组合物。
27.恶性间皮瘤细胞的溶解剂，其包含权利要求15～24中任一项所述的药物组合物。
28.抗CD26抗体及抗肿瘤剂在恶性间皮瘤的治疗用药物组合物的制造中的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其中，抗肿瘤剂为选自顺氯氨铂、培美曲塞、吉非替尼及吉西他滨中的一种以上药剂。
30.通过与抗CD26抗体合用而显示协同抗肿瘤效果的化合物的筛选方法，其中，该方法具备以下步骤：
(a)在受试化合物的存在下培养共表达CD26和CD9的肿瘤细胞株、及表达CD26而不表达CD9的细胞株的步骤；
(b)测定培养后的所述各个肿瘤细胞株的细胞数的步骤；
(c)比较所述受试化合物的共表达CD26和CD9的肿瘤细胞株的增殖抑制效果、及所述受试化合物的表达CD26而不表达CD9的细胞株的增殖抑制效果，在表达CD26而不表达CD9的细胞株的增殖抑制效果更为优异的情况下，选择所述受试化合物作为通过与抗CD26抗体合用而显示协同抗肿瘤效果的可能性高的化合物的步骤。
抗CD26抗体与其它抗癌剂组合而成的癌症治疗用组合物
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请基于2015年9月11日在日本提出申请的日本特愿2015-179672号要求优先权，并将该申请中记载的内容全部直接援引于本说明书。另外，将在本申请中引用的专利、专利申请及文献中记载的内容全部直接援引于本说明书。
技术领域
背景技术
[0004] 在间皮瘤的化学疗法中，有报道称，在利用单一抗癌剂的治疗中药剂反应性低至20％以下(非专利文献1)。因此，以更有效的间皮瘤的治疗为目标，尝试了合用多种药剂。例如，有报道称，与单一药剂相比，通过将顺氯氨铂和培美曲塞合用，其治疗效果更为优异(非专利文献2)。因此，目前作为间皮瘤的标准化学疗法而采用了顺氯氨铂与培美曲塞的合用(非专利文献3)。但是，在本合用疗法中，平均生存时间也仅为不足12个月，因而需要开发出治疗效果更高的化学疗法。另外，顺氯氨铂与培美曲塞的合用疗法的癌细胞增殖抑制效果涉及到细胞毒性，因而要求非铂类治疗等给予患者的副作用较少的疗法。
[0005] 吉西他滨是脱氧胞苷的糖链的2′位的氢被氟取代而成的核苷衍生物，以抑制DNA合成为作用机制。其安全性优异(非专利文献4)，已作为抗癌剂而被广泛使用。但是，吉西他滨单一药剂对于间皮瘤的治疗效果不够充分，期待通过将吉西他滨与适当的抗癌剂组合而开发出治疗效果高的合用疗法。例如，尝试了各自单独作为抗癌剂已显示出效果的培美曲塞与吉西他滨的合用，但在间皮瘤的治疗中，在平均生存时间的延长方面，仅仅得到了与单独给药培美曲塞的情况无差别的效果(非专利文献5)。进一步，有报道称：在间皮瘤的治疗中，将顺氯氨铂-培美曲塞的合用与顺氯氨铂-吉西他滨的合用加以比较的结果，顺氯氨铂-培美曲塞的合用更为优异(非专利文献6)。另外，即使将表柔比星和吉西他滨合用，也几乎没有得到由合用带来的改善效果(非专利文献7)。同样地有报道称：在作为长春花生物碱类抗恶性肿瘤剂的长春瑞滨和吉西他滨的合用中，没有由合用带来的改善效果(非专利文献8)。因此，对于这些目前为止所尝试过的吉西他滨合用剂而言，未能得到基于合用的改善效果。
[0006] 另一方面，将多西他赛与吉西他滨合用时平均生存时间达到了15个月，因此确认到了由合用带来的少许改善效果(非专利文献9)。另外，有报道称：在将作为叶酸代谢拮抗剂的甲氨蝶呤和吉西他滨合用的情况下，平均生存时间为19.4个月，稍有延长(非专利文献10)。但是，这些与吉西他滨合用的抗癌剂会非选择性地作用于细胞，因此存在引起副作用的隐患。
[0007] 在除间皮瘤以外的癌症中也研究了合用，例如，在肺癌中，顺氯氨铂-培美曲塞的合用显示出了优异的效果(非专利文献11)。另外，作为EGFR抑制剂的吉非替尼(易瑞沙)也被频繁地使用，需要开发出与除了顺氯氨铂、吉西他滨以外的药剂的合用疗法。
[0008] 也有通过将顺氯氨铂-培美曲塞合用疗法进一步与其它药剂合用来提高治疗效果的尝试。由于在间皮瘤的标准疗法中可见贫血，因而有时会给药促红细胞生成素，但促红细胞生成素并未增强顺氯氨铂-培美曲塞合用对于间皮瘤细胞株的细胞毒性效果(非专利文献12)。有报道称，与安慰剂相比，作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂的伏瑞斯特(Vorinostat)对于间皮瘤患者而言并没有延长延寿效果(非专利文献13)。有报道称，作为HDAC抑制剂的抗痉挛药丙戊酸盐，在使用了间皮瘤细胞株的实验中增强了顺氯氨铂-培美曲塞合用的抗肿瘤活性(非专利文献14)。但是，丙戊酸盐在使用中也有时容易出现恶心、呕吐等副作用，被认为难以对疲劳感强烈的癌症患者给药。
[0009] 已尝试了与基因治疗的合用，有报道称在使用间皮瘤细胞株的实验中，SOCS-1基因的细胞内导入使顺氯氨铂-培美曲塞合用的细胞毒性效果增强(非专利文献15)。另外，已知在多数间皮瘤中，p53基因是正常的，但p53会由于p14(ARF)、p16(INK4A)的缺失而失活。有报道称，在间皮瘤细胞株中，p53基因的导入会使顺氯氨铂、培美曲塞的细胞毒性效果协同性地增强，特别是在胸膜内移植了间皮瘤的小鼠中，通过向胸膜内导入p53基因可使顺氯氨铂的抗肿瘤活性增强(非专利文献16)。但是，在目前的临床中，基于基因导入的治疗较为困难，从实用的复杂程度考虑，期望更为简便而高效的方法。
[0010] 在间皮瘤的活检中，大多数情况下确认到了血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达，可考虑VEGF参与间皮瘤的增殖的可能性。于是，在II期临床试验中研究了抗VEGF抗体贝伐珠单抗(Bevacizumab)对标准疗法的效果(非专利文献17)，但贝伐珠单抗并未增强标准疗法顺氯氨铂-培美曲塞合用的治疗效果。在I期临床试验的非小细胞癌10例、间皮瘤1例中，研究了在作为标准疗法的顺氯氨铂-培美曲塞合用疗法中进一步追加作为受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂的低分子化合物舒尼替尼，但没有确认到药物相互作用(非专利文献18)。
[0011] 有报道称，在使用间皮瘤细胞株的实验中，干扰素β协同性地增强了顺氯氨铂、培美曲塞的细胞毒性活性(非专利文献19)。该效果可认为是基于由干扰素β诱发的p53表达。但就实用化而言，被认为存在伴随干扰素β的给药的发热、疲倦感等副作用的问题。
[0012] 间皮瘤的临床表现以向胸膜浸润为其特征(非专利文献20)，作为症状，会猛烈地出现由胸膜浸润引发的胸腔积液造成的呼吸困难。尽管间皮瘤的特征为浸润，但是对浸润的作用尚未被充分地解析。有报道称，向上述间皮瘤细胞导入SOCS-1基因，会使顺氯氨铂-培美曲塞合用的抗浸润作用协同地增加(非专利文献21)。间皮素是在间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌中过表达的40kDa的糖蛋白，有报道称间皮素会促进间皮瘤细胞株的浸润(非专利文献22)，但尚未报道作为针对间皮素的低分子化合物抑制剂、抗体而有效的药剂。另外，有报道称，在使用间皮瘤细胞株的实验中，妊娠相关血浆蛋白A(PAPPA)会促进浸润(非专利文献
23)，但尚未报道以PAPPA为靶向的对间皮瘤有效的物质。
23)，但尚未报道以PAPPA为靶向的对间皮瘤有效的物质。
[0013] 因此，尚未发现可以解决基于顺氯氨铂-培美曲塞合用的间皮瘤治疗中的问题并能够实用化的治疗方法。
[0014] 抗体药物复合体正作为主要针对恶性肿瘤的靶向疗法而被实用化。通过将与肿瘤细胞特异性结合的抗体和具有抗肿瘤作用的药剂结合，具有可将药剂有效地导入肿瘤细胞内、并且减轻基于对非肿瘤细胞的毒性的副作用的优点。抗体药物复合体可按以下顺序制作。对于使用计算机模拟(in silico modeling)的技术使针对在肿瘤细胞中特异性表达的抗原的小鼠-单克隆抗体经人源化而成的抗体，选择对作为靶向的肿瘤细胞具有极高的抗肿瘤作用的药剂，利用交联剂使它们与人源化抗体结合。在现阶段，被美国FDA批准作为药剂的抗体药物复合体有2件(适应症为急性骨髓性白血病及恶性淋巴瘤)，截至2013年，临床试验中的抗体药物复合体有35件。在日本国内还没有得到认可的抗体药物复合体。抗体药物复合体从有效性的增强和副作用的减轻这两方面考虑有望成为抗肿瘤药，但由于具有(1)抗原的选择、特异性良好的单克隆抗体的制作、(2)抗体的人源化、(3)抗体向肿瘤细胞内的导入、(4)进行结合的药剂的选择、(5)交联剂的选择、(6)安全性等多个阶段的考察事项，因此现状是：已实现实用化的还很少。恶性间皮瘤是即使通过多学科治疗也预后不良的疾病，期待开发出新型治疗法，但在现阶段，没有针对恶性间皮瘤的抗体药物复合体作为医药品而被认可。
[0015] CD26是一种跨膜型蛋白，是参与T细胞的活化的共刺激分子，近年来已明确了其在包括恶性间皮瘤在内的各种恶性肿瘤中高度表达。CD26是癌症特异性的，因此期待其抗肿瘤效果(专利文献1及专利文献2)。特别地，CD26在间皮瘤中过表达(非专利文献24)，可认为抗CD26抗体的安全性较高。实际上，抗CD26抗体会抑制间皮瘤细胞的增殖(非专利文献25；专利文献3)，因此，作为人源化抗CD26抗体的YS110的在法国的I期临床试验已经结束，其安全性已得到了确认(非专利文献26)。但是，迄今为止尚没有关于抗CD26抗体与其它药剂的合用的报道。
[0016] 现有技术文献
[0017] 专利文献
[0018] 专利文献1：国际公开WO 02/14462号
[0019] 专利文献2：国际公开WO 2007/014169号
[0020] 专利文献3：国际公开WO 2008/114876号
[0021] 非专利文献
[0022] 非专利文献1：Ong T and Vogelzang NJ,1996
[0023] 非专利文献2：Ellis P et al.,2006；Jaenne PA.,2006
[0024] 非专利文献3：Vogelzang et al 2003,Stahel RA et al.,2010,Boons C.C.L.M.,2013
[0025] 非专利文献4：Toschi L et al.,2005
[0026] 非专利文献5：Janne PA et al.,2008
[0027] 非专利文献6：Shukuya T et al.,2014
[0028] 非专利文献7：Okuno SH et al.,2008
[0029] 非专利文献8：Zauderer MG et al.,2014
[0030] 非专利文献9：Ralli M et al.,2009
[0031] 非专利文献10：Kuribayashi K et al.,2013
[0032] 非专利文献11：Sun JM et al J Clin Oncol 33(22)2450 2015
[0033] 非专利文献12：Palumbo C et al.,2008
[0034] 非专利文献13：Zauderer and Krug,2012
[0035] 非专利文献14：Vandermeets F et al,2009
[0036] 非专利文献15：Iwahori H et al.2013
[0037] 非专利文献16：Li Q et al.,2012
[0038] 非专利文献17：Dowell JE et al.,2012
[0039] 非专利文献18：Camidge DR e al.,2013
[0040] 非专利文献19：Li Q et al.,2013
[0041] 非专利文献20：Robinson and Lake,2005
[0042] 非专利文献21：Iwamoto H et al.,2013
[0043] 非专利文献22：Servais EL et al.,2012
[0044] 非专利文献23：Huang J et al.,2013
[0045] 非专利文献24：Amatya VJ et al.,2011
[0046] 非专利文献25：Inamoto T et al.,2007
[0047] 非专利文献26：Angebin E et al
[0048] 非专利文献27：Yamada K et al,Plos One,2013Apr 29；8(4)：e62304
发明内容
[0049] 如上所述，目前，对于间皮瘤化学疗法的标准疗法，为了解决顺氯氨铂-培美曲塞合用疗法的问题，已进行了其它药剂的合用等大量的研究，但在其实用化中仍存在众多的课题。标准疗法顺氯氨铂-培美曲塞合用的抗肿瘤效果基于细胞毒性效果，因此在标准疗法中进一步追加药剂的情况下，要求被追加的药剂不基于细胞毒性、安全性较高、且效果较高。进一步，期待与标准疗法不同的、不基于细胞毒性、基于非铂疗法的安全性高的新型治疗法。
[0050] 另外，尽管间皮瘤的病理性特征为局部浸润，但是以往几乎没有进行过关注于浸润的间皮瘤治疗药的研究。本发明人认为，通过着眼于浸润抑制效果而开发间皮瘤治疗方法，可得到良好的效果较高的治疗法。
[0051] CD26在间皮瘤中过表达，被认为安全性较高。实际上，由于抗CD26抗体抑制间皮瘤细胞的增殖，因此对间皮瘤患者已进行了I期临床试验。因此，对于间皮瘤细胞株中的增殖及浸润，本发明人已针对抗CD26抗体与标准疗法顺氯氨铂-培美曲塞合用组合而成的治疗方法进行了研究。其结果，明确了通过将抗CD26抗体与标准疗法顺氯氨铂-培美曲塞合用进行组合，可增强间皮瘤的增殖抑制效果。另外，本发明人发现：在顺氯氨铂与培美曲塞的合用中，浸润抑制效果仅稍稍增强，而与此相对，通过将顺氯氨铂-培美曲塞合用与抗CD26抗体组合，可协同性地增强浸润抑制效果。
[0052] 另外，作为增强浸润抑制效果的参与分子，本发明人对抗CD26抗体所处理的间皮瘤细胞的微阵列进行了分析，结果发现，AAMP、ESAM、FUT8、RAC1、FYN、RNF20参与了浸润抑制效果的增强。
[0053] 本发明人研究了CD26与各种药剂的合用效果，结果发现：对于间皮瘤细胞株的增殖，通过将人源化CD26抗体与吉西他滨或吉非替尼合用，可提供治疗效果高、安全性优异的间皮瘤治疗方法。
[0054] 进一步，本发明人针对使用了抗CD26抗体的抗体-药物复合体进行了各种研究。其结果，通过利用二价交联剂使已知具有较强的抗肿瘤细胞作用但尚未报道过作为抗体药物复合体的用途的雷公藤甲素(Triptolide)、与抗CD26抗体(YS110)结合，成功地得到了对于CD26阳性恶性间皮瘤细胞的效果非常高的新型抗体药物复合体(Y-TR1)。
[0055] 因此，本发明涉及将抗CD26抗体与其它药剂合用的药剂、或抗CD26抗体与雷公藤甲素结合形成的复合体。更具体而言，本发明涉及以下发明。
[0056] (1)抗CD26抗体或其片段与雷公藤甲素结合形成的复合体。
[0057] (2)上述(1)所述的复合体，其中，抗CD26抗体或其片段为人源化抗体或其片段。
[0058] (3)上述(2)所述的复合体，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
[0059] (4)上述(2)或(3)所述的复合体，其中，上述人源化抗体或其片段含有，与包含选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
[0060] (5)上述(2)～(4)中任一项所述的复合体，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条重链、及包含与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条轻链。
[0061] (6)上述(2)～(5)中任一项所述的复合体，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列中第20～465位的氨基酸序列的至少一条重链、及包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列中第21～234位的氨基酸序列的至少一条轻链。
[0062] (7)上述(2)～(6)中任一项所述的复合体，其中，上述人源化抗体或其片段与选自SEQ ID NO:19～28中的一个以上肽结合。
[0063] (8)上述(2)所述的复合体，其中，上述人源化抗体由具有美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)的保藏号PTA-7695、被命名为s604069.YST-pABMC148(x411)的株产生。
[0064] (9)上述(1)～(8)中任一项所述的复合体，其中，上述片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv及F(ab’)2。
[0065] (10)药物组合物，其含有(1)～(9)中任一项所述的复合体作为有效成分。
[0066] (11)上述(10)所述的药物组合物，其为恶性间皮瘤的治疗用药物组合物。
[0067] (12)恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂，其包含(1)～(9)中任一项所述的复合体。
[0068] (13)恶性间皮瘤细胞的溶解剂，其包含(1)～(9)中任一项所述的复合体。
[0069] (14)上述(1)～(9)中任一项所述的复合体的用于制造恶性间皮瘤的治疗用药物组合物的用途。
[0070] (15)药物组合物，其含有抗CD26抗体或其片段、和其它抗肿瘤剂。
[0071] (16)上述(15)所述的药物组合物，其中，上述其它抗肿瘤剂为选自顺氯氨铂、培美曲塞、吉非替尼及吉西他滨中的一种以上药剂。
[0072] (17)上述(15)或(16)所述的药物组合物，其中，抗CD26抗体或其片段为人源化抗体或其片段。
[0073] (18)上述(17)所述的药物组合物，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
[0074] (19)上述(17)所述的药物组合物，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含与选自SEQ ID NO:1～7中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:8～14中的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
[0075] (20)上述(17)所述的药物组合物，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条重链、及包含与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的至少一条轻链。
[0076] (21)上述(17)所述的药物组合物，其中，上述人源化抗体或其片段含有：包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列中第20～465位的氨基酸序列的至少一条重链、及包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列中第21～234位的氨基酸序列的至少一条轻链。
