技术领域
[0001] 本
发明属于
生物来源
杀菌剂和
农药加工工艺,具体是涉及一种具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(DHIS)的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的一种世界性病害。随着
温室和大棚中番茄栽培面积的不断扩大,导致灰霉病成为主要病害之一,每年都会造成大量经济损失,一般为20%~40%,严重的达60%。目前,防治灰霉病以
化学防治为主,常用的杀菌剂主要有二甲酰亚胺类杀菌剂、苯并咪唑类杀菌剂、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺、啶酰菌胺和咯菌腈等。
化学农药虽然取得了一定的防治效果,但其带来的“3R(residue,resistance,resurgence)”问题已经引起社会和国内外有关专家的高度重视,开发高效、低毒、对环境安全的
生物农药,已成为农药研发的主要途径之一。
[0003] 3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(简称DHIS,见图1),该化合物广泛存在于发光杆菌的
发酵液中,它被称为“瑞士军刀”具有很突出的生物活性,例如可抑制热带
疾病中的原生生物,可抗
真菌和抗
革兰氏阳性菌,杀
线虫,可抑制溶性环
氧化合物
水解酶[soluble epoxid hydrolase(sEH)]和在不同的
肿瘤细胞系中显示抗增殖活性,可
治疗银屑病,可治疗免疫和
炎症等疾病,如
专利(
申请号为: 201710084890.2)报道了该化合物作为
杀螨剂及其治疗性应用。目前该化合物的制备路线从酸开始,进行了米迦勒加成、克莱森缩合反应、一锅法、
皂化和脱羧等一系列反应,该方法产量低、分离纯化困难。
发明内容
[0004] 为了弥补上述
现有技术的不足,本发明的目的是提出一种具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(DHIS)的制备方法和应用,本发明优化了对发光杆菌的发酵条件,大大提高了3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的产量,本发明制备的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果,这为开发抗灰霉病的药剂奠定了
基础,在配药剂时添加了抗
氧化剂作为保护,有效防止了由于3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯在空气中不稳定而导致的防效降低。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的,本发明提供了具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法,其技术要点是:
[0006] (1)制备发光杆菌发酵液
[0007] 所述发光杆菌保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC);保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内;保藏日期为:2018年10月10 日;保藏编号为:CCTCC NO:M2018664,分类命名为:Photorhabdus temperata subsp.cinerea SN35。
[0008] 所述发光杆菌经NBTA培养基活化,将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得
种子发酵液,再转接于改良M发酵培养基中,放置在180r/min、28℃的恒温摇床上培养120h得到发光杆菌发酵液;
[0009] 所述改良M培养基的配方为:蛋白胨为15-35g/L,
氯化钠为1-5g/L,
葡萄糖6.13g/L,
硫酸镁1.50g/L,硫酸铵2.46g/L,
磷酸二氢
钾0.86g/L,
磷酸氢二钾1.11g/L,硫酸钠1.72g/L,亮
氨酸3.00g/L,蒸馏水1L,pH值7.2~7.6;
[0010] (2)3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的分离与纯化
[0011] 将步骤(1)中得到的发光杆菌发酵液在室温下离心除去菌体,收集上清液,向上清液中加入5%的大孔
树脂吸附4h后将大孔树脂取出放置在30℃烘箱中充分烘干,烘干后用甲醇浸泡3-4次,将收集的甲醇液减压浓缩得到发光杆菌的甲醇浸膏,浸膏用甲醇:水=1:1的溶液再次溶解,用相同体积的二氯甲烷萃取3次,收集二氯甲烷相并减压浓缩得到二氯甲烷浸膏;将二氯甲烷浸膏用正相
硅胶柱(350mm×30mm i.d.)分离纯化,依次用V(石油醚):V(乙酸乙酯)= (100:5、100:10、100:20、100:30、100:40和0:100)梯度洗脱,每个梯度3L,得到5个组分(A1-A5);然后将第三个组分多次经过正相硅胶柱层析,Sephadex LH-20凝胶柱层析制备得到;
[0012] (3)3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的结构鉴定
[0013] 将步骤(2)中得到的物质通过NMR或MS鉴定所得3,5-二羟基-4-异丙基- 二苯乙烯的结构。
[0014] 进一步的,所述改良M培养基配方为:葡萄糖6.13g/L,蛋白胨33.23g/L,
硫酸镁1.50g/L,硫酸铵2.46g/L,磷酸二氢钾0.86g/L,磷酸氢二钾1.11g/L,硫酸钠1.72g/L,亮氨酸3.00g/L,氯化钠3.01g/L,蒸馏水1L,pH值7.2~7.6。
[0015] 进一步的,所述发光杆菌发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量分析的方法,包括以下步骤:
