生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法
阅读：930发布：2024-02-13
专利汇可以提供生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了生产具有经异构化的己糖 醛 酸残基的肝素前体(heparosan)化合物的方法以及以改善的C5-差向异构化效率生产 硫酸 乙酰肝素的方法。具体地，本发明提供了生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法，所述方法包括在存在选自由以下(A)至(F)组成的组的 蛋白质 的情况下，从肝素前体化合物生产所述具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物：(A)蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的 氨 基酸序列；(B)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；(C)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；(D)蛋白质，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(E)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和(F)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。，下面是生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法专利的具体信息内容。
1.生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体(heparosan)化合物的方法，所述方法包括在存在选自由以下(A)至(F)组成的组的蛋白质的情况下，从肝素前体化合物生产所述具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物：
(A)蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(B)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
(C)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
(D)蛋白质，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(E)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和
(F)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
2.根据权利要求1的方法，
其中所述蛋白质(B)是(B')包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质，和
其中所述蛋白质(E)是(E')包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述蛋白质是选自由以下(E1)至(F1)组成的组的蛋白质：
(E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
(E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有
95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和(F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述蛋白质源自斑马鱼。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中在存在生产所述蛋白质的经转化的微生物或其提取物的情况下，生产所述具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述经转化的微生物是包含表达单元的宿主细胞，所述表达单元包含选自由以下(a)至(j)组成的组的多核苷酸和与其可操作地连接的启动子：
(a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；
(b)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
(c)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
(d)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列；
(e)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
(f)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:3的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
(g)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列；
(h)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
(i)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:4的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；和(j)选自由(a)至(i)组成的组的多核苷酸的简并突变体。
7.根据权利要求6的方法，
其中所述多核苷酸(b)是(b')包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有90％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸(e)是(e')包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有90％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质的多核苷酸，并且其中所述多核苷酸(h)是(h')包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有90％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质的多核苷酸。
8.根据权利要求6或7的方法，其中所述多核苷酸是选自由以下(e1)至(j1)组成的组的多核苷酸：
(e1)多核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO:55、58、61、64和67组成的组的核苷酸序列；
(e2)多核苷酸，其包含与选自由SEQ ID NO:58、61、64和67组成的组的核苷酸序列具有
95％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
和
(j1)多核苷酸(e1)或(e2)的简并突变体。
9.根据权利要求6至8中任一项的方法，其中所述经转化的微生物是属于埃希氏菌属的细菌。
10.根据权利要求9的方法，其中所述经转化的微生物是大肠杆菌。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述肝素前体化合物是经N-硫酸化的肝素前体。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述肝素前体化合物是低分子化的肝素前体。
13.生产硫酸乙酰肝素的方法，
所述方法包括对肝素前体进行处理以生产硫酸乙酰肝素，所述处理包括己糖醛酸残基的C5-差向异构化、己糖醛酸残基的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的N-去乙酰化、α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化，其中在存在选自以下(A)至(F)的蛋白质的情况下进行所述C5-差向异构化：
(A)蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(B)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
(C)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
(D)蛋白质，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(E)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和
(F)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
14.根据权利要求13的方法，
其中所述蛋白质(B)是(B')包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质，和
其中所述蛋白质(E)是(E')包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述蛋白质选自由以下(E1)至(F1)组成的组:
(E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
(E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有
95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和(F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
16.根据权利要求13至15中任一项的方法，其中所述处理进一步包括将肝素前体分解成小分子。
17.选自由以下(E1)至(F1)组成的组的蛋白质：
(E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
(E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有
95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和(F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法
技术领域
背景技术
[0002] 肝素是一种硫酸乙酰肝素并具有抗凝血活性的化合物。动物来源的肝素在质量控制方面存在问题。并且已经研究生产和开发质量控制的非动物来源的肝素。生产非动物来源的肝素的方法的实例包括通过对使用微生物生产的肝素前体进行诸如硫酸化和异构化的反应来生产肝素的方法(专利文献1和2，非专利文献1至3)。
[0003] 肝素前体是由葡糖醛酸(GlcA)残基和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)残基组成的二糖的重复结构[→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-D-GlcNAc-(1→]组成的多糖。肝素具有以下结构，其中肝素前体中的一部分D-葡糖醛酸残基异构化为α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)，其是差向异构体。因此，为了从肝素前体生产硫酸乙酰肝素如肝素，需要使部分己糖醛酸残基异构化的反应，即，使部分D-葡糖醛酸残基异构化为α-L-艾杜糖醛酸的反应(C5-差向异构化反应)。C5-差向异构化反应包括使用D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的酶促规程。作为C5-差向异构酶，迄今已报道了哺乳动物来源的C5-差向异构酶的利用(专利文献1至3，非专利文献1至3)。另外，还鉴定了催化C5-差向异构化反应的海洋细菌来源的蛋白质(非专利文献4)。然而，它们都没有足够的C-5差向异构化活性。有必要获得更有效的酶。
