人类肠道病原菌感染诊断用甲型副伤寒沙门菌特异性基因
探针
技术领域
背景技术
[0002] 肠道致病菌的传统检测方法是在细菌培养的
基础上，根据致病菌的生化反应及血清学试验进行鉴定，目前还存在许多不足之处：(1)受条件限制，许多细菌如厌
氧菌的培养只有极少数的实验室能进行，大多数临床检验实验室存在漏检的问题；(2)检测周期长，尤其当遇到急性重症病人，因不能及时获得确切致病菌的诊断结果，往往对临床用药指导不
力；(3)工作量大且效率低，我国
微生物实验室检验
粪便最常用的培养基是Mac琼脂和SS琼脂，
碱性蛋白胨
水， 4号琼脂等，主要针对沙门菌属、志贺菌属，弧菌属的检出，而对其他细菌的检验则需在上述选择性培养阴性基础上，再根据临床医生提供的临床症状有针对性地选用其他特殊培养基进行检验；(4)漏检
真菌。因此，目前临床微生物实验室对腹泻粪便中病原菌培养的阳性率较低。此外，目前三级医院大都购置了进口的微生物鉴定系统，也是基于细菌培养和生化反应进行鉴定，它必须在适当的培养基上生长出致病菌，然后选择适当的鉴定卡，孵育一段时间后，通过自动判读致病菌的生化反应对细菌进行鉴定，同样对有些细菌只能鉴定到属，还需结合相应的血清学试验才能鉴定到种。所以，用微生物鉴定系统检测肠道致病菌省工不省时，也不能提高检测的阳性率。在得不到确切的病原菌检验结果情况下，临床医师也只能据一般病症采用抗菌药的联用，以期获得良好的
治疗效果，此举也是加剧肠道致病菌耐药问题的主要原因。因此，迫切需要开展新技术的研究与应用，以提高肠道致病菌的检测率，降低肠道病原菌感染对人类健康的威胁。
[0003] 近年来随着细胞和分子生物学的发展，许多常用的分子生物学技术，如PCR、多重PCR、
荧光定量PCR等技术被临床实验室用于有关致病菌的检测。运用PCR 检测肠道感染的致病细菌时，虽有快速灵敏等优点，但也有易交叉污染，不能定量，一次只能检测一个基因等缺点；荧光定量PCR虽然能快速定量，但一次仍然只能检测一个基因(细菌)；多重PCR技术一次可检测多个基因(细菌)，但由于是根据PCR产物分子大小来区分，所以一次检测一般不超过6个基因(细菌)，即使是多重荧光定量PCR，其一次检测的目的基因(细菌)数量仍受限制，一般不超过10个。
[0004]
基因芯片分析技术在细菌分子流行病学调查、细菌基因鉴定、基因突变及多态性分析、基因表达谱分析等方面已有许多研究报道，在病原微生物检测方面也有尝试。以往研究发现，运用基因芯片直接检测细菌时灵敏度较低，一次往往需要105～6菌量，为了提高灵敏度，多采用与PCR结合应用，如设计通用引物扩增各种细菌的保守基因，如16SRNA或23SrRNA基因，扩增产物经荧
光标记后，再与芯片上固定的各种据保守基因的局部可变区设计的特异性探针进行杂交。利用此法虽可显著提高检测的灵敏度，但由于rRNA基因在同菌属内不同菌种之间的差异很小，对属内的种间区别很难。而且rRNA基因的二级结构和三级结构也常影响杂交效率，造成许多假阴性、
假阳性结果。另外，也有基因芯片与多重PCR结合应用报道，据各种致病菌特异性标志基因，如毒性因子基因等制备芯片探针固定于芯片，利用特异引物对样品先进行多重PCR扩增，并同标记时荧光，然后与基因芯片进行杂交。此法虽兼顾了检测的特异性和灵敏度，但也有一定的局限性，主要是因为多重PCR扩增目的基因时，一次同时扩增的基因种类受限，因为引物对数量过多，引物间易形成二聚体影响扩增效率，因此在检测是往往需对一份样品进行数次多重PCR扩增，一定程度上削弱了基因芯片的高效性。因此，日前还没有非常成熟的基因芯片用于临床肠道致病菌的
鉴别诊断。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服
现有技术中用微生物鉴定系统检测肠道致病菌省工不省时的
缺陷，提供一种人类肠道病原菌感染诊断用甲型副伤寒沙门菌特异性基因探针。
[0006] 本发明一种甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID：1所示。
[0007] SEQ ID：1甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)特异性探针的核苷酸序列[0008] GACCCTGGGT CTGGATACGC TGAATGTGCA GAAAAAATAT GATGTGAAGA GCGAAGCGGT CACGCCTTCG GCTACATTAA GCACTACTGC ACTTGATGGT ACTGGCCTCA AAACCGGAAC CGGTTCTACA ACTGATACTG GTTCAATTAA GGATGGTAAG GTTTACTATA ACAGCACCTC TAAAAATTAT TATGTTGAAG TAGAATTTAC CGATGCGACC GATCAAACCA ACAAAGGCGG GGCGGTAAAA GGCAGTGGGT TAGGGCTGAG TATCGCCAGA GATTGTATTC GTCGAATGCA