[0016] (1)通过向40mL的改良M培养基中接种等量的种子液培养得到发酵液,再离心、过滤对发酵液进行预处理;
[0017] (2)在高效液相色谱分析过程中,色谱条件为:色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB,4.60×250mm,5μm;流动相:68%甲醇水+0.1%
甲酸溶液;进样体积:10μL;流速1.0mL/min,柱温:30-39℃;检测
波长:247nm;
[0018] (3)在步骤(2)的色谱条件下绘制发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量的标准曲线,具体的回归方程如下:Y=10069X+3.7629(R2=0.9974),其中 Y为峰面积,X为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的浓度,单位为g/L。
[0019] 本发明提出了一种具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的应用,其技术要点是: 3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯可以用于防止由灰葡萄孢菌引起的
植物灰霉病。
[0020] 进一步的,所述灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病包括黄瓜灰霉病和番茄灰霉病。
[0021] 进一步的,所述3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯防治植物灰霉病的方法为
叶片喷雾,处理浓度为100-500μg/mL。
[0022] 进一步的,所述3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯可以与抗氧化剂混合应用,所述抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基
甲苯(BHT)、
没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ),所述3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯与抗氧化剂的重量比为1:0.5-1.5。
[0023] 本发明的积极效果:
[0024] (1)本发明优化对发光杆菌的发酵条件,所述改良M培养基在M基础培养基中添加氯化钠和亮氨酸,有助于提高3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的产量,为以后工业化生产提供了理论依据。
[0025] (2)本发明制备的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果,这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础,此外,在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护,有效防止了由于3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯在空气中不稳定而导致的防效降低。
[0026] (3)本发明中建立了高效液相色谱法快速测定发光杆菌发酵液中3,5-二羟基 -4-异丙基-二苯乙烯含量的方法,该方法简单易行、结果准确可靠,线性范围广,能够满足常见发光杆菌属中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的含量测定,可作为后续工业化生产的一杆秤。
附图说明
[0027] 图1为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的化学结构;
[0028] 图2为HPLC测定3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯标准曲线;
[0029] 图3为改良培养基中蛋白胨和氯化钠之间的响应面图和等高线图;
[0030] 图4为发光杆菌SN259菌株粗提物一级硅胶柱TLC结果;
[0031] 图5为未经处理的番茄灰霉病菌菌丝;
[0032] 图6为经DHIS处理的番茄灰霉病菌菌丝;
[0033] 图7为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯浓度为200μg/mL时对黄瓜灰霉病的防治效果;
[0034] 图8为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯浓度为200μg/mL时对番茄灰霉病的防治效果。
具体实施方式
[0035] 下述
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用材料、
试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0037] 发光杆菌发酵生产及提取分离3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的方法,以发光杆菌SN35为例,包括以下步骤:
[0038] (1)发光杆菌SN35菌株培养及发酵液的获得
[0039] 所述发光杆菌保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC);保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内;保藏日期为:2018年10月10 日;保藏编号为:CCTCC NO:M2018664,分类命名为:Photorhabdus temperata subsp.cinerea SN35。
[0040] 将保存于-80℃