[0077] (22)上述(17)～(21)中任一项所述的药物组合物，其中，上述人源化抗体或其片段与选自SEQ ID NO:19～28中的一个以上肽结合。
[0078] (23)上述(17)～(22)中任一项所述的药物组合物，其中，上述人源化抗体由具有美国菌种保藏中心(ATCC)的保藏号PTA-7695、被命名为s604069.YST-pABMC148(x411)的株产生。
[0079] (24)上述(15)～(23)中任一项所述的药物组合物，其中，上述片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv及F(ab’)2。
[0080] (25)上述(15)～(24)中任一项所述的药物组合物，其为恶性间皮瘤的治疗用药物组合物。
[0081] (26)恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂，其包含(15)～(24)中任一项所述的药物组合物。
[0082] (27)恶性间皮瘤细胞的溶解剂，其包含(15)～(24)中任一项所述的药物组合物。
[0083] (28)抗CD26抗体及其它抗肿瘤剂的用于制造恶性间皮瘤的治疗用药物组合物的用途。
[0084] (29)上述(28)所述的用途，其中，上述其它抗肿瘤剂为选自顺氯氨铂、培美曲塞，吉非替尼及吉西他滨中的一种以上药剂。
[0085] 发明的效果
[0086] 可以认为，通过将人源化CD26抗体与选自顺氯氨铂、培美曲塞、吉非替尼及吉西他滨中的一种以上药剂组合，可协同性地增强对于作为间皮瘤的病理性特征且为根本性的课题的浸润的抑制效果，且/或，可增强间皮瘤细胞的增殖抑制效果，因此在间皮瘤的治疗中是极为有用的。另外，吉非替尼或吉西他滨与抗CD26抗体的合用是非铂疗法，因此，能够提供安全性高的间皮瘤药物疗法。进一步，通过使雷公藤甲素与人源化抗CD26抗体结合，利用更少量的雷公藤甲素即可有效地抑制恶性间皮瘤细胞的增殖。因此，可以提供毒性低而效果高的抗恶性肿瘤剂。附图说明
[0087] [图1]为示出了利用MALDI-TOFF质谱分析测定的非结合YS110和Y-TR1(SMCC)的完整质量的图。A表示非结合YS110(测定值：147012.7)，B表示Y-TR1(SMCC)(测定值：151815.6)。
[0088] [图2]为示出了Y-TR1相对于恶性间皮瘤细胞株MSTO clone12(CD26阳性)的结合的图。第一抗体：Y-TR1，第二抗体：FITC结合兔抗人IgG。示出了10μg/ml以上的Y-TR1相对于CD26阳性细胞的完整结合。纵轴表示荧光强度，横轴表示细胞数。
[0089] [图3]为示出了雷公藤甲素对恶性间皮瘤细胞株及T细胞类白血病细胞株的毒性的结果的图。A：MSTO野生型(wt)；B：MSTO clone12；C：JMN；D：Jurkat CD26(-)；E：Jurkat CD26(+)。纵轴表示与对照相比的荧光强度(％)，横轴表示雷公藤甲素的浓度(nM)。
[0090] [图4]为示出了TR1对恶性间皮瘤细胞株的体外细胞毒性的图。纵轴表示与对照相比的荧光强度(％)，横轴表示TR1的浓度(nM)。
[0091] [图5]为示出了Y-TR1对恶性间皮瘤细胞株及T细胞类白血病细胞株的体外细胞毒性的图。A示出了在使用了各种接头(linker)的情况下，Y-TR1对CD26阳性恶性间皮瘤细胞株MSTO clone12的细胞毒性的比较。使用了SMCC的Y-TR1显示出了最高的细胞毒性。B示出了与非结合YS110相比的、TR1对CD26阳性恶性间皮瘤细胞株JMN的细胞毒性。C是示出了与CD26阴性细胞株MSTO野生型(wt)相比的、Y-TR1对于CD26阳性恶性间皮瘤细胞MSTO clone12的体外细胞毒性的图。与CD26阴性细胞株MSTO野生型(wt)相比，Y-TR1对于CD26阳性恶性间皮瘤细胞MSTO clone12显示出了更高的细胞毒性。
[0092] [图6]为示出了以摩尔浓度进行比较的非偶联TR1及Y-TR1的IC50值的图。
[0093] [图7]为示出了下述Y-TR1的体内抗肿瘤活性的图，所述Y-TR1使用了移植了CD26阳性恶性间皮瘤细胞株JMN的NOD/SCID小鼠异种移植模型。Y-TR1以4mg/kg/dose、每周3次向腹膜内给药。从皮下摄取了1×107细胞的JMN细胞的第0天开始，共计给药9次Y-TR1。利用Fisher的PLSD多重比较法(Fisher’s protected least-square differences(PLSD)multiple comparison test)，在3组间(对照组、YS110给药组、Y-TR1给药组)比较了第55天的平均推定肿瘤体积。与对照组及YS110给药组相比，Y-TR1给药组的平均肿瘤体积显著较低(p＜0.05)。纵轴表示推定平均肿瘤体积(mm3)，横轴表示各组。
[0094] [图8]为示出了间皮瘤细胞株中的CD26表达的图。在各图上示出了所使用的细胞。
[0095] [图9]为示出顺氯氨铂及培美曲塞的剂量-作用曲线的图。纵轴表示活细胞(浊度：OD)，横轴表示顺氯氨铂或培美曲塞的浓度。左图表示使用了MESO1细胞的结果，右图表示使用了H2452细胞的结果。上部表示顺氯氨铂、下部表示培美曲塞的结果。
[0096] [图10]为示出了基于YS110和顺氯氨铂(Cis)或培美曲塞(PMT)合用的MESO1增殖抑制效果的图。A表示顺氯氨铂的结果，B表示培美曲塞的结果。纵轴表示活细胞(浊度：OD)，横轴表示各药剂的给药量。抗-CD26表示抗CD26抗体YS110。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0097] [图11]为示出了基于YS110和顺氯氨铂(Cis)或培美曲塞(PMT)合用的H2452增殖抑制效果的图。A表示顺氯氨铂的结果，B表示培美曲塞的结果。纵轴表示活细胞(浊度：OD)，横轴表示各药剂的给药量。抗-CD26表示抗CD26抗体YS110。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
[0098] [图12]为示出了将YS110与顺氯氨铂(Cis)-培美曲塞(PMT)合用相组合的增殖抑制效果的图。A表示MESO1细胞的结果，B表示H2452细胞的结果。纵轴表示活细胞(浊度：OD)，横轴表示给药的药剂。抗-CD26表示抗CD26抗体YS110。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0099] [图13]为示出了基于YS110的顺氯氨铂(Cis)及培美曲塞(PMT)的体内的JMN细胞增殖抑制效果的图及照片。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。*p＜0.05，**p＜0.01
[0100] [图14]为示出了基于YS110的顺氯氨铂(Cis)-培美曲塞(PMT)合用的体内的JMN细胞增殖抑制效果的图及照片。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
[0101] [图15]为示出了基于YS110的顺氯氨铂-培美曲塞合用的体内的MESO1细胞增殖抑制效果的图及照片。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。*p＜0.05，**p＜0.01。
[0102] [图16]为示出了基于YS110的顺氯氨铂(Cis)-培美曲塞(PMT)合用的体内的H2452细胞增殖抑制效果的图及照片。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0103] [图17]为示出了顺氯氨铂(Cis)或培美曲塞(PMT)对细胞浸润的作用的图。纵轴表示浸润细胞数，横轴表示各药剂的浓度(μM)。左图表示使用了MESO1细胞的结果，右图表示使用了H2452细胞的结果。上部的图表示顺氯氨铂、下部的图表示培美曲塞的结果。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0104] [图18]为示出了顺氯氨铂(Cis)-培美曲塞(PMT)合用的细胞浸润抑制效果的图。纵轴表示浸润细胞数，横轴表示各药剂的浓度(μM)。上图表示使用了MESO1细胞的结果，下图表示使用了H2452细胞的结果。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0105] [图19]A：示出了基于YS110和顺氯氨铂(Cis)的合用的MESO1细胞的细胞浸润抑制效果的图。纵轴表示浸润细胞数，横轴表示各药剂的浓度(μM)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。B：示出了分析顺氯氨铂和YS110UI的对于MESO1细胞浸润抑制效果的相互作用的结果的表。
[0106] [图20]A：示出了基于YS110和顺氯氨铂(Cis)的合用的H2452细胞的细胞浸润抑制效果的图。纵轴表示浸润细胞数，横轴表示各药剂的浓度(μM)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。B：示出了分析顺氯氨铂和YS110的对于H2452细胞浸润抑制效果的相互作用的结果的表。
[0107] [图21]为示出了间皮瘤细胞株中的吉西他滨的剂量-作用曲线的图。纵轴表示活细胞(浊度：OD)，横轴表示吉西他滨的浓度。
[0108] [图22]A：示出了对于肉瘤型间皮瘤MESO1细胞增殖的YS110与吉西他滨(Gem)的合用效果的图。纵轴表示细胞数(×103细胞)，横轴表示各药剂的给药量。*p＜0.05，**p＜0.01。B：示出了分析吉西他滨和YS110的对于MESO1细胞增殖抑制效果的相互作用的结果的表。
[0109] [图23]A：示出了对于肉瘤型间皮瘤JMN细胞增殖的YS110与吉西他滨(Gem)的合用效果的图。纵轴表示细胞数(×103细胞)，横轴表示各药剂的给药量。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。B：示出了分析吉西他滨和YS110的对于JMN细胞增殖抑制效果的相互作用的结果的表。
[0110] [图24]A：示出了对于上皮型间皮瘤H2452细胞增殖的YS110与吉西他滨(Gem)的合用效果的图。纵轴表示细胞数(×103细胞)，横轴表示各药剂的给药量。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。B：示出了分析吉西他滨和YS110的对于H2452细胞增殖抑制效果的相互作用的结果的表。
[0111] [图25]A：示出了对于上皮型间皮瘤H226细胞增殖的抗CD26抗体和吉西他滨(Gem)3
的合用效果的图。纵轴表示细胞数(×10 细胞)，横轴表示各药剂的给药量。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。B：示出了分析吉西他滨和YS110的对于H226细胞增殖抑制效果的相互作用的结果的表。
的合用效果的图。纵轴表示细胞数(×10 细胞)，横轴表示各药剂的给药量。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。B：示出了分析吉西他滨和YS110的对于H226细胞增殖抑制效果的相互作用的结果的表。
[0112] [图26]为示出了相对于顺氯氨铂(Cis)-培美曲塞(PMT)的吉西他滨(Gem)合用效果的图。纵轴表示活细胞(浊度：OD)，横轴表示给药的药剂。表上示出了所使用的细胞株。黑方块表示对照组，黑圆表示吉西他滨3×10-8M给药组，黑三角表示吉西他滨1×10-9M给药组。
[0113] [图27]为示出了对于上皮型间皮瘤细胞H226细胞的体内增殖的YS110与吉西他滨的合用效果的图、照片，以及示出了吉西他滨和YS110的相互作用的表。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。
[0114] [图28]为示出了对于肉瘤型间皮瘤细胞JMN细胞的体内增殖的YS110与吉西他滨的合用效果的图、照片，以及示出了吉西他滨和YS110的相互作用的表。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。
[0115] [图29]为示出了对于CD26阳性肺癌细胞株HCC827细胞的体内增殖的YS110与顺氯氨铂-培美曲塞的合用效果的图。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。照片为切除的肿瘤样品。
[0116] [图30]为示出了对于CD26阳性肺癌细胞株HCC4006细胞的体内增殖的YS110与吉非替尼的合用效果的图。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。
[0117] [图31]为示出了对于CD26阳性肺癌细胞株HCC827细胞的体内增殖的YS110与吉非替尼的合用效果的图。图的纵轴表示肿瘤重量(mg)，横轴表示给药的药剂。
[0118] [图32]为将顺氯氨铂及培美曲塞的对于MESO1细胞及JMN细胞的增殖抑制效果加以比较的图。纵轴表示增殖抑制率(％)，横轴表示各药剂的浓度(M)。A：示出了对顺氯氨铂的增殖抑制效果进行比较的结果。B：示出了对培美曲塞的增殖抑制效果进行比较的结果。
[0119] [图33]为将吉西他滨的对于MESO1细胞和JMN细胞、以及H2452细胞和H226细胞的增殖抑制效果加以比较的图。A：示出了以MESO1、JMN比较吉西他滨的增殖抑制效果的结果。B：示出了以H2452、H226比较吉西他滨的增殖抑制效果的结果。
具体实施方式
[0120] 1.抗体
[0121] 在本说明书中的所述“抗体”是指能够经由位于免疫球蛋白分子的可变区的至少1个抗原识别位点与糖质、多核苷酸、脂质、抗体等靶标特异性结合的免疫球蛋白分子。在本说明书中使用时，上述用语不仅包括完全体的多克隆抗体或单克隆抗体，也包括它们的片段(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等)、单链(ScFv)、它们的变异体、包含抗体部分的融合蛋白、及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的其它修饰结构体。抗体包括IgG、IgA或IgM(或它们的亚类)等抗体的任意类别，不需要为特定的类别。免疫球蛋白根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列而被分类为不同的类别。免疫球蛋白的5个主要类别有IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，这些中的数个可进一步被细分为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2这样的亚类(同种型)。不同类别的免疫球蛋白的相应重链的恒定区分别被称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的每种免疫球蛋白的亚基结构及三维结构已为众所周知。
[0122] 在本说明书中，“单克隆抗体”指由产生实质上均一抗体的细胞群得到的抗体。即，除了少许有能够存在的可能性的天然的突变体以外，该细胞群中包含的各个抗体是相同的。单克隆抗体是针对单一抗原位点的抗体，是非常特异性的抗体。进一步，与以不同的决定基(表位)为靶标的包含不同抗原的典型的多克隆抗体形成对比地，各单克隆抗体以抗原的单一决定基为靶标。修饰语“单克隆”表示由实质上均一的抗体产生细胞群得到的抗体的特性，不应被理解为必须基于特定的方法来产生抗体。例如，按照本发明而使用的单克隆抗体，可通过美国专利第4,816,567号中记载的那样的重组DNA法进行制备。例如，从使用McCafferty等于1990年、Nature、348:552-554中记载的技术制作的噬菌体文库，也可以分离出单克隆抗体。
[0123] 在本说明书中使用的情况下，“人源化”抗体是指作为包括特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或源自非人免疫球蛋白的最小序列的它们的片段(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或者抗体的其它抗原结合性部分序列等)的非人(例如，小鼠)的抗体的形态。若干的人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，源自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望的特异性、亲和性及能力的源自小鼠、大鼠或兔等的非人种(供体抗体)的CDR的残基所取代。在若干个例子中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的源自非人的残基所取代。
若干的人源化抗体包含具有期望的特异性、亲和性和/或能力的源自小鼠、大鼠或兔等的非人种(供体抗体)中的至少1个、通常为2个可变区，而1个以上的Fv框架区的残基和/或1个以上的FvCDR残基被相应的人残基(即，源自人抗体序列的残基)所取代。最一般地，至少多个Fv框架区的残基可在人源化抗体的1个以上可变区中被取代。进一步，人源化抗体可包含在受体抗体中、在被移入的CDR或者框架序列中均未发现的残基，但也可包含用于进行抗体性能的进一步改良及优化的残基。
若干的人源化抗体包含具有期望的特异性、亲和性和/或能力的源自小鼠、大鼠或兔等的非人种(供体抗体)中的至少1个、通常为2个可变区，而1个以上的Fv框架区的残基和/或1个以上的FvCDR残基被相应的人残基(即，源自人抗体序列的残基)所取代。最一般地，至少多个Fv框架区的残基可在人源化抗体的1个以上可变区中被取代。进一步，人源化抗体可包含在受体抗体中、在被移入的CDR或者框架序列中均未发现的残基，但也可包含用于进行抗体性能的进一步改良及优化的残基。
[0124] 若干的人源化抗体实质上包含至少1个、通常为2个可变区的全部，在这些可变区中，CDR的全部或实质上全部与非人免疫球蛋白的CDR对应，并且FR的全部或实质上全部为人免疫球蛋白的共有序列的FR。若干的人源化抗体实质上包含至少1个、通常为2个可变区的全部，在这些可变区中，CDR的氨基酸残基的大部分与非人源化免疫球蛋白的CDR对应，并且FR的氨基酸残基的1个以上为人免疫球蛋白的共有序列的FR。人源化抗体可最优选为包含人免疫球蛋白的恒定区(Fc)或结构域(通常为人免疫球蛋白)的至少一部分。若干的人源化抗体具有国际公开公报第99/58572号中记载的那样的经修饰的Fc区。人源化抗体的若干个形态为具有对于原始抗体进行改变的1个以上(例如：1、2、3、4、5、6个)CDR，该CDR也被称为“源自”原始抗体的1个以上CDR的1个以上CDR。