[0004] 现有技术参考文献
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献1：美国专利号8,227,449
[0007] 专利文献2：美国专利申请公开号2012-322114
[0008] 专利文献3:WO 02/46379A
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献1：Lindahl U.et al.(2005)J Med Chem 48(2):349-352
[0011] 非专利文献2：Zhang Z.et al.(2008)Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007
[0012] 非专利文献3：Chen J,et al.,J Biol Chem.2005Dec 30；280(52):42817-25.[0013] 非专利文献4：John R,et al.,J Biol Chem.2013Aug 23；288(34):24332-9.[0014] 发明概述
[0015] 本发明要解决的问题
[0016] 本发明的目的是提供生产硫酸乙酰肝素的有效方法。
[0017] 解决问题的手段
[0018] 作为广泛研究的结果，本发明人已发现，使用与源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶具有80％或更高序列同源性的一系列蛋白质(见表4)可以有效地进行生产硫酸乙酰肝素所需的C5-差向异构化，并完成了本发明。
[0019] 即，本发明如下所述。
[0020] [1]生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法，所述方法包括在存在选自由以下(A)至(F)组成的组的蛋白质的情况下，从肝素前体化合物生产所述具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物：
[0021] (A)蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
[0022] (B)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
[0023] (C)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
[0024] (D)蛋白质，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
[0025] (E)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和
[0026] (F)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0027] [2]根据[1]的方法，
[0028] 其中所述蛋白质(B)是(B')包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质，和
[0029] 其中所述蛋白质(E)是(E')包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质。
[0030] [3]根据[1]或[2]的方法，其中所述蛋白质是选自由以下(E1)至(F1)组成的组的蛋白质：
[0031] (E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
[0032] (E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和[0033] (F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0034] [4]根据[1]至[3]中任一项的方法，其中所述蛋白质源自斑马鱼。
[0035] [5]根据[1]至[4]中任一项的方法，其中在存在生产所述蛋白质的经转化的微生物或其提取物的情况下，生产所述具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物。
[0036] [6]根据[5]的方法，其中所述经转化的微生物是包含表达单元的宿主细胞，所述表达单元包含选自由以下(a)至(j)组成的组的多核苷酸和与其可操作地连接的启动子：
[0037] (a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；
[0038] (b)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0039] (c)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0040] (d)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列；
[0041] (e)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0042] (f)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:3的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0043] (g)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列；
[0044] (h)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0045] (i)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:4的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；和[0046] (j)选自由(a)至(i)组成的组的多核苷酸的简并突变体。
[0047] [7]根据[6]的方法，
[0048] 其中所述多核苷酸(b)是(b')包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有90％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质的多核苷酸，[0049] 其中所述多核苷酸(e)是(e')包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有90％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质的多核苷酸，并且
[0050] 其中所述多核苷酸(h)是(h')包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有90％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质的多核苷酸。
[0051] [8]根据[6]或[7]的方法，其中所述多核苷酸是选自由以下(e1)至(j1)组成的组的多核苷酸：
[0052] (e1)多核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO:55、58、61、64和67组成的组的核苷酸序列；
[0053] (e2)多核苷酸，其包含与选自由SEQ ID NO:58、61、64和67组成的组的核苷酸序列具有95％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；和
[0054] (j1)多核苷酸(e1)或(e2)的简并突变体。
[0055] [9]根据[6]至[8]中任一项的方法，其中所述经转化的微生物是属于埃希氏菌属的细菌。
[0056] [10]根据[9]的方法，其中所述经转化的微生物是大肠杆菌。
[0057] [11]根据[1]至[10]中任一项的方法，其中所述肝素前体化合物是经N-硫酸化的肝素前体。
[0058] [12]根据[1]至[11]中任一项的方法，其中所述肝素前体化合物是低分子化的肝素前体。
[0059] [13]生产硫酸乙酰肝素的方法，
[0060] 所述方法包括对肝素前体进行处理以生产硫酸乙酰肝素，所述处理包括己糖醛酸残基的C5-差向异构化、己糖醛酸残基的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的N-去乙酰化、α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化，[0061] 其中在存在选自以下(A)至(F)的蛋白质的情况下进行所述C5-差向异构化：
[0062] (A)蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
[0063] (B)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
[0064] (C)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
[0065] (D)蛋白质，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
[0066] (E)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和
[0067] (F)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0068] [14]根据[13]的方法，
[0069] 其中所述蛋白质(B)是(B')包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质，和
[0070] 其中所述蛋白质(E)是(E')包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质。
[0071] [15]根据[13]或[14]的方法，其中所述蛋白质选自由以下(E1)至(F1)组成的组:
[0072] (E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
[0073] (E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和[0074] (F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0075] [16]根据[13]至[15]中任一项的方法，其中所述处理进一步包括低分子化肝素前体。
[0076] [17]选自由以下(E1)至(F1)组成的组的蛋白质：
[0077] (E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
[0078] (E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和[0079] (F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0081] 图1显示了编码源自斑马鱼的天然存在的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的全长核苷酸序列(GenBank登录号：AY388517.1，SEQ ID NO:1)。该图中框内的序列显示了编码部分氨基酸序列(SEQ ID NO:2中的Gly70至Asn585：SEQ ID NO:5)的天然存在的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0082] 图2显示了源自斑马鱼的天然存在的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的全长氨基酸序列(GenBank登录号：AY388517.1，SEQ ID NO:2)。该图中框内的序列(从Gly70至Asn585的部分氨基酸序列)对应于SEQ ID NO:5(参见实施例2)。
