技术领域
[0001] 本
发明属于
植物病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测甘蔗花叶病的甘蔗线条花叶病毒、
高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法。
背景技术
[0002] 甘蔗是我国最重要的糖料作物，其产糖量占全国总产糖量的85％以上，在农业经济收入中占有重要的地位。甘蔗花叶病是由病毒引起的世界性甘蔗“癌症”，导致感病植株品质变劣，种苗萌芽率下降、分蘖减少，
蔗糖结晶率下降，感染率达30％以上时产量损失30％～50％，蔗糖分下降6％～14％，已成为我国蔗区分布最广、危害最严重的病害之一，每年造成数以亿计的经济损失，严重制约了我国蔗糖产业的持续稳定发展。目前国际上还没有防治甘蔗花叶病的有效药剂，因此，有针对性地进行隔离检疫、筛选抗病品种，或培育无毒种苗等是防控甘蔗花叶病的重要措施，而对种苗及植株进行快速准确的病毒检测显得尤为重要。
[0003] 甘蔗花叶病病原复杂，可由多种病毒引起。我国蔗区已确定的甘蔗花叶病病原主要有甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)3种。这3种病原病毒所引起的症状表现非常相似，常常存在复合侵染或交叉感染现象，仅通过症状表现很难准确区分三种病原，而准确区分三种病原有助于针对性地进行抗病育种，选育不同病毒病原的抗性品种；同时也可以对不同病毒病原在各个地区的发生危害进行准确监测，实现品种合理布局，为制定科学有效的甘蔗花叶病防控措施提供依据；还可以适时监测甘蔗脱毒健康种苗、进出口种质带毒情况，为甘蔗产业的安全生产提供保障，因此，必须通过基因检测的方法进行准确诊断。
[0004] 基因检测是从核酸
水平检测病毒，其检测的灵敏度和特异性均高于血清学检测，特别适用于准确性要求高的样本检测。目前甘蔗病毒的基因检测方法主要有PCR、RT-PCR和环介导等温扩增技术等，其中常规RT-PCR是目前应用最广泛的RNA病毒检测方法，但常规RT-PCR一次只能对单一病毒进行检测。对于田间常以两种或两种以上病原复合侵染发生的甘蔗花叶病，利用常规RT-PCR进行病原检测，则需要进行2次或3次的RT-PCR，操作步骤繁琐，且使用
试剂种类多，成本高，检测一个样品至少需8h才能出结果，耗时长、检测效率低，不能满足现代生产的需要。现有的多重RT-PCR检测多采用两步法，需要在两个反应体系中完成病原的检测，反应步骤、程序比较复杂、耗时长、易造成交叉污染。
[0005] 随着甘蔗脱毒健康种苗在甘蔗生产上的运用，迫切需要一种更为快速、准确、高通量的甘蔗花叶病病原检测方法，目前未见同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测的相关报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速、准确、特异性的同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法，以简化操作、减少工作量、提高效率。
[0007] 本发明提供的一种同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测方法，3种甘蔗花叶病病原为甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒，所述一步法多重RT-PCR检测方法中采用甘蔗线条花叶病毒引物检测甘蔗线条花叶病毒，所述甘蔗线条花叶病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物组成，目的
片段长度为800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花叶病毒引物检测高粱花叶病毒，所述高粱花叶病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物组成，目的片段长度为450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花叶病毒引物检测甘蔗花叶病毒，所述甘蔗花叶病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物组成，目的片段长度为200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；检测结果判定为：
[0008] 当检测样品扩增到800bp大小的单一条带时，该样品为甘蔗线条花叶病毒阳性；若无800bp条带，则为甘蔗线条花叶病毒阴性；
[0009] 当检测样品扩增到450bp大小的单一条带时，该样品为高粱花叶病毒阳性；若无450bp条带，则为高粱花叶病毒阴性；
[0010] 当检测样品扩增到200bp大小的单一条带时，该样品为甘蔗花叶病毒阳性；若无200bp条带，则为甘蔗花叶病毒阴性；
[0011] 当检测样品同时扩增到上述三条条带、或同时扩增到上述任意两条条带，则该样品感染了对应的病毒。
[0012] 所述的一步法多重RT-PCR检测方法，其20μL一步法多重RT-PCR反应体系中有灭菌ddH2O 8.4μL，2×1 Step Buffer 8.0μL，5U/μL PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8μL，20μmoL/L SCSMV上、下游引物各0.25μL，20μmol/L SrMV上、下游引物各0.4μL，20μmol/L SCMV上、下游引物各0.25μL，RNA模板1.0μL；一步法多重RT-PCR反应条件为：50℃反转录
