肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062及其鉴定方法
阅读：1049发布：2020-06-13
专利汇可以提供肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062及其鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程技术领域，公开了一种肇东盐单胞菌耐盐 碱 基因duf2062及其鉴定方法，肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062序列全长552bp，含一个完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；鉴定方法包括：通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2M NaCl的 氨 苄抗性固体培养基作为筛选工具，得到含有耐盐碱基因的 片段 等等。本发明所提出的Hz_duf2062基因对盐碱地 土壤 改良具有重要意义，可用于构建高效的耐盐碱工程菌、开发 微 生物 肥料 和提高 植物 耐盐碱性的转基因领域的应用。，下面是肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062及其鉴定方法专利的具体信息内容。
1.一种肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062，其特征在于：所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062序列全长552 bp，含一个完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.一种利用权利要求1所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062编码的Hz_DUF2062蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.如权利要求2所述的Hz_DUF2062蛋白，其特征在于：所述Hz_DUF2062蛋白在荧光猝灭实验中具有Na+/H+逆向转运蛋白活性 、Li+/H+逆向转运蛋白活性或K+/H+逆向转运蛋白活性，以上所述逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。
4.一种如权利要求1所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062的鉴定方法，其特征在于，所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062的鉴定方法包括：
（1）通过现有技术基因文库与功能互补相结合的方法，以0.2 M NaCl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，得到含有耐盐碱基因的片段；
（2）利用现有的生物信息学软件对基因片段进行分析，确定耐盐碱相关基因，通过PCR扩增得到Hz_duf2062基因，构建含有Hz_duf2062基因的原核表达载体pET-19b-duf2062，用以表达Hz_DUF2062蛋白；
（3）通过基因功能互补的方法，对该基因的生理功能进行鉴定；
再通过荧光猝灭技术手段，以吖啶橙作为荧光探针，检测荧光猝灭及恢复情况，对Hz_duf2062基因编码的Hz_DUF2062蛋白功能进行鉴定。
5.如权利要求4所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062的鉴定方法，其特征在于：构建含有Hz_duf2062基因的原核表达载体pET-19b-duf2062的方法包括：根据Hz_duf2062基因序列，首先利用Primer5软件设计duf2062-F/ duf2062-R特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入Nde I、BamH I两个酶切位点，然后进行Hz_duf2062基因的PCR扩增，预期扩增中间序列片段长度为561 bp；
将PCR扩增产物末端加“A”后连入pEASY-T3载体，然后转化到Trans1-T1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选获得亚克隆；
再用Nde I、BamH I两种内切酶处理连有Hz_duf2062基因的pEASY-T3-duf2062，并同时对表达载体pET19b做相同处理，对处理后的pET19b和Hz_duf2062基因片段进行回收并连接，通过转化的方法将构建好的表达载体pET-19b-duf2062导入异源表达宿主E. coli KNabc中。
6.一种利用权利要求1所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062构建的耐盐碱工程菌。
7.一种利用权利要求1所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062制备的微生物肥料。
8.一种利用权利要求2所述的肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062编码表达的具有Na+/H+逆向转运活性的蛋白。
肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062及其鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其一种肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062 及其鉴定方法。
背景技术
[0002] 高盐碱环境不仅对细菌细胞本身产生毒害作用，而且高浓度的渗透压和离子压力也严重影响了细菌的正常生理功能。同时，在农业生产上具有重要经济价值的，并可作为微生物肥料的细菌耐盐碱能力却十分有限，诸如根瘤菌、固氮菌、磷细菌、钾细菌和根际促生菌等，这严重制约着其在农业生产中的应用前景。解决其最为有效的办法之一就是从耐盐碱细菌中克隆高效的耐盐碱基因，再将其导入可用作微生物肥料的细菌，构建高效耐盐碱基因的工程菌株。所以，细菌耐盐碱基因的克隆与功能鉴定及其耐盐碱分子遗传机制的研究在过去的几十年中一直是一个重要的研究课题。
[0003] 与一般非嗜盐菌相比，嗜盐菌中耐盐碱基因种类更多，其耐盐碱分子遗传机制也更加复杂。因此，从这类菌中获得新型的耐盐碱基因以及高效耐盐碱的关键基因的几率更大，不仅可以增进人们对细菌耐盐分子遗传机制的了解，而且所克隆的关键耐盐碱基因还可以用于构建高效耐盐碱的基因工程菌株。此外，细菌与植物的耐盐碱分子遗传机制具有很大的相似性，它们在高盐碱条件下，均在细胞内积累相似的亲合性物质，并且采用相似的阳离子转运蛋白等转运钠离子等阳离子。因此，嗜盐菌中耐盐碱基因的克隆和功能研究对理解植物的耐盐碱分子遗传机制具有重要的启示作用，并且关键耐盐碱基因还可以用于构建耐盐碱的转基因植物或有效的耐盐碱微生物肥料。
[0004] 综上所述，现有技术存在的问题是：
[0005] 现有的土壤改良的微生物肥料和植物不具有抵御高盐碱的能力；没有结合规模化地发掘高效耐盐碱的新功能基因构建相应基因工程菌株微生物肥料和转基因植物进行改良，缺乏高效耐盐碱细菌资源库的构建及关键新功能基因的发掘理论指导。
发明内容
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肇东盐单胞菌耐盐碱基因 duf2062及其鉴定方法。
[0007] 本发明的目的是从肇东盐单胞菌中获得新型或者高效耐盐碱的关键基因，用以深入研究细菌耐盐碱的分子机制，以及构建转基因耐盐碱作物和微生物，进而充分开发和利用盐碱地。。因此，通过基因文库和功能互补相结合的方法，我们在基因文库构建中常以载体所携带的抗性作为筛选条件之外，利用盐敏感缺陷株E.coli KNabc的生理特性，还在筛选培养基中加入0.2M NaCl作为第二条件，成功地从肇东盐单胞菌中克隆到耐盐碱基因duf2062，所述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062序列全长552bp，是一个完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种利用上述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062 编码的Hz_DUF2062蛋白；核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
[0009] 进一步，所述Hz_DUF2062蛋白在荧光猝灭实验中该蛋白展现出明显的Na+ (Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性，且Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062的鉴定方法包括：
[0013] (3)通过基因功能互补的方法，对该基因的生理功能进行鉴定；再通过荧光猝灭技术手段(以吖啶橙(AO)作为荧光探针，检测荧光猝灭及恢复情况)，对Hz_duf2062基因编码的Hz_DUF2062蛋白功能进行鉴定。
[0014] 进一步，所述对Hz_duf2062基因编码的Hz_DUF2062蛋白功能进行鉴定，具体包括：
[0015] 1)向盛2.5mL缓冲液B的石英杯中加入2μM荧光探针吖啶橙(AO)和 40μg的反转膜，抽吸混匀；
[0016] 2)向1)步骤反应体系中加入终浓度为5mM的Tris-D-乳酸并混匀反应体液，乳酸作为底物，通过呼吸链产生跨膜pH梯度(ΔpH)，此时荧光强度开始下降；利用荧光分光光度计来监控跨膜pH梯度的变化；荧光监控参数设置：激发光(EX)波长492nm，发射光(EM)波长526nm；
[0017] 3)当荧光强度下降至稳定状态时，向反应体系加入终浓度为5mM的NaCl、 KCl、LiCl，破坏pH梯度，荧光强度开始升高；
[0018] 4)根据荧光强度的恢复程度判断并表示Na+(Li+，K+)/H+逆向转运蛋白活性的有无及大小。
[0019] 进一步，构建含有Hz_duf2062基因的原核表达载体Hz_DUF2062蛋白的方法包括：根据Hz_duf2062基因序列，首先利用Primer5软件设计 duf2062-F/duf2062-R特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入Nde I、BamH I 两个酶切位点，然后进行Hz_duf2062基因的PCR扩增，预期扩增中间序列片段长度为561bp；
[0020] 将PCR扩增产物末端加“A”后连入pEASY-T3载体，然后化转到Trans1-T1 感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆；
