衍生自CLPB的蛋白质及其用途
阅读：455发布：2020-05-08
专利汇可以提供衍生自CLPB的蛋白质及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含ClpB蛋白的 片段 的多肽和 蛋白质 及其组合物。本发明还涉及 治疗 和/或 预防 炎症 ，特别是超重和/或与肥胖相关的 疾病 和病症。本发明还涉及诱导饱足感、延长饱腹感、减少进餐量、减少食物摄入、控制体重增加和刺激体重减轻的方法。，下面是衍生自CLPB的蛋白质及其用途专利的具体信息内容。
1.一种包含ClpB蛋白或其变体的片段的至少15个氨基酸的多肽或蛋白质，其包含带负电荷的残基以及两个连续的Arg和Trp残基，其中所述多肽或蛋白质不是全长ClpB蛋白。
2.根据权利要求1所述的多肽或蛋白质，其中所述多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求1或2所述的多肽或蛋白质，其中所述多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽或蛋白质，其中所述多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：4。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽或蛋白质，其还包含与序列GKPV具有至少
75％序列同源性的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽或蛋白质，其中所述多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。
7.一种包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质的组合物。
8.一种包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
9.一种包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质的药物。
10.一种包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质的膳食补充剂。
11.一种包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质的食品组合物。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质、根据权利要求8所述的药物组合物、根据权利要求9所述的药物，其用于在有需要的对象中治疗或预防肥胖症、超重和/或与肥胖相关的疾病和病症。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质、根据权利要求10所述的膳食补充剂或根据权利要求11所述的食品组合物用于减轻对象体重的用途。
14.根据权利要求12或13之用途的多肽或蛋白质、药物组合物、药物、膳食补充剂或食品组合物，其中所述对象不是肥胖的。
15.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或蛋白质、根据权利要求7所述的组合物、根据权利要求8所述的药物组合物、根据权利要求9所述的药物、根据权利要求10所述的膳食补充剂或根据权利要求11所述的食品组合物。
衍生自CLPB的蛋白质及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 肥胖是这种伴随许多合并症的难以治疗的慢性病之一。肥胖和超重通常以食物摄入量增加和能量消耗减少为特征，这表明肽能系统调节能量平衡的作用发生了改变。实际上，食欲和进食行为的调节涉及肠饥饿和饱腹感肽激素与含有促食性神经肽和厌食性神经肽的脑神经回路之间的相互作用(Schwartz等人，2000.Nature.404(6778)：661-71)。
[0003] 当前的食物摄入控制模式涉及肠源性饥饿和饱腹感激素信号传递至调节进食的体内平衡和享乐方面的几个脑回路(Berthoud，2011.Curr.Opin.Neurobiol.21(6)：888-896；Murphy等人，2006.Nature.444(7121)：854-859)。其中突出的是来自下丘脑弓状核(ARC)的厌食和促食途径，其分别包括阿黑皮素原(POMC)和神经肽Y(NPY)/刺豚鼠相关蛋白(AgRP)神经元，它们在室旁核(PVN)中传递(Atasoy等人，2012.Nature.488(7410)：172-
177；Garfield等人，2015.Nat.Neurosci.18(6)：863-71；Shi等人，2013.Cell Metab.17(2)：236-248)。
177；Garfield等人，2015.Nat.Neurosci.18(6)：863-71；Shi等人，2013.Cell Metab.17(2)：236-248)。
[0004] 由黑素皮质素肽组成的中枢黑素皮质素(MC)系统，包括从其前体阿黑皮素原(POMC)衍生并作用于MC4型受体(MC4R)的α-黑素细胞刺激激素(o-MSH)，其在调节能量平衡中至关重要(Cone，2006.Endocr.Rev.27(7)：736-49)。实际上，POMC表达和MC4R信号传导的缺乏会导致人类和转基因啮齿动物的食欲亢进和肥胖症(Huszar等人，1997.Cell.88(1)：131-41；Krude等人，1998.Nat.Genet.19(2)：155-7；Farooqi等人，2003.N.Engl.J.Med.348(12)：1085-95)。因此，对中枢MC4R的选择性刺激似乎是治疗食欲亢进和肥胖症的非常有吸引力的靶标，并且已经开发了几种α-MSH肽类似物并进行了临床测试，如setmelanotide作为POMC缺乏症期间的替代疗法并用于治疗普拉德-威利综合症情况下的食欲亢进(Chen等人，2015.J.Clin.Endocrinol.Metab.100(4)：1639-45；Kühnen等人，
2016.N.Engl.J.Med.375(3)：240-6)。然而，高亲和力的α-MSH样药物在大脑中的渗透具有产生不良副作用(例如血压升高)的风险。
2016.N.Engl.J.Med.375(3)：240-6)。然而，高亲和力的α-MSH样药物在大脑中的渗透具有产生不良副作用(例如血压升高)的风险。
[0005] 最近，肠道共生大肠杆菌(E.coli)酪蛋白分解蛋白酶B(ClpB)蛋白已被鉴定为α-MSH的构象模拟物，这暗示了特定细菌蛋白作为新型肽样药物的潜在用途(Tennoune等人，2014.Transl.Psychiatry.4：e458)。ClpB蛋白具有大于95kDa的分子量，这引起一些困难(例如，制备、稳定性等)。
[0006] 结果表明，肠道肠内分泌细胞中MC4R的激活刺激饱食感激素胰高血糖素样肽1(GLP-1)和肽YY(PYY)的释放(Panaro等人，2014.Cell Metab.20(6)：1018-1029)。
[0007] 最近的研究表明，对应于大肠杆菌ClpB序列的氨基酸残基第534至548位的ClpB片段是完整的微摩尔MC1R激动剂，对MC3R和MC5R具有部分活性，但对MC4R没有活性(Ericson等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2015，25：5306-5308)。然而，完整的ClpB或含有针对MCR的α-MSH样表位的较大片段的活性可能不同于Ericson等人研究的修饰的短片段。
[0008] 还已知激素α-MSH对免疫系统的细胞以及表达黑皮质素受体的外周非免疫细胞类型(例如MC1R和MC3R)具有有效的抗炎作用和保护作用(Brzoska等人，2008.Endrocr.Rev.29(5)：581-602)。此外，最近的研究表明，α-MSH是治疗牛皮癣、过敏性鼻炎 、骨 关节 炎 和 神经 炎 性 疾病 的 感兴 趣 靶 标 (A u ri e m ma 等 人 ，
2012.J.Invest.Dermatol.132(7)：1814-24；Kleiner等人，Clin.Exp.Allergy.46(8)：
1066-74； 等人，2016.Biochem.Pharmacol.116：89-99；Mykicki等人，
2016.Sci.Transl.Med.8(362)：362ra146)。
2012.J.Invest.Dermatol.132(7)：1814-24；Kleiner等人，Clin.Exp.Allergy.46(8)：
1066-74； 等人，2016.Biochem.Pharmacol.116：89-99；Mykicki等人，
2016.Sci.Transl.Med.8(362)：362ra146)。
[0009] 因此，仍然需要鉴定保留α-MSH的生物学活性，特别是与黑皮质素受体结合的生物学活性的新多肽或蛋白质。
[0010] 发明人出乎意料地发现，与α-MSH表位具有序列同源性的ClpB片段对肠黏膜细胞具有直接作用以刺激PYY的分泌。
[0011] 因此，本发明涉及包含ClpB蛋白片段或其变体的多肽和蛋白及其用途。
发明内容
[0012] 本发明涉及包含ClpB蛋白或其变体的片段的至少15个氨基酸的多肽或蛋白质，其包含带负电荷的残基以及两个连续的Arg和Trp残基，其中所述多肽或蛋白质不是全长ClpB蛋白质。
[0013] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：4。
[0014] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质还包含与序列GKPV具有至少75％序列同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。
[0015] 本发明还涉及包含本文所述的多肽或蛋白质的组合物。
[0016] 本发明还涉及药物组合物，其包含本文所述的多肽或蛋白质和至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0017] 本发明的另一个目的是包含根据本发明的多肽或蛋白质的药物。
[0018] 本发明还涉及包含本文所述的多肽或蛋白质的膳食补充剂。本发明还涉及包含本文所述的多肽或蛋白质的食品组合物。
[0019] 本发明还涉及根据本发明的多肽或蛋白质、药物组合物或药物，其用于有需要的对象中治疗或预防肥胖症、超重和/或肥胖相关的疾病和病症。
[0020] 本发明的另一个目的是根据本发明的多肽或蛋白质、膳食补充剂或食品组合物用于减轻对象体重的用途。在一个实施方案中，对象不是肥胖的。
[0022] 定义
[0023] 在本发明中，以下术语具有以下含义：
[0024] -数字前的“约”表示该数字值的加或减10％的范围。
[0025] -如本文所用，“氨基酸”由如本领域中众所周知的其全名、其三个字母代码或一个字母代码表示。肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸为亮或L；异亮氨酸是Ile还是I；蛋氨酸是Met还是M；缬氨酸是Val或V；丝氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；苏氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；组氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸为Arg或R；甘氨酸是Gly或G。
[0026] 术语“氨基酸”包括天然氨基酸和合成氨基酸，以及D氨基酸和L氨基酸。“标准氨基酸”或“天然存在的氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准L-氨基酸中的任何氨基酸。“非标准氨基酸残基”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是天然来源的。例如，萘丙氨酸可以替代色氨酸以促进合成。可以替代的其他合成氨基酸包括但不限于L-羟丙基，L-3，4-二羟基苯丙氨酰基，α-氨基酸例如L-α-羟基赖氨酰基和D-α-甲基丙氨酰基、L-α-甲基丙氨酰基，β-氨基酸和异喹啉基。
[0027] 术语“氨基酸”还涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和经取代的氨基酸。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或被其他化学基团取代来修饰本发明多肽内所含的氨基酸，特别是在羧基末端或氨基末端，这些修饰可以改变多肽的循环半衰期而不会对其活性产生不利影响。另外，本发明的多肽中可以存在或不存在二硫键。
[0028] -“抗体”和“免疫球蛋白”(“Ig”)是可互换的，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可。
[0029] -“暴饮暴食”、“强迫性进食”、“暴饮暴食症”和“强迫性进食症”是指由无法控制的进食事件组成但没有随后的清除事件(例如，呕吐)的饮食失调。根据暴食饮量表检查单(Gormally等人，1982.Addict Behav.7(1)：47-55)或等效的诊断措施(例如，专业评估)，“暴饮暴食者”被确定为经历暴饮暴食或强迫性进食。暴饮暴食或强迫性进食的严重程度通过单个事件的严重程度和/或此类事件的发生频率进行衡量。
[0030] -“构象模拟物”是指与另一蛋白质具有至少部分相同构象的多肽或蛋白质。在一个实施方案中，“α-MSH肽的构象模拟物”意指与α-MSH肽(SEQ ID NO：20)具有至少部分相同构象的多肽或蛋白质。在一个特定的实施方案中，α-MSH肽的构象模拟物具有连续的Arg和Trp残基、与序列GKPV具有至少75％序列同源性、和/或在连续的Arg和Trp的上游具有带负电荷的残基。
[0031] -“保守置换”是其中一个氨基酸被具有相似特性的另一种氨基酸置换，因此肽化学领域的技术人员将期望该多肽的二级结构和亲水性质基本不变的情形。因此，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸置换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值且具有不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他可能代表保守性变化的氨基酸组包括：
[0032] (1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；
[0033] (2)Cys、Ser、Tyr、Thr；
[0034] (3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；
[0035] (4)Lys、Arg、His；和
[0036] (5)Phe、Tyr、Trp、His。
[0037] 术语“保守氨基酸置换”还可以定义为在以下五组之一内进行的氨基酸交换：
[0038] (i)小脂肪族非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
[0039] (ii)极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
[0040] (iii)极性带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
[0041] (iv)大脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys；
[0042] (v)大芳香族残基：Phe、Tyr、Trp。
[0043] -“表位”是指位于抗体所结合的一种或多于一种蛋白质上的氨基酸的特定排列。表位通常由分子例如氨基酸或糖侧链群化所形成的化学活性表面组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线性和/或构象的，即在抗原的各个区域中涉及两个或多于两个氨基酸序列，这些区域不一定是连续的。
[0044] -“片段”是指蛋白质如ClpB蛋白的一部分或区域，其包含比整个或完整蛋白例如ClpB蛋白更少的氨基酸残基。术语“片段”还指，例如，氨基酸序列例如氨基酸序列SEQ ID NO：1的至少约5个、10个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个或多于800个氨基酸的部分，该部分是通过至少一种蛋白酶通过蛋白水解切割而从天然存在的氨基酸序列切割而来的，或者是通过化学方法或使用本领域技术人员已知的重组DNA技术合成的天然存在的氨基酸序列的一部分(例如，从编码天然存在的氨基酸序列的核苷酸序列的一部分表达)。“片段”还可指，例如，特定氨基酸序列例如氨基酸序列SEQ ID NO：1的约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％的部分。