[0083] 图3显示了编码来自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:5)的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)(参见实施例2)。
具体实施方式
[0084] 本发明提供了生产具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的方法。本发明的方法包括在存在选自由以下(A)至(F)组成的组的蛋白质的情况下，从肝素前体化合物生产所述具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物：
[0085] (A)蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
[0086] (B)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
[0087] (C)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；
[0088] (D)蛋白质，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
[0089] (E)蛋白质，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和
[0090] (F)蛋白质，其包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入一个或几个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0091] 本发明中使用的蛋白质可以是选自由以下(E1)至(F1)组成的组的蛋白质：
[0092] (E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
[0093] (E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和[0094] (F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0096] 本发明中的“肝素衍生物”是指具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)选自以下由(1)至(6)组成的组的修饰的肝素前体：
[0097] (1)低分子化；
[0098] (2)肝素前体中α-D-葡糖胺残基的N-乙酰基的N-去乙酰化(例如，部分N-去乙酰化)；
[0099] (3)肝素前体中α-D-葡糖胺残基的氨基的N-硫酸化；
[0100] (4)肝素前体中的己糖醛酸残基的位置2处的羟基的硫酸化(2-O-硫酸化)；
[0101] (5)α-D-葡糖胺残基的位置3处的羟基的硫酸化(3-O-硫酸化)；和
[0102] (6)α-D-葡糖胺残基的位置6处的羟基的硫酸化(6-O-硫酸化)。
[0103] 此类衍生物可以通过利用α-D-葡糖胺残基的N-去乙酰化、低分子化、α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化、己糖醛酸残基的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化来获得，如下所述。
[0104] 在一个实施方案中，肝素前体化合物可以是经N-硫酸化的肝素前体。经N-硫酸化的肝素前体可以通过例如对肝素前体进行N-去乙酰化(优选地部分N-去乙酰化)和N-硫酸化来获得，如下所述。
[0105] 在另一个实施方案中，肝素前体化合物可以是小分子肝素前体化合物。小分子肝素前体化合物可以通过例如对肝素前体进行低分子化的处理来获得，如下所述。
[0106] 在优选的实施方案中，肝素前体化合物可以是经N-硫酸化的小分子肝素前体。经N-硫酸化的小分子肝素前体可以通过例如对肝素前体化合物进行N-去乙酰化(优选地部分N-去乙酰化)、分解成低分子和N-硫酸化的处理来获得，如下所述。
[0107] 在本发明中，术语“己糖醛酸(HexA)”用作β-D-葡糖醛酸(GlcA)和α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)的包括性术语。除非另有说明，术语“己糖醛酸(HexA)”，即术语“β-D-葡糖醛酸(GlcA)”和“α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)”包括根据本发明的方法的实施方案的所有可能的衍生物。除非另有说明，术语“α-D-葡糖胺”包括根据本发明的方法的实施方案的所有可能的衍生物。在具有C-4和C-5之间双键的HexA残基中，不区分IdoA残基和GlcA残基。因此，当计算鉴定多糖如本发明的多糖的每个参数时，除非另有说明，否则认为此类HexA残基是对应于HexA残基但既不对应于IdoA残基也不对应于GlcA残基的残基。
[0108] 在本发明中，“具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物”是具有葡糖醛酸(GlcA)残基的一部分异构化为艾杜糖醛酸(IdoA)残基的化合物。葡糖醛酸(GlcA)残基异构化为艾杜糖醛酸(IdoA)残基称为“C5-差向异构化”。“D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性”是可以催化葡糖醛酸(GlcA)残基异构化为艾杜糖醛酸(IdoA)残基(C5-差向异构化)的活性。C5-差向异构化的反应条件可以由本领域技术人员适当地配置。作为C5-差向异构化的反应条件，可以参考先前报道的条件(Chen J,et al.,"Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate."J.Biol.Chem.2005Dec 30；280(52):42817-
25)。具体地，C5-差向异构化的反应条件包括例如实施例中描述的条件。C5-差向异构化的程度(即差向异构化比率)可以例如通过二糖分析确认。也就是说，差向异构化比率可以计算为当对多糖进行二糖分析时具有IdoA残基的二糖单元的量相对于具有IdoA残基或GlcA残基的二糖单元的总量的百分比(摩尔比率)。
25)。具体地，C5-差向异构化的反应条件包括例如实施例中描述的条件。C5-差向异构化的程度(即差向异构化比率)可以例如通过二糖分析确认。也就是说，差向异构化比率可以计算为当对多糖进行二糖分析时具有IdoA残基的二糖单元的量相对于具有IdoA残基或GlcA残基的二糖单元的总量的百分比(摩尔比率)。
[0109] SEQ ID NO:5的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的部分氨基酸序列(Gly70至Asn585)并且具有包括膜锚定位点的氨基酸序列(Met1至Gly69)的缺失。SEQ ID NO:56、59、62、65和68的氨基酸序列是通过修饰SEQ ID NO:5的氨基酸序列获得的氨基酸序列。
[0110] 在蛋白质(B)或(E)中，与SEQ ID NO:2或5的氨基酸序列的同源性百分比可以为80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、
87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、
94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。在蛋白质(E2)中，与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列的同源性百分比可以为
95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或99.5％或更高。上文所述的氨基酸序列和下文所述的核苷酸序列的同源性(即同一性或相似性)可以例如使用Karlin和Altscchul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))和Pearson的FASTA(Methods Enzymol.,183,63(1990))来确定。基于此算法BLAST，已开发称为BLASTP和BLASTN的程序(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)并且可以使用这些程序在默认设置下计算同源性。对于同源性，可以使用例如当相似性以百分比计算时的值，所述值采用Lipman-Pearson方法，使用Genetyx Corporation的GENETYX Ver.7.0.9软件，使用ORF中编码的全长多肽部分，具有待比较的单位大小(Unit Size to Compare)＝2的设置。或者，同源性可以是通过在NEEDLE程序(J.Mol.Biol.1970；48:443-453)搜索中的默认设置中通过使用参数(缺口罚分＝10，延伸罚分＝0.5以及矩阵＝EBLOSUM62)获得的值(同一性)。在通过这些计算所得的同源性百分比的值中，可以使用最低值。对于同源性百分比，优选使用同一性百分比。
87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、
94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。在蛋白质(E2)中，与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列的同源性百分比可以为
95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或99.5％或更高。上文所述的氨基酸序列和下文所述的核苷酸序列的同源性(即同一性或相似性)可以例如使用Karlin和Altscchul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))和Pearson的FASTA(Methods Enzymol.,183,63(1990))来确定。基于此算法BLAST，已开发称为BLASTP和BLASTN的程序(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)并且可以使用这些程序在默认设置下计算同源性。对于同源性，可以使用例如当相似性以百分比计算时的值，所述值采用Lipman-Pearson方法，使用Genetyx Corporation的GENETYX Ver.7.0.9软件，使用ORF中编码的全长多肽部分，具有待比较的单位大小(Unit Size to Compare)＝2的设置。或者，同源性可以是通过在NEEDLE程序(J.Mol.Biol.1970；48:443-453)搜索中的默认设置中通过使用参数(缺口罚分＝10，延伸罚分＝0.5以及矩阵＝EBLOSUM62)获得的值(同一性)。在通过这些计算所得的同源性百分比的值中，可以使用最低值。对于同源性百分比，优选使用同一性百分比。
[0111] 在蛋白质(C)、(F)或(F1)中，可以通过选自由氨基酸残基的缺失、取代、添加和插入组成的组的一个、两个、三个或四个突变修饰一个或几个氨基酸残基。可以将氨基酸残基的突变引入氨基酸序列中的一个区域或多个不同区域中。术语“一个或几个氨基酸残基”是指不会显著损害蛋白质的活性的氨基酸残基的数量。在蛋白质(C)和(F)中，术语“一个或几个”表示以下的数量，例如1至120，优选地1至110，更优选地1至100、1至90、1至80、1至75、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至25、1至20、1至10或1至5(例如1、2、3、4或5)。在蛋白质(F1)中，术语“一个或几个”表示以下的数量，例如1至25、1至20、1至10或1至5(例如1、2、3、4或5)。
[0112] 选自由(A)至(F)和(E1)至(F1)组成的组的蛋白质具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性，从而具有以下特性，即在具有经异构化的己糖醛酸残基的肝素前体化合物的具体生产中可以是优异的。当在特定条件下测量活性时，蛋白质(B)和(C)以及蛋白质(E)和(F)以及蛋白质(E2)和(F1)优选基于蛋白质(A)的活性以及基于蛋白质(D)的活性以及基于蛋白质(E1)的活性具有60％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、94％或更多、96％或更多、98％或更多的活性，或者分别具有与蛋白质(A)以及蛋白质(D)以及蛋白质(E1)相同或更高的活性。此类测量的特定条件的实例包括以下条件，其中将表达目标蛋白质的微生物的30％无细胞提取溶液(超声和离心微生物细胞后获得的上清液)添加到反应溶液(2mg/mL经N-硫酸化的肝素前体，50mM MES(pH7.0)，1mM氯化钙)并且混合物在37℃反应30分钟或12小时。