[0125] 抗体的“可变区”参照抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区的各自单独或组合。重链及轻链的可变区分别由通过作为超可变区而被已知的3个互补决定区(CDR)连接的4个框架区(FR)构成。各链中的CDR通过FR而保持非常接近，其有助于与来自另一个链的CDR共同形成抗体的抗原结合位点。为了确定CDR，至少包括2种技术：(1)基于异种间序列可变性的方式(Approach)(例如：Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological
Interest，(5th ed.，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；及(2)基于抗原-抗体复合体的晶体结构学研究的方式(Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:
927-948))。进一步，为了确定CDR，在该技术领域中有时使用这2种方式的组合。
Interest，(5th ed.，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；及(2)基于抗原-抗体复合体的晶体结构学研究的方式(Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:
927-948))。进一步，为了确定CDR，在该技术领域中有时使用这2种方式的组合。
[0126] 抗体的“恒定区”参考抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区的各自单独或组合。
[0127] 与抗体“特异性结合”的表位是在该技术领域已被充分理解的用语，另外，用于确定特异性结合的方法也在该技术领域中被公知。在与分子和另外的细胞或物质发生反应或发生相互作用相比，分子与特定的细胞或物质更频繁、更快速、持续更长时间、和/或以更大的亲和性发生反应或发生相互作用的情况下，可认为分子显示“特异性结合”。在与抗体和其它物质结合相比，抗体以更大的亲和性、结合活性、更迅速和/或持续更长时间发生结合时，抗体与靶标发生“特异性结合”。例如，特异性地与1个CD26表位结合的抗体，是与和其它CD26表位或非CD26表位结合相比，以更大亲和性、结合活性、更迅速和/或持续更长时间与该CD26表位结合的抗体。根据该定义，还可解释为例如：与第1靶标特异性结合的抗体(或部分或表位)，可能与第2靶标特异性结合、或者还可能不结合。像这样，“特异性结合”不一定需要(可以包含)排他性结合。
[0128] “宿主细胞”包含单个的细胞或细胞培养物，其可成为插入有多核苷酸插入物的载体的受体、或已经成为了受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，后代根据自然的、偶然发生的或有计划的突变而(在形态学上或基因组DNA互补体中)不一定与原始的亲本细胞相同。宿主细胞包括利用本发明的多核苷酸在体内进行了转染的细胞。
[0129] “分离的”抗体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物，是采取了在自然界中不存在的形态的抗体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的抗体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化成在自然界中不存在的形态的那些。在某一实施方式中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物实质上是纯的。
[0130] 在本说明书中使用的情况下，“治疗”为用于得到有益的或期望的临床结果的方式。在本发明的目的中，有益的或期望的临床结果不论是能检测还是不能检测的，包括：一种以上症状的减轻、疾病范围的缩小、疾病的稳定化(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或延缓、疾病状态的恢复或纾解、及缓解(局部或全体)，但不限于这些。“治疗”也指相对于假如未接受治疗的情况下的估计的剩余寿命，延长剩余寿命。
[0131] “有效量”是对于实现包含临床结果的有益的或期望的临床结果而言足够的量。有效量可以利用1次或多次给药进行给予。在本发明的目的中，本说明书中记载的抗CD26抗体复合体、抗CD26抗体和其它抗癌剂等的有效量是对于延迟与肿瘤增殖相关的状态的发展而言足够的量。正如在该技术领域中被理解的那样，例如，抗CD26抗体复合体、抗CD26抗体和其它抗癌剂的有效量，也可以依赖于或根据尤其是患者病历、及使用的抗CD26抗体复合体、其它抗癌剂的种类(和/或量)等其它要素而发生变动。
[0132] 在本说明书中使用的情况下，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括在与有效成分组合的情况下，其有效成分可以保持生物活性、被送达时与被测体的免疫系统为非反应性、对被测体无毒性的任意材料。作为例子，包括但不限于：磷酸缓冲盐水、水、油/水乳液等乳液、及各种湿润剂等所有标准的药物载体。用于进行喷雾给药或非口服给药的优选稀释剂为磷酸缓冲盐水或生理盐水(0.9％)。包含这样的载体的组合物可利用众所周知的传统方法配制(例如参考Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thedition，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990及Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000)。
[0133] 抗CD26抗体
[0134] 在某一实施方式中，本说明书中使用的抗CD26抗体与人CD26特异性结合。在某一实施方式中，本说明书中记载的抗CD26抗体与小鼠单克隆抗体14D10结合于相同表位。在某一实施方式中，本说明书中记载的抗CD26抗体在竞争测定中，有阻断小鼠单克隆抗体14D10对人CD26的结合的能力(与小鼠单克隆抗体14D10发生竞争)。在某一实施方式中，本说明书中记载的抗CD26抗体在竞争测定中，有阻断小鼠单克隆抗体1F7对人CD26的结合的能力(与小鼠单克隆抗体1F7发生竞争)。竞争测定可以如下地进行：使被测抗体与固定化的表位或抗原接触后，通过洗涤而除去未结合的抗体，接着，使标记化的14D10抗体或1F7抗体与该表位或抗原接触，在通过洗涤而除去未结合的抗体后，检测已结合的14D10抗体或1F7抗体。与14D10抗体或1F7抗体相对于对照(未与被测抗体接触)的表位或抗原的结合相比，在使与被测抗体接触的情况下14D10抗体或1F7抗体与表位或抗原的结合发生减少的情况下，可以判定为在竞争测定中，有阻断14D10抗体或1F7抗体的结合的能力(与14D10抗体或1F7抗体发生竞争)。
[0135] 作为本说明书中使用的抗CD26抗体的对人CD26的结合亲和性，可列举具有低于10-5M、低于5×10-5M、低于10-6M、低于5×10-7M、低于10-7M、低于5×10-8M、低于10-8M、低于5×
10-9M、低于10-9M、低于5×10-10M、低于10-10M、低于5×10-11M或低于10-11M的解离常数(即Kd)的亲和性。另外，解离常数也可以为10-15M以上、5×10-15M以上、10-14M以上、5×10-14M以上、
10-13M以上、5×10-13M以上、10-12M以上、5×10-12M以上、10-11M以上、5×10-11M以上、10-10M以上或5×10-10M以上。用于确定亲和性的方法在该技术领域中是已知的。例如，结合亲和性可以使用BIAcore生物传感器、KinExA生物传感器、闪烁亲近测定、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司)、荧光猝灭、荧光转变和/或酵母展示而确定。亲和性也可以使用适当的生物测定法(bioassay)进行筛选。
10-9M、低于10-9M、低于5×10-10M、低于10-10M、低于5×10-11M或低于10-11M的解离常数(即Kd)的亲和性。另外，解离常数也可以为10-15M以上、5×10-15M以上、10-14M以上、5×10-14M以上、
10-13M以上、5×10-13M以上、10-12M以上、5×10-12M以上、10-11M以上、5×10-11M以上、10-10M以上或5×10-10M以上。用于确定亲和性的方法在该技术领域中是已知的。例如，结合亲和性可以使用BIAcore生物传感器、KinExA生物传感器、闪烁亲近测定、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司)、荧光猝灭、荧光转变和/或酵母展示而确定。亲和性也可以使用适当的生物测定法(bioassay)进行筛选。
[0136] 用于确定针对CD26的抗体的结合亲和性的一个方法是测定抗体的单官能性Fab片段的亲和性的方法。为了得到单官能性Fab片段，可以将抗体、例如IgG利用木瓜蛋白酶进行切割、或通过重组技术进行表达。单克隆抗体的抗CD26Fab片段的亲和性可以通过表面等离子共振(SPR)系统(BIAcore3000(商标)，BIAcore公司，Piscaway，NJ)确定。依照供应商的操作说明书，可使用SA芯片(链霉亲和素)。可以将经生物素化的CD26稀释于HBS-EP(100mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20)中，以0.005mg/mL的浓度注入芯片上。使用跨越单个的芯片通道的可变的流动时间，可实现抗原密度的2个范围：为了详细的动力学试验的10～20个响应单位(RU)，为了浓度的500～600RU。Pierce洗脱缓冲液及4M NaCl(2:1)的混合物可有效地去除结合的Fab，另一方面，可针对200次以上的注入而保持芯片上的CD26的活性。HBS-EP缓冲液可以作为运行缓冲液而用于全部BIAcore测定。将纯化后的Fab试样的梯度稀释溶液(0.1～10×所估计的KD)以100μL/分钟注入2分钟，通常允许直到
30分钟为止的解离时间。Fab蛋白质的浓度可以使用已知浓度(通过氨基酸分析确定)的标准的Fab、通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳而确定。反应速度的结合速度(kon)及解离速度(koff)可通过使用BIAevaluation程序、将数据拟合为1:1Langmuir结合模型(Lofas&Johnsson，1990)而同时得到。平衡解离常数(KD)值以koff/kon来计算。
30分钟为止的解离时间。Fab蛋白质的浓度可以使用已知浓度(通过氨基酸分析确定)的标准的Fab、通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳而确定。反应速度的结合速度(kon)及解离速度(koff)可通过使用BIAevaluation程序、将数据拟合为1:1Langmuir结合模型(Lofas&Johnsson，1990)而同时得到。平衡解离常数(KD)值以koff/kon来计算。
[0137] 在某一实施方式中，本发明涉及抑制表达CD26的细胞的增殖的抗CD26抗体-雷公藤甲素复合体、或含有抗CD26抗体和其它抗癌剂的药物组合物。本发明也包含以下实施方式：上述复合体或组合物对于与CD26表达相关的状态(疾病或病症等)、例如恶性间皮瘤的治疗有用。在某一实施方式中，本发明的复合体或组合物任选具有下述中的1个以上特征：(a)与CD26结合，(b)调节CD26活性，(c)在G1/S检查点使CD26+细胞的细胞周期停止，(d)抑制表达CD26的细胞(例如：恶性间皮瘤)的增殖，(e)抑制CD26对细胞外基质的结合，和/或(f)对与CD26表达相关的状态的治疗有用。在某一实施方式中，与CD26的表达相关的状态为与CD26的过表达相关的疾病或病症。在某一实施方式中，与CD26的表达相关的状态为至少部分由CD26介导的状态。在某一实施方式中，与CD26的表达相关的状态为与CD26所表达的细胞的增殖相关的状态。在某一实施方式中，上述疾病或病症为：癌症(例如：恶性间皮瘤、肺癌、肾癌、肝癌或伴有CD26的表达的其它恶性肿瘤)。
[0138] 在某一实施方式中，本发明的复合体或组合物所含有的抗体含有：包含与选自SEQ ID NO:8-14中的氨基酸序列至少具有约80％的同一性的氨基酸序列的重链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:1-7中的氨基酸序列至少具有约80％的同一性的氨基酸序列的轻链可变区这两者。在某一实施方式中，本发明的复合体或组合物所含有的抗体含有：包含与选自SEQ ID NO:8-14中的氨基酸序列至少具有约80％的同一性的氨基酸序列的轻链可变区、及包含与选自SEQ ID NO:1-7中的氨基酸序列至少具有约80％的同一性的氨基酸序列的重链可变区。
[0139] 在某一实施方式中，本发明的复合体或组合物所含有的抗体含有：SEQ ID NO:1-14中任一个氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少8个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸或至少约50个连续氨基酸。
[0140] 本发明进一步提供含有包含本说明书中记载的那样的抗体序列(例如：SEQ ID NO:1-7、SEQ ID NO:8-14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16中的任一个)的片段的抗体的抗CD26抗体-雷公藤甲素复合体、或含有抗CD26抗体和其它抗癌剂的药物组合物。在某一实施方式中，上述抗体包含本说明书中记载的那样的抗体序列的片段，且该片段为至少约50个氨基酸、至少约75个氨基酸或至少约100个氨基酸的长度的片段。
[0141] SEQ ID NO:15
[0142]EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS[0143] 上述序列中，X1为E或Q，X2为A或g，X3为g或E，X4为L或V，X5为V、K或E，X6为g或E，X7为T或S，X8为T或S，X9为T或K，X10为F或Y，X11为S或T，X12为T、N或S，X13为V或M，X14为g或D，X15为A或S，X16为A或S，X17为K或R，X18为N或T，X19为S或N，X20为V或A，X21为M或L，X22为V、M或T，并且X23为N或S。
[0144] SEQ ID NO:16
[0145]XIIX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX11IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLXI3X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK
[0146] 上述序列中，X1为D或E，X2为L或E，X3为M或L，X4为A或V，X5为S或T，X6为L、P或A，X7为D或E，X8为V或A，X9为T或S，X10为S或R，X11为g或D，X12为S或N，X13为H或Q，X14为S或T，X15为S、D或A，X16为E或Q，X17为P或A，X18为F或V，X19为T、A或I，X20为I或N，并且X21为F或L。
[0147] 表1示出了人源化VL变异体X376(SEQ ID NO:1)、X377(SEQ ID NO:2)、X378(SEQ ID NO:3)、X379(SEQ ID NO:4)、X380(SEQ ID NO:5)、X381(SEQ ID NO:6)及X394(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。带有Kabat编号及SEQ ID NO的体系(scheme)与轻链可变区一致。
[0148] 表2示出了人源化VH变异体X384(SEQ ID NO:8)、X385(SEQ ID NO:9)、X386(SEQ ID NO:10)、X387(SEQ ID NO:11)及X388(SEQ ID NO:12)、X399(SEQ ID NO:13)及X420(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。示出了SEQ ID NO及Kabat编号体系这两者。Kabat编号体系包含82a、82b及82c。
[0149] [表1]
[0150]
[0151] [表2]
[0152]
[0153] 上述抗体可以进一步包含SEQ ID NO:17或它们的片段或者变异体。在某一实施方式中，上述抗体包含SEQ ID NO:17。在某一实施方式中，上述抗体包含除去信号序列的SEQ ID NO:17(本领域技术人员应该可以容易地理解，在某一实施方式中，抗体的信号序列被从抗体切割掉)。在某一实施方式中，上述抗体包含SEQ ID NO:17的可变区。在某一实施方式中，上述抗体包含相对于SEQ ID NO:17具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的同一性的抗体(或它们的片段)。在某一实施方式中，上述抗体包含SEQ ID NO:17的片段，且该片段为至少约10个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少约75个氨基酸、至少约100个氨基酸的长度的片段。在某一实施方式中，上述抗体与人CD26结合。
[0154] 重链(SEQ ID NO:17)
[0155] MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0156] 上述抗体进一步包含SEQ ID NO:18或者它们的片段或变异体。在某一实施方式中，上述抗体包含SEQ ID NO:18。在某一实施方式中，上述抗体包含除去信号序列的SEQ ID NO:18(本领域技术人员应该可以容易地理解，在某一实施方式中，抗体的信号序列被从抗体切割掉)。在某一实施方式中，上述抗体包含SEQ ID NO:18的可变区。在某一实施方式中，上述抗体包含相对于SEQ ID NO:18具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的同一性的抗体(或它们的片段)。在某一实施方式中，上述抗体包含SEQ ID NO:18的片段，且该片段为至少约10个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少约75个氨基酸、至少约100个氨基酸的长度的片段。在某一实施方式中，上述抗体进一步包含SEQ ID NO:18、或者其片段或变异体。在某一实施方式中，上述抗体与人CD26结合。例如：在某一实施方式中，上述抗体为含有至少一条重链(例如：2条重链)及至少一条轻链(例如：