[0045] -当在两个或多于两个氨基酸序列的序列之间的关系中使用时，“同一性”或“同一的”是指氨基酸序列之间的序列相关性程度，其由两个或多于两个氨基酸残基的区段之间的匹配数目决定。“同一性”采用特定数学模型或计算机程序(即“算法”)所指定的空位比对(如果有)测量两个或多于两个序列中较小者之间相同匹配的百分比。比较两个或多于两个序列的同一性的方法是本领域众所周知的。这样的方法包括但不限于在Arthur M.Lesk，Computational Molecular Biology：Sources and Methods for Sequence Analysis(New-York：Oxford University Press，1988)；Douglas W.Smith，Biocomputing：Informatics and Genome Projects(New-York：Academic Press，1993)；Hugh G.Griffin和Annette M.Griffin，Computer Analysis of Sequence Data，Part 1(New Jersey：
Humana Press，1994)；Gunnar von Heinje，Sequence Analysis in Molecular Biology：
Treasure Trove or Trivial Pursuit(Academic Press，1987)；Michael Gribskov和John Devereux，Sequence Analysis Primer(New York：M.Stockton Press，1991)；以及Carillo等人，1988.SIAM J.Appl.Math.48(5)：1073-1082中描述的那些。用于确定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。公众可获得的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，其中包括GAP(Devereux等人，1984.Nucl.Acid.Res.12(1 Pt 1)：387-395；Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、TBLASTN和FASTA(Altschul等人，1990.J.Mol.Biol.215(3)：403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，1990.J.Mol.Biol.215(3)：403-410)公开获得。优选地可使用“Needle”程序，该程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman S.B.和Wunsch C.D.，1970.J.Mol.Biol.48：443-453)以在考虑两个序列的整个长度时找到两个序列的最佳比对(包括空位)。例如，needle程序可在ebi.ac.uk万维网站上获得。根据本发明的同一性百分比优选地使用EMBOSS：needle(全局)程序，其中“Gap Open”参数等于10.0、“Gap Extend”参数等于0.5；和Blosum62矩阵来计算。众所周知的史密斯沃特曼算法也可以用于确定同一性。
Humana Press，1994)；Gunnar von Heinje，Sequence Analysis in Molecular Biology：
Treasure Trove or Trivial Pursuit(Academic Press，1987)；Michael Gribskov和John Devereux，Sequence Analysis Primer(New York：M.Stockton Press，1991)；以及Carillo等人，1988.SIAM J.Appl.Math.48(5)：1073-1082中描述的那些。用于确定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。公众可获得的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，其中包括GAP(Devereux等人，1984.Nucl.Acid.Res.12(1 Pt 1)：387-395；Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、TBLASTN和FASTA(Altschul等人，1990.J.Mol.Biol.215(3)：403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，1990.J.Mol.Biol.215(3)：403-410)公开获得。优选地可使用“Needle”程序，该程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman S.B.和Wunsch C.D.，1970.J.Mol.Biol.48：443-453)以在考虑两个序列的整个长度时找到两个序列的最佳比对(包括空位)。例如，needle程序可在ebi.ac.uk万维网站上获得。根据本发明的同一性百分比优选地使用EMBOSS：needle(全局)程序，其中“Gap Open”参数等于10.0、“Gap Extend”参数等于0.5；和Blosum62矩阵来计算。众所周知的史密斯沃特曼算法也可以用于确定同一性。
[0046] -“肥胖”是指其中对象的BMI优选为＞30的医学状况。“BMI”或“体重指数”定义为2
对象的体重除以其身高的平方。普遍用于医学的公式形成了测量单位kg/m 。“中度肥胖”的对象是指BMI为30至35的对象。“非肥胖”的对象是BMI＜30的对象。因此，“非肥胖”的对象可能体重正常或超重。“正常体重”在本文中是指导致BMI为18.5至25的体重。
对象的体重除以其身高的平方。普遍用于医学的公式形成了测量单位kg/m 。“中度肥胖”的对象是指BMI为30至35的对象。“非肥胖”的对象是BMI＜30的对象。因此，“非肥胖”的对象可能体重正常或超重。“正常体重”在本文中是指导致BMI为18.5至25的体重。
[0047] -“超重”是指BMI为25至30的体重。在一些实施方案中，对象是健康的超重对象或无并发症的超重对象。“健康的超重”或“无并发症的超重”对象在本文中是指不表现出与他/她的体重直接相关的任何疾病或病症的超重对象。
[0048] -“药学上”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于对象、特别是人时，不会产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载剂或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。可用于本发明组合物中的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸、水、盐或电解质的部分甘油酯混合物，电解质例如为鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。在本发明的药物组合物中，如下所述的活性成分可以单独地或与另一种活性成分组合以单位给药形式作为与常规药物载剂的混合物形式施用于动物和人类。合适的单位给药形式包括经口途径形式如片剂、凝胶胶囊剂、散剂、颗粒剂和口服混悬剂或溶液、舌下和颊部给药形式、气雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、真皮下、鞘内和鼻内给药形式和直肠给药形式。优选地，药物组合物包含对于制剂而言药学上可接受的能够被注射的载剂。这些尤其可以是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等、或此类盐的混合物)、或干燥的、尤其是冻干的组合物，其根据情况添加无菌水或生理盐水而构成注射溶液。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；以及用于临时制备无菌可注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的目的。其必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。以游离碱或药理学上可接受的盐的形式包含本发明化合物的溶液可以在水中适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合而制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。可以将活性成分配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其由诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载剂也可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。无菌可注射溶液通过将所需量的活性多肽与所需的上述各种其他成分掺入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载剂中来制备分散液，所述无菌载剂包含基本分散介质和来自上文列举的那些所需的其他成分。对于用于制备无菌可注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。配制后，以与剂型相容的方式和治疗有效量施用溶液。所述制剂易于以多种剂型施用，例如以上述可注射溶液的类型施用，但是也可以使用药物释放胶囊等。例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。就此而言，根据本公开，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一剂量溶解在1mL等渗NaCl溶液中，然后添加到1000mL皮下输液中或在建议的输注部位注射。根据治疗对象的状况，必然会发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责给药的人员将为个体对象确定适合的剂量。
[0049] -“多肽”以其常规含义使用，即少于100个氨基酸的序列。多肽通常是指单体实体。术语“蛋白质”是指多于100个氨基酸的序列和/或多聚体实体。本发明的蛋白质不限于产物的特定长度。该术语不涉及或排除蛋白质的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。蛋白质可以是完整蛋白质或其子序列。“分离的蛋白质”是已经从其自然环境的组成部分中鉴定、分离和/或回收的蛋白质。在优选的实施方案中，分离的蛋白质将被纯化至：
[0050] (1)通过Lowry方法测定到大于80重量％、85重量％、90重量％、95重量％的蛋白质，最优选大于96重量％、97重量％、98重量％或99重量％的蛋白质；
[0051] (2)达到通过使用旋转杯测序仪足以获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列的程度；或
[0053] 分离的蛋白质包括重组细胞中的原位蛋白质，因为蛋白质自然环境中的至少一种组分不会存在。然而，通常，分离的蛋白质将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0054] -“多肽衍生物”或“蛋白质衍生物”是指具有氨基(-NH-)的化合物，更特别地是指具有肽键的化合物。多肽和蛋白质可视为经取代的酰胺。像酰胺基一样，肽键显示出高度的共振稳定性。肽键中的C-N单键通常具有约40％的双键特征，而C＝O双键则具有约40％的单键特征。“保护基团”是防止涉及未保护官能团的不期望反应(例如蛋白水解)的那些基团。氨基保护基团的具体实例包括甲酰基；三氟乙酰基；苄氧羰基；经取代的苄氧羰基，例如(邻或对)氯苄氧羰基和(邻或对)溴苄氧羰基；脂肪族氧羰基，例如叔丁氧羰基和叔戊氧羰基。
氨基酸的羧基可以通过转化成酯基来保护。酯基包括苄基酯、经取代的苄基酯例如甲氧基苄基酯；烷基酯例如环己基酯、环庚基酯或叔丁酯。胍基部分也可以被硝基或芳基磺酰基例如甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基保护，即使其不需要保护基团。咪唑的保护基团包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基。色氨酸的吲哚基可以被甲酰基保护或可以不被保护。
氨基酸的羧基可以通过转化成酯基来保护。酯基包括苄基酯、经取代的苄基酯例如甲氧基苄基酯；烷基酯例如环己基酯、环庚基酯或叔丁酯。胍基部分也可以被硝基或芳基磺酰基例如甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基保护，即使其不需要保护基团。咪唑的保护基团包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基。色氨酸的吲哚基可以被甲酰基保护或可以不被保护。
[0055] 包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质的修饰特别是旨在改善其在体内的寿命。一种修饰类型是将聚乙二醇(PEG)添加到多肽或蛋白质的N末端或C末端。PEG是本领域技术人员已知的，具有许多使其成为多肽的理想载体的特性，例如高水溶性、高溶液迁移率和低免疫原性。该修饰还保护多肽和蛋白质免受肽链外切酶的破坏，因此增加了它们在体内的整体稳定性。
[0056] 用于防止内肽酶或外肽酶降解多肽和蛋白质的其他修饰包括N末端修饰(例如乙酰化或糖基化)、C末端修饰(例如酰胺化)和在多肽或蛋白质的特定位点使用非天然氨基酸(β-氨基和α-三氟甲基氨基酸)。
[0057] 增加多肽和蛋白质分子大小的另一种替代方案是将多肽与人免疫球蛋白(包括例如IgA、IgM和IgG)的Fc结构域进行遗传融合或将多肽与白蛋白融合。
[0058] -“饱腹感”是指一种基本的自我平衡状态，在这种状态下，个体感到他们的心理渴求得到满足或减到最小。认为许多生理因素会影响个体的饱腹感。例如，味觉或嗅觉以及胃部饱满感都可能有助于个体是否感到“满足”。更特别地，“饱腹感”是一种状态，在该状态下再进食被禁止并且确定进餐之间的时间和下一餐所消耗的食物量。“饱腹感增强”或类似的含义是指，与对照情况相比，饱腹感更加明显和/或时间更长。
[0059] -“饱足感”是指在一餐中停止进食的状态，通常发生在在开始进餐后的一段时间(例如20分钟至30分钟)内。因此，每当在该文件中提及“引起饱足感”等时，其具有引起对象在进餐时停止食用食物的趋势的含义。对饱足感的效果可以通过对进餐结束的时间点进行评分来确定，即从进餐开始到进餐终止之间的时间。如果在进餐时摄入的卡路里的量明显少于对照组，例如少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％或多于20％，则可以看出饱足感效果。与对照饮食相比，在更长的时间段内(例如1周、2周、3周、4周、5周或多于5周)，还可以对体重减轻或体重变化进行评分。与对照对象相比，施用规律量的测试组合物(例如每天一次、每天两次或多于两次)的对象的体重优先得到明显控制(减少或增加较少)。如本文所用，“对照对象”是指未施用本发明的多肽或蛋白、多核苷酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗的对象。
[0060] -“对象”是指温血动物，优选人、宠物或牲畜。如本文所用，术语“宠物”和“牲畜”包括但不限于狗、猫、豚鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、马和家禽。在一些实施方案中，对象是男性对象或女性对象。在一些实施方案中，对象是成年人(例如，年龄在18岁(以人类年龄为单位)以上的对象或已达到生殖能力的对象)。在另一个实施方案中，对象是儿童(例如，未满18岁(以人类年龄为单位)的对象或尚未达到生殖能力的对象)。在一些实施方案中，对象可以是“患者”，即正在等待接受医疗程序(例如根据本发明方法的医疗程序)或正在接受医疗程序或曾经/正在/将要成为医疗程序对象的对象，或被监测疾病发展的对象。
[0061] -“持续释放”表示可以以控制的速率从组合物中释放治疗活性剂，使得血液水平(仍低于药物的毒性水平)可以在延长的时间内(例如，对于日剂量制剂为24小时或更长时间，从而提供单剂量)保持在治疗有益水平。
[0062] -“治疗有效量”指足以在不对对象造成重大负面或不利副作用的情况下达到有益效果(例如，刺激饱腹感、延长饱足感、减少食物摄入、控制特别是减少体重增加、刺激体重减轻和/或减少脂肪质量与瘦肉质量比)的量的：
[0063] ○包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段的或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白；或
[0064] ○编码包含本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段的或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白的多核苷酸；或
[0065] ○编码包含本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段的或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白的载体。在本发明的上下文中，要施用于对象的多肽、蛋白质、多核苷酸或载体的量将取决于个体的特征，例如总体健康状况、年龄、性别、体重等等。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。