[0113] 只要可以维持目标特征，可以将突变引入蛋白质(B)、(C)、(E)、(F)、(E2)和(F1)的催化结构域内的部分和除催化结构域以外的部分。可以引入可以维持目标特征的突变的氨基酸残基的位置对于本领域技术人员是显而易见的。具体地，本领域技术人员可以1)比较具有相似类型特征的多种蛋白质的氨基酸序列，2)明晰相对保守的区域和相对非保守的区域，以及3)分别从相对保守的区域和相对非保守的区域预测可以对功能起重要作用的区域和不能对功能起重要作用的区域，并因此可以识别结构和功能相关性。因此，本领域技术人员可以确定可以在本发明中使用的蛋白质的氨基酸序列中引入突变的氨基酸残基的位置。
[0114] 当氨基酸残基通过取代突变时，氨基酸残基的取代可以是保守取代。如本文所用，术语“保守取代”是指用具有相似侧链的氨基酸残基取代特定氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族是本领域熟知的。家族的实例包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)，具有β-位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)，具有含羟基(例如醇和酚)侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)，和具有含硫侧链的氨基酸(例如半胱氨酸和甲硫氨酸)。氨基酸的保守取代可以优选地是天冬氨酸和谷氨酸之间的取代，精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代，色氨酸和苯丙氨酸之间的取代，苯丙氨酸和缬氨酸之间的取代，亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸之间的取代，以及甘氨酸和丙氨酸之间的取代。
[0115] 另外，本发明中使用的蛋白质可以是经由肽键与异源部分连接的融合蛋白。异源部分的实例包括促进目标蛋白纯化的肽组分(例如，标签部分如组氨酸标签和Strep标签II；蛋白质如谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白及其突变体，其用于纯化目标蛋白)，改善目标蛋白的溶解度的肽组分(例如，Nus-标签)，作为伴侣蛋白起作用的肽组分(例如，触发因子)，具有其他功能的肽组分(例如，全长蛋白质或其部分)和接头。
[0116] 本发明中使用的蛋白质的实例包括源自斑马鱼的蛋白质，其天然存在的同源物和人工制备的突变体蛋白质。例如，突变体蛋白质可以通过将突变引入到编码目标蛋白的DNA中并使用获得的突变体DNA产生突变体蛋白质来获得。用于引入突变的方法的实例包括定点诱变和随机突变引入处理(例如，用突变剂和紫外线照射处理)。
[0117] 在一个实施方案中，本发明的方法可以使用本发明中使用的蛋白质本身进行。对于在本发明中使用的蛋白质，可以使用天然蛋白质或重组蛋白质。重组蛋白质可以通过例如使用无细胞载体或从产生本发明中使用的蛋白质的微生物获得。本发明中使用的蛋白质可以用作未纯化的、粗略纯化的或纯化的蛋白质。在反应中这些蛋白质可以用作固定化的蛋白质，其固定化至固相。
[0118] 本发明中使用的蛋白质通过已知方法分离，并根据情况进一步纯化，由此获得目标蛋白。生产蛋白质的微生物优选是经转化的微生物。当使用经转化的微生物时，获得目标蛋白作为无活性的目标蛋白聚集体，即蛋白质包涵体，其可以通过适当的方法激活。激活后，可以通过已知方法分离和纯化激活的蛋白质来获得目标蛋白。
[0119] 用于培养微生物的培养基是已知的；碳源、氮源、维生素源等可以添加到营养培养基如LB培养基或基本培养基如M9培养基中。根据宿主，经转化的微生物通常在16℃至42℃，优选25℃至37℃下培养5小时至168小时，优选8小时至72小时。可以根据宿主进行振荡培养和静置培养两者；可以根据需要进行搅拌和通风。当放线菌用作表达宿主时，可以适当地使用可以用于生产目标蛋白的条件。当诱导型启动子用于表达目标蛋白时，也可以使用添加到培养基的启动子诱导物进行培养。
[0120] 生产的目标蛋白可以通过已知的盐析，沉降如等电沉降和溶剂沉降，使用分子量差异的方法如透析、超滤和凝胶过滤，使用特定亲和力的方法如离子交换色谱法，使用疏水程度差异的方法，如疏水色谱和反相色谱、亲和色谱、SDS聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦或其组合从经转化的微生物的提取物纯化并分离。当目标蛋白经以分泌方式表达时，通过离心等从通过培养经转化的微生物获得的培养液中除去细菌以获得含有目标蛋白的培养上清液。目标蛋白也可以从该培养的上清液纯化和分离。
[0121] 在经转化的微生物的培养结束后，例如将通过离心收集的细菌悬浮在细菌压碎缓冲液(20mM至100mM的Tris-HCl(pH 8.0)和5mM的EDTA)中，并进行超声压碎约10分钟，由此可以破碎细菌。细菌破碎也可以用添加到培养液中的溶剂如甲苯进行。将该破碎处理溶液以12,000rpm离心10分钟，由此可以对上清液进行上述纯化操作。离心后的沉降物可以用氯化胍、尿素等溶解，以根据需要进一步纯化。当目标蛋白经以分泌方式表达时，在经转化的微生物的培养结束后，将培养液以12,000rpm离心10分钟，由此可以对上清液进行上述纯化操作。
[0122] 具体地，目标蛋白的纯化可以例如如下进行。在宿主的培养结束后，将硫酸铵(2.8M)添加到培养上清液或细胞提取物进行沉降分级，并进一步进行操作如CM Sephadex C-50或DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析或辛基-琼脂糖(Octyl-Sepharose)CL-4B或苯基-琼脂糖(Phenyl-Sepharose)CL-4B柱层析，由此可以将目标蛋白纯化至对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时在凝胶上显示单一条带的程度。
[0123] 可以通过测量D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性来评估所得目标蛋白质的活性(例如，参见实施例)。
[0124] 在另一个实施方案中，本发明的方法可以在存在经转化的微生物或其提取物的情况下进行，所述微生物生产本发明中使用的蛋白质。
[0125] 对于生产本发明中使用的蛋白质的微生物的提取物，可以使用含有目标蛋白并通过任何方法处理的处理溶液。处理的实例包括上述分离和纯化中提及的方法和能够杀死微生物的杀微生物处理方法。对于杀微生物处理方法，可以使用能够杀死微生物的任何方法；其实例包括热处理、酸处理、碱处理、表面活性剂处理和有机溶剂处理。
[0126] 在优选的实施方案中，经转化的微生物是包含表达单元的宿主细胞，所述表达单元包含选自由以下(a)至(j)组成的组的多核苷酸和与其可操作地连接的启动子：
[0127] (a)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；
[0128] (b)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0129] (c)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0130] (d)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列；
[0131] (e)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0132] (f)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:3的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0133] (g)多核苷酸，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列；
[0134] (h)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；
[0135] (i)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO:4的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；和[0136] (j)选自由(a)至(i)组成的组的多核苷酸的简并突变体。
[0137] 本发明中使用的多核苷酸可以是选自由以下(e1)至(j1)组成的组的多核苷酸：
[0138] (e1)多核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO:55、58、61、64和67组成的组的核苷酸序列；
[0139] (e2)多核苷酸，其包含与选自由SEQ ID NO:58、61、64和67组成的组的核苷酸序列具有95％或更高同源性的核苷酸序列，并编码具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性的蛋白质；和
[0140] (j1)多核苷酸(e1)或(e2)的简并突变体。
[0141] 上述多核苷酸(a)至(j)和(e1)至(j1)可以是DNA或RNA，并且优选是DNA。SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列。SEQ ID NO:3和4的核苷酸序列编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列。SEQ ID NO:1的核苷酸序列是编码源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的天然存在的全长核苷酸序列(GenBank:AY388517.1)。SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1的核苷酸序列的部分序列，并且对应于从Gly70至Asn585的序列。SEQ ID NO:4的核苷酸序列是SEQ ID NO:3的核苷酸序列的简并突变体。SEQ ID NO:55、58、61、64和67的核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:56、59、62、65和68的氨基酸序列。
[0142] 在上述多核苷酸(b)、(e)或(h)中，核苷酸序列与SEQ ID NO:1、3或4的核苷酸序列的同源性％可以是80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多。在上述多核苷酸(e2)中，与选自由SEQ ID NO:58、61、64和67组成的组的核苷酸序列的同源性％可以是95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多或99.5％或更多。
[0143] 多核苷酸(c)、(f)或(i)中的术语“严格条件”是指其中形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体的条件。严格条件的实例包括在约45℃下在6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中杂交，随后在50℃至65℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤一次或两次或更多次。
[0144] 在多核苷酸(j)和(j1)中，术语“简并变体”是指多核苷酸突变体，其中变异之前的多核苷酸中的编码特定氨基酸残基的至少一个密码子已经变成编码相同氨基酸残基的另一个密码子。该简并变体是基于沉默突变的突变体，并且由简并变体编码的蛋白质与由变异之前的多核苷酸编码的蛋白质相同。