2条轻链)的抗体，所述重链各自包含没有信号序列的SEQ ID NO:17，所述轻链各自包含没有信号序列的SEQ ID NO:18。
2条轻链)的抗体，所述重链各自包含没有信号序列的SEQ ID NO:17，所述轻链各自包含没有信号序列的SEQ ID NO:18。
[0157] 轻链(SEQ ID NO:18)
[0158] MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0159] 在本说明书中，人源化抗CD26抗体“YS110”是指重链恒定区由SEQ ID NO:17中记载的氨基酸序列构成、轻链恒定区由SEQ ID NO:18中记载的氨基酸序列构成的抗体。有报道称YS110与恶性肿瘤细胞膜上的CD26结合时会被摄入细胞内，并进一步转移至核内(Yamada K et al，Plos One，2013Apr29；8(4)：e62304)。更具体而言，YS110被认为通过窖蛋白(Caveolin)依赖性的内吞作用被摄入细胞质内，并通过早期内吞囊泡被输送至核内。因此，在一种实施方式中，基于YS110和雷公藤甲素复合体的抗肿瘤效果(例如：对间皮瘤的治疗效果)也可以基于由YS110产生的这种作用。即，本发明的抗CD26抗体可以是在与恶性肿瘤细胞膜上的CD26结合时被摄入细胞内、并进一步转移至核内的抗体。抗体在与恶性肿瘤细胞膜上的CD26结合时是否会被摄入细胞内并进一步转移至核内，可以通过在使标记化的抗体与细胞接触后，基于标记而利用显微镜等检测抗体的存在位置、确定该位置与细胞内的组织的位置关系来进行。
[0160] 另一方面，上述抗体与选自下组中的一个以上肽结合：YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:19；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:20；肽35)、TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO:22；肽84)、RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:23；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:24；肽37)、EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO:25；肽79)、
DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)及
IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:28；肽63)。在某一实施方式中，上述抗体与上述肽中的一个以上发生特异性结合。这些肽为人CD26的区域。在某一实施方式中，与对应于人CD26的其它区域的一个以上肽相比，上述抗体会与选自下组中的一个以上肽发生特异性结合：
YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:19；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:20；肽35)、
TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO:22；肽84)、
RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:23；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:24；肽37)、
EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO:25；肽79)、DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)、
SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)及IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:28；肽63)。
DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)、SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)及
IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:28；肽63)。在某一实施方式中，上述抗体与上述肽中的一个以上发生特异性结合。这些肽为人CD26的区域。在某一实施方式中，与对应于人CD26的其它区域的一个以上肽相比，上述抗体会与选自下组中的一个以上肽发生特异性结合：
YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:19；肽6)、LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:20；肽35)、
TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)、LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO:22；肽84)、
RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:23；肽132)、YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:24；肽37)、
EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO:25；肽79)、DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)、
SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)及IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:28；肽63)。
[0161] 在某一实施方式中，上述抗体与以下的各个肽结合：与YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:19；肽6)；LEYNYVKQWRHSY(SEQ ID NO:20；肽35)；TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)；LWWSPNGTFLAYA(SEQ ID NO:22；肽84)；及RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:23；肽132)结合。在某一其它实施方式中，抗体为以下的各个肽：YSLRWISDHEYLY(SEQ ID NO:19；肽6)；
TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)；RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:23；肽132)；
YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:24；肽37)；及EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO:25；肽79)。在某一实施方式中，上述抗体与以下的各个肽结合：DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)；
SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)；及TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)。在某一其它实施方式中，上述抗体与以下的各个肽结合：DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)；
SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)；TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)；及
IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:28；肽63)。
TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)；RISLQWLRRIQNY(SEQ ID NO:23；肽132)；
YVKQWRHSYTASY(SEQ ID NO:24；肽37)；及EEEVFSAYSALWW(SEQ ID NO:25；肽79)。在某一实施方式中，上述抗体与以下的各个肽结合：DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)；
SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)；及TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)。在某一其它实施方式中，上述抗体与以下的各个肽结合：DYSISPDGQFILL(SEQ ID NO:26；肽29)；
SISPDGQFILLEY(SEQ ID NO:27；肽30)；TWSPVGHKLAYVW(SEQ ID NO:21；肽55)；及
IYVKIEPNLPSYR(SEQ ID NO:28；肽63)。
[0162] 可以利用竞争测定来确定2个抗体是否通过识别相同的或立体性重叠的表位而与相同表位结合。通常，抗原被固定于多孔板上，测定非标记抗体阻断标记抗体的结合的性能。用于这样的竞争测定的常规标记为放射性标记或酶标记。进一步，可以通过使用本领域技术人员已知的表位作图(Epitope Mapping)技术来确定抗体所结合的表位。
[0163] 在某一实施方式中，上述抗体包含1个以上的恒定区。在某一实施方式中，上述抗体包含人的恒定区。在某一实施方式中，恒定区为重链的恒定区。在另外的实施方式中，恒定区为轻链的恒定区。在某一实施方式中，上述抗体包含相对于人的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％的同一性的恒定区。在某一实施方式中，上述抗体包含Fc区。在某一实施方式中，上述抗体包含人的Fc区。在某一实施方式中，上述抗体包含相对于人的Fc区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％的同一性的Fc区。
[0164] 在某一实施方式中，上述抗体为IgG抗体。在某一实施方式中，上述抗体为IgG1抗体。在另外的实施方式中，上述抗体为IgG2抗体。在某一实施方式中，上述抗体为人IgG抗体。
[0165] 上述抗体可以为单体、二聚体及多聚体的形态的抗体。例如，双重特异性抗体、至少对2个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，可以使用本说明书中公开的抗体而制备(例如，参考Suresh等，Methods in Enzymology，1986，121，210)。以往以来，双重特异性抗体的重组生产基于的是包含具有不同特异性的2个重链的2组免疫球蛋白的重链-轻链对的共表达(Millstein，Cuello，Nature，1983，305，537-539)。
[0166] 根据用于制作双重特异性抗体的1个方式，具有期望的结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白的恒定区融合。优选上述融合部分伴有至少包含铰链部、CH2及CH3区的部分的免疫球蛋白的重链恒定区。优选在至少1个融合部分具有包含对于轻链的结合而言的位点的第1重链恒定区(CH1)。编码免疫球蛋白重链融合物的DNA及在需要的情况下编码免疫球蛋白轻链的DNA分别被插入表达载体，同时转染至适当的宿主生物。在构建中使用的3条抗体链的不等比提供最佳产量的实施方式中，可以以高度灵活性制备上述3种抗体的相互比(mutual proportion)。在至少2种抗体的等比的表达带来高产率、或比率不是特别重要的情况下，可以将2种或3种的全部抗体的编码序列插入1个表达载体中。
[0167] 作为1个方式，可列举由一个臂的具有第1结合特异性的杂合型免疫球蛋白重链、及另一个臂的杂合型重链-轻链对(具有第2结合特异性)构成的双重特异性抗体。利用该不对称的结构(仅在双重特异性抗体分子的一半的部分具有免疫球蛋白轻链)，容易从不需要的免疫球蛋白链的组合中分离出需要的双重特异性化合物。该方式记载于1994年3月3日公开的国际公开公报第94/04690号。
[0168] 包含2个形成了共价键的抗体的异源偶联抗体也在上述抗体的范围内。这样的抗体用于使免疫系统细胞靶向于不必要的细胞(美国专利第4,676,980号)、或用于HIV感染的治疗(国际公开公报第91/00,360号及第92/200,373号；欧洲专利第03089号)。异源偶联抗体可以使用任意适宜的交联法制作。合适的交联剂及交联技术为该技术领域所熟知，记载于美国专利第4,676,980号中。
[0169] 在特定的实施方式中，上述抗体为抗体片段。例如，在某一实施方式中，抗体选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv及F(ab’)2中。在某一实施方式中，抗体为Fab。为了抗体片段的生产，已开发了各种技术。这些片段可以经由完全体的抗体的蛋白质消化而得到(参考例如，Morimoto等，1992，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117及Brennan等，1985，Science 229：81)，或者也可以由重组宿主细胞直接生产。例如，可从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，通过使其形成化学键而形成F(ab’)2片段(Carter等，1992，Bio/Technology 10：163-167)。在另外的实施方式中，F(ab’)2使用促进F(ab’)2分子的组装的亮氨酸拉链GCN4而形成。根据其它方式，Fv、Fab、或F(ab’)2的片段由重组宿主细胞培养直接分离。
[0170] 在某一实施方式中，上述抗体为其单链(ScFv)、变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双价抗体(diabody)、线型抗体、单链抗体及经任意其它修饰的立体构型的免疫球蛋白分子。
[0171] 单链可变区片段通过使用较短的连接肽连接轻链和/或重链可变区而制作。Bird等(1988)Science 242：423-426。连接肽的例子为：交联一个可变区的羧基末端及另一个可变区的氨基末端之间的约3.5nm的(GGGGS)3(SEQ ID NO:29)。也设计及使用其它序列的接头。Bird等(1988)。接头可以为了后续的药物的固定或相对于固体载体的固定等附加功能而进行修饰。单链变异体也可以通过重组技术或合成技术中的任一技术而生产。在通过合成技术生产scFv的情况下，可以使用自动合成仪。在通过重组技术生产scFv的情况下，可以将包含编码scFv的多核苷酸的适当的质粒导入适当的宿主细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞等真核生物、或大肠杆菌等原核生物。编码目标的scFv的多核苷酸可以通过多核苷酸的连接等常规操作来制作。其最终产生的scFv可以使用该技术领域中已知的标准的蛋白质纯化技术进行分离。
[0172] 另外，上述抗体也包括双价抗体等其它形态的单链抗体。双价抗体为在单一的抗体链上表达VH区及VL区的二价的双重特异性抗体，但使用的是对于在同一链上成对地形成这2个区而言过短的接头，因此，不得不强制性地使这些区与另外的链的互补的区成对，制作出2个抗原结合位点(参考例如，Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等(1994)Structure 2：1121-1123)。
[0173] 上述抗体包含对本说明书中记载的抗体的修饰，作为这样的修饰的例子，可列举不会对该抗体的特性造成显著影响的在功能上等效的抗体、及具有增强或减弱了的活性的变异体。抗体的修饰为该技术领域的常规操作，不需要详细地记载于本说明书中。经修饰的抗体的例子包括：伴有氨基酸残基的保守取代、不导致功能活性显著变差的1个以上的氨基酸的缺失或添加、或化学类似物的使用的抗体。
[0174] 氨基酸序列的插入或添加包括：在长度为1个残基至包含100个以上残基的抗体的氨基末端和/或羧基末端的融合、及单一或多个氨基酸残基的序列内的插入。末端的插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变异体包括：使抗体的血清半衰期延长的酶或者抗体的相对于抗体的N末端或C末端的融合。
[0175] 在取代突变体中，抗体序列的至少1个氨基酸残基被除去，并在其位置上插入了不同的残基。通过取代性突变导入最可获得效果的部位包括CDR，但FR的改变也是预期的。将保守性的取代示于表3的标题“保守性的取代”。这样的取代会带来生物活性的变化的情况下被命名为表3的“例示性的取代”，或也可以进一步关于氨基酸类别导入如下记载的更实质的变化而筛选产物。
[0176] [表3]
[0177] 表3:氨基酸取代
[0178]
[0179] 抗体的生物学特性方面的实质性修饰可通过选择使(a)例如片或螺旋构象等取代区中的抗体主链的结构、(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性、或(c)可使对于侧链体积的保持的修饰效果显著发生变化的取代而实现。以天然状态存在的残基基于常规的侧链特性而分类为以下几组：
[0180] (1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
[0181] (2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；
[0182] (3)酸性：Asp、Glu；
[0183] (4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
[0184] (5)对链取向带来影响的残基：Gly、Pro；以及