[0066] -“治疗”、“处理”或“缓解”是指治疗性处理和预防性或预止性措施；其中目的是预防或缓解(减轻)目标疾病或病症。需要治疗的对象包括已经患有疾病的对象、那些容易患有疾病的对象、或那些需要预防疾病的对象。如果在接受治疗量的本发明的药剂后，对象表现出可观察的和/或可测量的：饱足感、饱腹感延长、食物摄入减少、体重增加受到控制、刺激体重减轻和/或脂肪瘦肉质量比降低，则对象或哺乳动物成功地“治疗”了目标疾病或病症。通过医师熟悉的常规程序可以容易地测量用于评估成功治疗和改善病症或疾病的这些参数。
[0067] -“变体”和“突变体”是可互换的术语，是指通常与本文具体公开的多肽或蛋白质的区别在于一个或多于一个置换、缺失、添加和/或插入的多肽或蛋白质。此类变体可以是天然存在的或可以是合成制备的，例如，通过修饰如本文所述的多肽或蛋白质的多肽或蛋白质序列并评估一种或多于一种生物学活性和/或使用多种本领域公知技术来制备。可以对多肽或蛋白质的结构进行修饰，并且仍然获得编码具有所需特征的变体或衍生多肽或蛋白质的功能分子。
[0068] 当需要改变多肽或蛋白质的氨基酸序列以制备本发明的多肽或蛋白质的等同或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多于一个密码子。例如，与野生型蛋白质例如ClpB蛋白质相比，某些氨基酸可以被蛋白质结构中的其他氨基酸置换而没有明显的功能损失。
[0069] 可以在多肽或蛋白质序列中进行某些氨基酸序列的置换、缺失、添加和/或插入，当然也可以在其基础的DNA编码序列中进行，从而获得具有不同特性的多肽或蛋白质。因此，预期可以对多肽或蛋白质序列或编码所述多肽或蛋白质的相应DNA序列进行各种改变，并对它们的生物学效用或活性进行适当的调节(即，活化/增强或抑制/减少)。这样的突变包括但不限于无义突变、移码突变和非保守错义突变。
[0070] 可以在多肽或蛋白质序列中进行某些氨基酸序列的置换、缺失、添加和/或插入，当然也可以在其基础的DNA编码序列中进行，尽管如此，仍可获得具有类似特性的多肽或蛋白质。因此，预期可以对多肽或蛋白质序列或编码所述多肽或蛋白质的相应DNA序列进行各种改变，而不会明显丧失其生物学效用或活性。这样的突变包括但不限于沉默突变、沉默错义突变和保守突变。
[0071] 术语“变体”和“突变体”还包括具有以下一种或多于一种修饰的多肽：
[0072] i)其中一个或多于一个肽基-C(O)NR-键已被非肽基键，例如-CH2-氨基甲酸酯键(-CH2OC(O)NR-)、膦酸酯键、-CH2-磺酰胺键(-CH2-S(O)2NR-)、脲键(-NHC(O)NH-)、-CH2-仲胺键或烷基化的肽基键(-C(O)NR-)替代的多肽，其中R为C1-C4烷基；
[0073] ii)其中N末端衍生为-NRR1基团、-NRC(O)R基团、-NRC(O)OR基团、-NRS(O)2R基团、-NHC(O)NHR基团的多肽，其中R和R1为氢或C1-C4烷基，条件是R和R1不都是氢；
[0074] iii)其中C末端衍生为-C(O)R2的多肽，其中R2选C1-C4烷氧基和-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢和C1-C4烷基。
[0075] -“野生型”是指具有从天然来源分离的基因或蛋白质的特征的基因或蛋白质。野生型基因或蛋白质是在群体中最常观察到的基因或蛋白质，因此与“变体”或“突变体”相反，其专门被称为基因或蛋白质的“野生型”形式。
[0076] 详细描述
[0077] 因此，本发明涉及包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质。
[0078] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含至少15个氨基酸或由至少15个氨基酸组成。在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含至少16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个氨基酸或由至少16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个氨基酸组成。在一个实施方案中，本发明的多肽包含少于100个、75个、60个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个或16个氨基酸或由少于100个、75个、60个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个或16个氨基酸组成。
[0079] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含4个至100个或多于100个氨基酸、10个至80个氨基酸、15个至70个氨基酸、20个至60个氨基酸、25个至50个氨基酸、30个至45个氨基酸、或35个至40个氨基酸。
[0080] 在另一个实施方案中，本发明的多肽包含10个至100个氨基酸，或10个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个或15个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含15个至100个氨基酸，或15个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个或20个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含20个至100个氨基酸，或20个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个或25个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含25个至100个氨基酸，或25个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个或30个氨基酸。
[0081] 在一个实施方案中，本发明的多肽包含15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个氨基酸或由15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个氨基酸组成。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸或由25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸组成。
[0082] 在一个实施方案中，本发明的多肽不包含少于15个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少15个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的多肽不包含少于20个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少20个氨基酸。
[0083] 在另一个实施方案中，本发明的蛋白质包含至少100个、125个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或多于600个氨基酸或由至少100个、125个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或多于600个氨基酸组成。
[0084] 在一个实施方案中，本发明的蛋白质包含100个至1500个或多于100个氨基酸、100个至1000个氨基酸、100个至900个氨基酸、100个至850个氨基酸、100个至800个氨基酸、100个至750个氨基酸、或100个至700个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的蛋白质包含150个至1500个、1000个、900个、850个、800个、750个或700个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的蛋白质包含200个至1500个、1000个、900个、850个、800个、750个或700个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的蛋白质包含300个至1500个、1000个、900个、850个、800个、750个或700个氨基酸。
[0085] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含15个至1500个或多于1500个氨基酸、15个至1000个氨基酸、15个至900个氨基酸、15个至800个氨基酸、15个至700个氨基酸、15个至600个氨基酸、或15个至500个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含20个至1500个、1000个、900个、800个、700个、600个或500个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含25个至1500个、1000个、900个、800个、700个、600个或500个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含30个至1500个、1000个、900个、
800个、700个、600个或500个氨基酸。
800个、700个、600个或500个氨基酸。
[0086] 根据本发明的ClpB蛋白是指酪蛋白水解蛋白酶B蛋白，其是六聚AAA+-ATP酶的Hsp100/ClpB家族成员。
[0087] 在一个实施方案中，根据本发明的ClpB蛋白是细菌ClpB蛋白。在一个实施方案中，本发明的ClpB蛋白是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)蛋白。肠杆菌科包括但不限于杀雄菌属(Arsenophonus)、布伦勒氏菌属(Brenneria)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、布特维西菌属(Budvicia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、西地西菌属(Cedecea)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Cosenzaea、克洛诺菌属(Cronobacter)、迪基氏菌属(Dickeya)、爱德华菌属(Edwardsiella)、肠芽孢杆菌属(Enterobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、爱文氏菌属(Ewingella)、弗朗科杆菌属(Franconibacter)、Gibbsiella、哈夫尼菌属(Hafnia)、Izhakiella、小坂菌属(Kosakonia)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、克吕沃氏菌属(Kluyvera)、勒克菌属(Leclercia)、莱略特菌(Lelliottia)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、列文菌属(Levinea)、Lonsdalea、Mangrovibacter、米勒氏菌属(Moellerella)、摩根菌属(Morganella)、肥大杆菌属(Obesumbacterium)、泛菌属(Pantoea)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、菜豆杆菌属(Phaseolibacter)、光杆状菌属(Photorhabdus)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、多源菌属(Pluralibacter)、布拉格菌属(Pragia)、变形杆菌属(Proteus)、普罗威登菌属
(Providencia)、Pseudocitrobacter、拉恩氏菌属(Rahnella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、Rosenbergiella、Rouxiella、糖杆菌属(Saccharobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、Samsonia、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、西姆惠菌属(Shimwellia)、干燥杆菌属(Siccibacter)、伴突属(Sodalis)、塔特姆氏菌属(Tatumella)、Thorsellia、特布尔西菌属(Trabulsiella)、威格尔斯沃思氏菌属(Wigglesworthia)、致病杆菌属
(Xenorhabdus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和预研菌属(Yokenella)。
(Providencia)、Pseudocitrobacter、拉恩氏菌属(Rahnella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、Rosenbergiella、Rouxiella、糖杆菌属(Saccharobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、Samsonia、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、西姆惠菌属(Shimwellia)、干燥杆菌属(Siccibacter)、伴突属(Sodalis)、塔特姆氏菌属(Tatumella)、Thorsellia、特布尔西菌属(Trabulsiella)、威格尔斯沃思氏菌属(Wigglesworthia)、致病杆菌属
(Xenorhabdus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和预研菌属(Yokenella)。
[0088] 在一个实施方案中，根据本发明的ClpB蛋白是来自哈夫尼菌属，优选来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的ClpB(SEQ ID NO：1)。在一个实施方案中，根据本发明的ClpB蛋白是来自大肠杆菌，优选来自大肠杆菌K12的ClpB(SEQ ID NO：21)。
[0089] 在蜂房哈夫尼菌中，伴侣蛋白ClpB是857个氨基酸的蛋白。在一个实施方案中，ClpB蛋白具有来自蜂房哈夫尼菌的伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示(GenBank参考号：KIC99545.2)。在一个实施方案中，ClpB的氨基酸序列包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少约95％至约100％同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在本申请的上下文中，使用整体比对来计算同一性百分比(即，将两个序列在其整个长度上进行比较)。
[0090] SEQ ID NO：1
[0091]
[0092] 在大肠杆菌K12中，伴侣蛋白ClpB是857个氨基酸的蛋白。在一个实施方案中，ClpB蛋白具有来自大肠杆菌K12的伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列，如SEQ ID NO：21所示(GenBank参考号：BAA16476.1)。在一个实施方案中，ClpB的氨基酸序列包含与氨基酸序列SEQ ID NO：21具有至少约95％至约100％同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在本申请的上下文中，使用整体比对来计算同一性百分比(即，将两个序列在其整个长度上进行比较)。
[0093] 在一个实施方案中，根据本发明的ClpB蛋白是ClpB变体。
[0094] 在一个实施方案中，本文所用的ClpB变体包含以下序列或由以下序列组成：该序列与氨基酸序列SEQ ID NO：1呈现至少约70％的序列同一性，优选至少约80％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。
[0095] ClpB变体还可以或替代地包含非保守改变。在一个实施方案中，变体多肽通过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸的置换、缺失或添加而不同于天然序列。变体还可以(或替代地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性影响最小的氨基酸来修饰。