冰箱的SN35均匀涂布在NBTA培养基上28℃培养48h得到蓝色单菌落用于下一步发酵。用已灭菌的接种环挑取单菌落接种于5mL的液体LB培养基中,放置在180r/min、28℃的恒温摇床上培养18h得到种子发酵液,再将种子发酵液按5%的接种量接种于含400mL改良M培养基的2L三
角瓶中,总发酵量为24L,放置在180r/min、28℃的恒温摇床上培养120h得到发酵液。
[0041] 所述NBTA培养基:
牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,琼脂粉15.0 g,氯化三苯基四氮唑(TTC)0.040g,溴百里酚蓝(BTB)0.025g,蒸馏水1L, pH值7.0。
[0042] 所述LB培养基:胰蛋白胨10.0g,
酵母提取物5.0g,氯化钠10.0g,蒸馏水1L,pH值7.0。
[0043] 所述改良M培养基配方为:葡萄糖6.13g/L,蛋白胨33.23g/L,硫酸镁1.50 g/L,硫酸铵2.46g/L,磷酸二氢钾0.86g/L,磷酸氢二钾1.11g/L,硫酸钠1.72 g/L,亮氨酸3.00g/L,氯化钠3.01g/L,蒸馏水1L,pH值7.2~7.6。
[0044] (2)3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的分离与纯化
[0045] 将步骤(1)中得到的发酵液在室温12000rpm离心12min除去菌体,收集上清液,向上清液中加入5%的大孔树脂吸附4h后将大孔树脂取出放置在 30℃烘箱中充分烘干。将烘干的大孔树脂用甲醇浸泡3-4次,每次4-5h,将收集的甲醇液减压浓缩成固体。将固体用甲醇:水=1:1的溶液再次溶解,然后再用相同体积的二氯甲烷萃取3次,收集二氯甲烷相并减压浓缩得到6.45g棕色浸膏。将收集到的浸膏用正相硅胶柱(350mm×30mm i.d.)分离纯化,依次用V(石油醚):V(乙酸乙酯)=(100:5、100:10、100:20、100:30、100:40和0:100)梯度洗脱,每个梯度3L,得到5个组分(S1-S5、图4)。将S3组分反复经过硅胶柱层析,Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(石油醚):V(二氯甲烷):V(甲醇)=2: 1:1],最终得到化合物3,5-二羟基-
4-异丙基-二苯乙烯(600mg)。3,5-二羟基-4- 异丙基-二苯乙烯的1H和13CNMR数据与文献(Paul V J,Frautschy S,Fenical W, Nealson K H.1981.Antibiotics in microbial ecology-isolation and structure assignment of several new anti-bacterial compounds from the insect-symbiotic bacteria Xenorhabdus Spp.Journal of Chemical Ecology,7(3):589-597.)报道基本一致。
[0046] 所述柱层析硅胶(48-74μm)生产厂家为青岛海洋化工厂;SephadexTM LH-20 柱层析凝胶生产厂家为瑞典Pharmacia公司;XAD-16大孔树脂生产厂家为罗
门哈斯国际贸易有限公司。
[0047] 实施例2
[0048] (1)发光杆菌发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量分析的方法,以发光杆菌SN35为例,主要步骤如下:
[0049] a.发酵液的获得和预处理
[0050] 将保存于-80℃冰箱的SN35均匀涂布在NBTA培养基上28℃培养48h得到蓝色单菌落用于下一步发酵。用已灭菌的接种环挑取单菌落接种于5mL的液体LB培养基中,放置在180r/min、28℃的恒温摇床上培养18h得到种子发酵液。为保证每次接种量相同,将2mL OD值为0.541-0.549的种子发酵液接种在 40mL的M液体培养基中培养4d得到发酵液。将发酵液在室温12000rpm,离心5min,取上清液用流动相稀释5倍,稀释液用0.45μm的有机滤
膜过滤两次,最后再用0.22μm的有机滤膜过滤三次进行液相分析。
[0051] b.色谱条件
[0052] 色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB,4.60×250mm,5μm;流动相:68%甲醇水+0.1%甲
酸溶液;进样体积:10μL;流速1.0mL/min,柱温:30-39℃;检测波长:247nm。
[0053] c.线性关系的测定
[0054] 精确称取3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯标样0.1g至100mL容量瓶中,加流动相定容至刻度线,即得3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯浓度为1g/L的标准储备液。精确移取标准储备液配置成浓度为0.005g/L,0.008g/L,0.01g/L,0.04 g/L,0.05g/L,0.08g/L,0.1g/L的标准品溶液,以峰面积对标准品浓度(g/L) 进行回归分析(图2)。回归方程如下:
[0055] Y=10069X+3.7629(R2=0.9974),其中Y为峰面积,X为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的浓度,单位为g/L。
[0057] 将标准品用流动相制成标准品溶液进行测定,线性范围是:0.002~5g/L,以3倍
信噪比计算最小检出限为2mg/L。
[0059] 在已知浓度的发酵液中分别加入不同
质量的标准品作为待测液,每个待测液做5次重复,计算平均回收率和标准偏差(表1),从表中可看出平均回收率为 97.01-100.50%,RSD为1.67-4.63。