[0145] 简并变体优选是其中密码子已经改变的多核苷酸突变体，以适应将要引入简并变体的宿主细胞的密码子使用频率。当基因由异源宿主细胞(例如微生物)表达时，由于密码子使用频率的差异，相应的tRNA分子种类未得以充分供应，这可能导致翻译效率降低和/或翻译不正确(例如，翻译停止)。例如，在大肠杆菌中，表1中列出的低频密码子是已知的。
[0146] 表1.大肠杆菌中的低频密码子
[0147]氨基酸残基 密码子 低频密码子
Arg AGG/AGA/CGG/CGA/CGU/CGC AGG/AGA/CGG/CGA
Gly GGG/GGA/GGU/GGC GGA
Ile AUA/AUU/AUC AUA
Leu UUG/UUA/CUG/CUA/CUU/CUC CUA
Pro CCG/CCA/CCU/CCC CCC
Arg AGG/AGA/CGG/CGA/CGU/CGC AGG/AGA/CGG/CGA
Gly GGG/GGA/GGU/GGC GGA
Ile AUA/AUU/AUC AUA
Leu UUG/UUA/CUG/CUA/CUU/CUC CUA
Pro CCG/CCA/CCU/CCC CCC
[0148] 鉴于这些情况，本发明可以使用适应于下述宿主细胞(例如微生物)的密码子使用频率的简并变体。在本发明的简并变体中，例如，编码一种或多种选自由精氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基和脯氨酸残基组成的组的氨基酸残基的密码子可以得以改变。更具体地，在本发明的简并变体中，选自由低频密码子组成的组的一种或多种密码子(例如，AGG、AGA、CGG、CGA、GGA、AUA、CUA和CCC)可以得以改变。简并变体可以优选地含有选自下述组中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种或五种)密码子的改变：
[0149] i)将选自由编码Arg的四种密码子(AGG、AGA、CGG和CGA)组成的组的至少一种密码子改变为编码Arg的另一密码子(CGU或CGC)；
[0150] ii)将编码Gly的一种密码子(GGA)改变为另一密码子(GGG、GGU或GGC)；
[0151] iii)将编码Ile的一种密码子(AUA)改变为另一密码子(AUU或AUC)；
[0152] iv)将编码Leu的一种密码子(CUA)改变为另一密码子(UUG、UUA、CUG、CUU或CUC)；和
[0153] v)将编码Pro的一种密码子(CCC)改变为另一密码子(CCG、CCA或CCU)。
[0154] 当本发明的简并变体是RNA时，应如上所述使用核苷酸残基“U”，而当本发明的简并变体是DNA时，应使用“T”代替核苷酸残基“U”。适应于宿主细胞的密码子使用频率的核苷酸残基的突变数量(只要在突变之前和之后相同的蛋白质得以编码，其不限于特定数量)例如是1至400、1至300、1至200或1至100。
[0155] 通过使用本领域已知的技术，可以基于任何宿主细胞的类型和基因组序列信息容易地鉴定低频密码子。因此，简并变体可以含有低频密码子改变为非低频密码子(例如，高频密码子)。考虑不仅低频密码子而且还有对生产菌株的基因组GC含量的适应性的因素设计突变体的方法是已知的(Alan Villalobos et al.,Gene Designer:a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments,BMC Bioinformatics.2006Jun 6；7:285.)；可以使用此类方法。因此，可以根据可以引入突变体的任何宿主细胞(例如，下述微生物)的类型适当地制备上述突变体。
[0156] 术语“表达单元”是指含有待表达为蛋白质的特定多核苷酸和可操作地连接于其上的启动子并且能够转录多核苷酸并最终产生由多核苷酸编码的蛋白质的最小单位。表达单元可以进一步含有元件如终止子、核糖体结合位点和耐药基因。表达单元可以是DNA或RNA，并优选是DNA。
[0157] 表达单元相对于宿主细胞可以是同源的或异源的，并且优选是异源表达单元。术语“异源表达单元”意指表达单元相对于宿主细胞是异源的。因此，在本发明中，表达单元中含有的至少一种元件相对于宿主细胞是异源的。相对于宿主细胞异源的表达单元中含有的元件的实例包括上述元件。异源表达单元中含有的编码目标蛋白的多核苷酸和启动子之一或两者优选相对于宿主细胞是异源的。因此，在本发明中，编码目标蛋白和启动子的多核苷之一或两者源于宿主细胞以外的活体(例如，原核生物或真核生物、微生物、昆虫、植物，或动物如哺乳动物)或病毒或者是人工合成的。或者，编码目标蛋白的多核苷酸相对于宿主细胞可以是异源的。目标蛋白优选相对于宿主细胞是异源的。
[0158] 异源表达单元中含有的启动子不限于特定的启动子，只要在宿主细胞中它可以表达由与其下游连接的多核苷酸编码的蛋白质。例如，启动子相对于宿主细胞可以是同源的或异源的。例如，可以使用通常用于生产重组蛋白的组成型或诱导型启动子。此类启动子的实例包括PhoA启动子、PhoC启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、PR启动子、PL启动子、SP6启动子、阿拉伯糖诱导型启动子，冷激启动子和四环素诱导型启动子。可以优选使用在宿主细胞中具有强转录活性的启动子。在宿主细胞中具有强转录活性的启动子的实例包括在宿主细胞中高表达的基因的启动子和源自病毒的启动子。
[0159] 在本发明中用作经转化的微生物的宿主细胞的实例包括各种微生物，包括属于埃希氏菌属的细菌(例如大肠杆菌)、放线菌和棒状细菌。在本发明中用作宿主细胞的大肠杆菌包括经常通常用于克隆和表达异源蛋白质的菌株如HB101、MC1061、JM109、CJ236和MV1184。在本发明中用作宿主细胞的放线菌包括经常通常用于表达异源蛋白质如浅青紫链霉菌(S.lividans)TK24和天蓝色链霉菌A3(2)的菌株。在本发明中用作宿主细胞的棒状细菌是需氧革兰氏阳性杆菌，其包括目前合并到棒状杆菌属中的细菌，尽管通常已被分类为短杆菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981))并且还包括属于短杆菌属的细菌，其与棒状杆菌属非常密切相关。使用棒状细菌的优点包括当目标蛋白以分泌方式产生时简化和省略其纯化过程的能力，因为细胞外分泌的蛋白质的量本质上远小于霉菌、酵母和属于芽孢杆菌属的细菌，其已被认为适合于蛋白质分泌；减少由细菌成分、不纯的酶等引起的杂质和副反应的能力，因为当使用以分泌方式产生的酶进行酶反应时，培养上清液可以用作酶源；培养基的成本、培养的方法和培养生产力优异，因为其在含有糖、氨、无机盐等的简单培养基中容易生长。使用Tat系统分泌途径，工业上有用的蛋白质，如异麦芽糖葡聚糖酶和蛋白质谷氨酰胺酶(其是先前已知的Sec系统分泌途径难以以分泌方式产生的蛋白质)也可以有效地分泌(WO 2005/103278)。或者，也可以使用WO 01/23491、WO 02/081694、WO 01/23491等中公开的方法。
[0160] 本发明中使用的经转化的微生物可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，此类表达单元以掺入到宿主细胞的基因组DNA中的形式或未掺入到宿主细胞的基因组DNA中的形式(例如，表达载体的形式)包含在宿主细胞中。包含表达单元的宿主细胞可以通过本领域已知的任何方法(例如，感受态细胞方法和电穿孔方法)通过表达载体转化宿主细胞来获得。当表达载体是引起与宿主细胞的基因组DNA同源重组的整合载体时，可以通过转化将表达单元掺入到宿主细胞的基因组DNA中。相反，当表达载体是不引起与宿主细胞的基因组DNA同源重组的非整合载体时，表达载体不通过转化掺入到宿主细胞的基因组DNA中并且可以作为独立于基因组DNA存在的表达载体保持。或者，可以通过基因组编辑技术(例如，CRISPR/Cas系统和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN))将表达单元掺入到宿主细胞的基因组DNA中。
[0161] 除了上述作为表达单元的最小单元之外，本发明中使用的表达载体可以进一步含有元件如在宿主细胞中起作用的终止子、核糖体结合位点和耐药基因。耐药基因的实例包括针对药物如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素和草丁膦的抗性基因。
[0162] 表达载体可以进一步含有能够与宿主细胞的基因组同源重组以与宿主细胞的基因组DNA同源重组的区域。例如表达载体可以经设计使得其中包含的表达单元位于一对同源区域(例如，与宿主细胞的基因组中的特定序列同源的同源臂loxP和FRT)之间。将要引入表达单元的宿主细胞的基因组区域(同源区域的靶标)(不限于特定区域)可以是在宿主细胞中具有大量表达的基因的基因座。
[0163] 表达载体可以是质粒、病毒载体、噬菌体或人工染色体。表达载体可以是整合载体或非整合载体。整合载体可以是整个掺入到宿主细胞的基因组中的类型的载体。或者，表达载体可以是仅部分(例如表达单元)掺入宿主细胞的基因组中的类型的载体。此外，表达载体可以是DNA载体或RNA载体(例如，逆转录病毒)。对于表达载体，可以使用通常使用的表达载体。此类表达载体的实例包括pUC(例如pUC19和pUC18)、pSTV、pBR(例如pBR322)、pHSG(例如pHSG299、pHSG298、pHSG399和pHSG398)、RSF(例如RSF1010)、pACYC(例如pACYC177和pACYC184)、pMW(例如pMW119、pMW118、pMW219和pMW218)、pQE(例如pQE30)及其衍生物。当选择棒状杆菌如谷氨酸棒杆菌作为宿主细胞时，可以适合地使用作为高拷贝载体的pPK4等。
[0164] 如上所述，本发明的方法可以在存在蛋白质本身和/或产生蛋白质的微生物或其处理溶液的情况下，在包括氨基酸或其盐和羧酸或其盐的反应系统中进行。
[0165] 本发明还提供了生产硫酸乙酰肝素的方法。本发明的方法包括通过对肝素前体进行己糖醛酸残基的C5-差向异构化、己糖醛酸残基的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化来生成硫酸乙酰肝素。
[0166] 在生产硫酸乙酰肝素的方法中，C5-差向异构化可以通过如上所述的方法进行。
[0167] 在生产硫酸乙酰肝素的方法中，肝素前体化合物的N-去乙酰化、己糖醛酸残基的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化可以通过本领域中熟知的方法进行(例如，美国专利号8,227,449；美国专利申请公开号2012-322114；Lindahl U.et al.(2005)J.Med.Chem.,48(2):349-352；Zhang Z.et al.(2008)Journal of the American Chemical Society,130(39):12998-13007；
Chen J,et al.,J.Biol.Chem.,2005Dec 30；280(52):42817-25)。进行这些处理的顺序没有特别限制，只要获得硫酸乙酰肝素即可。进行各处理的顺序可以根据各种条件如进行各处理的规程和用于各处理的酶的底物特异性来适当地设定。上述处理可以同时进行或分开进行。
Chen J,et al.,J.Biol.Chem.,2005Dec 30；280(52):42817-25)。进行这些处理的顺序没有特别限制，只要获得硫酸乙酰肝素即可。进行各处理的顺序可以根据各种条件如进行各处理的规程和用于各处理的酶的底物特异性来适当地设定。上述处理可以同时进行或分开进行。
[0168] 进行上述处理的代表性顺序的实例包括以下顺序：
[0169] 1.肝素前体化合物的N-去乙酰化；
[0170] 2.α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化；
[0171] 3.己糖醛酸残基的C5-差向异构化；和
[0172] 4.己糖醛酸残基的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化。
[0173] 也可以并行进行两种或更多种处理。
[0174] 己糖醛酸的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化可以以任何顺序进行。代表性顺序的实例包括己糖醛酸的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化的顺序以及己糖醛酸的2-O-硫酸化、α-D-葡糖胺残基的6-O-硫酸化和α-D-葡糖胺残基的3-O-硫酸化的顺序。也可以并行进行两种或更多种处理。