[0096] 在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的变体能够以至少等同于SEQ ID NO：1之一的效率，在有需要的对象中诱导饱足感、延长饱腹感、减少食物摄入、控制体重增加、刺激体重减轻和/或降低脂肪质量与瘦肉质量比。
[0097] 在一个实施方案中，与SEQ ID NO：1的序列相比，SEQ ID NO：1的变体包含保守氨基酸置换，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个保守氨基酸置换。
[0098] 在另一个实施方案中，SEQ ID NO：1的变体是SEQ ID NO：1序列中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸缺失或被任何氨基酸置换的多肽，或添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸(连续或不连续的)的多肽。
[0099] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含ClpB的至少一个片段、优选具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的ClpB的至少一个片段或由该至少一个片段组成。
[0100] 在一个实施方案中，ClpB片段包含ClpB蛋白、优选具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的ClpB的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个氨基酸或由ClpB蛋白、优选具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的ClpB的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个氨基酸组成。
[0101] 在一个实施方案中，ClpB片段包含少于100个、75个、60个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或少于10个氨基酸或由少于100个、75个、60个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、
14个、13个、12个、11个、10个或少于10个氨基酸组成。
14个、13个、12个、11个、10个或少于10个氨基酸组成。
[0102] 在一个实施方案中，ClpB片段包含4个至100个或多于100个氨基酸、10个至80个氨基酸、15个至70个氨基酸、20个至60个氨基酸、25个至50个氨基酸、30个至45个氨基酸、或35个至40个氨基酸。
[0103] 在另一个实施方案中，ClpB片段包含4个至80个氨基酸，或4个至70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个或10个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含6个至100个氨基酸，或6个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、
15个或10个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含8个至100个氨基酸，或8个至80个、
70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个或10个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含10个至100个氨基酸，或10个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个或15个氨基酸。
15个或10个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含8个至100个氨基酸，或8个至80个、
70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个或10个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含10个至100个氨基酸，或10个至80个、70个、60个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个或15个氨基酸。
[0104] 在一个实施方案中，ClpB片段包含4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、14个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸或由4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、14个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸组成。在另一个实施方案中，ClpB片段包含25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、80个、90个或100个氨基酸或由25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、80个、90个或100个氨基酸组成。
[0105] 在另一个实施方案中，ClpB片段包含100个至500个或多于500个氨基酸、100个至400个氨基酸、100个至300个氨基酸、100个至200个氨基酸、或100个至150个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含150个至500个或多于500个氨基酸、150个至400个氨基酸、150个至300个氨基酸、或150个至200个氨基酸。在另一个实施方案中，ClpB片段包含100个至
350个氨基酸、150个至300个氨基酸、或200个至250个氨基酸。
350个氨基酸、150个至300个氨基酸、或200个至250个氨基酸。
[0106] 在一个实施方案中，ClpB片段包含100个、125个、150个、175个、200个、250个、或300个氨基酸或由100个、125个、150个、175个、200个、250个、或300个氨基酸组成。在另一个实施方案中，ClpB片段包含220个氨基酸或由220个氨基酸组成。在一个实施方案中，ClpB片段包含210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个或230个氨基酸或由210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、
224个、225个、226个、227个、228个、229个或230个氨基酸组成。
224个、225个、226个、227个、228个、229个或230个氨基酸组成。
[0107] 在一个实施方案中，ClpB片段包含SEQ ID NO：1或其变体的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个氨基酸残基或由SEQ ID NO：1或其变体的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个氨基酸残基组成。
[0108] 在一个实施方案中，ClpB片段包含SEQ ID NO：1的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个连续的氨基酸残基或由SEQ ID NO：1的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个连续的氨基酸残基组成。在一个实施方案中，ClpB片段包含SEQ ID NO：1或其变体的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个不连续的氨基酸残基或由SEQ ID NO：1或其变体的至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、75个、100个或多于100个不连续的氨基酸残基组成。在一个实施方案中，ClpB片段包含SEQ ID NO：1或其变体的至少5个不连续的氨基酸残基或由SEQ ID NO：1或其变体的至少5个不连续的氨基酸残基组成。在一个实施方案中，ClpB片段包含SEQ ID NO：1或其变体的至少6个不连续的氨基酸残基或由SEQ ID NO：1或其变体的至少6个不连续的氨基酸残基组成。
[0109] 在一个实施方案中，本发明的ClpB片段包含带负电荷的残基以及两个连续的Arg和Trp残基。在一个实施方案中，本发明的ClpB片段包含连续的Arg和Trp残基以及在连续的Arg和Trp残基上游的带负电荷的残基。
[0110] 在一个实施方案中，本发明的ClpB片段至少包含在连续的Arg和Trp残基上游的带负电荷的残基。如本文所用，术语“连续的Arg和Trp残基上游”是指在Arg残基的-1位、-2位、-3位、-4位或-5位。换句话说，在一个实施方案中，连续的Arg和Trp序列的Arg残基在带负电荷的残基的+1位、+2位、+3位、+4位或+5位。
[0111] 在一个实施方案中，带负电荷的残基是Glu或Asp残基。在一个特定的实施方案中，带负电荷的残基是Glu残基。
[0112] 在一个实施方案中，ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基E538。
[0113] 在一个实施方案中，ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基R542和/或W543或由其组成。在一个实施方案中，ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基R542和W543或由其组成。
[0114] 在一个实施方案中，ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基E538、R542和W543或由其组成。
[0115] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或由其组成。
[0116] SEQ ID NO：2
[0117] E/D-X2-4-R-W
[0118] 其中X是任何氨基酸并且X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸，优选其中E/D是E。
[0119] 在另一个特定实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：3或由其组成。
[0120] SEQ ID NO：3
[0121] E/D-V-X-X-R-W
[0122] 其中X是任何氨基酸，优选其中E/D是E。
[0123] 在另一个特定的实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：4或由其组成。
[0124] SEQ ID NO：4
[0125] E/D-V-L-A-R-W
[0126] 在一个优选的实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：5或由其组成。
[0127] SEQ ID NO：5
[0128] E-V-L-A-R-W
[0129] 在一个特定的实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5，并且具有至少15个氨基酸，优选至少20个氨基酸的长度。
[0130] 在一个实施方案中，本发明的ClpB片段还包含与序列GKPV具有至少75％序列同源性的序列。
[0131] 在一个实施方案中，ClpB片段还至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基G545、P547和/或V548。在一个特定的实施方案中，ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基G545、I546、P547和/或V548。在一个优选的实施方案中，ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基G545、I546、P547和V548。
[0132] 在一个实施方案中，根据本发明的ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基E538、R542、W543、G545、P547和V548或由其组成。在一个实施方案中，根据本发明的ClpB片段至少包含SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸残基E538、R542、W543、G545、I546、P547和V548或由其组成。
[0133] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或由其组成。
[0134] SEQ ID NO：6
[0135] E/D-X2-4-R-W-X-G-X-P-V
[0136] 其中X是任何氨基酸并且X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸，优选其中E/D是E。
[0137] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或由其组成。
[0138] SEQ ID NO：7
[0139] E/D-X2-4-R-W-X-G-I/K-P-V
[0140] 其中X是任何氨基酸并且X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸。
[0141] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或由其组成。
[0142] SEQ ID NO：8
[0143] E-X2-4-R-W-X-G-I/K-P-V
[0144] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：9或由其组成。
[0145] SEQ ID NO：9
[0146] E-X2-4-R-W-X-G-I-P-V
[0147] 其中X是任何氨基酸并且X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸。
[0148] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：10或由其组成。
[0149] SEQ ID NO：10
[0150] E-X2-4-R-W-T-G-I-P-V
[0151] 其中X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸。
[0152] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：11或由其组成。
[0153] SEQ ID NO：11
[0154] E-V-X-X-R-W-T-G-I-P-V
[0155] 其中X是任何氨基酸。
[0156] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：12或由其组成。
[0157] SEQ ID NO：12
[0158] E-V-L-A-R-W-T-G-I-P-V
[0159] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：13或由其组成。
[0160] SEQ ID NO：13
[0161] E-X2-4-R-W-X-G-K-P-V
[0162] 其中X是任何氨基酸并且X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸。
[0163] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：14或由其组成。
[0164] SEQ ID NO：14
[0165] E-X2-4-R-W-T-G-K-P-V
[0166] 其中X2-4是2个、3个或4个任何氨基酸。
[0167] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或由其组成。
[0168] SEQ ID NO：15
[0169] E-V-X-X-R-W-T-G-K-P-V
[0170] 其中X是任何氨基酸。
[0171] 在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：16或由其组成。
[0172] SEQ ID NO：16
[0173] E-V-L-A-R-W-T-G-K-P-V
[0174] 在一个特定的实施方案中，本发明的多肽或蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16，并且具有至少15个氨基酸，优选至少20个氨基酸的长度。