[0185] (6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
[0186] 非保守性的取代通过将这些类别中的1个成员与其它类别交换而实现。更保守性的取代包括某类别中的1个成员与相同类别的其它成员进行交换。
[0187] 通过对不参与保持抗体的适当的立体结构的任意半胱氨酸残基进行取代(通常为与丝氨酸进行取代)，可以使分子的氧化稳定性提高，妨碍异常的交联形成。相反地，尤其是在抗体为Fv片段等抗体片段的情况下，通过向抗体添加半胱氨酸键，可以提高抗体的稳定性。
[0188] 氨基酸修饰覆盖从1个以上氨基酸的变化或修饰到对可变区等区域的完全的再设计。可变区中的变化可以使结合亲和性和/或特异性发生变化。在某一实施方式中，1～5个以下的保守性的氨基酸取代在CDR区内进行。其它实施方式中，1～3个以下保守性的氨基酸取代在CDR3区内进行。在另外的实施方式中，CDR区为CDRH3和/或CDR L3。
[0189] 修饰还包括：糖基化及非糖基化抗体、以及例如具有不同糖中的糖基化、乙酰化及磷酸化等其它翻译后修饰的抗体。抗体在它们的恒定区中的保守的位置被糖基化(Jefferis及Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright及Morrison，1997，TibTECH
15：26-32)。免疫球蛋白的低聚糖侧链会对蛋白质的功能(Boyd等，1996，Mol.Immunol.32：
1311-1318，Wittwe及Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)以及糖蛋白质的立体结构及可对提呈的三维表面结构带来影响的糖蛋白质的部分间的分子内相互作用(Hefferis及Lund，同上，Wyss及Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)带来影响。给定的糖蛋白质有时会利用低聚糖、基于特异性识别结构而以某种分子作为靶标。有报道称抗体的糖基化还对抗体依赖性细胞伤害作用(ADCC)带来影响。特别是，报道了在四环素控制下表达作为催化二分的GlcNAc的形成的糖基转移酶的β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII)的CHO细胞中，ADCC活性提高(Umana等，1999，Nature Biotech.17：176-180)。
15：26-32)。免疫球蛋白的低聚糖侧链会对蛋白质的功能(Boyd等，1996，Mol.Immunol.32：
1311-1318，Wittwe及Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)以及糖蛋白质的立体结构及可对提呈的三维表面结构带来影响的糖蛋白质的部分间的分子内相互作用(Hefferis及Lund，同上，Wyss及Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)带来影响。给定的糖蛋白质有时会利用低聚糖、基于特异性识别结构而以某种分子作为靶标。有报道称抗体的糖基化还对抗体依赖性细胞伤害作用(ADCC)带来影响。特别是，报道了在四环素控制下表达作为催化二分的GlcNAc的形成的糖基转移酶的β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII)的CHO细胞中，ADCC活性提高(Umana等，1999，Nature Biotech.17：176-180)。
[0190] 抗体的糖基化通常为N-结合型或O-结合型中的任意类型。N-结合型是指糖质部分对天冬酰胺残基的侧链的结合。作为三肽序列的天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸及天冬酰胺-X-半胱氨酸(式中，X为除了脯氨酸以外的任意氨基酸)是用于糖质部分以酶方式对天冬酰胺侧链进行添加的识别序列。像这样，通过使这些三肽序列中的任意存在于抗体，可制作出潜在的糖基化位点。O-结合型糖基化指N-乙酰基氨基半乳糖、半乳糖或木糖中的1个糖质与羟基氨基酸、最通常为丝氨酸或苏氨酸的结合，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0191] 相对于抗体的糖基化位点的添加可通过修饰氨基酸序列使得抗体包含上述三肽序列中的1个以上而方便地完成(用于N-结合型糖基化位点)。修饰还可以通过对原始抗体的序列进行基于1个以上丝氨酸残基或苏氨酸残基的添加或取代(用于O-结合型糖基化位点)而进行。
[0192] 抗体的糖基化模式还可以在不改变基本的核苷酸序列的情况下进行修饰。糖基化大大依赖于用于表达抗体的宿主细胞。作为可考虑的治疗法，由于重组糖蛋白质、例如用于表达抗体飞细胞的种类很少为天然细胞，因此，可以预想到抗体的糖基化模式的多样性(参考例如，Hse等，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
[0193] 除了宿主细胞的选择以外，在抗体的重组生产期间对糖基化带来影响的要素包括：增殖方式、培养基配合、培养密度、添加氧、pH、纯化体系等。为了在特定的宿主生物中修饰完成的糖基化模式，已提出了各种方法，而这些中包括导入或过表达参与低聚糖生产的特定的酶(美国专利第5,047,335号，第5,510,261号及第5,278,299号)。糖基化或特定种类的糖基化可以通过酶、例如使用内切糖苷酶H(EndoH)从糖蛋白质除去。进一步，重组宿主细胞可以修饰基因而使得特定种类的多糖的加工发生缺陷。这些技术及类似的技术在该技术领域中是被公知的。
[0194] 作为修饰的其它方法，可列举该技术领域中已知的耦合技术的使用，作为这样的技术的例子，可列举基于酶的办法、氧化性取代及螯合化，但不限于这些。通过使用修饰，可以添加例如用于免疫测定方法的标记。经修饰的抗体可以使用该技术领域中被确立的顺序进行制作，可以使用该技术领域中已知的标准的测定进行筛选，其中的若干个方法记载于以下及实施例中。
[0195] 就其它的抗体修饰而言，包括在1999年11月18日公开的国际公开公报第99/58572号中记载的那样的经修饰的抗体。这些抗体除了针对靶分子导向的结合区以外，包含具有与人免疫球蛋白重链的恒定区的全部或一部分实质上相同的氨基酸序列的效应区。这些抗体具有不破坏显著的补体依赖性溶解或靶标的细胞介导性而与靶分子结合的能力。在某一实施方式中，效应区可以与FcRn和/或FcγRIIb特异性结合。这些通常基于源自2个以上人免疫球蛋白重链CH2区的嵌合区。经这样修饰的抗体尤其适于在慢性型的抗体疗法中使用，相对于传统抗体疗法可避免炎症及其它有害反应。
[0196] 上述抗体包括亲和性成熟的实施方式。例如，亲和性成熟抗体可以通过该技术领域中已知的方法生产(Marks等，1992，Bio/Technology，10：779-783；Barbas等，1994，Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Schier等，1995，Gene，169：147-155；Yelton等，1995，J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等，1995，J.Immunol.，154(7)：3310-9；Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.，226：889-896；及国际公开公报第2004/058184号)。作为候选的亲和性成熟抗体，可以使用包括使用了包含BIAcore表面等离子共振的筛选方法及噬菌体展示、酵母展示、及核糖体展示的该技术领域中已知的任意选择方法，基于经改善和/或修饰的结合亲和性进行筛选或选择。
[0197] 单克隆抗体也可以使用如Kohler及Milstein，1975，Nature 256：495记载的那样的杂交瘤法制备。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物通常通过利用免疫剂进行免疫而产生与该免疫剂特异性结合的抗体、或诱导能够产生该抗体的淋巴细胞。或者，也可以在体外免疫淋巴细胞。
[0198] 单克隆抗体(及其它抗体)还可以通过如美国专利第4,816,567号中记载的那样的重组DNA法制作。可以采用能够使编码单克隆抗体的DNA与编码单克隆抗体的重链或轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探头这样的传统方法而进行分离及序列确定。分离后，DNA被组装至表达载体，转染大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或只要没有导入该表达载体就不产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞等宿主细胞，由此完成在该重组宿主细胞中的单克隆抗体的合成。
[0199] 在某一实施方式中，上述抗体在包括但不限于细菌、酵母、植物、昆虫及哺乳类的任意生物或源自任意生物的细胞中表达。细胞的特定类型包括：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其它酵母、大肠杆菌、Bacillus subtilis(枯草芽胞杆菌)、SF9细胞、HEK-293细胞、脉孢菌(Neurospora)、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、Hela细胞、成纤维细胞、神经鞘瘤细胞系、永生化哺乳动物骨髓及淋巴样细胞系、Jurkat细胞、肥大细胞及其它内分泌及外分泌细胞、及神经细胞，但不限于这些。
[0200] 对抗体的生产有效的各种蛋白质表达体系、载体及细胞培养基为本领域技术人员所已知。例如，可参考如下：国际公开公报第03/054172号、第04/009823号、及第03/064630号(这些的全文通过参考而并入本说明书中)。在某一实施方式中，谷氨酰胺合成酶(GS)表达体系用于上述抗体的表达。
[0201] 优选上述抗体在表达后，按照本领域技术人员已知的方法进行纯化或分离。作为纯化方法的例子，可列举电泳的、分子生物学的、免疫学的及色谱的方法，作为这样的方法，可列举离子交换、疏水亲和性及反相HPLC色谱及等电点电泳。必要的纯化程度可以根据抗体的用途而改变。根据实施方式不同，有时不需要纯化。
[0202] DNA例如可通过在免疫球蛋白编码序列上以共价键连接非免疫球蛋白抗体的编码序列的全部或一部分而进行修饰。这样一来，可制备具有本说明书中公开的单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。通常，就这样的非免疫球蛋白抗体而言，通过利用本发明的抗体的恒定区进行取代、或利用本发明的抗体的1个抗原结合位点的可变区进行取代，可制作出包含具有针对CD26的1个表面表位的特异性的1个抗原结合位点、及具有针对不同抗原或者CD26表位的特异性的另外的抗原结合位点的嵌合的二价抗体。
[0203] 上述抗体也包含人源化抗体。就治疗抗体而言，诱导对所给药的抗体的免疫应答成为部分的原因，常常会引起副作用。其结果，会引起药效的降低、具有靶抗原的细胞的减少、及不希望的炎症反应。为了避免这些，也可以制作重组抗CD26人源化抗体。抗体的人源化的一般原理包括保持抗体的抗原结合部分的基本的序列，另一方面，包括将抗体的非人剩余部分中的至少一部分与人抗体序列交换。用于将单克隆抗体人源化的4个以往的常规的步骤包括：(1)确定起始抗体的轻链可变区及重链可变区的核苷酸序列及推定氨基酸序列，(2)设计人源化抗体、即在人源化的工序中确定是否使用任意的抗体框架区或残基和/或CDR残基，(3)实际的进行人源化的方法论/技术，及(4)人源化抗体的转染及表达，但不限于这些。在将抗体用于人的临床试验及治疗的情况下，为了避免免疫应答，可以利用重组技术使恒定区也更接近于人恒定区。参考例如美国专利第5,997,867号及第5,866,692号。
[0204] 在重组人源化抗体中，通过修饰Fcγ部分，可以避免Fcγ受体及补体免疫系统之间的相互作用。这样的抗体的制备技术记载于国际公开公报第99/58572号中。
[0205] 已有包含源自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的众多“人源化”抗体分子被报道，作为它们的例子，可列举啮齿类V区和与其相关的互补决定区(CDR)与人恒定区融合而成的那些。参考例如：Winter等，Nature 349：293-299(1991)；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.ScI USA 86：4220-4224(1989)；Shaw等，J Immunol.138：4534-4538(1987)；及Brown等，Cancer Res.47：3577-3583(1987)。在其它参考文献中，记载了在与适当的人抗体恒定区融合前组装于人支持框架区(FR)的啮齿类CDR。参考例如：Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)；及Jones等，Nature 321：522-525(1986)。在另一个参考文献中，记载了被经过了重组镶饰(veneering)的啮齿类框架区所支持的啮齿类CDR。参考例如：欧洲专利公开第519,596号。这些种类的“人源化”分子被设计为用于使限制人移植患者中的这些部分的治疗适用的时期及有效性的对于啮齿类抗人抗体分子而言不需要的免疫学应答达到最小限度。其它可利用的抗体的人源化方法公开于Daugherty等，Nucl.Acids Res.，19：2471-2476(1991)及美国专利第6,180,377号；第6,054,297号；第5,997,867号；第5,866,692号；第6,210,671号；第6,350,861号；及国际公开公报第01/27160号中。
[0206] 将抗体人源化的进一步例示性的方法记载于国际公开公报第02/084277号及美国专利公开公报第2004/0,133,357号中，这两者的全文通过参考而并入本说明书中。
[0207] 在另一个替代方案中，可以通过使用经过了可实现特异性人免疫球蛋白蛋白质的表达的操作的市售小鼠而得到完全人抗体。可以将经过设计、使得可产生更理想的(例如：完全为人抗体)或更顽强的免疫应答的转基因动物也用于人源化抗体或人抗体的制作。这样的技术的例子为来自Abgenix公司(Fremont,California州)的Xenomouse(商标)及来自Medarex公司(Princeton,New Jersey州)的HuMAb-Mouse(注册商标)及TC Mouse(商标)。
[0208] 在其它的替代方案中，也可以通过噬菌体展示技术、利用重组来制作抗体。参考例如：美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号及第6,265,150号，及Winter等,Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552-553(1990))可以用于将人抗体及人抗体片段由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库而在体外生产。根据该技术，将抗体V区基因在框内克隆至M13或fd等丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因内，并作为功能性抗体片段而展示在噬菌体粒子的表面上。由于丝状粒子包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于功能性特性而选择抗体，也成了选择编码显示这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模仿了B细胞的若干特性。噬菌体展示可以以各种方式实施。作为参考，可参考例如：Johnson，Kevin S.及Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3，564-571(1993)。在噬菌体展示中，可以使用多个V基因段供应源。
[0209] Clackson等,Nature 352:624-628(1991)从源自免疫小鼠的脾脏的V基因的较小的随机组合文库分离出了抗 唑酮抗体的多种阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因库，可以实质上按照由Mark等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-34(1993)记载的技术将针对多种阵列的抗原(包括自身抗原)的抗体分离。在天然的免疫应答中，抗体基因以高速率蓄积突变(高于体细胞性的突变)。被导入的若干变化使得赋予高度的亲和性，使表达高亲和性的表面免疫球蛋白的B细胞优先地被复制，在连续抗原攻击时发生分化。该天然的程序可以通过使用作为“链替换”而已知的技术进行模仿。Marks等,Bio/Technol.10:779-783(1992))。在该方法中，对通过噬菌体展示而得到的“原代的”人抗体的亲和性，可以通过将重链及轻链的V区基因依次取代为由未免疫供体得到的V区基因的天然变异体(库)的库而提高。利用该技术，可以实现具有pM～nM范围的亲和性的抗体及抗体片段的生产。用于制作非常大量的噬菌体抗体库(也作为“全文库的母体”而被已知)的对策记载于Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21:2265-2266(1993)中。
[0210] 在人抗体具有与起始啮齿类抗体同等程度的亲和性及特异性的情况下，也可以通过使用基因改组而由啮齿类抗体诱导人抗体。根据也参考了“表位印迹”的该方法，可通过噬菌体展示技术得到的啮齿类抗体的重链或轻链的V区基因取代为人V区基因库，从而制作出啮齿类人嵌合体。基于抗原的选择，带来可以重建功能性抗原结合位点的人可变区的分离。即，表位支配(印记)了配偶体的选择。为了取代残存的啮齿类V区而重复进行上述方法，则可得到人抗体(参考1993年4月1日公开的国际公开公报第9306213号)。与基于CDR移植的啮齿类抗体的传统人源化不同，该技术提供不具有源自啮齿类的框架或CDR残基的完全人型的抗体。上述的讨论关系到人源化抗体，但可以明确，所讨论的一般性原理可以适用于用于例如犬、猫、灵长动物、马及牛的抗体的定制。
[0211] 另外，嵌合抗体或杂合抗体还包括使用交联剂的方法，可以使用合成蛋白质化学的公知的方法在体外进行制备。例如，免疫毒素可以通过使用二硫化物交换反应或形成硫醚键而构建。作为适于该目的的试剂的例子，可列举亚氨基硫醇酯及甲基-4-巯基丁基亚胺酯。
[0212] 另外，单链Fv片段可以如Iliades等,1997,FEBS Letters,409:437-441中记载的那样地生产。使用了各种接头的这样的单链片段的耦合记载于Kortt等,1997,Protein Engineering,10:423-433中。关于抗体的重组生产及重组操作的各种技术在该技术领域中众所周知。