[0175] N-去乙酰化可以使用去乙酰化剂以化学方式进行。N-去乙酰化剂的实例包括碱性物质，例如碱金属盐、碱土金属盐和肼。碱金属盐的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铷和氢氧化铯。碱土金属盐的实例包括氢氧化铍、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶和氢氧化钡。
[0176] N-去乙酰化优选是部分N-去乙酰化。可以进行N-去乙酰化，使得N-乙酰基的残留率变为以下值。也就是说，N-乙酰基的残留率可以是例如1％或更多、1.5％或更多、3％或更多、5％或更多、7％或更多、9％或更多或11％或更多、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、33％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少或17％或更少或其组合。具体地，N-乙酰基的残留率可以是例如1％至33％、7％至33％、7％至30％或11％至17％。例如，7％至30％的N-乙酰基的残留率大约对应于其中N-乙酰基以每6至28个糖残基一个N-乙酰基的比率存在的状态(每3至14个作为二糖单元的单元一个)。另外例如，11％至
17％的N-乙酰基的残留率大约对应于其中N-乙酰基以每12至18个糖残基一个N-乙酰基的比率存在的状态(每6至9个作为二糖单元的单元一个)。可以例如通过二糖分析证实N-去乙酰化的程度(即N-乙酰基的残留率)。也就是说，当对多糖进行二糖分析时，N-乙酰基的残留率可以计算为具有N-乙酰化的基团的二糖单元相对于二糖单元的总量的量的百分比(摩尔比率)。
17％的N-乙酰基的残留率大约对应于其中N-乙酰基以每12至18个糖残基一个N-乙酰基的比率存在的状态(每6至9个作为二糖单元的单元一个)。可以例如通过二糖分析证实N-去乙酰化的程度(即N-乙酰基的残留率)。也就是说，当对多糖进行二糖分析时，N-乙酰基的残留率可以计算为具有N-乙酰化的基团的二糖单元相对于二糖单元的总量的量的百分比(摩尔比率)。
[0177] 作为利用氢氧化钠的部分N-去乙酰化的条件，例如，可以参考先前报道的条件(Kuberan B.et al.,(2003)"Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Non-classical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides."J.Biol.Chem.,278(52):52613-52621.和US2011281820A1)。作为利用肼的部分N-去乙酰化的条件，例如，可以参考先前报道的条件(Glycobiology,10(2000)159-171；Carbohydrate Research,290(1996)87-96；Biochem.J.217(1984)187-197)。
[0178] 2-O-硫酸化是对肝素前体化合物中的己糖醛酸残基中位置2处的羟基硫酸化的步骤。可以利用2-O-硫酸化酶(2-OST)以酶促方式进行2-O-硫酸化。
[0179] N-硫酸化是对肝素前体化合物中的α-D-葡糖胺残基的氨基硫酸化的步骤。可以使用硫酸化试剂以化学方式进行N-硫酸化。硫酸化试剂包括三氧化硫复合物如三氧化硫吡啶复合物(PySO3)和三氧化硫三甲胺复合物(TMASO3)。
[0180] 6-O-硫酸化是对肝素前体化合物中的α-D-葡糖胺残基的位置6处的羟基硫酸化的步骤。可以利用例如6-O-硫酸化酶(6-OST)以酶促方式进行6-O-硫酸化。6-OST的实例包括6-OST-1、6-OST-2和6-OST-3。也可以通过利用硫酸化试剂以化学方式进行6-O-硫酸化。硫酸化试剂包括三氧化硫复合物如三氧化硫吡啶复合物(PySO3)和三氧化硫三甲胺复合物(TMASO3)。
[0181] 3-O-硫酸化是对肝素前体化合物中的α-D-葡糖胺残基的位置3处的羟基硫酸化的步骤。可以利用例如3-O-硫酸化酶(3-OST)以酶促方式进行3-O-硫酸化。3-OST的实例包括3-OST-1、3-OST-2、3-OST-3、3-OST-4和3-OST-5。
[0182] 在本发明的生产硫酸乙酰肝素的方法中，处理可以进一步包括使肝素前体化合物低分子化。
[0183] 低分子化的顺序没有特别限制，只要获得硫酸乙酰肝素即可。低分子化的顺序可以根据各种条件如低分子化和其他处理的规程和用于处理的酶的底物特异性来适当地设定。低分子化可以与其他处理同时进行或分开进行。代表性地，低分子化可以在肝素前体化合物的N-去乙酰化之后和α-D-葡糖胺残基的N-硫酸化之前进行。
[0184] 可以使用肝素酶以酶促方式进行低分子化。肝素酶的实例包括肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III并且优选肝素酶III。低分子化没有特别限制，只要处理肝素前体使得低分子化后的肝素前体的分子量小于低分子化前的分子量，并且可以进行低分子化使得如使用普鲁兰多糖作为标准的GPC测量的数均分子量(Mn)为1000至150000、优选8000至60000以及重均分子量(Mw)为2000至300000、优选10000至100000。
[0185] 优选地，使用肝素酶III进行低分子化。“肝素酶III”是指切割糖胺聚糖如肝素前体的经N-硫酸化的或经N-去乙酰化的葡糖胺残基的位点的酶(典型地为EC 4.2.2.8)。在本发明中待使用的肝素酶III没有特别限制，只要其可以优先切割经N-去乙酰化的肝素前体中具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点。“优先切割具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点”是指相比不具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点，更优先切割具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点。“优先切割具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点”可以意指切割具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点但基本上不切割不具有N-乙酰基的葡糖胺残基的位点。“切割葡糖胺残基的位点”是指切割葡糖胺残基与其下游(在还原末端侧)的葡糖醛酸(GlcA)残基之间的α-1,4-糖苷键。
[0186] 每个步骤的反应溶液中包含的每个步骤的产物可以直接进行后续步骤，或者可以从反应溶液中回收，并然后进行后续步骤。从反应溶液回收每种产物的规程没有特别限制。回收每种产物的规程包括用于分离和纯化化合物的已知技术如膜处理法和沉淀法。可以适当地对每个步骤的产物进行处理如纯化、稀释、浓缩、干燥、溶解和酶的失活，并随后进行后续步骤。可以进行纯化至所期望的程度。可以单独或以适当组合来进行这些处理。
[0187] 本发明还提供了选自由以下(E1)至(F1)组成的组的蛋白质：
[0188] (E1)蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:56、59、62、65和68组成的组的氨基酸序列；
[0189] (E2)蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列，并具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性；和[0190] (F1)蛋白质，其包含在选自由SEQ ID NO:59、62、65和68组成的组的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入1至25个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。
[0191] 本发明的蛋白质是源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的变体。当在某些条件下测量活性时，源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶具有比源自其他生物体物种的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶更优异的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。此外，当在某些条件下测量活性时，与源自斑马鱼的野生型D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶相比，本发明的蛋白质具有相当或改善的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。例如，本发明的蛋白质具有相当(100％)或更高、110％或更高、120％或更高、130％或更高、140％或更高、150％或更高、160％或更高、170％或更高、180％或更高、190％或更高或200％或更高于野生型酶的活性的活性。因此，本发明的蛋白质具有极其优异的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。此类测量的某些条件包括例如以下条件，其中将表达目标蛋白质的微生物的30％无细胞提取溶液(超声和离心微生物细胞后获得的上清液)添加到反应溶液(2mg/mL经N-硫酸化的肝素前体，50mM MES(pH7.0)，1mM氯化钙)并且混合物在37℃反应30分钟或12小时。
[0192] 本发明的蛋白质可以用作高效进行C5-差向异构化反应的酶，因为其具有极其优异的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性。例如，本发明的蛋白质可以在从肝素前体生产硫酸乙酰肝素如肝素中用于高效进行C5-差向异构化反应。
[0193] 本发明的蛋白质可以以上述任何结构或形式提供，只要其具有D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶活性即可。也就是说，本发明的蛋白质可以通过肽键以与上述异源部分连接的融合蛋白的结构提供，或者可以以不与上述异源部分连接的蛋白质的结构提供。此外，本发明的蛋白质可以以未经纯化的产物、粗产物或经纯化的蛋白质的形式提供，或者可以以固定化至固相的固相蛋白质的形式提供，并且优选以经纯化的蛋白质的形式提供。本发明的蛋白质可以从培养基、表达本发明的蛋白质的微生物的培养上清液、通过超声微生物细胞的破碎产物，以及超声和离心在微生物细胞后获得的上清液(无细胞提取物)来制备。
[0194] 实施例
[0195] 参考实施例更详细地解释本发明，然而，本发明不限于以下实施例。
[0196] 实施例1：经N-硫酸化的低分子化的肝素前体的制备
[0197] (1)肝素前体发酵
[0198] 使用WO2015/050184的实施例1中描述的肝素前体生产细菌(大肠杆菌BL21(DE3)/pVK9-kfiABCD菌株)和培养条件获得含有肝素前体的培养液。
[0199] (2)肝素前体的纯化
[0200] 通过离心从培养液中收集培养上清液。为了去除培养基成分，使用UF膜用Milli-Q水洗涤1mL的培养上清液，并浓缩至250μL。将500μL的100％乙醇添加到用UF膜浓缩的250μL的溶液中，并通过离心沉淀肝素前体。将所得的沉淀物在空气中干燥以获得肝素前体。另外从剩余的培养上清液中，通过相同的规程纯化肝素前体。获得总共10g的肝素前体。
[0201] (3)肝素前体的N-去乙酰化
[0202] 1)将61mL的肼·H2O和4.7mL的1N硫酸添加到1.22g的肝素前体中，并且在用氮气替换气相后，将混合物加热至100℃并反应4.75小时。
[0203] 2)在通过冰冷却终止反应后，添加61mL的16％NaCl水溶液和610mL的MeOH，并将混合物离心。去除上清液。将所得的沉淀物在50mL的H2O中溶解，然后使用Amicon UF膜(3kDa)脱盐并浓缩。
[0204] 3)将两倍体积的H2O和等体积的1M NaHCO3添加到所得的浓缩溶液中，然后滴加0.2M I2/0.4M KI溶液直至呈黄色。随后，滴加肼·H2O以将过多的碘还原为碘离子，然后再次使用Amicon UF膜(3kDa)脱盐并浓缩溶液。将浓缩的溶液在减压下干燥以获得经N-去乙酰化的肝素前体。在获得的经N-去乙酰化的肝素前体中乙酰基的残留率为14.9％(稍后描述)。