[0175] 在一个实施方案中，ClpB片段包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：1的第538至548位氨基酸序列(EVLARWTGIPV，SEQ ID NO：12)具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：
12或由其组成。
12或由其组成。
[0176] 在一个实施方案中，ClpB片段包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：1的第536至548位氨基酸序列(IAEVLARWTGIPV，SEQ ID NO：18)具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：18或由其组成。
[0177] 在一个实施方案中，ClpB片段包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：21的第534至548位氨基酸序列(AEIAEVLARWTGIPV，SEQ ID NO：19)具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：19或由其组成。
97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：19或由其组成。
[0178] 在一个实施方案中，ClpB片段包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：1的第534至548位氨基酸序列(VEIAEVLARWTGIPV，SEQ ID NO：17)具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：17或由其组成。
[0179] 在一个实施方案中，ClpB片段包以下含氨基酸序列或由以下含氨基酸序列组成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：21的第537至756位氨基酸序列(SEQ ID NO：22)具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性。在一个实施方案中，ClpB片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：22或由其组成。
[0180] 在一个实施方案中，包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质不由ClpB蛋白的氨基酸序列组成。换句话说，在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质不是全长的ClpB蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质的氨基酸序列与ClpB序列不是100％相同。在一个特定的实施方案中，本发明的多肽或蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：1不是100％相同和/或与SEQ ID NO：21不是100％相同。
[0181] 在一个实施方案中，包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质不由α-MSH的氨基酸序列组成。在一个具体的实施方案中，包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质不由SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成。
[0182] 在一实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体与α-MSH(SEQ ID NO：20)具有同源性。在一实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体与α-MSH具有构象同源性。在另一实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体与α-MSH具有序列同源性。在另一实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体与α-MSH具有构象和序列同源性。
[0183] 在一实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体被抗α-MSH抗体识别。换句话说，在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体用作抗α-MSH抗体的表位。在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体用作抗α-MSH抗体的构象表位。
[0184] 在一个实施方案中，包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质是多肽衍生物。
[0185] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质或其变体通过本领域众所周知的方式进行修饰，例如，通过添加一种或多于一种官能团例如磷酸、乙酸、脂质或碳水化合物基团，和/或通过添加一种或多于一种保护基团进行修饰。例如，本发明的多肽或蛋白质或其变体可以通过添加一种或多于一种官能团例如磷酸、乙酸或各种脂质和碳水化合物基团进行修饰。
[0186] 如本领域所熟知的，本文所述的本发明的多肽或蛋白质或其变体可以通过化学合成或酶促合成来合成制备。或者，可以将编码本发明的多肽或蛋白质或其变体的核苷酸序列引入蛋白质表达载体中，并在合适的宿主生物体(例如细菌、昆虫细胞等)中产生，然后纯化。在一个实施方案中，通过克隆方法获得本发明的多肽或蛋白质或其变体，例如，使用本领域已知的任何生产系统例如大肠杆菌、酵母、杆状病毒-昆虫细胞，或哺乳动物细胞例如HEK或CHO表达系统。
[0187] 为了纯化或鉴定多肽，可以添加其他多肽(“标签”)。蛋白质标签可以例如使多肽以高亲和力吸附到基质上，然后可以使用合适的缓冲液严格洗涤基质，而不会将复合物洗脱到任何显著程度，随后可以选择性地洗脱所吸附的复合物。技术人员已知的蛋白质标签的实例是(His)6标签、Myc标签、FLAG标签、血凝素标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、具有几丁质结合亲和力的内含肽标签、或麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。这些蛋白质标签可以位于N末端、C末端和/或内部。
[0188] 本发明还涉及编码包含本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质的多核苷酸或核酸。
[0189] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸是DNA。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸是RNA，例如信使RNA(mRNA)的形式。
[0190] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸是单链的。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸是双链的。
[0191] 本发明的另一个目的是编码包含本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质的载体，或包含多核苷酸或核酸的载体，该多核苷酸或核酸编码包含本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由本文所述的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质。
[0192] 载体的实例包括但不限于质粒、噬菌体、病毒、阳离子囊泡或任何其他类型的载体。
[0193] 在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。
[0194] 本发明的另一个目的是一种组合物，其包含本文所述的多肽或蛋白质或其变体、或本文所述的多核苷酸或核酸、或本文所述的载体。
[0195] 本发明的另一个目的是药物组合物，其包含本文所述的多肽或蛋白质或其变体、或本文所述的多核苷酸或核酸、或本文所述的载体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0196] 本发明的另一个目的是一种药物，其包含本文所述的多肽或蛋白质或其变体、或本文所述的多核苷酸或核酸、或本文所述的载体。
[0197] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或药物包含治疗有效量的本发明的多肽、蛋白质、多核苷酸或核酸或载体。
[0198] 本发明的另一个目的是一种疫苗，其包含本文所述的多肽或蛋白质或其变体、或本文所述的多核苷酸或核酸、或本文所述的载体。
[0199] 在一实施方案中，根据本发明的疫苗用于预防超重和/或肥胖相关的疾病和病症。
[0200] 本发明的另一个目的是包含多肽的膳食补充剂或蛋白质膳食补充剂，该多肽包含如本文所述的ClpB蛋白的片段，优选地，该多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的ClpB片段。
[0201] 本发明的另一个目的是包含多肽的食品组合物，该多肽包含如本文所述的ClpB蛋白的片段，优选地，该多肽包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的ClpB片段。
[0202] 在一个实施方案中，膳食补充剂或食品组合物包含约1重量％至约80重量％的包含根据本发明的ClpB蛋白片段的多肽或蛋白质或由其组成。在一个实施方案中，膳食补充剂或食品组合物包含约1重量％至约50重量％，优选约2重量％至约25重量％的包含根据本发明的ClpB蛋白片段的多肽或蛋白质或由其组成。
[0203] 在一个实施方案中，膳食补充剂或食品组合物包含至少1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％或高于80％的包含根据本发明的ClpB蛋白片段的多肽或由其组成。
[0204] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物包含至少一种选自简单和/或复合的碳水化合物、脂质、纤维或矿物质的附加成分。
[0205] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物包含至少一种必需氨基酸。优选地，所述至少一种必需氨基酸是分离的或游离的，即未结合到蛋白质链中。
[0206] 在一个实施方案中，根据本发明的膳食补充剂或食品组合物为无水粉末形式、或含有水或水分的粉末形式。
[0207] 在一个实施方案中，膳食补充剂或食品组合物还包含载剂或媒介物。“载剂”或“媒介物”是指适用于给药的材料，包括本领域已知的任何此类材料，例如任何无毒的液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，其是无毒的且不会以有害的方式与组合物的任何组分，特别是与组合物的细菌菌株相互作用。营养上可接受的载剂的实例包括例如，水、盐溶液、乙醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、黏性石蜡、香料油、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、石油乙烯脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0208] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物包含一定量的膳食纤维。膳食纤维通过小肠而不会被酶消化，并具有天然填充剂和缓泻剂的功能。膳食纤维可以是可溶的或不可溶的，并且通常优选两种类型的混合物。膳食纤维的合适来源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液酸乳糖和源自动物乳的低聚糖。在一些实施方案中，膳食纤维选自甘露聚糖。甘露聚糖(例如葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖)，例如瓜尔豆胶、刺槐豆胶、魔芋和黄原胶存在于一些植物的细胞壁中。葡甘露聚糖通常由(1-4)-β-连接的葡萄糖和甘露糖单元组成，而半乳甘露聚糖通常由被(1-6)-α-半乳糖单独单元取代的(1-4)-β-甘露聚糖骨架组成。在种子发育过程中，许多胚乳豆科植物，例如瓜尔豆和刺槐豆，在胚乳中都含有半乳甘露聚糖。还发现了葡甘露聚糖是谷物的次要成分。
[0209] 在一个实施方案中，根据政府机构如USRDA的建议，本发明的膳食补充剂或食品组合物包含矿物质和微量营养物，例如微量元素和维生素。例如，组合物可以包含按日剂量计的一种或多于一种以下微量营养素：300mg至500mg的钙、50mg至100mg的镁、150mg至250mg的磷、5mg至20mg的铁、1mg至7mg的锌、0.1mg到0.3mg的铜、50μg到200μg的碘、5μg到15μg的硒、1000μg至3000μg的β-胡萝卜素、10mg至80mg的维生素C、1mg至2mg的维生素B1、0.5mg至1.5mg的维生素B6、0.5mg至2mg的维生素B2、5mg至18mg的烟酸、0.5μg至2.0μg的维生素B12、
100μg至800μg的叶酸、30μg至70μg的生物素、1μg至5μg的维生素D、3μg至10μg的维生素E。
100μg至800μg的叶酸、30μg至70μg的生物素、1μg至5μg的维生素D、3μg至10μg的维生素E。
[0210] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物还包含乳化剂。食品级乳化剂的实例通常包括甘油单酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂以及甘油单酯和甘油二酯。类似地，可以包含合适的盐和稳定剂。
[0211] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物可用于制备保健食品。
[0212] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物可用于引入日常膳食中。
[0213] 本发明还涉及如上所述包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物，其用于治疗有需要的对象的炎症。
[0214] 本发明的另一个目的涉及一种在有需要的对象中治疗炎症的方法，其包括向所述对象施用有效量的如上所述的包含ClpB蛋白质或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白质或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物。
[0215] 在本发明的含义中，如道兰氏医学词典中所定义的，“炎症”是指“由组织的损伤或破坏引起的局部保护性反应，其作用是破坏、稀释或隔离有害试剂和受伤的组织”。其特征在于微血管扩张、血液中的元素渗漏到间质空间以及白细胞迁移到发炎的组织中。从宏观上讲，这通常伴有红斑、浮肿、痛觉过敏(压痛)和疼痛的常见临床症状。
[0216] 在一个实施方案中，根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物用于治疗炎症，其中所述炎症选自肥胖症、肥胖相关疾病或病症、神经炎症、多发性硬化、动脉粥样硬化、过敏、强直性脊柱炎、关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎或银屑病关节炎)、哮喘、移植物抗宿主病、帕金森病、阿尔茨海默病、克罗恩病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合症、系统性红斑狼疮、肾炎和溃疡性结肠炎。
[0217] 在一个实施方案中，本发明的炎症是急性炎症。在另一个实施方案中，本发明的炎症是慢性炎症。
[0218] 在一个实施方案中，根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物用于治疗炎症，其中所述炎症选自肥胖症、肥胖相关疾病或病症、神经炎症、多发性硬化、银屑病、过敏性鼻炎、骨关节炎和神经炎性疾病。在一个特定的实施方案中，根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物用于治疗炎症，其中所述炎症选自肥胖症、神经炎症、多发性硬化、银屑病、过敏性鼻炎、骨关节炎和神经炎性疾病。
[0219] 本发明的一个目的涉及包含根据本发明的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由根据本发明的ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物，其用于治疗或预防有需要的对象的肥胖症。