30min，94℃预变性5min；然后94℃变性30s，62℃
退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；最后
72℃延伸10min，降温至12℃结束反应。
[0013] 本发明提供一组采用一步法多重RT-PCR检测方法同时检测甘蔗花叶病3种病原的特异性引物组，由甘蔗线条花叶病毒引物、高粱花叶病毒引物和甘蔗花叶病毒引物组成，甘蔗线条花叶病毒引物用于检测甘蔗线条花叶病毒，所述甘蔗线条花叶病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物组成，目的片段长度为800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花叶病毒引物用于检测高粱花叶病毒，所述高粱花叶病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物组成，目的片段长度为450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花叶病毒引物用于检测甘蔗花叶病毒，所述甘蔗花叶病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物组成，目的片段长度为200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0014] 本发明提供的一种同时检测甘蔗花叶病3种病原的一步法多重RT-PCR检测
试剂盒，包括所述的采用一步法多重RT-PCR检测方法同时检测甘蔗花叶病3种病原的特异性引物组，所述甘蔗花叶病3种病原为甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒。
[0015] 进一步，所述的试剂盒还包括20μL一步法多重RT-PCR反应体系：灭菌ddH2O 8.4μL，2×1 Step Buffer 8.0μL，5U/μL PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8μL，20μmol/L SCSMV上、下游引物各0.25μL，20μmol/L SrMV上、下游引物各0.4μL，20μmol/L SCMV上、下游引物各0.25μL，RNA模板1.0μL。
[0016] 本发明还提供了上述特异性引物组或上述试剂盒用一步法多重RT-PCR方法在同时检测甘蔗花叶病3种病原的应用，所述3种病原为甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0018] 1.本发明一次RT-PCR反应既能完成反转录和PCR扩增，可同时扩增到引起甘蔗花叶病的3种病原的特异性条带，特异性强、快速、准确、操作步骤简单、灵敏度高。
[0019] 本发明针对甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒3种病原的
外壳蛋白基因核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物，并通过对这三对特异性引物、特异性引物浓度、酶用量和退火
温度等的优化，仅一次RT-PCR反应(在一个RT-PCR反应体系，同一反应管中，同一反应条件下)，以样品总RNA为模板，一步即能完成反转录和PCR扩增，克服了常规RT-PCR进行病原检测，需要进行2次或3次的RT-PCR，操作步骤繁琐，使用试剂种类多，成本高和两步法多重RT-PCR反应步骤、程序比较复杂、耗时长、交叉污染的
缺陷。
[0020] 本发明可使SCSMV、SrMV和SCMV三种病原病毒在浓度为0.1ng/μL时仍能扩增出对应的特异性条带，即具有很高的检测灵敏度。
[0021] 本发明仅需3小时即可得到检测结果，大幅节约了检测时间，提高了检测效率。
[0022] 本发明方法所有试剂均在反应前加入反应管，避免扩增后开盖加入反应液产生污染，大大减少了
假阳性的出现。
[0023] 本发明方法整个检测过程无需大量的试剂和耗材，降低了检测成本。
[0024] 2.本发明能快速、准确检测、区分引起甘蔗花叶病的三种病原，对于有针对性地进行甘蔗花叶病的抗病育种，对不同病毒病原在各个地区的发生危害进行准确监测，实现品种合理布局，制定科学有效的甘蔗花叶病防控措施、适时监测甘蔗脱毒健康种苗、进出口种质带毒情况，为甘蔗产业的安全生产、种质交换和引种检疫，防控甘蔗花叶病的扩散蔓延具有重要意义。
[0025]
序列表中SEQ ID NO：1所示的是SCSMV上游引物的核苷酸序列。
[0026] 序列表中SEQ ID NO：2所示的是SCSMV下游引物的核苷酸序列。
[0027] 序列表中SEQ ID NO：3所示的是SrMV上游引物的核苷酸序列。
[0028] 序列表中SEQ ID NO：4所示的是SrMV下游引物的核苷酸序列。
[0029] 序列表中SEQ ID NO：5所示的是SCMV上游引物的核苷酸序列。
[0030] 序列表中SEQ ID NO：6所示的是SCMV下游引物的核苷酸序列。
附图说明
[0031] 图1为3种病原引物RT-PCR检测特异性
电泳图，M为DNA Marker E；1、3、5依次为SCSMV、SrMV、SCMV；2、4、6分别为相对应的阴性对照。