[0205] (4)经N-去乙酰化的肝素前体的低分子化
[0206] (1)肝素酶III的制备
[0207] <肝素黄杆菌来源的hepC基因表达质粒的构建>
[0208] 将源自肝素黄杆菌的编码肝素酶III的hepC基因克隆到pMIV-Pnlp0载体(美国专利申请公开20050196846)中以构建hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC。pMIV-Pnlp0-ter包括强效的nlp0启动子(Pnlp0)和rrnB终止子，并且可以通过在启动子和终止子之间插入目的基因作为表达单元发挥作用。“Pnlp0”表示源自大肠杆菌K-12的野生型nlpD基因的启动子。
[0209] 表达质粒的构建的细节如下所示。通过使用引物P1(SEQ ID NO:22)和引物P2(SEQ ID NO:23)的用来自大肠杆菌MG1655的染色体DNA作为模板的PCR获得包含约300bp的nlpD基因的启动子区域(Pnlp0)的DNA片段。已经在这些引物的每个5'末端设计了限制酶SalI和PaeI的位点。PCR循环如下。首先，95℃3分钟，然后两个循环的95℃60秒、50℃30秒和72℃40秒，随后25个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃15秒，最后72℃5分钟。用SalI和PaeI处理所得的片段，并将其插入到pMIV-5JS(日本专利申请公开号2008-099668)的SalI-PaeI位点中以获得质粒pMIV-Pnlp0。插入到该pMIV-Pnlp0质粒中的Pnlp0启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:24中所示。
[0210] 随后，通过使用引物P3(SEQ ID NO:25)和引物P4(SEQ ID NO:26)的用来自MG1655的染色体DNA作为模板的PCR获得包含约300bp的rrnB基因的终止子区域的DNA片段(SEQ ID NO:27)。已经在这些引物的每个5'末端处设计了限制酶XbaI和BamHI的位点。PCR循环如下。首先，95℃3分钟，然后两个循环的95℃60秒、50℃30秒和72℃40秒，随后25个循环的94℃20秒、59℃20秒和72℃15秒，最后72℃5分钟。用XbaI和BamHI处理所得的片段，并将其插入到pMIV-Pnlp0的XbaI-BamHI位点中以获得质粒pMIV-Pnlp0-ter。
[0211] 随后，人工合成包含源自肝素黄杆菌(ATCC 13125)(Su H.et.al.,Appl.Environ.Microbiol.,1996,62:2723-2734)的hepC基因的ORF的DNA链。通过使用引物P5(SEQ ID NO:28)和引物P6(SEQ ID NO:29)的用该DNA链作为模板的PCR扩增hepC基因的DNA片段。以方案中描述的反应组成使用PrimeStar聚合酶(TaKaRa)进行PCR。PCR循环如下。
首先，94℃5分钟，然后30个循环的98℃5秒、55℃10秒和72℃8分钟，最后保持在4℃。另外，通过使用引物7(SEQ ID NO:30)和引物8(SEQ ID NO:31)的寡核苷酸作为引物的用pMIV-Pnlp0作为模板DNA的PCR获得pMIV-Pnlp0的DNA片段。使用PrimeStar聚合酶(TaKaRa)和方案中描述的反应组成来进行PCR。PCR循环如下。首先，94℃5分钟，然后30个循环的98℃5秒、
55℃10秒和72℃6分钟，最后保持在4℃。使用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(Clontech)连接所得的两个DNA片段以构建hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC。克隆的hepC基因的核苷酸序列和由其编码的肝素酶III(HepC)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32和33中所示。
首先，94℃5分钟，然后30个循环的98℃5秒、55℃10秒和72℃8分钟，最后保持在4℃。另外，通过使用引物7(SEQ ID NO:30)和引物8(SEQ ID NO:31)的寡核苷酸作为引物的用pMIV-Pnlp0作为模板DNA的PCR获得pMIV-Pnlp0的DNA片段。使用PrimeStar聚合酶(TaKaRa)和方案中描述的反应组成来进行PCR。PCR循环如下。首先，94℃5分钟，然后30个循环的98℃5秒、
55℃10秒和72℃6分钟，最后保持在4℃。使用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(Clontech)连接所得的两个DNA片段以构建hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC。克隆的hepC基因的核苷酸序列和由其编码的肝素酶III(HepC)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32和33中所示。
[0212] <表达hepC基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的构建和肝素酶III酶溶液的制备>[0213] 通过电穿孔(细胞：80μL，200Ω，25μF，1.8kV，比色皿：0.1mL)将hepC基因表达质粒pMIV-Pnlp0-hepC导入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Life Technologies)中以获得大肠杆菌BL21(DE3)/pMIV-Pnlp0-hepC菌株作为肝素酶III生产菌株。该菌株在25μg/mL添加氯霉素的LB培养基中在37℃预培养过夜。随后，将培养液接种到Sakaguchi烧瓶中的300mL LB培养基中，终浓度为2％v/v。在37℃进行振荡培养4小时，然后终止培养。离心后，用0.85％NaCl洗涤微生物细胞两次，并在30mL的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中悬浮。对悬浮液进行超声破碎以破碎微生物细胞。将经破碎的微生物细胞溶液离心以制备肝素酶III酶溶液作为上清液(无细胞提取液)。
[0214] 2)通过肝素酶III反应的低分子化
[0215] 将1g以上(3)中获得的N-乙酰基残留率为14.9％的经N-去乙酰化的肝素前体与2mL的31.3mIU/μL肝素酶III溶液溶解于100mL的含有100mM NaCl和1.5mM CaCl2的Tris缓冲溶液(pH 8.0)中，并且在37℃反应5.3小时。将100mL的16％NaCl水溶液和900mL的EtOH添加到反应溶液中并混合，离心以去除上清液并获得低分子化的经N-去乙酰化的肝素前体。
通过使用普鲁兰多糖作为标准的GPC测量通过肝素酶III低分子化后的分子量。结果，数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)分别为9860和15430。
通过使用普鲁兰多糖作为标准的GPC测量通过肝素酶III低分子化后的分子量。结果，数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)分别为9860和15430。
[0216] (5)低分子化的经N-去乙酰化的肝素前体的N-硫酸化
[0217] 1)将1g以上(4)中获得的低分子化的经N-去乙酰化的肝素前体溶解于50mL的MilliQ水中，并将50mL的20mg/mL NaHCO3/20mg/mL三甲胺·SO3的水溶液添加到其中，并且混合物在55℃反应过夜。
[0218] 2)将1L的EtOH添加到混合物中，然后将其离心去除上清液以获得经N-硫酸化的低分子化的肝素前体。
[0219] 3)将获得的经N-硫酸化的低分子化的肝素前体溶解于MilliQ水中至500μL，并进行二糖分析以计算相对于N-去乙酰化的肝素前体的产率。规程如下所示。
[0220] <二糖分析>
[0221] 根据先前报道的条件(T.Imanari,et.al.,"High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides."J.O.Chromato.A,720,275-293(1996))进行经N-硫酸化的低分子化的肝素前体的二糖分析。也就是说，通过使用肝素酶II和III将经N-硫酸化的低分子化的肝素前体分解成不饱和二糖并通过HPLC分析各分解产物来定量各成分二糖的量。
[0222] 同样地，进行N-去乙酰化的肝素前体的二糖分析。在N-去乙酰化的肝素前体得以N-硫酸化后进行N-去乙酰化的肝素前体的二糖分析。也就是说，通过N-硫酸化N-去乙酰化的肝素前体，随后使用肝素酶II和III将其分解成不饱和二糖并通过HPLC分析各分解产物来定量各成分二糖的量。以与低分子化的N-去乙酰化的肝素前体的N-硫酸化相同地进行N-去乙酰化的肝素前体的N-硫酸化。
[0223] 通过以下规程具体进行二糖分析。
[0224] 1)将0.2U的肝素酶II(Sigma)、0.02至0.03mIU的肝素酶III、5μg的多糖样品和10μL的用于酶促消化的缓冲液(100mM CH3COONa，10mM(CH3COO)2Ca，pH 7.0)混合并用Milli-Q水稀释至100μL的测量体积以用作反应溶液。
[0225] 2)反应溶液在37℃反应16小时或更长，随后在100℃煮沸2分钟以终止反应。
[0226] 3)通过0.45μm滤膜去除杂质以获得随后用作二糖分析的样品的溶液。
[0227] 4)在以下条件下使用具有5μm粒径的Inertsil ODS-3 150mm×2.1mm的柱子进行分析，所述条件为50℃的温度、0.25mL/分钟的流速和230nm的检测波长，并且使用4％乙腈和1.2mM三丁胺作为溶液A以及4％乙腈和0.1M CsCl作为溶液B的洗脱液组成，其中溶液B的梯度为从1至90％。
[0228] 从各多糖样品产生的成分二糖的量的总和计算产率。也就是说，产率计算为从经N-硫酸化的低分子化的肝素前体产生的二糖的总量相对于从N-去乙酰化的肝素前体产生的二糖的总量的百分比(摩尔比率)。另外，此时，证实了在获得的经N-硫酸化的低分子化的肝素前体中，N-乙酰化产生的99％或更多的氨基被N-硫酸化。
[0229] 另外，基于从N-去乙酰化的肝素前体产生的各成分二糖的量计算N-去乙酰化的肝素前体中N-乙酰基的残留率。也就是说，乙酰基的残留率计算为具有乙酰基的二糖的量相对于二糖的总量的百分比(摩尔比率)。乙酰基的残留率为14.9％。
[0230] 实施例2：表达D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(Dlce)的细菌菌株的构建(1)表达源自人的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(hspDlce)的细菌菌株的构建
[0231] 通过使用SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35作为引物以pMAL-c2x(SEQ ID NO:2，New England BioLabs)作为模板DNA的PCR获得突变体麦芽糖结合蛋白(MBP*)的C-末端区域DNA片段。在上述PCR中，将限制酶BglII的识别位点加到5'末端，并将限制酶HindIII、BamHI、SacI、XhoI和NotI的限制性位点加到3'末端。用BglII和HindIII切割pMAL-c2x质粒DNA和MBP*的C-末端区域DNA片段，并连接以产生pMAL-MBP*质粒。pMAL-MBP*质粒的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:21中。