[0220] 本发明的另一个目的涉及在有需要的对象中治疗和预防肥胖的方法，其包括向所述对象施用有效量的如上所述的包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物。
[0221] 本发明的一个方面涉及如上所述的包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物，其用于治疗或预防超重和/或与肥胖相关的疾病和病症。
[0222] 本发明的另一个方面涉及在有需要的对象中治疗或预防超重和/或与肥胖相关的疾病和病症的方法，其包括向所述对象施用有效量的如上所述的包含ClpB蛋白或其变体的至少一个片段或由ClpB蛋白或其变体的至少一个片段组成的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、疫苗、药物组合物或药物。
[0223] 超重和/或与肥胖相关的疾病和病症包括但不限于高血压、糖尿病(尤其是2型糖尿病)、葡萄糖不耐症、胰岛素抵抗、心血管疾病(例如动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、动脉狭窄、心绞痛、心脏病发作、血栓)、高胆固醇、脂肪肝疾病、肝脂肪变性、胆石症、关节疾病、骨关节炎、矫形问题、平衡能力受损、皮肤状况、睡眠呼吸暂停、呼吸系统疾病、哮喘、严重打鼾、癌症(包括乳腺癌、结肠癌、胆囊癌、子宫癌、结肠癌和前列腺癌)、代谢综合征、月经异常和社会心理效应。
[0224] 本发明的一个方面涉及在有需要的对象中诱导饱足感的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗。
[0225] 本发明的一个方面涉及一种根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗，其用于在有需要的对象中引起饱足感。
[0226] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象中引起饱足感的非治疗用途。
[0227] 本发明的一个方面涉及在有需要的对象中延长饱腹感的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0228] 本发明的一个方面涉及一种根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象中延长饱腹感。
[0229] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象中延长饱腹感的非治疗用途。
[0230] 在一个实施方案中，饱腹感延长至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个特定的实施方案中，相对于两餐之间经过的时间、优选在施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前两餐之间经过的时间，饱腹感延长至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，饱腹感延长至少15％、20％或25％。在一个特定的实施方案中，相对于两餐之间经过的时间、优选在施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前两餐之间经过的时间，饱腹感延长至少15％、20％或25％。
[0231] 本发明的一个方面涉及在有需要的对象中减少进餐量的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0232] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象中减少进餐量。
[0233] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于减少对象的进餐量的非治疗用途。
[0234] 在一个实施方案中，进餐量减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前的进餐量，进餐量减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，进餐量减少至少15％、20％或25％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前的进餐量，进餐量减少至少15％、20％或25％。
[0235] 本发明的一个方面涉及在有需要的对象中减少食物摄入的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0236] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象中减少食物摄入。
[0237] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象中减少食物摄入的非治疗用途。
[0238] 在一个实施方案中，食物摄入减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前的食物摄入，食物摄入减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，食物摄入减少至少15％、20％或25％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前的食物摄入，食物摄入减少至少15％、20％或25％。
[0239] 本发明的一个方面涉及在有需要的对象中控制体重增加、特别是减少体重增加的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0240] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象中控制体重增加、特别是减少体重增加。
[0241] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象中控制体重增加、特别是减少体重增加的非治疗用途。
[0242] 本发明的另一个方面还涉及在有需要的对象中刺激体重减轻的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0243] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象中刺激体重减轻。
[0244] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象中刺激体重减轻的非治疗用途。
[0245] 在一个实施方案中，刺激体重减轻至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的体重减轻，刺激体重减轻至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，刺激体重减轻至少15％、20％或25％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的体重减轻，刺激体重减轻至少15％、20％或25％。
[0246] 本发明的另一个方面还涉及在有需要的对象中减轻体重的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0247] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象中减轻体重。
[0248] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象中减轻体重的非治疗用途。
[0249] 在一个实施方案中，体重减轻至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的体重，体重减轻至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，体重减轻至少15％、20％或25％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的体重，体重减轻至少15％、20％或25％。
[0250] 本发明的一个方面涉及在有需要的对象中降低脂肪质量与瘦肉质量比的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0251] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物，其用于在有需要的对象、特别是肥胖对象中降低脂肪质量与瘦肉质量比。
[0252] 本发明的一个方面涉及根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物用于在对象、特别是体重正常或简单的超重对象中降低脂肪质量与瘦肉质量比的非治疗用途。
[0253] 在一个实施方案中，脂肪质量与瘦肉质量比降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的脂肪质量与瘦肉质量比，脂肪质量与瘦肉质量比降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，脂肪质量与瘦肉质量比降低至少15％、20％或
25％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的脂肪质量与瘦肉质量比，脂肪质量与瘦肉质量比降低至少15％、20％或25％。
7％、8％、9％或10％。在一个实施方案中，脂肪质量与瘦肉质量比降低至少15％、20％或
25％。在一个特定的实施方案中，相对于施用根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物之前对象的脂肪质量与瘦肉质量比，脂肪质量与瘦肉质量比降低至少15％、20％或25％。
[0254] 在一个实施方案中，根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、膳食补充剂或食品组合物的用途是化妆品用途。
[0255] 在一些实施方案中，对象是女性。在一些实施方案中，对象是男性。
[0256] 在一些实施方案中，对象是儿童，例如年龄未满18岁(以人类年龄为单位)的个体。在一些实施方案中，对象是成年人，例如18岁或18岁以上(以人类年龄计)的个体。
[0257] 在一个实施方案中，对象是肥胖的。在一个实施方案中，对象的体重指数(BMI)高于30。
[0258] 在一个实施方案中，对象是中等肥胖的。在一个实施方案中，对象的BMI为约30至约35。在一个实施方案中，对象是严重肥胖的。在一个实施方案中，对象的BMI为约35至约40。在一个实施方案中，对象是病态肥胖的。在一个实施方案中，对象的BMI为约40至约50或大于50。
[0259] 在一个实施方案中，对象是不肥胖的。在一个实施方案中，对象的BMI低于30。在一个实施方案中，对象是超重的。因此，在一个实施方案中，对象的BMI为约25至约30。
[0260] 在一个实施方案中，对象是健康的超重对象。在一个实施方案中，对象是非健康的超重对象。
[0261] 在一个实施方案中，对象具有正常体重。在一个实施方案中，对象的BMI为18.5至25。
[0262] 在一个实施方案中，对象正在进行减肥性饮食和/或打算减肥。在另一个实施方案中，对象未进行减肥性饮食和/或未打算减肥。
[0263] 在一个实施方案中，对象有增重的风险。在一个实施方案中，对象有累积过多脂肪的风险。
[0264] 在一个实施方案中，对象有发展成超重和/或肥胖症的风险。在一个实施方案中，对象有发展成超重和/或肥胖相关的疾病和病症的风险。
[0265] 在一个实施方案中，对象是暴饮暴食者。在一个实施方案中，对象患有暴饮暴食症或强迫性进食症。
[0266] 在一个实施方案中，将本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、或载体以组合物、药物组合物、药物或疫苗的形式施用于对象。在一个实施方案中，将本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、或载体与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质例如可生物降解的聚合物组合以形成药物组合物。
[0268] 所公开的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗可以以多种方式递送至靶细胞。选择的递送机制将部分取决于所靶向的细胞的类型以及递送是在例如体内还是体外进行。技术人员将能够适应性改变本发明的多肽或核酸序列的递送。
[0269] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗经口给药。适用于经口给药的制剂的实例包括但不限于：固体形式、液体形式和凝胶。适于经口给药的固体形式的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、压制片剂、扁囊剂、糯米纸囊剂(wafer)、糖衣丸剂、糖衣片剂、或分散片剂/崩解片剂、散剂、适于在经口给药之前溶解或悬浮在液体中的固体形式、和泡腾片。适于经口给药的液体形式的实例包括但不限于溶液、混悬剂、可饮用溶液、酏剂、密封瓶、饮剂、浸液、糖浆剂和液体。
[0270] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗通过注射给药，优选通过全身注射给药。适用于全身注射的制剂的实例包括但不限于：液体溶液或混悬剂、适合在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。全身注射的实例包括但不限于静脉内、皮下、肌内、皮内、玻璃体内和腹膜内注射或灌注。在另一个实施方案中，当注射时，本发明的组合物、药物组合物或药物是无菌的。获得无菌药物组合物的方法包括但不限于GMP合成(GMP代表“药品生产质量管理规范”)。
[0271] 在另一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗通过局部给药。适于局部给药的制剂的实例包括但不限于棒、蜡、霜剂、洗剂、软膏剂、香脂、凝胶剂、面膜、免洗洗剂和/或类似制剂。
[0272] 在本发明的一个实施方案中，软膏剂是油性软膏；乳化软膏，例如水包油或油包水软膏；或水溶性软膏，优选是油性软膏。
[0273] 在本发明的一个实施方案中，油性软膏使用以下基质：例如动植物油；动植物脂肪；蜡；凡士林，例如白色凡士林或凡士林油；和石蜡，例如液体石蜡或石蜡油。
[0274] 在另一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗也可以使用透皮系统局部施用，该透皮系统例如为具有树脂交联剂的基于丙烯酸的聚合物黏合剂中的一种，其浸渍有组合物并层压到不可渗透的背衬上。适于透皮给药的制剂的实例包括但不限于软膏剂、糊剂、霜剂、膜剂、香脂、贴剂例如透皮贴剂、凝胶剂、脂质体形式等。
[0275] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗可以作为透皮贴剂局部给药，更特别地作为缓释透皮贴剂局部给药。透皮贴剂可以包括任何常规形式，例如黏合剂基质、聚合物基质、储库型贴剂、基质或整体式层压结构，并且通常由一个或多于一个背衬层、黏合剂、渗透促进剂、任选的速率控制膜和离型衬垫组成，该离型衬垫在施用前除去以暴露黏合剂。聚合物基质贴剂还包含聚合物基质形成材料。合适的透皮贴剂在本领域中已有很好的描述[参见，例如美国专利5262165、5948433、6010715和6071531]。
[0276] 在一个实施方案中，本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗以控释、延迟释放、延长释放、长效释放、改良释放、持续释放或定时释放形式施用。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合物、药物组合物、药物或疫苗还包含持续释放的基质，例如可生物降解的聚合物。
[0277] 在一个实施方案中，根据本发明的膳食补充剂或食品组合物将会经口施用。适用于经口施用的制剂的实例包括但不限于：固体形式、液体形式和凝胶。适于经口施用的固体形式的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、压制片剂、扁囊剂、糯米纸囊剂、糖衣丸剂、糖衣片剂、或分散片剂/崩解片剂、散剂、适于在口服之前溶解或悬浮在液体中的固体形式、和泡腾片。适于经口施用的液体形式的实例包括但不限于溶液、混悬剂、可饮用溶液、酏剂、密封瓶、饮剂、浸液、糖浆剂和液体。
[0278] 在一个实施方案中，根据本发明的膳食补充剂或食品组合物被配制成粉末，例如，用于与可食用液体如牛奶、果汁、水，或可食用凝胶或糖浆混合，以混合到其他饮食性液体或食物中。在一个实施方案中，例如，将根据本发明的膳食补充剂或食品组合物与其他食物或液体一起配制以提供预先测量的补充食物，例如单独的食用棒(serving bar)。可以根据需要添加调味剂、黏合剂、蛋白质、复合碳水化合物等。