[0021] 再用Nde I、BamH I两种内切酶处理连有Hz_duf2062基因的 pEASY-T3-duf2062，并同时对表达载体pET19b做相同处理，对处理后的pET19b 和Hz_duf2062基因片段进行回收并连接，通过化转的方法将构建好的表达载体 pET19b-duf2062导入异源表达宿主E.coli KNabc中。
[0022] 本发明的另一目的在于提供一种利用上述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062 构建的耐盐碱工程菌；
[0023] 本发明的另一目的在于提供一种利用上述肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062 制备的微生物肥料。
[0024] 本发明的另一目的在于提供一种利用上述Hz_DUF2062蛋白构建的具有 Na+/H+逆向转运蛋白。
[0025] 本发明的优点及积极效果为：
[0026] 本发明公开肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062及其鉴定方法，该鉴定方法通过0.2M NaCl的筛选培养基中直接克隆到具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，与构建基因文库相比，其目的性更强、效率更高、可以直接获得与耐盐碱有关的基因表型。本发明所提出的Hz_duf2062基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，可用于构建高效的耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的应用。
附图说明
附图说明
[0028] 图中：A.蛋白的跨膜区预测(黑色方块表示跨膜区)；B.蛋白的疏水性分析。
[0029] 图2是本发明实施例提供的Hz_duf2062基因原核表达载体pET-19b-duf2062 的构建流程图；
[0030] 图3是本发明实施例提供的构建Hz_duf2062基因表达载体的电泳检测图；
[0031] 图中：A.Hz_duf2062基因PCR产物电泳结果(第1、2泳道分别为Hz_duf2062 PCR产物、阴性对照)，B.pEASY-T3-duf2062双酶切(Nde I、BamH I)结果， C.Nde I、BamH I双酶切后回收产物电泳结果(第1、2泳道分别为pET-19b及 Hz_duf2062)；
[0032] 图4是本发明实施例提供的Hz_duf2062基因生理功能的鉴定图；
[0033] 图5是本发明实施例提供的本发明实施例提供的Hz_DUF2062系统发育进化树图；
[0034] 图中：◆Hz_DUF2062蛋白，◇表示DUF2062家族其他同源蛋白成员，▲表示已知的具有钠/氢逆向转运活性的蛋白，●表示已知的钠/氢逆向转运蛋白；
[0035] 图6是本发明实施例提供的DUF2062蛋白的同源性比对图；
[0036] ━表示跨膜区
[0037] 图7是本发明实施例提供的Hz_DUF2062蛋白活性的鉴定图；
[0038] 图中：A.Na+/H+逆向转运活性，B.Li+/H+逆向转运活性，C.K+/H+逆向转运活性；
[0039] 图8是本发明实施例提供的Hz_DUF2062蛋白活性的pH轮廓图；
[0040] 图9是本发明实施例提供的Hz_DUF2062对Na+、Li+、K+的亲和能力图；
[0041] 图10是本发明实施例提供的Hz_DUF2062蛋白细胞定位图；
[0042] 图中：M为预染蛋白分子量标准marker，1、3、5泳道为表达有Hz_DUF2062 蛋白的相应样品，2、4、6泳道为阴性对照相应样品。
具体实施方式
[0043] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0044] 本发明公开肇东盐单胞菌耐盐碱基因duf2062及其鉴定方法，从此菌中获取并具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，本发明所提出的Hz_duf2062基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，可用于构建高的效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的应用。
[0045] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
[0046] 本发明实施例以肇东盐单胞菌作为分离新型有效的耐盐碱基因的供体，借助大肠杆菌(Escherichia coli)盐敏感突变株KNabc(ΔnhaA，ΔnhaB，ΔchaA) 的生理特征，通过基因文库筛选和功能互补相结合的技术手段，成功获得耐盐碱基因duf2062，利用各种生物软件对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，发现该基因序列全长552bp，其编码的蛋白属于DUF2062蛋白家族(domain of unknown function with No.2062family)，而且其功能尚未被注释。所以，本发明将其基因命名为Hz_duf2062，其编码的蛋白命名为Hz_DUF2062。功能互补实验显示，Hz_duf2062可使盐敏感突变株KNabc在0.3M NaCl或5mM LiCl的培养基上恢复生长，而且在偏碱性的环境中，其生长能力要明显好于负对照，这表明了该基因具有一定的耐盐碱能力。且利用荧光猝灭技术，发现Hz_DUF2062具有钠/氢逆向转运蛋白活性。跨膜预测分析显示，Hz_DUF2062具有3个跨膜区，和它们亲缘关系最近的同系物有54个高度保守的氨基酸残基，其中主要包括28个疏水性氨基酸、10个带正电的氨基酸和13个极性氨基酸；同源比对和系统进化发育学分析表明，Hz_duf2062是一种新型有效的耐盐碱基因。