[0060] 表1DHIS检测的平均回收率和相对标准偏差(n=5)
[0061]
[0062] 实施例3
[0063] 不同发酵培养基对3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯产量的影响:
[0064] M培养基:葡萄糖6.13g,蛋白胨21.29g,硫酸镁1.50g,硫酸铵2.46g,磷酸二氢钾0.86g,磷酸氢二钾1.11g,硫酸钠1.72g,蒸馏水1L,pH值7.2~7.6。
[0065] 改良M培养基:M培养基为葡萄糖6.13g/L,蛋白胨33.23g/L,硫酸镁1.50 g/L,硫酸铵2.46g/L,磷酸二氢钾0.86g/L,磷酸氢二钾1.11g/L,硫酸钠1.72 g/L,亮氨酸3.00g/L,氯化钠3.01g/L,蒸馏水1L,pH值7.2~7.6,
[0066] 发光杆菌发光杆菌SN35菌株培养和种子发酵液获得方法见实施例1。
[0067] 表2不同培养基对DHIS产量的影响
[0068] DHIS产量(mg/L)
M培养基 38.80
改良M培养基 86.31
[0069] 试验结果,采用改良M培养基发酵3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的产量比采用M培养基发酵提高了2.22倍。
[0070] 实施例4
[0071] 3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯在开发防治灰霉病药物中的应用,具体步骤包括如下:
[0072] (1)采用菌丝生长速率法测菌丝生长抑制率。将3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯和百菌清分别溶于V(丙
酮):V(吐温-80)=1:1中配成5000μg/mL的母液,吸取不同体积的母液添加至PDA培养基中制成质量浓度分别为50、25、12.5、 6.25、3.125μg/mL的含药平板。以只含丙酮-吐温-80的混合
溶剂的培养基为阴性对照。分别接入直径为6mm的灰霉病菌菌饼,25℃培养4-5d后测菌落直径 (十字交叉法)。用下列公式计算菌丝生长抑制率。
[0073] 生长抑制率(%)=空白对照菌落直径-药剂处理菌落直径/空白对照菌落直径 -菌饼直径×100
[0074] 结果表明3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对番茄灰霉病菌菌丝的生长具有较强的抑制作用,其EC50为9.14±0.17μg/mL,阳性对照百菌清EC50为0.90±0.08 μg/mL,并通过培养皿表面可观察到菌丝的生长量与空白对照差异较大。进一步将菌丝制成玻片标本放在
显微镜下进行观察,可看到处理组较空白节间增长,增粗,分枝减少,分生孢子减少,顶端缢缩(图5、6)。
[0075] (2)采用凹玻片法测3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用。用无菌水将灰霉病菌孢子制成浓度为2×105个/mL的孢子悬浮液,将10μg/mL的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯和百菌清分别与孢子悬浮液等体积混匀,取60μL滴加在凹玻片上,重复5次,架放于带有湿润
滤纸片的培养皿中保湿培养,至空白对照萌发率大于
80%时,观察各试验组孢子萌发数量,计算对孢子萌发的抑制率。结果表明,在DHIS浓度为
10μg/mL时,对孢子萌发的抑制作用为63.01%,阳性对照百菌清为100%。
[0076] (3)DHIS对黄瓜灰霉病防治的盆栽试验
[0077] 试验药剂:
[0078] 5%3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯
乳油的制备:制备方法为用0.3mL甲醇溶解60.0mg的DHIS(3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯):TBHQ(叔丁基对苯二酚) =5:1(即将
50mg的DHIS和10mg的TBHQ混合,然后用0.3ml的甲醇溶解),加入0.0075g农乳500与0.0425g农乳600(生产厂家为山东天道
生物工程有限公司)混匀,用DMSO(二甲基亚砜)补充到1.0mL刻度线。
[0079] 分别将百菌清和叔丁基对苯二酚(TBHQ)用同样的方法配置5%乳油溶液。
[0080] 黄瓜活体盆栽盆栽试验:将3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯5%乳油溶液用蒸馏水稀释成200μg/mL备用。以相同浓度的百菌清作为阳性对照,以TBHQ乳油溶液作为空白对照。在黄瓜
幼苗长至2片叶时,将不同药液均匀喷施于叶面至全部湿润,放置在室温下自然通
风晾干24h后,在叶面上接种6mm的番茄灰霉病菌菌饼。将其放置在低温高湿(湿度80%-90%)下培养,每次处理3盆,4 次重复,不定期观察发病情况,待空白对照完全发病后从叶片背面测量病斑直径,计算防治效果。
[0081] 番茄活体盆栽试验:在番茄幼苗叶片长至30片左右时,将不同药液均匀喷施于叶面至全部湿润,放置在室温下自然
通风晾干24h后,在叶面上喷施一定浓度的孢子悬浮液。将其放置在低温高湿(湿度80%-90%)下培养,每次处理3 盆,4次重复,不定期观察发病情况,待空白对照发病后,根据病情指数分级标准调查所有番茄叶片病情指数,然后与对照组比较计算防治效果。
[0082]
[0083]
[0084] 结果表明,在3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯浓度为200μg/mL时,在黄瓜盆栽试验中具有很好的防治效果,防效为92.19%,百菌清防效为97.64%(图7),两个药剂防治效果相当,在番茄盆栽试验中也具有较好的防治效果,病情指数为 3.29,防治效果为72.12%,百菌清病情指数为2.17,防治效果为81.61%(图8)。