[0279] 在一个实施方案中，本发明的膳食补充剂或食品组合物使用上述维生素、矿物质和其他营养素的任何药学上可接受的形式(包括它们的盐)配制。优选的形式是碳酸钙、氢氧化镁或硫酸镁、四硼酸钠、氧化铜、硫酸锰、硫酸锌、胆钙化醇、富马酸亚铁、盐酸吡哆醇、吡啶甲酸铬、d-α-生育酚乙酸酯和抗坏血酸。
[0280] 在一个实施方案中，每天至少一次、每天两次或每天至少三次施用治疗有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗。在另一个实施方案中，每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天或每七天施用一次治疗有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗。
[0281] 在另一个实施方案中，每周一次、每周两次、每两周一次或每月一次施用治疗有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗。在另一个实施方案中，每月施用治疗有效量的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗持续至少2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。
[0282] 在另一个实施方案中，根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或载体的治疗有效量为约1μg至5g。在另一个实施方案中，待施用的根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或载体的治疗有效量为约0.1μg/kg至1g/kg，即约0.1μg/kg体重至1g/kg体重。
[0283] 在一个实施方案中，本发明的方法用于慢性治疗，即，长时间施用本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗持续例如，至少约1周、1个月、1年或超过1年。
[0284] 在另一个实施方案中，本发明的方法用于急性治疗，例如仅施用1次、2次或3次本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗进行治疗。
[0285] 在一个实施方案中，重复施用本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物或疫苗、膳食补充剂或食品组合物，例如每天2次至3次，持续一天或超过一天，并且通常持续至少4天，甚至4周至15周的持续时间，并在适当情况下有一个或多于一个中断的期间。在一个实施方案中，在对象进餐的同时或与对象进餐相继施用本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。在一个实施方案中，在对象进餐前施用本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、载体、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0286] 本发明还涉及试剂盒，其包含根据本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、组合物、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物。
[0287] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含向有需要的对象施用多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物的装置。
[0288] 施用多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物的装置包括但不限于注射器、针头和其他材料。在一些实施方案中，施用多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、药物组合物、药物、疫苗、膳食补充剂或食品组合物的装置包括预先填充有本发明的多肽或蛋白质、多核苷酸或核酸、药物组合物、药物或疫苗的注射器。
[0290] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于治疗或预防有需要对象的肥胖症。在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于治疗或预防有需要对象的超重和/或与肥胖有关的疾病或病症。
[0291] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于在有需要的对象中诱导饱足感、延长饱腹感、减少进餐量、减少食物摄入、控制体重增加、减少体重增加、刺激体重减轻、减少体重和/或降低脂肪质量与瘦肉质量比。
附图说明
[0293] 图1是一张照片，其显示了在ClpB的蛋白质组学鉴定过程中使用二维凝胶电泳(a)和用抗α-MSH抗体(b和c，由α-MSH预吸附)的免疫印迹进行的大肠杆菌K12胞质蛋白分离(斑点1、2、3和4)。斑点5、6、7和8对应于蛋白质GroEL(来自Tennoune等人，2014)。
[0294] 图2是序列的比对，其显示人α-MSH肽与大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌的ClpB蛋白之间的同源性(A)，以及α-MSH肽与干酪乳杆菌(L.casei)、动物双歧杆菌(B.animalis)、粪肠球菌(E.fecalis)和酿酒酵母(S.cerevisiae)的ClpB蛋白同源物之间的同源性(B)。
[0295] 图3是一张照片，其显示了用抗α-MSH抗体显示的ClpB蛋白(左列)和用0.01％胰蛋白酶处理后的ClpB蛋白片段(右列)的蛋白质印迹。
[0296] 图4是一张照片，其显示了用抗α-MSH抗体(a)和抗ClpB抗体(b)揭示的小鼠(A)和大鼠(B)的血浆、下丘脑和结肠黏膜的蛋白质印迹。
[0297] 图5是一张图表，其显示了与大肠杆菌野生型(中间列)和大肠杆菌ΔClpB(右列)的总蛋白一起孵育的原代培养肠细胞的PYY分泌，其中均用0.01％的胰蛋白酶预孵育，并相对未经预先孵育的大肠杆菌野生型(对照，左列)的总蛋白进行归一化。**：未配对的t检验p＝0.0078；$：未配对的t检验p＝0.0571(趋势)。
[0298] 图6是一个柱状图，其显示了在用浓度均为10nM的ClpB蛋白和约25kDa的ClpB片段孵育后，大鼠结肠和回肠中PYY的分泌。结果表示为与对照(用PBS孵育)相比的比率。
[0299] 图7是显示与分别施用对照缓冲液的对照组小鼠相比，通过腹膜内(i.p.)注射施用2pmol的体积为200μL的全长ClpB蛋白(A)或约25kDa片段(B)的小鼠累积食物摄入量的图。
[0300] 图8是显示与分别施用对照缓冲液的对照组小鼠相比，经口施用60pmol的体积为为200μL的全长ClpB蛋白(A)或约25kDa片段(B)的小鼠累积食物摄入量的图。实施例
[0301] 通过以下实施例进一步说明本发明。
[0302] 实施例1：鉴定细菌蛋白与α-MSH具有同源性
[0303] 先前的计算机分析表明，大肠杆菌和一些其他微生物的几种蛋白质与α-MSH的氨基酸序列同源，这表明它们可能与产生α-MSH反应性自身抗体有关(Fetissov，in：Neuropsychiatric Disorders and Infection，Fatemi，S.H.(ed.)，Taylor&Francis Books Ldt，2004，pp 253-262；Fetissov等人，2008.Nutrition.24：348-359)。
[0304] 为了找出哪些细菌蛋白可能不仅是理论上的而且是功能性的α-MSH抗原模拟物，已经使用大肠杆菌菌株K12来进行新的蛋白质组学方法。这种方法的新颖性在于利用众所周知的免疫检测方案(例如蛋白质印迹)中的一抗导致的所谓的非特异性染色现象。在这种方法中，研究了除用于抗体产生的抗原肽以外的其他蛋白质的“非特异性染色”，作为α-MSH肽和细菌蛋白质之间结构构象同源性的基础。
[0305] 材料和方法
[0306] 本文综述的蛋白质组学方法已用于原始研究(Tennoune等人，2014，Transl Psychiatry，4：e458)且在于二维凝胶电泳，以分离大肠杆菌K12的总蛋白。
[0307] 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0308] 对于二维(2D)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，将400μg大肠杆菌K12蛋白提取物添加到等电聚焦缓冲液(7M尿素，2M硫脲和0.5％两性电解质，pH4至7，20mM二硫苏糖醇，2mM三丁基膦，2％CHAPS和0.005％溴酚蓝)，在室温下轻微摇动溶解60分钟。使用ReadyStrip IPG Strip(18cm，pH 4至7NL，Bio-Rad，Marnes-la-Coquette，法国)进行一维凝胶分离。在用等电聚焦缓冲液对条带进行被动水合24小时后，将蛋白质样品通过放置在距阴极1.5cm处的装载杯添加到条带中。用Ettan IPGphor 3系统(GE Healthcare)以四个步骤(31500Vh)进行等电聚焦：500V持续1h、1000V梯度、10000V梯度和10000V持续2h。在分别用2％二硫苏糖醇和2.5％碘乙酰胺进行两个平衡步骤后，在Ettan Daltsix垂直电泳系统(GE Healthcare)上进行第二维测量，即SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺凝胶，20cm×18cm×1mm)，每个凝胶12mA。SDS-PAGE后，在室温下将2D凝胶在2％(体积∶体积)正磷酸和50％(体积∶体积)甲醇中固定2小时。
[0309] 然后用水冲洗凝胶，并通过CBB G-250(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)染色(每升34％(体积∶体积)甲醇，17％(重量：体积)硫酸铵，2％(体积：体积)正磷酸和0.66g CBB G-250)使蛋白质斑点可视化。
[0310] 免疫印迹法
[0311] 2D-PAGE后，通过干转移法(Trans Blot Cell，Bio-Rad)在0.8mA.cm-2的恒定电流下将大肠杆菌胞质蛋白转移到Hybond-ECL聚偏二氟乙烯膜(GE Healthcare)上，持续2h。转-1 -1移后，用在磷酸盐缓冲液(PBS；10mmol.L Tris，pH 8和150mmol.L NaCl)中并加有0.05％(体积∶体积)Tween 20的5％(重量：体积)牛奶(Regilait，Macon，法国)封闭膜。洗涤后，将膜与多克隆兔抗α-MSH IgG(1∶1000，Peninsula Laboratories，San Carlos，CA，USA)在4℃下孵育过夜，然后洗涤并与多克隆猪抗兔辣根过氧化物酶结合的Ig(1∶3000；Dako，Trappes，法国)一起孵育。免疫印迹通过ECL检测系统(GE Healthcare)显色，用
ImageScanner II(GE Healthcare)进行扫描，并使用Labscan 6.00软件(GE Healthcare)进行数字化。
ImageScanner II(GE Healthcare)进行扫描，并使用Labscan 6.00软件(GE Healthcare)进行数字化。
[0312] 用10-6的α-MSH肽(Bachem AG，Bubendorf，瑞士)在4℃下过夜吸附兔抗α-MSH IgG后，执行相同的步骤。
[0313] 蛋白质鉴定
[0314] 使用Ettan Spot Picker(GE Healthcare)从CBB G-250染色的2D凝胶中切下目标蛋白质斑点，并在Ettan Digester(GE Healthcare)上进行蛋白质的凝胶内自动消化。然后将蛋白质提取物重悬于10μl的5％乙腈(体积∶体积)/0.1％甲酸(体积：体积)中，然后使用nano-LC1200系统进行分析，该系统与配备了Nanospray离子源和HPLC-chip立方体接口的6340 Ion Trap质谱仪(Agilent Technologies，Courtaboeuf，法国)连接。简而言之，将肽在40-nl RPC18捕集柱上富集和脱盐，然后在Zorbax(孔径30nm，粒径5μm)C18柱(43mm长×
75μm内径；Agilent Technologies)上分离。使用流速400nl.min-1进行9分钟的线性梯度洗脱(0.1％甲酸中的3-80％乙腈)，并用离子阱质谱仪分析洗脱液。为了进行蛋白质鉴定，使用MASCOT Daemon版本2.2.2(Matrix Science，Boston，MA，USA)搜索引擎提取MS/MS峰列表并将其与蛋白质数据库进行比较。使用以下特定参数进行搜索：酶特异性，胰蛋白酶，允许进行一次错位切割；没有固定的修饰；可变修饰，蛋氨酸氧化，半胱氨酸氨基甲酰甲基化，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸磷酸化；单一同位素；肽电荷2+和3+；前体离子的质量公差1.5Da；片段的质量公差0.6Da；设备为电喷雾电离-诱捕仪；分类学，大肠杆菌；国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(NCBI Nr 20120531(18280215序列，6265275233残基)；Bethesda，MD，USA)。如果满足以下条件之一，则可以自动验证蛋白质命中：用每个MASCOT得分为454(Po0.01)的排名至少前两名的肽(粗体和红色)或每个MASCOT得分为447(Po0.05)的排名至少前两名的肽进行鉴定。为了评估误报率，所有初始数据库搜索均使用MASCOT的“诱饵”选项进行。如果假阳性率从未超过1％，则认为结果是相关的。
75μm内径；Agilent Technologies)上分离。使用流速400nl.min-1进行9分钟的线性梯度洗脱(0.1％甲酸中的3-80％乙腈)，并用离子阱质谱仪分析洗脱液。为了进行蛋白质鉴定，使用MASCOT Daemon版本2.2.2(Matrix Science，Boston，MA，USA)搜索引擎提取MS/MS峰列表并将其与蛋白质数据库进行比较。使用以下特定参数进行搜索：酶特异性，胰蛋白酶，允许进行一次错位切割；没有固定的修饰；可变修饰，蛋氨酸氧化，半胱氨酸氨基甲酰甲基化，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸磷酸化；单一同位素；肽电荷2+和3+；前体离子的质量公差1.5Da；片段的质量公差0.6Da；设备为电喷雾电离-诱捕仪；分类学，大肠杆菌；国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(NCBI Nr 20120531(18280215序列，6265275233残基)；Bethesda，MD，USA)。如果满足以下条件之一，则可以自动验证蛋白质命中：用每个MASCOT得分为454(Po0.01)的排名至少前两名的肽(粗体和红色)或每个MASCOT得分为447(Po0.05)的排名至少前两名的肽进行鉴定。为了评估误报率，所有初始数据库搜索均使用MASCOT的“诱饵”选项进行。如果假阳性率从未超过1％，则认为结果是相关的。
[0315] 结果
[0316] 二维凝胶电泳分离大肠杆菌K12总蛋白的结果如图1a所示。转移到膜上后，通过应用多克隆抗α-MSH IgG验证包含α-MSH样表位的蛋白质的存在显示出几个阳性斑点(图1b)。然而，预先用α-MSH肽吸附抗α-MSH IgG后，抗α-MSH IgG的应用仅消除了几个阳性斑点(图
1c)，这表明只有消失的斑点(箭头)才应包含α-MSH样表位。质谱鉴定的最强烈染色的α-MSH特异性染色斑点显示，它们对应于酪蛋白水解蛋白酶B(ClpB)同源物，即一种热休克蛋白家族的96kDa蛋白(图1a的斑点1、2、3、4)。
1c)，这表明只有消失的斑点(箭头)才应包含α-MSH样表位。质谱鉴定的最强烈染色的α-MSH特异性染色斑点显示，它们对应于酪蛋白水解蛋白酶B(ClpB)同源物，即一种热休克蛋白家族的96kDa蛋白(图1a的斑点1、2、3、4)。
[0317] 实施例2：CIpB和α-MSH之间的序列比对
[0318] 肠杆菌的ClpB蛋白已显示出可刺激α-MSH交叉反应性抗体的产生。因此，发明人推测肠杆菌的ClpB蛋白中存在α-MSH样表位。
[0319] ClpB和α-MSH之间的序列比对揭示了大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌ClpB的中心部分(SEQ ID NO：1的氨基酸残基第534至548位)之间存在不连续的6个氨基酸序列同源性(图2A)。使用α-MSH连续序列同源性的搜索算法，通过计算机分析与大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌蛋白数据库中的α-MSH的同源性，无法预测该序列。此外，蛋白质组学方法(Fetissov等人，