[0047] 因此，在上述的基础上，本发明实施例提出了肇东盐单胞菌耐盐碱基因 duf2062及其鉴定方法。其中，所述的Hz_duf2062基因长552bp，是一个完整开放阅读框(ORF)，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0048] 更进一步的，本发明实施例还提出了Hz_duf2062基因的编码蛋白在构建高效的耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的用途。
[0049] 其中，所述的Hz_DUF2062为Hz_duf2062基因在异源原核宿主细胞中表达的蛋白。
[0050] 再进一步的，本发明实施例还提出了一种耐盐碱基因的鉴定方法，包括以下步骤：
[0051] (1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2M NaCl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，首先得到含有耐盐碱基因的片段；
[0052] (2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定可能的耐盐碱的基因，通过PCR扩增得到Hz_duf2062基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；构建含有Hz_duf2062基因的原核表达载体；
[0053] (3)通过基因功能互补的方法，首先对该基因的生理功能进行鉴定；再通过荧光猝灭技术手段，对Hz_duf2062基因编码的蛋白功能进行鉴定。
[0054] 本发明实施例提供一种肇东盐单胞菌duf2062基因的编码蛋白，在荧光猝灭实验中该蛋白展现出明显的Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性，且以上活性具有pH依赖性。
[0055] 所述的肇东盐单胞菌duf2062的编码蛋白属于未知功能的DUF2062蛋白家族(domain of unknown function with No.2062family)，在NCBI蛋白数据库中其功能尚未被注释。Hz_DUF2062为肇东盐单胞菌duf2062基因的原核表达蛋白。为：SEQ ID NO.2。
[0056] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0057] 实施例1.在线生物软件分析Hz_DUF2062蛋白的跨膜区及疏水性：如图1 所示；
[0058] 本发明利用在线预测网站http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/和http://web.expasy.org/protscale/对Hz_duf2062基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白Hz_DUF2062具有三个跨膜区，且蛋白呈现出高疏水性。
[0059] 实施例2Hz_duf2062基因原核表达载体pET-19b-duf2062的构建流程：如图 2所示；
[0060] 根据Hz_duf2062基因序列，首先利用Primer5软件设计duf2062-F/duf2062-R 特异引物(如表1所示)，
[0061] 为：SEQ ID NO.3：CATATGCCGCGCCGTTTTCTG；
[0062] SEQ ID NO.4：GGATCCTTAATCATCAAATTCTGAT。
[0063] 并在基因的5’和3’端分别引入Nde I、BamH I两个酶切位点，然后进行 Hz_duf2062基因的扩增(如表2所示)，预期扩增中间序列片段长度约为561bp (如图3-A所示)。
[0064] 表1 Hz_duf2062基因表达载体构建引物序列
[0065]
[0066] 表2 PCR扩增反应
[0067]
[0068] 将上述PCR产物末端加“A”后连入pEASY-T3载体，然后化转到Trans1-T1 感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆。再用Nde I、BamH I两种内切酶处理连有Hz_duf2062基因的pEASY-T3-duf2062(如图3-B所示)，并同时对表达载体pET19b做相同处理，对处理后的pET19b和Hz_duf2062基因片段进行回收(如图3-C所示)并连接，通过化转的发法将构建好的表达载体pET-19b-duf2062导入异源表达宿主E.coli KNabc中。
[0069] 实施例3Hz_duf2062基因生理功能的鉴定：
[0070] 为了鉴定duf2062基因的生理功能，本发明以KNabc/pET19b和KNabc/pUC18 为负对照，将亚克隆KNabc/pET19-duf2062和原始克隆KNabc/pUC-ZD-4的菌液按1％接种量转接到含有不同盐浓度(0-0.4M NaCl或0-15mM LiCl)的新鲜LBK 培养基中培养24h。结果如图4-A&B所示：在0.3M NaCl或5mM LiCl的盐胁迫下，与负对照相比，亚克隆KNabc/pET19-duf2062和原始克隆KNabc/pUC-ZD-4 均能使盐敏感突变株KNabc恢复生长，并且他们的生长趋势基本一致。在碱性环境中(如图4-C)，亚克隆KNabc/pET19-duf2062和原始克隆KNabc/pUC-ZD-4在 pH 7.5时能使盐敏感突变株KNabc恢复生长，而在pH 8.0的环境中，呈现微弱生长。这就说明Hz_duf2062基因具有明显的耐盐碱能力。