[0009] 该特异性探针的制备方法如下：
[0010] S1、DNA序列初选
[0011] 从特异性DNA序列信息库中选取相应的序列，并结合根据相关文献查得其菌种特有的
毒力基因或
抗原编码基因，并进一步确定各基因的特异性区域，以此作为探针设计的候选序列。
[0012] S2、DNA序列验证
[0013] 据初选的DNA序列，设计特异性引物，选用标准和临床分离的野生菌株进行PCR调查和相应的序列分析验证。
[0014] 根据验证的病原菌特异性探针序列，设计合成引物并经PCR扩增相应的特异性核苷酸
片段，每个长约200核苷酸，再通过重叠延伸PCR将某种病原菌的 3至5个特异性片段扩增链接，以此作为各种病原菌特异性的探针。因为单一基因的特异性区域往往有限，仅扩展某特异性基因的长度来获取灵敏度，必然会造成特异性和削弱，此类将多个基因的高度特异区域
串联制成的探针，不但有较高的特异性，而且由于可同时与多个特异片段杂交使检测的灵敏度大为提高。
[0015] 本发明所达到的有益效果是：
[0016] 本项目将通过改进探针设计、改进核酸提取工艺及标记荧光等研究，并综合运用以提高基因芯片检测直接检测病原菌的灵敏度，建立一个针对我国人类各种常见肠道病原菌种特异性的基因芯片分析系统，使得无需通过多重PCR扩增而能直接从粪便标本中检测各种肠道致病菌。此外，从基因芯片获得的
信号强度还将可以反映标本中各种细菌的丰度，因而也能对肠道复合感染和菌群失调等病症提供更多的诊疗信息。随着芯片
扫描仪在医院的普及，这种特异且广谱的肠道病原菌诊断用基因芯片将会有较广阔的市场前景，推广应用将会产生极大的社会和经济价值。
[0017] 在细菌特异性DNA序列信息库基础上，设计开发肠道细菌感染诊断用的基因芯片分析系统，能针对目前临床上比较繁杂而以重要的肠道细菌检验工作，克服现有应用技术的诸多弊端，充分提高临床检验中心室检测效率和正确率，也能进一步验证和发挥细菌特异性DNA序列信息库建立的意义和作用。
具体实施方式
[0018] 以下对本发明的优选
实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019] 实施例1
[0020] 本发明提供一种人类肠道病原菌感染诊断用甲型副伤寒沙门菌特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该探针可用于
化学发光法检测检测甲型副伤寒沙门菌含量，通过化学发光强度获取甲型副伤寒沙门菌的含量，并采用标准加入法对检测效果进行了评价，结果表明本发明的方法在甲型副伤寒沙门菌检测中具有精
密度高的特点，表面本发明的探针具有较高的精密度，样品的回收率为98.5～102.3％。
[0021] 在特异性评价时，将设计制备的甲型副伤寒沙门菌DNA探针与副溶血弧菌、痢疾志贺菌、鼠伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌特异DNA探针点制于玻璃芯片表面，每种探针双重平行点制，将健康人群糞便样本提取的DNA 10μg加1.0ng甲型副伤寒沙门菌基因组DNA，作为样品，用8联随机引物和Kelnow酶外体进行荧光(Cy3)标记，后与芯片探针进行杂交，清洗后扫描分析，将荧
光信号数字化后，以甲型副伤寒沙门菌探针产生的平均荧光强度计100％，其他探针产生的相对荧光强度均小于15％，表明本发明的甲型副伤寒沙门菌探针灵敏性和特异性较好。
[0022]
[0023] 采用同样方法，将鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌的DNA探针，分别经荧光标记后与甲型副伤寒沙门菌特异性DNA 探针进行杂交，相对荧光强度均小于目标探针信号的15％，结果如下：
[0024] 与鼠伤寒沙门菌DNA杂交
[0025]
[0026] 与伤寒沙门菌DNA杂交
[0027]
[0028]
[0029] 与丙型副伤寒沙门菌杂交
[0030]
[0031] 与伤寒沙门菌杂交
[0032]
[0033] 由此可见，本发明的甲型副伤寒沙门菌DNA探针与鼠伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌的DNA区分度较好，进一步说明，伤寒沙门菌DNA探针的特异性较高。
[0034] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