[0032] 图2为3种病原引物浓度优化电泳图，M为DNA Marker E；1-4依次为第一组、第二组、第三组、第四组引物组合。
[0033] 图3为DNA聚合酶用量优化电泳图，M为DNA Marker E；1-4依次为2.5U、4U、5U、6U。
[0034] 图4为退火温度优化电泳图，M为DNA Marker E；1-8依次为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃。
[0035] 图5为一步法多重RT-PCR特异性和
稳定性电泳图，M为DNA Marker E；1为SCSMV+SrMV+SCMV；2为SCSMV+SrMV；3为SCSMV+SCMV；4为SrMV+SCMV；5为SCSMV；6为SrMV；7为SCMV；8为阴性对照；9为空白对照。
[0036] 图6为一步法多重RT-PCR灵敏度分析电泳图，M为DNA Marker E；1-7SCSMV、SrMV和0 1 2 3 4 5 6
SCMV 3种病原病毒复合RNA模板稀释倍数依次为10、10、10、10、10、10、10。
具体实施方式
[0037] 下面结合具体
实施例对本发明作进一步说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。
[0038] 1.引物设计
[0039] 根据甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒3种病原的外壳蛋白基因核苷酸序列，应用BLAST在线引物设计
软件设计出三对特异性引物即所述的甘蔗线条花叶病毒引物、高粱花叶病毒引物及甘蔗花叶病毒引物，并对引物之间的同源性和互补性分析和优化，以确保上述三种病原能扩增出差异明显的特异性片段，最后交由上海生工
生物工程有限公司合成。所述甘蔗线条花叶病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物组成，目的片段长度为800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花叶病毒引物检测高粱花叶病毒，所述高粱花叶病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物组成，目的片段长度为450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花叶病毒引物检测甘蔗花叶病毒，所述甘蔗花叶病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物组成，目的片段长度为200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0040] 2.总RNA提取
[0041] 按文献“Wang X Y,Li W F,Huang Y K,et al.Molecular detection and phylogenetic analysis of viruses causing mosaic symptoms in new sugarcane varieties in China.European Journal of Plant Pathology,2017,148(4):931-940.”方法检测得到单独感染甘蔗线条花叶病毒(SCSMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗花叶病毒(SCMV)的甘蔗
叶片，采集SCSMV、SrMV、SCMV单独侵染的甘蔗叶片0.2g，使用植物基因组RNA提取试剂盒(以北京全式金生物技术公司的TransZol Plant植物RNA提取试剂盒为例)分别提取叶片总RNA，具体步骤按照该
说明书操作。
[0042] 3.单重RT-PCR检测
[0043] 3.1一步法RT-PCR扩增
[0044] 20μL一步法RT-PCR反应体系中，灭菌ddH2O 7.6μL，2×1 Step Buffer 8.0μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0μL，20μmol/L SCSMV上、下游引物各0.4μL，20μmol/L SrMV上、下游引物各0.4μL，20μmol/L SCMV上、下游引物各0.4μL，RNA模板为1.0μL。一步法RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，降温至12℃结束反应。
[0045] 采用上述一步法RT-PCR反应体系和一步法RT-PCR反应条件，分别以步骤2.提取的分别感染了上述3种病毒的总RNA为模板，进行单重RT-PCR检测。
[0046] 3.2PCR产物电泳检测
[0047] 取6μL PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。分别得到SCSMV、SrMV和SCMV的扩增条带，依次约为800bp、450bp和200bp，其大小与理论值相符，结果见图1。
[0048] 4.一步法多重RT-PCR优化
[0049] 4.1引物浓度比例的优化
[0050] 设置了4个引物浓度组合：
[0051] 第一组：20μmol/L SCSMV上游引物、20μmol/L SCSMV下游引物、20μmol/L SrMV上游引物，20μmol/L SrMV下游引物、20μmol/L SCMV上游引物和20μmol/L SCMV下游引物的终浓度均为0.25μmol/L。