[0071] 实施例4Hz_duf2062基因表达蛋白的生物信息学分析：
[0072] 一、Hz_duf2062基因编码蛋白理化性质：
[0073] 采用ExPASy Protparam对Hz_duf2062基因编码蛋白进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明：耐盐碱基因Hz_duf2062编码183个氨基酸，相对分子量为21.3294kD，等电点11.76，为碱性蛋白；组成的原子是C(973)H(1556) N(284)O(236)S(10)，一共3059个原子，理论半衰期30h，不稳定参数 79.48，是不稳定蛋白，氨基酸中带正电荷氨基酸(Arg、Lys)28个，带负电荷氨基酸(Asp、Glu)10个。Hz_DUF2062蛋白的氨基酸组成(表3)，结果显示其中包含的中性疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸分别为44.9％、39.5％、11.8％、15.6％。说明抗病候选基因Hz_duf2062编码蛋白为具有一定疏水能力不稳定的碱性蛋白。
[0074] 表3 Hz_duf2062基因编码蛋白氨基酸组成
[0075]
[0076] 二、Hz_DUF2062系统发育进化树
[0077] 利用Neighbor-Joining算法，对Hz_DUF2062家族蛋白、已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白进行系统进化距离分析。结果表明(图5)：DUF2062与同家族的其他蛋白聚集在一簇阙值(bootstrap values)为91％的分支上，此分支与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白系统进化距离很远。所以，本发明认为Hz_DUF2062应该是一类新型的钠/氢逆向转运蛋白。
[0078] 二、Hz_DUF2062与同系物的同源性比对
[0079] 本发明根据上述二的结果，选择了与它进化距离最近的17个同源蛋白进行多序列比对(图6)，结果发现：Hz_DUF2062与这些同系物的同源性在55.1-92.9％之间，其中与Halomonas sp.TD01的同源性最高为92.9％。
[0080] 实施例5Hz_DUF2062蛋白功能的鉴定
[0081] 一、Hz_DUF2062蛋白活性的鉴定
[0082] 本发明将含有pET-19b-duf2062和pET19b的KNabc细胞，用法式细胞破碎机制备成反转膜，以吖啶橙作为荧光指示剂，检测其Na+(Li+，K+)/H+逆向转运蛋白活性(图7)。结果发现：在荧光猝灭的最低平衡点加入单一的单价阳离子溶液，反转膜KNabc/pET-duf2062的荧光值升高(图7-A&B&C左侧)，而负对照KNabc/pET19b在加入单价阳离子溶液后荧光值没有变化(图7-A&B&C右侧)。所以，我们认为Hz_DUF2062是具有转运Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性的。
[0083] 二、Hz_DUF2062蛋白活性的pH轮廓
[0084] 钠/氢逆向转运蛋白对pH是具有一定的依赖性的，即它的转运活性会随环境中pH的变化而改变。因此，本发明在不同pH(6.5-9.5)的反应体系中，检测Hz_DUF2062的蛋白活性。结果发现：在pH 7.0-9.0的范围内，Hz_DUF2062 对Na+、Li+、K+的转运活性会随pH的变化而改变(其趋势见图8)，而且当反应体系中的pH为8.5时，DUF2062的离子转运活性最高，并且对三种不同离子的转运活性也存在一定的差距。
[0085] 三、Hz_DUF2062对Na+、Li+、K+的亲和能力
[0086] 由于Hz_DUF2062对Na+、Li+、K+三种离子转运能力是有差别的，即对底物偏好性不同。当K0.5值越小时，就表示对某一底物的转运偏好性越好。所以，本发明通过OriginPro 8.6数据分析软件计算K0.5值(图9)。发现，当转运活性达到最大反应活性的一半时，Na+、Li+、K+的K0.5值分别是0.2±0.13mM、0.22 ±0.1mM、0.43±0.08mM，换而言之，Hz_DUF2062对Na+的偏好性最好，对三种离子的偏好由强到弱依次为：Na+>Li+>K+。
[0087] 实施例6Hz_DUF2062蛋白的细胞定位
[0088] 本发明利用超离法将KNabc/pET-19b-duf2062细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开，再通过蛋白印迹杂交(Western Blot，简称WB)的技术手段，分别对提取的细胞全蛋白(超声破碎上清液)、胞浆蛋白(超离上清液)和膜蛋白(超离沉淀)进行检测。理论上，WB实验只能在制备的细胞全蛋白(超声破碎上清液)和膜蛋白(超离沉淀)样品中检测出目的条带(即Hz_DUF2062所携有的标签抗体信号)，而胞浆蛋白样品(超离上清液)则检测不出目的条带。
[0089] 发现(图10)：第一，与负对照相比(B-2、4、6)，Hz_DUF2062蛋白——只在细胞的全蛋白和膜蛋白样品中被检测出条带(B-1、5)，而胞浆蛋白样品中没有(B-3)，综上所述，Hz_DUF2062的确是位于在内膜上的膜蛋白，这与之前对它的分析是相互印证的。
[0091]
[0092]
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