[0213] 进一步，上述抗体也可以与水溶性的聚合物部分结合。上述抗体还可以与聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等结合。上述抗体可以在分子上的随机位置、或分子上的预先确定的位置进行修饰，并且可以包含1个、2个或3个以上的结合部分。上述聚合物可以为任意分子量，可以为支链状或非支链状。
在某一实施方式中，上述部分经由接头与抗体结合。在某一实施方式中，上述结合部分使动物体内的抗体的循环半衰期增加。PEG等聚合物的相对于抗体的结合方法，在该技术领域中众所周知。在某一实施方式中，上述抗体为经PEG化的抗体等经PEG化的抗体。另外，上述复合体也可以进一步与不同的化疗剂、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、造影剂、毒素、生物制剂、酶抑制剂或抗体等其它药剂结合。
在某一实施方式中，上述部分经由接头与抗体结合。在某一实施方式中，上述结合部分使动物体内的抗体的循环半衰期增加。PEG等聚合物的相对于抗体的结合方法，在该技术领域中众所周知。在某一实施方式中，上述抗体为经PEG化的抗体等经PEG化的抗体。另外，上述复合体也可以进一步与不同的化疗剂、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、造影剂、毒素、生物制剂、酶抑制剂或抗体等其它药剂结合。
[0214] 2.抗体-药物复合体
[0215] 在某一实施方式中，本发明涉及上述抗体与雷公藤甲素结合形成的复合体。雷公藤甲素为IUPAC名(3bS,4aS,5aS,6R,6aR,7aS,7bS,8aS,8bS)-6-羟基-6a-异丙基-8b-甲基-3b,4,4a,6,6a,7a,7b,8b,9,10-十氢三氧杂环己烯并[6,7:8a,9:4b,5]菲并[1,2-c]呋喃-1(3H)-酮，具有下式表示的结构：
[0216] [化学式1]
[0217]
[0218] 因此，本发明的抗体-雷公藤甲素复合体可以以下式表示：
[0219] [化学式2]
[0220]
[0221] [式中，Ab表示抗体，L表示接头，n为自然数，表示与抗体结合的雷公藤甲素的数量。]
[0222] 抗体与雷公藤甲素经由接头L以共价键结合。将抗体与雷公藤甲素结合的接头L可以使用多价性的接头(例如：二价性的接头)。可以使抗体与药物结合的接头在本技术领域中为众所周知。该接头可以为分解性，或者也可以为非分解性。另外，该接头包含硫原子或不包含硫原子。例如，接头可以制成酸分解性、光分解性、肽酶分解性、酯酶分解性、二硫键还原性或疏水性。接头也可以具有例如马来酰亚胺基或卤代乙酰基作为基本骨架。
[0223] 作为接头，可列举：N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺、钠盐(磺基-GMBS)、N-[(4-马来酰亚胺甲基)环己基羰氧基]磺基琥珀酰亚胺、钠盐(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、ε-马来酰亚胺己酸N-琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯(AMSA)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMIP)、包含PEG的马来酰亚胺类的交联剂、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)、及N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。
[0224] 就成为原料的雷公藤甲素而言，为了提高保存稳定性，可以制成具有以下结构的二聚体，可以将该二聚体还原后直接使用。
[0225] [化学式3]
[0226]
[0227] 在该情况下，通过还原二聚体，可得到在各个雷公藤甲素上结合有4-氧代-4-[(2-硫代乙基)氨基]丁酸基的以下物质。
[0228] [化学式4]
[0229]
[0230] 与雷公藤甲素结合的4-氧代-4-[(2-硫代乙基)氨基]丁酸基也可以直接作为接头L使用。或者，也可以除去4-氧代-4-[(2-硫代乙基)氨基]丁酸基，仅将上述的接头作为接头L而直接与雷公藤甲素结合。或者，接头L可以为上述的2价性的接头与4-氧代-4-[(2-硫代乙基)氨基]丁酸基结合而成的基团。例如，在使用4-氧代-4-[(2-硫代乙基)氨基]丁酸及SMCC作为接头L的情况下，本发明的抗体-雷公藤甲素复合体可以以下式表示：
[0231] [化学式5]
[0232]
[0233] 与1分子抗体结合的雷公藤甲素的数量(上述式中的n)至少为1个即可，例如可以为：2或其以上、2.5或其以上、3或其以上、3.5或其以上、4或其以上、4.5或其以上、5或其以上、5.5或其以上、6或其以上、6.489或其以上、6.5或其以上、7或其以上、7.5或其以上、8或其以上、8.5或其以上、9或其以上、9.5或其以上、或者10或其以上。另外，与1分子抗体结合的雷公藤甲素的数量(上述式中的n)可以为3或其以下、3.5或其以下、4或其以下、4.5或其以下、5或其以下、5.5或其以下、6或其以下、6.5或其以下、7或其以下、7.5或其以下、8或其以下、8.5或其以下、9或其以下、9.5或其以下、或者10或其以下。或者，与1分子抗体结合的雷公藤甲素的数量可以为1～10、1～9、1～8、1～7、1～6、1～5、1～4、1～3、1～2、2～10、2～9、2～8、2～7、2～6、2～5、2～4、2～3、3～10、3～9、3～8、3～7、3～6、3～5、3～4、4～10、4～
9、4～8、4～7、4～6、4～5、5～10、5～9、5～8、5～7、5～6、6～10、6～9、6～8、6～7、7～10、7～9、7～8、8～10、8～9、9～10、或1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.489、7、7.5、8、
8.5、9、9.5或10。
9、4～8、4～7、4～6、4～5、5～10、5～9、5～8、5～7、5～6、6～10、6～9、6～8、6～7、7～10、7～9、7～8、8～10、8～9、9～10、或1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.489、7、7.5、8、
8.5、9、9.5或10。
[0234] 接头与抗体的结合通常可通过将抗体的赖氨酸残基进行酰基化而实现。雷公藤甲素相对于抗体的结合位置，只要是对抗体的特异性不产生影响的位置即可，没有特别的限定，优选结合于抗体的恒定区。
[0235] 本发明的抗体-药物复合体可以通过本领域技术人员熟知的方法制造。例如，可以在首先使抗体与接头反应而结合后，使药物(雷公藤甲素)与接头结合。具体而言，在PBS-EDTA(pH 7.5)中，于室温下使抗体与溶解于DMSO的10～50摩尔倍量的接头反应30分钟，去除未反应的接头，由此可以使接头结合至抗体。使雷公藤甲素衍生物的二聚物溶解于100％乙醇，还原2小时，将接头修饰抗体与雷公藤甲素以1:5.68的比例在PBS-EDTA pH 7.5中于室温反应一夜，由此可以得到抗体-接头-雷公藤甲素的结合物。
[0236] 3.合用剂
[0237] 本发明进一步涉及上述抗体与其它抗肿瘤剂的合用剂。作为可与上述抗体合用的抗肿瘤剂，可列举包含环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、噻替派等氮芥(Nitrogen mustard)类、及尼莫斯汀、雷莫斯汀、氮烯咪胺、甲基苄肼、替莫唑胺、卡氮芥(Carmustine)、链脲霉素、苯达莫司汀(bendamustine)等硝基脲类的烷化剂；顺氯氨铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等铂化合物；依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟(carmofur)、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷烷磷酯(Cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟-氧嗪酸钾(oteracil potassium)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、Nelarabine、羟基脲、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯基嘌呤、甲氨蝶呤等代谢拮抗药；依立替康、依托泊苷、Eribulin、索布佐生、多西他赛、拓扑替康、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春碱等植物生物碱或微管抑制剂；放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁(zinostatin)、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博莱霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、脂质体多柔比星等抗癌性抗生素；Sipuleucel-T等癌症疫苗；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊马替尼、依维莫司、厄洛替尼、吉非替尼、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕尼单抗、贝伐珠单抗、硼替佐米、拉帕替尼、利妥昔单抗等分子靶向药物；
阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、乙炔雌二醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚(phosphestrol)、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、来曲唑等激素制剂；干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干燥BCG、香菇多糖等生物反应调节剂，优选为顺氯氨铂、培美曲塞、吉西他滨，更优选为吉西他滨。
阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、乙炔雌二醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚(phosphestrol)、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、来曲唑等激素制剂；干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干燥BCG、香菇多糖等生物反应调节剂，优选为顺氯氨铂、培美曲塞、吉西他滨，更优选为吉西他滨。
[0238] 本发明的合用剂(含有2种以上药剂的药物组合物)可以在一个制剂中含有所合用的2种以上中的全部或部分药剂，也可以以合用为目的而以单独含有各个药剂的制剂的形式提供。或者，本发明的合用剂也可以针对所合用的2种以上中的全部或部分药剂，以用于具备单独含有各个药剂的制剂的合用的试剂盒形式提供。
[0239] 4.用途
[0240] 本发明的复合体或合用剂在包括治疗方法、恶性细胞的溶解方法的各种适用中有用，但不限于这些。例如，本发明包括：含有本发明的复合体或合用剂作为有效成分的药物组合物、恶性间皮瘤治疗药、恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂、恶性间皮瘤细胞的溶解剂。或者，本发明可以为用于制成药物组合物、恶性间皮瘤治疗药、恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂、恶性间皮瘤细胞的溶解剂使用的本发明的复合体或合用剂。或者，本发明可以为本发明的复合体的用于药物组合物、恶性间皮瘤治疗药、恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂、恶性间皮瘤细胞的溶解剂的制造的用途，或抗CD26抗体及抗肿瘤剂的用于药物组合物、恶性间皮瘤治疗药、恶性间皮瘤细胞的增殖抑制剂、恶性间皮瘤细胞的溶解剂的制造的用途。在一种实施方式中，本发明包括恶性间皮瘤的治疗方法、恶性间皮瘤细胞的增殖抑制方法、恶性间皮瘤细胞的溶解方法，其具备将有效量的本发明的复合体或合用剂给药于需要其的患者。因此，本发明也提供抑制CD26表达细胞的增殖的方法。CD26表达细胞的增殖抑制包括包含部分的增殖抑制或完全的增殖抑制的可观察到的所有水平的抑制。在某一实施方式中，细胞增殖被抑制至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％。本方法可以在体外或体内进行。在某一实施方式中，方法包括使细胞与本说明书中记载的复合体或合用剂接触的工序。一般而言，使对于抑制细胞增殖而言足够量的复合体或合用剂与细胞接触。
[0241] 在某一实施方式中，CD26表达细胞为哺乳类细胞，优选为人细胞。在某一实施方式中，CD26表达细胞为癌细胞。在某一实施方式中，CD26表达细胞为恶性间皮瘤、肺癌、肾癌、肝癌或其它伴有CD26的表达的恶性肿瘤。在某一实施方式中，肿瘤细胞为恶性或良性。
[0242] 评价细胞增殖的抑制的方法在该领域中公知，可列举MTT测定(参考例如：Aytac等(2003)British Journal of Cancer 88：455-462，Ho等(2001)Clinical Cancer Research 7：2031-2040，Hansen等(1989)J.Immunol.Methods，119：203-210，及Aytac等(2001)Cancer Res 61：7204-7210。)。
[0243] 进一步，本发明提供对象的与CD26表达相关的状态的治疗方法。对象的与CD26表达相关的状态的治疗法包括：将包含本说明书中记载的复合体或合用剂的有效量的组合物给药于对象。与CD26表达相关的状态也可以与CD26的异常表达相关。与CD26表达相关的状态可以为：与CD26表达的变化或异常(在某一实施方式中，为CD26表达量的增加或减少(与正常样品比较)，和/或不适当的表达，例如在通常不表达CD26的组织和/或细胞内的表达、或在通常表达CD26的组织或细胞内的CD26表达的缺陷)相关的状态。与CD26的表达相关的状态可以为与CD26的过表达相关的状态。与CD26表达相关的状态可以至少部分由CD26介导，可以是与CD26表达细胞相关的状态、或者可以是确定了CD26表达细胞的增殖异常的状态。CD26表达细胞可以为T细胞或肿瘤细胞，该肿瘤细胞可以为恶性或良性。
[0244] 对象中的与CD26表达相关的状态包括增殖性疾病，特别是癌症。癌症为恶性间皮瘤、肺癌、肾癌、肝癌或其它伴有CD26的表达的恶性肿瘤。
[0245] 本说明书中记载的方法(包括治疗方法)可以通过向单一部位或者多个部位在单一时间点或者多个时间点的单次直接注射而实施。另外，给药可以基本同时对多个部位进行。给药频率在治疗过程的基础上确定及调整，完成基于所期望的结果。根据情况不同，本发明的复合体或合用剂及药物组合物的持续缓释制剂可以是适宜的。用于实现缓释的各种制剂、装置在该领域中众所周知。
[0247] 复合体或合用剂优选以包含载体(优选为药学上可接受的载体)的状态给药于哺乳动物。适当的载体及它们的制剂记载于Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990年及Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing，2000年中。通常，将合适量的药学上可接受的盐使用于制剂，由此使该制剂变得具有等渗性。作为载体的例子，可列举生理盐水、林格氏液及葡萄糖溶液。这些溶液的pH优选为约5～约8，更优选为约7～约7.5。进一步，作为载体，可列举含有抗体的固体的由疏水性聚合物制的半透性基质等缓释制剂，其基质处于例如：膜、脂质体或微粒等成形品的形态。例如，本领域技术人员应该明确的是，依赖于所给药的抗体的给药路径及浓度，存在更优选某种不同种类的载体的情况。
[0248] 复合体或合用剂可以通过向哺乳动物注射(例如：全身、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、门静脉内)而给药，或者可以通过确保以有效的形态向血流进行递送的其它方法(例如：注入)而给药。为了在局部获得治疗效果，复合体或合用剂也可以利用组织内分离灌注等分离灌注法进行给药。优选静脉注射。
[0249] 可根据经验确定用于给药本发明的复合体或合用剂的有效用量及日程表，这样的确定方法在该技术领域的技术常识的范围内。本领域技术人员应该理解的是：应给药的复合体或合用剂的用量依赖于例如接种复合体或合用剂的哺乳动物、给药路径、使用的抗体的具体种类及对上述哺乳动物给药的其它药剂而发生变化。单独使用的复合体或合用剂的每1天的典型的给药量(依上述的要素不同而不同)可以为从每1天约1μg/体重kg到100mg/体重kg或其以上的范围。一般而言，可以使用以下任意给药量：至少约50mg/体重kg；至少约10mg/体重kg；至少约3mg/体重kg；至少约1mg/体重kg；至少约750μg/体重kg；至少约500μg/体重kg；至少约250μg/体重kg；至少约100μg/体重kg；至少约50μg/体重kg；至少约10μg/体重kg；至少约1μg/体重kg的给药量，或给药高于至少约1μg/体重kg的给药量。
[0250] 复合体或合用剂可以进一步与有效量的其它1种以上治疗药合用而给药于哺乳动物。复合体或合用剂可以连续或同时与其它1种以上治疗药进行给药。复合体或合用剂及治疗药的量依赖于例如：使用何种药剂、治疗的病理学状态、及给药日程表及给药路径，一般地，可使给药量为比假定分别使用该复合体或合用剂及该治疗药的情况更少的量。
[0251] 对哺乳动物给药复合体或合用剂之后的哺乳动物的生理状态可以通过本领域技术人员众所周知的各种方法进行监测。
[0252] 5.通过与抗CD26抗体合用而显示协同效果的化合物的筛选方法
[0253] 在其它的实施方式中，本发明涉及通过与抗CD26抗体合用而显示协同效果的化合物的筛选方法。本发明的筛选方法基于使CD26与CD9进行相互作用、并互相响应(counter)(Okamoto等，PLOS One(2014)9(1)：e86671)。在候选化疗剂与CD26相互作用的情况下，由于其效果被CD9减弱，因此在增殖抑制效果在共表达CD26和CD9的细胞株与表达CD26而不表达CD9的细胞株之间存在差异的情况下，可以确定为通过与抗CD26抗体合用而显示协同效果的药物。具体而言，本发明的筛选方法如下。