2008.Transl Psychiatry，2014，4：e458)也不能鉴定出包含这种连续序列的大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌蛋白，这突出了使用计算机方法难以预测具有功能意义的大蛋白中肽样表位的存在。此外，在其他细菌或酵母菌(例如干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、粪肠球菌和酿酒酵母)中未发现此类序列同源性(图2B)。
2008.Transl Psychiatry，2014，4：e458)也不能鉴定出包含这种连续序列的大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌蛋白，这突出了使用计算机方法难以预测具有功能意义的大蛋白中肽样表位的存在。此外，在其他细菌或酵母菌(例如干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、粪肠球菌和酿酒酵母)中未发现此类序列同源性(图2B)。
[0320] α-MSH是在N末端肽处酰化的13个氨基酸。中心部分HFRW(SEQ ID NO：2的氨基酸残基第6至9位)代表所有中枢黑皮质素(MC)系统肽的通用药效团，是用最重要的氨基酸Arg(8)和Trp(9)激活MC受体所必需的，而N末端和C末端均不同地参与MCR结合(Hruby等人，1987，J.Med.Chem.30：2126-2130； 等人，European Journal of Pharmacology，
1998，349：359-366；Haskell-Luevano等人，2001，Journal of Medicinal Chemistry，44：
2247-2252)。酸性氨基酸Glu(5)(SEQ ID NO：2的氨基酸残基第5位)的存在可通过与碱性Arg(8)(SEQ ID NO：2的氨基酸残基第8位)形成盐桥而参与α-MSH空间构象。这种α-MSH折叠形成β-转角，从而暴露出MCR激活所需的肽核心序列(Li等人，1999，European Journal of Biochemistry，265：430-440)。
1998，349：359-366；Haskell-Luevano等人，2001，Journal of Medicinal Chemistry，44：
2247-2252)。酸性氨基酸Glu(5)(SEQ ID NO：2的氨基酸残基第5位)的存在可通过与碱性Arg(8)(SEQ ID NO：2的氨基酸残基第8位)形成盐桥而参与α-MSH空间构象。这种α-MSH折叠形成β-转角，从而暴露出MCR激活所需的肽核心序列(Li等人，1999，European Journal of Biochemistry，265：430-440)。
[0321] 肠杆菌的ClpB序列具有以下α-MSH肽的特性：
[0322] 1.存在连续的Arg(SEQ ID NO：1中的R542)和Trp(SEQ ID NO：1中的W543)，它们是激活MC受体所必需的α-MSH药效团中的两个关键氨基酸(SEQ ID NO：2中的R8W9)；
[0323] 2.存在与α-MSH中的Glu(SEQ ID NO：2中的E5)同源的带负电荷的Glu(SEQ ID NO：1中的E538)，其对于蛋白质/肽折叠和在β-转角处暴露中心RW序列可能是重要的；
[0324] 3.GIPV545-548(SEQ ID NO：1)与GKPV10-13(SEQ ID NO：2)，即α-MSH的C末端存在序列同源性(75％)。
[0325] 两个第一特性的组合可能对于ClpB的α-MSH样表位(SEQ ID NO：1的氨基酸残基534-548)的独特功能(包括抗原性配体相互作用和α-MSH样配体相互作用)是必需的。
[0326] 所有共生的致病性肠杆菌科细菌都含有相同的ClpB的α-MSH样表位，这暗示了该家族细菌干扰α-MSH信号传导的能力。这些细菌包括但不限于埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷白杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克洛诺菌属和哈夫尼菌属。
[0327] 实施例3：ClpB片段鉴定
[0328] 材料和方法
[0329] ClpB片段化
[0330] 首先，在不同条件下进行片段化：将ClpB以1/10(从5mg/mL的储备液中)进行稀释，并将ClpB 1/10用0.0025％胰蛋白酶消化。将那些不同的条件在37℃下放置20分钟。孵育后，将试管放在冰上立即终止片段化，并进行蛋白质印迹分析。
[0331] 蛋白质印迹
[0332] 片段化后，将不含β-巯基乙醇的Leamli溶液添加到试管中，以在Tris-甘氨酸缓冲液(BioRad，Hercules，美国)中的20％丙烯酰胺SDS凝胶上进行蛋白质印迹，然后转移到硝酸纤维素膜(GE Healthcare，Orsay，法国)上。然后，在室温下用5重量/体积％的在TBS(10mmol/LTris，pH8；150mmol/L NaCl)中并且加入0.05重量/体积％Tween 20的脱脂奶粉封闭膜。封闭后，将膜与抗α-MSH抗体在4℃孵育过夜。将膜与兔多克隆抗α-MSH抗体(1∶1000，Phoenix Pharmaceuticals)在4℃下孵育过夜。在5重量/体积％在TBS/0.05％Tween
20中的脱脂奶粉封闭溶液中洗涤3次后，将膜与过氧化物酶偶联的抗兔IgG(1∶1000，SantaCruz Biotechnology)一起孵育1小时。洗涤3次后，使用ECL检测试剂盒(GE Healthcare)显示过氧化物酶反应。将蛋白条带与分子量标准品(Precision Plus，BioRad)进行比较，并使用ImageScanner III(GE Healthcare)扫描胶片。
20中的脱脂奶粉封闭溶液中洗涤3次后，将膜与过氧化物酶偶联的抗兔IgG(1∶1000，SantaCruz Biotechnology)一起孵育1小时。洗涤3次后，使用ECL检测试剂盒(GE Healthcare)显示过氧化物酶反应。将蛋白条带与分子量标准品(Precision Plus，BioRad)进行比较，并使用ImageScanner III(GE Healthcare)扫描胶片。
[0333] 血浆、下丘脑和结肠黏膜的蛋白质印迹
[0334] 所有动物护理和实验均符合美国国家卫生部制定的准则，并符合法国和欧洲共同体的规定(欧洲共同体官方公报L358，18，1986年12月18日)。将雄性Sprague-Dawley大鼠或C57Bl6小鼠(Janvier Labs，Genest-Saint-Isle，法国)放置在笼子里，并控制环境条件(22℃+/-1℃，昼夜循环12小时，上午7：30照亮)。在适应期，动物自由饮水并给予RM1标准食物(RM1饮食；Special Diet Service Ltd，Witham，埃塞克斯，英国)。
[0335] 从这些大鼠和小鼠中取出结肠黏膜，并用PBS洗涤。还采集了这些相同动物的血浆和下丘脑，并将其储存在-80℃下。
[0336] 用提取缓冲液(PBS+蛋白酶抑制剂(1％))孵育组织。添加的体积取决于样品量。使用波-伊匀浆器(potter)将样品均质化。然后，将对样品进行离心(12000g，20min，4℃)。如果不立即分析，将上清液在-80℃下储存。
[0337] 使用的方案与先前描述的相同，但是在Laemli溶液中添加了10重量/体积％的β-巯基乙醇。然后，在凝胶上迁移之前，将样品在85℃下加热2分钟。测试了两种主要抗体：兔多克隆抗大肠杆菌ClpB抗体(1∶5000，Delphi Genetics)和抗α-MSH抗体(1∶3000，Phoenix Pharmaceuticals)。用于两者的二抗是过氧化物酶偶联的抗兔IgG(1∶5000，Dako)。
[0338] 结果
[0339] 当用抗α-MSH抗体显示时，对用胰蛋白酶预孵育的ClpB蛋白进行的蛋白质印迹显示出多个条带(图3)。因此，胰蛋白酶消化的步骤产生ClpB的几个片段。特别地，约25kDa的产生量似乎比其他片段更多。另外，这些结果证明，这些片段含有与α-MSH肽具有相似性的序列，因为它们被抗α-MSH抗体识别。
[0340] 此外，蛋白质印迹表明，胰蛋白酶消化后溶液中不存在全长ClpB(约96kDa)。
[0341] 另外，图4的结果表明，在小鼠(A)和大鼠(B)的结肠黏膜、下丘脑和血浆中检测到约25kDa的片段。此外，该片段通过多克隆抗α-MSH(a)和抗ClpB抗体(b)显示出来。
[0342] 在对该约25kDa的片段进行测序之后，其似乎对应于ClpB的氨基酸第537位到氨基酸第756位的序列(SEQ ID NO：22)。
[0343] 实施例4：本发明的多肽对PYY和GLP-1释放的影响
[0344] 大鼠结肠中的PYY分泌实验
[0345] 细胞培养
[0346] 安乐死后，对大鼠结肠取样并用新鲜的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。然后用维持生理pH的L-15培养基(Leibovitz-15培养基；Sigma-Aldrich，Mo，US)洗涤肠组织。刮下结肠黏膜，并用在高葡萄糖DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基；法国Dominique Dutsche，补充有5.5mmol/L的L-谷氨酰胺、100U/mL的青霉素、0.1mg/mL的链霉素和非必需氨基酸)中的
0.4mg/mL胶原酶IX(Psichas等人，2015.Int J Obes(Lond).39(3)：424-9)在37℃下消化5分钟至10分钟。将细胞悬浮液以750rpm离心8分钟，并将肠细胞悬浮在添加了10％胎牛血清的相同补充DMEM培养基中。将细胞悬浮液以100μm过滤器(Merck Millipore，美国马萨诸塞州)过滤，并在用1％Matrigel(Corning，NY，美国)包被的24孔板中培养。最后，将板在95％O2/5％CO2气氛中于37℃孵育过夜。
0.4mg/mL胶原酶IX(Psichas等人，2015.Int J Obes(Lond).39(3)：424-9)在37℃下消化5分钟至10分钟。将细胞悬浮液以750rpm离心8分钟，并将肠细胞悬浮在添加了10％胎牛血清的相同补充DMEM培养基中。将细胞悬浮液以100μm过滤器(Merck Millipore，美国马萨诸塞州)过滤，并在用1％Matrigel(Corning，NY，美国)包被的24孔板中培养。最后，将板在95％O2/5％CO2气氛中于37℃孵育过夜。
[0347] 细胞裂解液的制备
[0348] 预先进行野生型(WT)和ClpB缺失(ΔClpB)大肠杆菌K12的细菌培养以进行总蛋白提取。通过在30秒内超声处理，在含有1％蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，Mo，US)的PBS中进行蛋白质提取。然后，在4℃下30分钟内以10000rpm进行离心分离。然后将含有蛋白质的上清液与0.0025％胰蛋白酶在37℃下孵育20分钟。孵育后，通过将试管放在冰上而立即停止片段化。对包含蛋白质的溶液进行取样和计量，以确定每种条件下的总蛋白质浓度。
[0349] 同时，将肠细胞在pH7.4的分泌缓冲液(4.5mM KCl、138mM NaCl、4.2mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、2.6mM CaCl2、1.2mM MgCl2和10mM HEPES)中孵育。然后将细胞在分泌缓冲液中于37℃孵育20分钟，该缓冲液含有0.015μg/μL的经胰蛋白酶消化的大肠杆菌K12WT和大肠杆菌K12ΔClpB蛋白片段(Breton等人，2015.International Journal of Eating Disorders.49：805-808；每种条件下n＝4)。作为对照，还将细胞在PBS中孵育。
[0350] 孵育后，取上清液，离心(3分钟内10000rpm)，立即保存在-80℃下。然后用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、1％IGEPAL-CA 630、0.5％脱氧胆酸和不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物)处理细胞以提取细胞内的肽。立即将细胞裂解物在-80℃冷冻，以进行PYY测量。
[0351] PYY测量
[0352] 在细胞培养基和细胞裂解物中进行PYY测量，以测量PYY释放量(在培养基中)、产量(在裂解物中)和总PYY相对产量(培养基和裂解物)。根据生产商的说明，使用Fluorescent (Phoenix Pharmaceuticals，Inc.)实现该测量。
[0353] 简言之，在所有试剂重构后，将50μl的1x分析缓冲液作为总结合物加入2个孔中，将50μl制备好的肽标准品(一式两份)、50μl再水化阳性对照(一式两份)和50μl制备好的样品(一式两份)加入免疫板上。然后，将25μl再水化的一抗和25μl再水化的生物素化的肽添加到除空白孔之外的每个孔中。将微孔板在300rpm至400rpm的环形摇动下于室温(20℃至23℃)孵育2小时。孵育后，每个孔用350μl的1x分析缓冲液洗涤四次，并添加100μl SA-HRP抗体溶液，该溶液预先通过将12μl SA-HRP稀释到12ml 1x分析缓冲液中而制备。将免疫板在300rpm至400rpm的环形摇动下于室温(20℃至23℃)下再次孵育1小时。孵育后，以与之前相同的方式洗涤每个孔，并添加100μl TMB底物溶液。孵育该板并在室温(20℃至23℃)下在
300rpm至400rpm的环形摇动下避光1小时。
300rpm至400rpm的环形摇动下避光1小时。
[0355] 大鼠结肠和回肠中的PYY分泌实验
[0356] 从雄性大鼠(Janvier Labs，Genest-Saint-Isle，法国)中取出结肠和回肠。将它们用冰冷的PBS洗涤，然后用冰冷的L-15(Leibowitz)培养基(PAA，Yeovil，UK)洗涤。然后将它们用在高葡萄糖DMEM(+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素+1％链霉素+1％非必需氨基酸)中的0.4mg/mL胶原酶XI(Sigma，Poole，UK)在37℃下消化10分钟。离心细胞悬浮液(400g离心10分钟)，将沉淀重悬于高葡萄糖DMEM(与之前相同，但含10％胎牛血清(FBS))。通过尼龙网(孔径为100μm)(Merck Millipore，Mass，美国)过滤细胞悬浮液，并铺板到经1％Matrigel包被的24孔板(Corning，NY，美国)上。将板在95％O2和5％CO2气氛中于37℃孵育过夜。
[0357] 培养24小时后，将细胞在水浴中与分泌缓冲液(4mM KCl、138mM NaCl、1.2mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、2.6mM CaCl2、1.2mM MgCl2和10mM HEPES，调节至pH7.4)和浓度为10nM的全长ClpB或约25kDa片段一起孵育20分钟。作为对照，将细胞与分泌缓冲液和PBS一起孵育。
[0358] 孵育后，将细胞用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1％IGEPAL CA-630、0.5％脱氧胆酸+完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂的混合物)处理以提取细胞内的肽。用细胞刮刀收集细胞，并将裂解物离心(20分钟，12000g)。如果不立即分析，则将裂解物在-80℃下储存。
[0359] 如上所述，使用PYY Fluorescent Immunoassay (Phoenix Pharmaceuticals，Inc.)测定肠激素的分泌。
[0360] 结果
[0361] PYY在大鼠结肠中的释放
[0362] 将用胰蛋白酶预孵育从而产生ClpB片段的与上述相同大肠杆菌蛋白用于针对来自大鼠结肠的原代培养肠细胞的实验。结果显示与对照相比，PYY释放增加(图5)。相反，在ClpB缺失菌株中未观察到效果(图5)。
[0363] 这些结果表明，ClpB的片段导致PYY的更有效释放，从而证明了MC4R的活化(参见Panaro等人，2014.Cell Metab.20(6)：1018-1029)。
[0364] PYY在大鼠结肠和回肠中的释放
[0365] 结果表明，与对照相比，用全长ClpB和用约25kDa片段孵育大鼠肠组织均增加了PYY分泌(图6)。
[0366] 实施例5：本发明的多肽对食物摄入的影响
[0367] 材料和方法
[0368] 单独将雄性C57/B16小鼠放在BioDAQ小鼠笼中(Research Diets，Inc.，New Brunswick，NJ)，以测量食物摄入量。向每只小鼠施用生理血清(n＝6)、全长ClpB或约25kDa的片段。
[0369] 测试了两种给药方式：以200μL体积中2pmol的浓度(n＝8)进行腹膜内(ip)注射、以200μL体积中60pmol的浓度(n＝10)经口施用。
[0370] 结果
[0371] 图7和图8中显示的结果表明，在至少90分钟内，施用约25kDa的片段减少小鼠的食物摄入量，至少与施用全长ClpB蛋白时小鼠食物摄入量的减少相当。
[0372] 特别地，约25kDa片段的经口施用减少食物摄入量，而全长ClpB蛋白的经口施用则没有这种效果(图8)。
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