[0052] 第二组：20μmol/L SCSMV上游引物和20μmol/L SCSMV下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，20μmol/L SrMV上游引物和20μmol/L SrMV下游引物的终浓度均为0.25μmol/L、20μmol/L SCMV上游引物和20μmol/L SCMV下游引物的终浓度均为0.4μmol/L。
[0053] 第三组：20μmol/L SCSMV上游引物和20μmol/L SCSMV下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，20μmol/L SrMV上游引物和20μmol/L SrMV下游引物的终浓度均为0.25μmol/L，20μmol/L SCMV上游引物和20μmol/L SCMV下游引物的终浓度均为0.25μmol/L。
[0054] 第四组：20μmol/L SCSMV上游引物和20μmol/L SCSMV下游引物的终浓度均为0.25μmol/L，20μmol/L SrMV上游引物和20μmol/L SrMV下游引物的终浓度均为0.4μmol/L，20μmol/L SCMV上游引物和20μmol/L SCMV下游引物的终浓度均为0.25μmol/L。
[0055] 按照上述3.单重RT-PCR检测方法，以3种病原病毒复合RNA为模板进行多重RT-PCR反应，电泳结果见图2。经筛选，20μmol/L SCSMV上下游引物，20μmol/L SrMV上下游引物，20μmol/L SCMV上下游引物最佳终浓度分别为0.25、0.4、0.25μmol/L，即20μL一步法多重RT-PCR体系中20μmol/L SCSMV上游引物和20μmol/L SCSMV下游引物各0.25μL，20μmol/L SrMV上游引物和20μmol/L SrMV下游引物各0.4μL，20μmol/L SCMV上游引物和20μmol/L SCMV下游引物各0.25μL。
[0056] 4.2 DNA聚合酶用量的优化
[0057] 对浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶的用量设置4个梯度：2.5U、4U、5U、6U四个梯度，按照上述3.单重RT-PCR检测方法，以3种病原病毒复合RNA为模板进行多重RT-PCR反应，电泳结果见图3。Taq DNA聚合酶用量4U和6U时条带较清晰，但从节约成本
角度考虑，选用4U，即PrimerScript 1 Step Enzyme Mix 0.8μL。
[0058] 4.3退火温度优化
[0059] 对退火温度进行优化，从50℃到64℃每2℃为一个梯度，按照上述3.单重RT-PCR检测方法，以3种病原病毒复合RNA为模板进行多重RT-PCR反应，电泳结果见图4。从图4可以看出62℃时扩增出的3条条带均比较清晰且无杂带，因此
选定退火温度62℃为最佳。
[0060] 4.4一步法多重RT-PCR特异性和稳定性
[0061] 根据上述优化结果，一步法多重RT-PCR最佳反应体系为：灭菌ddH2O 8.4μL，2×1 Step Buffer 8.0μL，5U/μL PrimerScript 1 Step Enzyme Mix 0.8μL，20μmol/L SCSMV上游引物0.25μL，20μmol/L SCSMV下游引物0.25μL，20μmol/L SrMV上游引物0.4μL，20μmol/L SrMV下游引物0.4μL，20μmol/L SCMV上游引物0.25μL，20μmol/L SCMV下游引物0.25μL，RNA模板1.0μL；一步法多重RT-PCR最佳反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性5min；然后94℃变性30s，62℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min，降温至12℃结束反应。
[0062] 具体地，取多份单独侵染SCSMV、SrMV、SCMV的RNA样品，按照3种病原病毒复合RNA模板(1种)、两种病原病毒随机组合的复合RNA模板(3种)、单一病原病毒RNA模板(3种)的方式配制成7种不同的检测样品，健康甘蔗样品总RNA作为阴性对照，采用上述4.4优化的条件，对其进行检测并重复实验。电泳结果见图5。图5表明：3对引物混合在同一个反应体系中,分别以3种、2种、1种病毒的RNA作模板,均能够同时扩增出对应的特异条带,无杂带出现,而阴性和空白对照样品则无扩增条带出现,说明这3对引物扩增不同病毒的片段是特异和专化的，无交叉和相互干扰现象,所建立的一步法多重RT-PCR不仅可以检测甘蔗花叶病的单个病原病毒，而且可同时检测甘蔗花叶病的3种病原病毒。
[0063] 5.三重RT-PCR灵敏度分析
[0064] 取浓度分别为100ng/μL的SCSMV、SrMV和SCMV三种病原病毒总RNA等体积混合在一0 1 2 3 4 5 6
起作为复合RNA模板，将复合RNA模板进行10、10、10 、10、10、10 、10倍的梯度稀释，采用上述4.4优化的条件，进行多重PCR扩增以检测其灵敏度，电泳结果见图6。由图6可知，当稀释倍数为103时，即SCSMV、SrMV和SCMV三种病原病毒RNA浓度均为0.1ng/μL时，多重RT-PCR仍能扩增出各病原病毒的特异性条带，由此可见本发明具有很高的灵敏度。