[0254] 为通过与抗CD26抗体合用而显示协同性的抗肿瘤效果的化合物的筛选方法，其具备以下步骤：
[0255] (a)在受试化合物的存在下培养共表达CD26和CD9的肿瘤细胞株、及表达CD26而不表达CD9的细胞株的步骤；
[0256] (b)测定培养后的上述各个肿瘤细胞株的细胞数的步骤；
[0257] (c)计算上述受试化合物的共表达CD26和CD9的肿瘤细胞株的增殖抑制效果、以及上述受试化合物的表达CD26而不表达CD9的细胞株的增殖抑制效果的步骤；
[0258] (d)将上述受试化合物的共表达CD26和CD9的肿瘤细胞株的增殖抑制效果、及上述受试化合物的表达CD26而不表达CD9的细胞株的增殖抑制效果加以比较，在表达CD26而不表达CD9的细胞株的增殖抑制效果更为优异的情况下，选择上述受试化合物作为通过与抗CD26抗体合用而显示协同抗肿瘤效果的可能性高的化合物的步骤。
[0259] 在本方法中，作为共表达CD26和CD9的肿瘤细胞株，可以使用间皮瘤细胞株MESO1、H2452。另外，作为表达CD26而不表达CD9的细胞株，可以使用JMN、H226。
[0260] 就测定肿瘤细胞株的细胞数的步骤而言，只要是可得到反映细胞数的测定值的方法即可，可以采用公知的所有方法，例如，也可以代替细胞数而采用以浊度、MTT测定的测定值等可作为细胞数的指标的其它数值。
[0261] 肿瘤细胞株的增殖抑制效果可以作为将对照作为100的情况下的细胞数而进行计算，也可以计算出IC50等可作为药效指标的数值。增殖抑制效果是否优异，可以将被增殖抑制的细胞数较多的情况判定为增殖抑制效果优异。
[0262] 以下，为了更具体地对本发明进行说明而给出实施例，但本发明不受其限制。需要说明的是，整个本说明书中引用的全部文献通过参考直接并入本说明书中。
[0263] (实施例1)抗体-药物的结合
[0264] (1)原料
[0265] 人源化抗CD26抗体YS110是通过已有报道的方法、以抗CD26小鼠抗体14D10为基础进行设计并使其表达的(参考国际公开公报WO2007/014169)；Inamoto T等，Clin Cancer Res(2007)13:4191-200)。具有以下结构的雷公藤甲素(triptolide)(分子式：C20H24O6；MW＝360.4)从Shaanxi Taiji Technology(陕西省，中国)购入。
[0266] [化学式6]
[0267]
[0268] (2)结合方案
[0269] 由ChemGenesis Inc.(东京，日本)向雷公藤甲素导入SH基。将得到的雷公藤甲素衍生物命名为TR1。对于TR1，为了提高其化学稳定性，以具有以下结构的以S-S键结合而成的二聚体形式提供。
[0270] [化学式7]
[0271]
[0272] 将作为异型二价性接头的SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)(产品目录编号21857，Themo Scientific Inc.，Waltham，MA)、GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯)(产品目录编号22309，Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)、SMCC(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)(产品目录编号22360，Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)在即将使用前溶解于DMSO。YS110在PBS-EDTA(pH 7.5)中，于室温下与异型二价性接头SPDP(15摩尔倍量)、GMBS(30摩尔倍量)或SMCC(20摩尔倍量)反应30分钟而进行了修饰。利用HiTrap Desalting柱(产品目录编号21857，GE Healthcare Inc.，Buckinghamshire，UK)除去未反应的接头。使雷公藤甲素衍生物TR1S-S二聚物溶解于100％乙醇，利用固定化TCEP还原凝胶(TCEP Reducing Gel)(产品目录编号77712，Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)进行2小时还原。利用DTNB((5,5-二硫-双-(2-硝基苯甲酸))测定了经还原的TR1-SH的SH基的浓度。将接头修饰YS110与TR1-SH以1:5.68的比例在PBS-EDTA pH 7.5中于室温反应一夜。利用PD10柱(产品目录编号17085101，CGE
Healthcare Inc.，Buckinghamshire，UK)除去未反应的TR1-SH。本反应的概要如下所述。
Healthcare Inc.，Buckinghamshire，UK)除去未反应的TR1-SH。本反应的概要如下所述。
[0273] [化学式8]
[0274]
[0275] 对得到的产物使用Millex-GV Filter Unit 0.22um(Cat no.SLGV 013SL，EMD Millipore，Billerica，MA)进行过滤器灭菌，使用BCA protein assay reagent kit(产品目录编号23225，Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)测定了最终浓度。利用DTNB分析测定了产物中未结合的残余的TR1-SH。
[0276] (3)结果
[0277] 按照上述方法、使用异型二价性接头(SPDP、GMBS、SMCC)使YS110与TR1结合。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA protein assay reagent kit)(Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)测定的最终产物浓度为约1mg/ml。通过DTNB分析测定了产物中的残存非结合TR1-SH，但几乎未能检测到(数据未图示)。
[0278] (实施例2)细胞培养
[0279] 向CD26阴性恶性间皮瘤细胞株MSTO-211H(MSTO)(American Type Cell Culture Collection，Manassas，VA)导入CD26基因，命名为MSTO-clone12(Aoe K等，Clin Cancer Res.(2012)18:1447-56)。向CD26阴性T细胞类白血病细胞株Jurkat(American Type Cell Culture Collection，Manassas，VA)导入CD26基因，命名为Jurkat CD26(+)(Tanaka T等，Proc Natl Acad Sci USA(1993)90：4586-90)。由恶性间皮瘤建立的CD26阳性细胞株JMN由东京大学医科学研究所的森本几夫先生提供。全部细胞株在含有10％热灭活胎牛血清(FBS，Life Technologies，Carlsbad，CA)、ABPC(100μg/ml)及链霉素(100μg/ml)的RPMI培养基(产品目录编号11875-093，Life Technologies，Carlsbad，CA)中，于37℃、5％CO2环境中进行了培养。
[0280] (实施例3)质谱测定
[0281] 在超滤之后，使用Autoflex III(Bruker Corporation，Billerica，MA)、通过基质辅助激光解吸电离法(MALDI-TOFmass)分析了Y-TR1的药剂/抗体比例。
[0282] 利用MALDI-TOF质谱而分析的非结合YS110及Y-TR1(SMCC)的完整质量分别为147012.7及151815.6(图1)。与抗体结合的TR1及SMCC基的推定分子量为739.6。基于该分子量，与1分子的YS110结合的TR1-SMCC基的平均值可以利用{(151815.6-147012.7)/739.6}的计算式进行计算，其结果为6.489。这意味着平均6.489个分子的TR-1分子与1个分子的YS110发生结合。
[0283] (实施例4)结合分析
[0284] 为了考察Y-TR1的CD26阳性恶性间皮瘤细胞结合，回收了培养的MSTO-wt细胞(CD26阴性)及MSTO-clone12细胞(CD26阳性)，与1×106细胞1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的Y-TR1共同于4℃培养30分钟。将细胞洗涤3次，以1：100稀释而与FITC结合兔抗人IgG(产品目录编号6140-02，Southern Biotech，Birmingham，AL)共同于4℃培养30分钟。洗涤3次后，使用Epics XL-MCL(Beckman Coulter，Brea，CA)进行了FACS分析。
[0285] 通过流式细胞分析确认了Y-TR1与CD26阳性恶性间皮瘤细胞株MSTO clone12的完整的结合(图2)。
[0286] (实施例5)细胞毒性测定
[0287] 基于甲臜色素的比色检测，使用colorimetric cell proliferation kit(比色细胞增殖试剂盒)WST-1(产品目录编号11644807001，Roche Applied Science，Rotkreuz，Switzerland)测定了雷公藤甲素、YS110及Y-TR1对恶性间皮瘤细胞株及T细胞类白血病细3
胞株的细胞毒性。作为概略，将5×10细胞的MSTO-wt，MSTO-clone12、JMN、Jurkat CD26(-)及Jurkat CD26(+)细胞，在含有10％热灭活胎牛血清、ABPC(100μg/ml)及链霉素(100μg/ml)的RPMI培养基中，在96孔板内与雷公藤甲素(0～100nM)、TR1(0～100nM)、YS110(0～100μg/ml)或Y-TR1(0～100ug/ml)共同于37℃、5％CO2环境中培养48小时。WST-1测定依照制造者提供的指南实施。从各样品在450nm下的测定值减去在630nm下的背景吸光度。实验以一式三份进行，示出了代表性的结果。
胞株的细胞毒性。作为概略，将5×10细胞的MSTO-wt，MSTO-clone12、JMN、Jurkat CD26(-)及Jurkat CD26(+)细胞，在含有10％热灭活胎牛血清、ABPC(100μg/ml)及链霉素(100μg/ml)的RPMI培养基中，在96孔板内与雷公藤甲素(0～100nM)、TR1(0～100nM)、YS110(0～100μg/ml)或Y-TR1(0～100ug/ml)共同于37℃、5％CO2环境中培养48小时。WST-1测定依照制造者提供的指南实施。从各样品在450nm下的测定值减去在630nm下的背景吸光度。实验以一式三份进行，示出了代表性的结果。
[0288] 如图3所示，在处理48小时后，雷公藤甲素对于恶性间皮瘤细胞株MSTO-wt、MSTO-clone12、JMN及T细胞类白血病细胞株Jurkat、Jurkat CD26(+)显示了剂量依赖性毒性效果。将雷公藤甲素对这些细胞株的IC50值示于表4。
[0289] 将同样地试验了设计为用于与接头结合的雷公藤甲素衍生物TR1的细胞毒性及IC50值的结果示于图4及表4。TR1在测定前通过固定化TR-1TCEP还原凝胶(TCEP Reducing Gel)(Thermo Scientific Inc.，Waltham，MA)、由SS二聚体还原。
[0290] 对于CD26阳性恶性间皮瘤细胞株及白血病细胞株，Y-TR1显示了剂量依赖性细胞毒性(图5)。在3种接头(SPDP、GMBS及SMCC)间比较了Y-TR1对CD26阳性恶性间皮瘤细胞株MSTO clone12的细胞毒性(图5A)。进行了3种异型二价性接头间的比较，结果为：对于MSTO clone 12，使用了SPDP、GMBS及SMCC的Y-TR1的IC50值分别为38μg/ml、18μg/ml及15μg/ml(表5)。在本实验中，通过SMCC结合的Y-TR1显示出了最优异的细胞毒性，因此在后续的实验中使用了Y-TR1(SMCC)。将Y-TR1对CD26阳性或CD26阴性恶性间皮瘤细胞株及白血病细胞株的细胞毒性与非结合YS110进行了比较(图5A、B)。将Y-TR1(SMCC)对各种细胞株的IC50值示于表4。相对于CD26阳性细胞(MSTO clone12、JMN、Jurkat CD26(+))，与YS110相比，Y-TR1显示出了更显更高的细胞毒性。与相应的CD26阴性细胞(MSTO wt、Jurkat CD26(-))相比，CD26阳性细胞株(MSTO clone12、Jurkat CD26(+))对Y-TR1细胞毒性的灵敏度更高(图5C、D)。由Y-TR1(约15μg/ml＝99nM)及非结合TR-1(250nM)的IC50值计算相当于Y-TR1的游离的TR-1的对MSTO clone12细胞株的结果，1分子的Y-TR1相当于2.5分子的TR1(图6)。由此可确认，通过与抗CD26抗体YS110结合，雷公藤甲素每一分子对间皮瘤细胞株的细胞毒性作用显著增大。由此显示，能够以更少的给药量治疗恶性间皮瘤。
[0291] [表4]
[0292]
[0293] [表5]
[0294]偶联物 IC50(ug/ml)
Y-TR1SPDP 35
Y-TR1GMBS 18
Y-TR1SMCC 15
Y-TR1SPDP 35
Y-TR1GMBS 18
Y-TR1SMCC 15
[0295] (实施例6)体内效果测定及毒性研究
[0296] 将NOD/SCID(NOD/LtSz-scid)小鼠保持在无特定病原体(SPF)设施内的微型隔离笼中，允许自由摄取灭菌食料及灭菌水。动物实验计划是在得到了动物实验委员会的认可而进行。
[0297] 将1×107细胞的培养JMN细胞对6-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠进行皮下给药。将共计30只动物随机分成3种治疗组，即：对照组、YS110给药组、及Y-TR1给药组。从移植日开始，YS110及Y-TR1组向腹膜内每周3次给药4mg/kg/dose的YS110或Y-TR1，共计给药9次。对照组给药了相同量的PBS。在肉眼可明确观察到肿瘤的时间点切除肿瘤，利用游标卡尺测量大小。推定肿瘤体积利用式：π/6×L×W×W计算而求出(Tomayko MM等，Cancer Chemother Pharmacol.(1989)24：148-54)。各组的平均肿瘤体积间的统计显著性使用了Fisher的PLSD多重比较法(Fisher’s protected least-square differences(PLSD)multiple comparison test)确定。统计分析使用SPSS软件(IBM，Armonk，NY)进行。
[0298] 使用了CD26阳性恶性间皮瘤细胞株JMN的NOD/SCID小鼠异种移植模型中的Y-TR1相比于非结合YS110的体内有效性的结果示于图7。对于利用椭球体积公式(π/6×L×W×H)(Tomayko MM等，Cancer Chemother Pharmacol.(1989)24:148-54)推定的第55天的平均肿瘤体积，使用Fisher的PLSD多重比较法(Fisher’s protected least-square differences(PLSD)multiple comparison test)在3组(对照、YS110、Y-TR1)间进行了比较。与对照组及YS110给药组相比，Y-TR1给药组(腹膜内共计给药36mg/kg的Y-TR1)的平均肿瘤体积显著降低(p＜0.05)。Two of the nine Y-TR1给药组的9只小鼠中的2只，在实验结束时(第55天)以肉眼确认了完全的肿瘤增殖抑制。图7示出了2次得到的相同的实验结果中的代表的一例。实验结束时的各组小鼠的平均体重没有显著不同。
[0299] (实施例7)间皮瘤细胞株中的CD26的表达的确认
[0300] 通过FACS测定并确认了间皮瘤细胞株中的CD26表达。在CD26阳性间皮瘤细胞株中，使用了作为肉瘤型间皮瘤细胞株的ACC-MESO1、JMN，作为上皮型间皮瘤细胞株的NCI-H2452、NCI-H226。利用抗CD26单克隆抗体-FITC对ACC-MESO1、JMN、NCI-H2452、NCI-H226细胞进行染色之后进行了FACS分析。
[0301] 将结果示于图8。在实验的全部细胞株中确认到了CD26的表达。
[0302] (实施例8)间皮瘤细胞中的顺氯氨铂-培美曲塞与YS110的合用带来的细胞增殖抑制效果的增强
[0303] (1)顺氯氨铂及培美曲塞的剂量-作用曲线
[0304] 将MESO1、H2452细胞(2×103/孔)播种于96孔板1小时后，以10-9、10-8、10-7、10-6、-5 -410 、10 M添加了顺氯氨铂或培美曲塞(n＝6)。在第2天进行了MTT分析。
[0305] 将结果示于图9。顺氯氨铂及培美曲塞呈剂量依赖性地抑制了MESO1、H2452的增殖。
[0306] (2)基于YS110的顺氯氨铂及培美曲塞的MESO1细胞增殖抑制效果的增强
[0307] 将MESO1细胞(2×103/孔)播种于96孔板1小时后，添加了顺氯氨铂0.3、3、10μM与YS110的0.1、3、10μg/ml的组合，或培美曲塞0.03、0.3、1μM与YS110的0.1、3、10μg/ml的组合。在第2天进行MTT分析。使用双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0308] 将结果示于图10。YS110增强了顺氯氨铂及培美曲塞的细胞增殖抑制效果。
[0309] 培美曲塞
[0310] (3)基于YS110的顺氯氨铂及培美曲塞的H2452细胞增殖抑制效果的增强
[0311] 将H2452细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，添加了顺氯氨铂0.03、0.3、1μM与YS110的0.1、3、10μg/ml的组合，或培美曲塞0.01、0.1、0.3μM与YS110的0.1、3、10μg/ml的组合(n＝6)。在第2天进行MTT分析。使用双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0312] 将结果示于图11。YS110增强了顺氯氨铂及培美曲塞的细胞增殖抑制效果。
[0313] (4)基于YS110的顺氯氨铂-培美曲塞合用的MESO1细胞增殖抑制效果增强
[0314] 将MESO1细胞(2×103细胞/孔)或H2452细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，添加了顺氯氨铂0.3μM-培美曲塞0.1μM的组合，或将YS110(10μg/ml)追加于顺氯氨铂0.3μM-培美曲塞0.1μM中而成的组合(n＝6)。在第2天进行MTT分析。使用双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0315] 将结果示于图12。YS110增强了顺氯氨铂-培美曲塞的细胞增殖抑制效果。
[0316] (5)基于YS110的顺氯氨铂及培美曲塞的JMN细胞体内增殖抑制效果的增强
[0317] 将JMN细胞(3×105细胞/只)移植至雌性SCID小鼠的背部皮下。将移植之日作为第0天，于第1天和第4天共2次，腹膜内给药了YS110(10mg/kg)单独、顺氯氨铂(0.5mg/kg)单独、培美曲塞(50mg/kg)单独、顺氯氨铂(0.5mg/kg)与YS110(10mg/kg)的合用、或培美曲塞(50mg/kg)与YS110(10mg/kg)的合用。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0318] 将结果示于图13。YS110增强了顺氯氨铂及培美曲塞的体内的肿瘤增殖抑制效果。
[0319] (6)基于YS110的顺氯氨铂-培美曲塞合用的JMN细胞体内增殖抑制效果的增强[0320] 将JMN细胞(5×103细胞/只)移植至雌性SCID小鼠的背部皮下。将移植之日作为第0天，于第1天和第4天共2次，腹膜内给药了顺氯氨铂(0.5mg/kg)-培美曲塞(50mg/kg)合用、YS110(10mg/kg)单独、或上述顺氯氨铂-培美曲塞合用与YS110(10mg/kg)的合用。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0321] 将结果示于图14。YS110增强了顺氯氨铂-培美曲塞的体内的肿瘤增殖抑制效果。
[0322] (7)基于YS110的顺氯氨铂-培美曲塞合用的MESO1细胞体内增殖抑制效果的增强[0323] 将MESO1细胞(3×105细胞/只)移植至雌性SCID小鼠的背部皮下。将移植之日作为第0天，于第1天和第4天共2次，腹膜内给药了YS110(10mg/kg)单独、顺氯氨铂(0.5mg/kg)-培美曲塞(50mg/kg)合用、或上述顺氯氨铂-培美曲塞合用与YS110(10mg/kg)的合用。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0324] 将结果示于图15。YS110在MESO1细胞中增强了顺氯氨铂-培美曲塞的体内的肿瘤增殖抑制效果。
[0325] (8)基于YS110的顺氯氨铂-培美曲塞合用的H2452细胞体内增殖抑制效果的增强[0326] 将H2452细胞(3×105细胞/只)移植至雌性SCID小鼠的背部皮下。将移植之日作为第0天，于第1天和第4天共2次，腹膜内给药了YS110(10mg/kg)单独、顺氯氨铂(0.5mg/kg)-培美曲塞(50mg/kg)合用、或上述顺氯氨铂-培美曲塞合用与YS110(10mg/kg)的合用。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0327] 将结果示于图16。YS110在H2452细胞中增强了顺氯氨铂-培美曲塞的在体内的肿瘤增殖抑制效果。
[0328] (实施例9)间皮瘤细胞中顺氯氨铂-培美曲塞与YS110的合用带来的细胞浸润抑制效果的增强
[0329] (1)顺氯氨铂及培美曲塞对细胞浸润的作用
[0330] 将MESO1细胞或H2452细胞(2.5×104细胞/孔)播种于Boyden小室1小时后，添加了顺氯氨铂(5、10、30μM)或培美曲塞(1、10、30μM)(n＝5)，进行了Boyden小室侵袭分析。自细胞接种开始的24小时后利用Diff-Qick染色试剂盒对浸润细胞进行染色。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0331] 将结果示于图17。顺氯氨铂在10及30μM下抑制了侵袭。另一方面，培美曲塞即使在30μM下也没有对侵袭显示抑制作用。
[0332] (2)顺氯氨铂-培美曲塞合用的细胞浸润抑制效果
[0333] 将MESO1细胞或H2452细胞(2.5×104细胞/孔)播种于Boyden小室1小时后，添加了顺氯氨铂(0、3、10μM)和培美曲塞(0、10、30μM)的组合(n＝5)，进行了Boyden小室侵袭分析。自细胞接种开始的24小时后利用Diff-Qick染色试剂盒对浸润细胞进行染色。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0334] 将结果示于图18。顺氯氨铂在10μM想抑制了细胞浸润，但培美曲塞在30μM想也没有增强基于顺氯氨铂的细胞浸润抑制效果。因此，即使将顺氯氨铂与培美曲塞组合，也没有使对细胞浸润的抑制效果增强，这表示对于细胞浸润，顺氯氨铂和顺氯氨铂-培美曲塞是同等的。
[0335] (3)YS110在MESO1细胞中增强顺氯氨铂的细胞浸润抑制效果
[0336] 将MESO1细胞(2.5×104细胞/孔)播种于Boyden小室，1小时后添加了顺氯氨铂(0、3、10μM)与YS110(0、10、20μg/ml)的组合(n＝5)，进行了Boyden小室侵袭分析。自细胞接种开始的24小时后利用Diff-Qick染色试剂盒对浸润细胞进行染色。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。接着研究了YS110和顺氯氨铂-培美曲塞的合用中的相互作用。
相互作用利用Two-way ANOVA进行了分析。
相互作用利用Two-way ANOVA进行了分析。
[0337] 将结果示于图19。YS110增强了顺氯氨铂-培美曲塞的细胞浸润抑制作用(A)。在YS110(10μg/ml)+顺氯氨铂(10μM)及YS110(20μg/ml)+顺氯氨铂(10μM)的组合中存在相互作用(B)。
[0338] (4)YS110在H2452细胞中增强顺氯氨铂的细胞浸润抑制效果
[0339] 将H2452细胞(2.5×104细胞/孔)播种于Boyden小室，1小时后添加了顺氯氨铂(0、3、10μM)与YS110(0、10、20μg/ml)的组合(n＝5)，进行了Boyden小室侵袭分析。自细胞接种开始的24小时后利用Diff-Qick染色试剂盒对浸润细胞进行染色。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。接着研究了YS110和顺氯氨铂-培美曲塞的合用中的相互作用。
相互作用利用Two-way ANOVA进行了分析。
相互作用利用Two-way ANOVA进行了分析。
[0340] 将结果示于图20。YS110协同性地增强了顺氯氨铂-培美曲塞的细胞浸润抑制作用(A)。在YS110(10μg/ml)+顺氯氨铂(10μM)及YS110(20μg/ml)+顺氯氨铂(10μM)的组合中存在相互作用(B)。
[0341] (实施例10)间皮瘤细胞中的吉西他滨与YS110的合用
[0342] (1)间皮瘤细胞株中的吉西他滨的剂量-作用曲线
[0343] 研究了吉西他滨对间皮瘤细胞株的增殖的效果。将间皮瘤细胞株MESO1、JMN、H2452、H226(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，添加了吉西他滨(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4M)(N＝6)。2天后进行了MTT分析。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0344] 将结果示于图21。吉西他滨在JMN、H226中更强地抑制了增殖。
[0345] (2)YS110与吉西他滨对肉瘤型间皮瘤MESO1细胞增殖的合用效果
[0346] 将MESO1细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，组合添加了吉西他滨(0、10-8、3×10-8、10-7M)与YS110(0、1、3、10μg/ml)。在第2天进行MTT分析。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。接着研究了药物合用中的相互作用(n＝6)。YS110与吉西他滨的合用中的相互作用利用Two-way ANOVA分析。
[0347] 将结果示于图22。吉西他滨的增殖抑制效果被YS110增强(A)。另外，在吉西他滨(10-8M)与YS110(3μg/ml)的组合中确认到了相互作用(B)。
[0348] (3)YS110与吉西他滨对肉瘤型间皮瘤JMN细胞增殖的合用效果
[0349] 将JMN细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，组合添加了吉西他滨(0、3×10-10、10-9、3×10-8M)与YS110(0、1、3、10μg/ml)。在第2天进行MTT分析。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。接着研究了药物合用中的相互作用(n＝6)。YS110与吉西他滨的合用中的相互作用利用Two-way ANOVA分析。
[0350] 将结果示于图23。吉西他滨的增殖抑制效果被YS110增强(A)。另外，在吉西他滨(3×10-8M)与YS110(3μg/ml)、及吉西他滨(3×10-8M)与YS110(10μg/ml)的组合中确认到了相互作用(B)。
[0351] (4)YS110与吉西他滨对上皮型间皮瘤H2452细胞增殖的合用效果
[0352] 将H2452细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，组合添加了吉西他滨(0、10-8、3×10-8、10-7M)与YS110(0、1、3、10μg/ml)。在第2天进行MTT分析。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。接着研究了药物合用中的相互作用(n＝6)。YS110与吉西他滨的合用中的相互作用利用Two-way ANOVA分析。
[0353] 将结果示于图24。吉西他滨的增殖抑制效果被YS110增强(A)。另外，在吉西他滨(10-7M)与YS110(3μg/ml)的组合中确认到了相互作用(B)。
[0354] (5)YS110与吉西他滨对上皮型间皮瘤H226细胞增殖的合用效果
[0355] 将H226细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，组合添加了吉西他滨(0、10-8 -8 -7、3×10 、10 M)与YS110(0、1、3、10μg/ml)。在第2天进行MTT分析。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。接着研究了药物合用中的相互作用(n＝6)。YS110与吉西他滨的合用中的相互作用利用Two-way ANOVA分析。
[0356] 将结果示于图25。吉西他滨的增殖抑制效果被YS110增强(A)。另外，在吉西他滨-8(10-8M)与YS110(3μg/ml)的组合、吉西他滨(3×10 M)与YS110(3μg/ml)的组合、吉西他滨(3×10-8M)与YS110(10μg/ml)的组合中确认到了相互作用(B)。
[0357] (6)吉西他滨相对于标准疗法顺氯氨铂-培美曲塞的合用
[0358] 将MESO1、JMN、H2452及H226细胞(2×103细胞/孔)播种于96孔板1小时后，在顺氯氨铂(0、0.1、0.3、1μM)与培美曲塞(0、0.03、0.1、0.3μM)的组合中合用并添加了吉西他滨3×10-8M或10-7M(n＝6)。在第2天进行MTT分析。
[0359] 将结果示于图26。吉西他滨相对于顺氯氨铂-培美曲塞的组合的合用没有增强顺氯氨铂-培美曲塞的增殖抑制作用。
[0360] (7)针对上皮型间皮瘤细胞H226的体内增殖的YS110与吉西他滨的合用
[0361] 将H226移植至雌性SCID小鼠背部皮下(3.8×105细胞/只)。将移植之日作为第0天，于第2天和第4天共2次，腹膜内给药了YS110(10mg/kg)、吉西他滨(20mg/kg)、或YS110(10mg/kg)+吉西他滨(20mg/kg)(n＝6)。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。YS110与吉西他滨的合用中的相互作用利用Two-way ANOVA分析。
[0362] 将结果示于图27。YS110单独、吉西他滨单独、YS110+吉西他滨的各组分别显示了34％、29％及88％的抑制效果，分别显示了显著的抑制效果。另外，在YS110与吉西他滨的合用中确认了相互作用。
[0363] (8)针对肉瘤型间皮瘤细胞JMN的体内增殖的YS110与吉西他滨的合用
[0364] 将H226细胞移植至雌性SCID小鼠的背部皮下(3×105细胞/只)。将移植之日作为第0天，于第2天和第4天共2次，腹膜内给药了YS110(10mg/kg)、吉西他滨(10mg/kg)、或YS110(10mg/kg)+吉西他滨(10mg/kg)(n＝6)。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。YS110与吉西他滨的合用中的相互作用利用Two-way ANOVA分析。
[0365] 将结果示于图28。YS110单独、吉西他滨单独、YS110+吉西他滨的各组分别显示了34％、29％及88％的抑制效果，分别显示了显著的抑制效果。另外，在YS110与吉西他滨的合用中确认了相互作用。
[0366] (实施例11)针对CD26阳性肺癌细胞株的体内增殖的与YS110的合用(1)针对CD26阳性肺癌细胞株HCC827的体内增殖的YS110和顺氯氨铂-培美曲塞的合用
[0367] 将HCC827细胞移植至雌性SCID小鼠的背部皮下(1.8×105细胞/只)。将移植之日作为第0天，在第1天向腹膜内给药了YS110(10mg/kg)单独、顺氯氨铂(0.5mg/kg)+培美曲塞(50mg/kg)、或YS110(10mg/kg)+顺氯氨铂(0.5mg/kg)+培美曲塞(50mg/kg)，在第4天以相同量、相同方法给药了与第1天相同的药剂(n＝6)。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0368] 将结果示于图29。YS110增强了顺氯氨铂-培美曲塞的效果。
[0369] (2)针对CD26阳性肺癌细胞株HCC4006细胞的体内增殖的YS110与吉非替尼的合用[0370] 将HCC827细胞移植至雌性SCID小鼠的背部皮下(0.5×105细胞/只)。将移植之日作为第0天，于第1天和第4天共2次，给药了YS110(10mg/kg，腹膜内给药)、吉非替尼(100mg/kg，口服给药)、或YS110(10mg/kg，腹膜内给药)+吉非替尼(100mg/kg，口服给药)。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0371] 将结果示于图30。YS110增强了吉非替尼的效果。
[0372] (3)针对CD26阳性肺癌细胞株HCC827的体内增殖的YS110与吉非替尼的合用
[0373] 将HCC827细胞移植至雌性SCID小鼠的背部皮下(0.9×105细胞/只)。将移植之日作为第0天，于第1天和第4天共2次，给药了YS110(10mg/kg，腹膜内给药)、吉非替尼(100mg/kg，口服给药)、及YS110(10mg/kg，腹膜内给药)+吉非替尼(100mg/kg，口服给药)。在第7天切除肿瘤，测定了肿瘤重量。通过双尾T检验(vs Cont)进行显著性差异检测。
[0374] 将结果示于图31。YS110增强了吉非替尼的效果。
[0375] (实施例12)关于是否可通过将化疗剂与CD26抗体合用而期待协同效果的筛选体系的研究
[0376] 药物疗法中的协同效果被认为是由参与分子彼此间发生相互作用而带来的。因此，可考虑下述可能性：在某种化疗剂在与CD26相互作用的同时发挥出抗癌效果的情况下，可期待通过将其与CD26抗体合用而获得协同效果。CD26与CD9进行相互作用，互相响应(Okamoto等，PLOS One(2014)9(1)：e86671)。因此在某种化疗剂与CD26发生相互作用的情况下，存在其效果被CD9减弱的可能性。因此，使用共表达CD26和CD9的间皮瘤细胞株MESO1、H2452和表达CD26但不表达CD9的细胞株JMN，进行了是否可通过将H226化疗剂与CD26抗体合用而期待协同效果的筛选体系设定的研究。
[0377] (1)使用MESO1、JMN细胞株的顺氯氨铂、培美曲塞的增殖抑制效果的比较
[0378] 使用MESO1、JMN细胞株比较了顺氯氨铂(10-9～10-4M)及培美曲塞(10-9～10-4M)的增殖抑制效果。
[0379] 将结果示于图32。A：比较了顺氯氨铂的增殖抑制效果，其结果，顺氯氨铂的增殖抑制效果在MESO1、JMN间没有差异。B：比较了培美曲塞的增殖抑制效果，其结果，培美曲塞的增殖抑制效果在MESO1、JMN间没有差异。因此，表明了在抗CD26抗体与顺氯氨铂的合用、抗CD26抗体与培美曲塞的合用中无法期待协同效果的可能性。
[0380] (2)使用MESO1、H2452、JMN、H226细胞株的吉西他滨的增殖抑制效果的比较[0381] 使用MESO1、H2452、JMN、H226细胞株比较了吉西他滨(10-9～10-4M)的增殖抑制效果。
[0382] 将结果示于图33。A：利用MESO1、JMN比较了吉西他滨的增殖抑制效果，其结果，吉西他滨在JMN中比在MESO1中显示了明显更强的增殖抑制效果。B：利用H2452、H226比较了吉西他滨的增殖抑制效果，其结果，吉西他滨在H226中比在H2452中显示了明显更强的增殖抑制效果。吉西他滨在MESO1与JMN、H2452与H226间的比较中，在未表达CD9的JMN、H226中观察到了较强的增殖抑制效果。因此，表明了在抗CD26抗体与吉西他滨的合用中可以期待协同效果的可能性。
[0383] 如上所述，顺氯氨铂、培美曲塞在MESO1细胞(CD9+)和JMN细胞(CD9-)间，增殖抑制效果没有差异。在上述实验中，确认了抗CD26抗体与顺氯氨铂、培美曲塞的合用为相加效果，因此，在增殖抑制效果在MESO1细胞(CD9+)与JMN细胞(CD9-)间没有差异的情况下，表示在与抗CD26抗体的合用中可获得协同效果。另一方面，确认了吉西他滨在MESO1(CD9+)与JMN(CD9-)、H2452(CD9+)与H226(CD9-)之间，增殖抑制效果存在显著差异。在上述实验中，在吉西他滨与抗CD26抗体的合用中确认了协同效果，因此，在增殖抑制效果在CD9+细胞和CD9-细胞间存在差异的情况下，表示在与抗CD26抗体的合用中可获得协同效果。综上可知，通过使用共表达CD26和CD9的细胞(例如：MESO1、H2452)、和表达CD26但不表达CD9的细胞(JMN、H226)，可以筛选出可通过与CD26抗体合用而带来协同效果的化疗剂。
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