[0232] 通过人工基因合成(Thermo Fisher Scientific)制备编码源自人的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的全长蛋白质的cDNA。使用该cDNA作为模板和PrimeStar聚合酶(TaKaRa)作为聚合酶，根据方案进行PCR扩增(其中30个循环的98℃5秒、55℃10秒和72℃2分钟)以产生包括编码源自人的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Gly101至Asn617)的核苷酸序列的DNA片段。SEQ ID NO:36和37的组合用作引物。将所得的DNA片段用NotI和XhoI消化，并通过连接反应连接到先前用NotI和XhoI消化的pMAL-MBP*质粒上。用该反应溶液转化大肠杆菌JM109菌株，然后将其施加到含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，并在30℃培养过夜。根据已知方法从生长的经转化的微生物的菌落中提取质粒，使用3100遗传分析仪(Applied Biosystems)确认其核苷酸序列，并将具有目标结构的质粒命名为pMAL-MBP*-hspDlce(G101)。用所得的pMAL-MBP*-hspDlce(G101)转化大肠杆菌Origami B(DE3)，然后将其施加到含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，并得到具有目标质粒的经转化的微生物。将该经转化的微生物命名为大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-hspDlce(G101)，并用作表达hspDlce的菌株。插入的片段的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中。
[0233] (2)表达源自其他生物体物种的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的构建细菌菌株[0234] 使用pMAL-MBP*作为模板DNA和PrimeStar聚合酶(TaKaRa)作为聚合酶，根据制造商的方案进行PCR扩增(其中30个循环的98℃5秒、55℃10秒和72℃2分钟)以产生pMAL-MBP*的DNA片段。SEQ ID NO:38和39的组合用作引物。
[0235] 通过人工基因合成(Thermo Fisher Scientific)制备编码以下各项的全长蛋白质的cDNA：源自负鼠的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶、源自鸡的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶、源自蛙的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶、源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶、源自海鞘的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶，和源自果蝇的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶和源自秀丽隐杆线虫的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶。通过与(1)中相同的方法使用这些cDNA获得包括编码以下各项的核苷酸序列的DNA片段：源自负鼠的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Gly100至Asn617)、源自鸡的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Gly88至Asn605)、源自蛙的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Gly92至Asn607)、源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Gly70至Asn585)、源自海鞘的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Gly92至Asn637)、源自果蝇的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的催化位点(Y66至Asn614)和源自秀丽隐杆线虫的全长D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶。SEQ ID NO:40和41、SEQ ID NO:42和43、SEQ ID NO:44和45、SEQ ID NO:46和47、SEQ ID NO:48和49、SEQ ID NO:50和51以及SEQ ID NO:52和53的组合分别用作引物。使用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(Clontech)连接所得的各个DNA片段和pMAL-MBP*的DNA片段。通过与(1)中相同的方法用该连接溶液转化大肠杆菌JM109菌株以产生pMAL-MBP*-mdoDlce(G100)、pMAL-MBP*-ggaDlce(G88)、pMAL-MBP*-xtrDlce(G92)、pMAL-MBP*-dreDlce(G70)、pMAL-MBP*-cinDlce(K92)、pMAL-MBP*-dmeDlce(Y66)和pMAL-MBP*-celDlce。用所得的质粒各自转化大肠杆菌Origami B(DE3)。将所得的细菌菌株分别命名为大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-mdoDlce(G100)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-ggaDlce(G88)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-xtrDlce(G92)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-dreDlce(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-cinDlce(K92)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-dmeDlce(Y66)和大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-celDlce，并将其用作表达源自每个生物体物种的Dlce的细菌菌株。插入的片段的核苷酸序列各自显示在SEQ ID NO:8、10、12、14、16和18中，并且由其编码的氨基酸序列各自显示在SEQ ID NO:9、11、13、15、17和19中。
[0236] 实施例3：源自每个生物体物种的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(Dlce)的表达[0237] 大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-hspDlce(G101)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-mdoDlce(G100)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-ggaDlce(G88)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-xtrDlce(G92)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-dreDlce(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-cinDlce(K92)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-dmeDlce(Y66)和大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-celDlce各自接种至含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基(1.0％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、1.0％(w/v)NaCl)并在37℃预培养过夜。随后，将所得的培养基以1％的终浓度接种至3mL的LB培养基，并在37℃振荡培养3小时。然后，将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Nacalai Tesque)以0.5mM的终浓度添加到其中，并在22℃继续培养过夜，以在微生物细胞中表达源自各个生物体物种的Dlce。
[0238] 离心培养基，收集微生物细胞，用洗涤液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，200mM NaCl)洗涤一次，并以1/10的培养基的量重悬于洗涤液中。然后，使用Bioraptor(Sonic Bio)通过超声破碎微生物细胞，并以14,000rpm离心20分钟。将所得的上清液用作含有源自各个生物体物种的Dlce的无细胞提取物。
[0239] 实施例4：通过含有源自各个生物体物种的Dlce的无细胞提取物进行C5-差向异构化反应
[0240] (1)C5-差向异构化反应
[0241] 将含有源自各个生物体物种的Dlce的无细胞提取物以30％的浓度添加至反应溶液(2mg/mL经N-硫酸化的低分子化的肝素前体，50mM MES，pH 7.0，1mM氯化钙)并且混合物在37℃反应30分钟或12小时。作为阴性对照，在将洗涤溶液代替无细胞提取物添加到反应溶液的条件下进行酶促反应。
[0242] (2)C5-差向异构化比率的定量
[0243] 通过使用亚硝酸降解的二糖组成分析定量C5-差向异构化比率。
[0244] <试剂>
[0245] NaNO2(CAS No.7632-00-0，MW:69.01)
[0246] 柠檬酸(CAS No.77-92-9，MW:192.1)
[0247] 2,4-二硝基苯肼(CAS No.119-26-6，MW:198.1)，50％含水产品(缩写:DNPH)[0248] <试验溶液>
[0249] NaNO2水溶液：将49.5mg的试剂溶解于0.1mL的H2O中。
[0250] 柠檬酸水溶液：将384.2mg的试剂溶解于0.1mL的H2O中。
[0251] <分析规程>
[0252] 将10μL的反应溶液、20μL的柠檬酸盐缓冲液和10μL的NaNO2水溶液以该顺序添加到1.5mL微管(Eppendorf)中，并在65℃搅拌(1000rpm)混合溶液2小时以产生亚硝酸降解溶液，并在45℃搅拌(1000rpm)混合物2小时以产生衍生化溶液。在以下所示的条件下通过HPLC分析所得的衍生化溶液的组成。
[0253]
[0254] 柱子：由Sumika Chemical Analysis Service制造的ODS Z-CLUE 3μm，2.0mm×250mm
[0255] 柱温箱温度：50℃
[0256] 洗脱液流速：0.3mL/分钟
[0257] 检测：UV 365nm
[0258] 注射量：5μL
[0259] 洗脱液组成：溶液A：50mM NCOONH4(pH 4.5)
[0260] 溶液B：MeCN
[0261] 表2 HPLC梯度条件
[0262]时间(分钟) 溶液A(％) 溶液B(％)
0.0 90 10
13.0 80 20
27.0 20 80
27.1 90 10
40.0 90 10
0.0 90 10
13.0 80 20
27.0 20 80
27.1 90 10
40.0 90 10
[0263] (3)结果
[0264] 从通过HPLC分析获得的GlcA-GlcN(NS)与IdoA-GlcN(NS)的比率计算C5-差向异构化比率，其结果显示在表3中。从30分钟的反应中比较，证明含有MBP*-dreDlce(G70)的无细胞提取物表现出显著更高的C5-差向异构化比率。表中的符号(-)表示未获得数据。
[0265] 表3 C5-差向异构化比率
[0266]
[0267]
[0268] 实施例5：表达经修饰的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(Dlce)的细菌菌株的构建[0269] 通过人工DNA合成(Thermo Fisher Scientific)制备FcDlce-02、FcDlce-04、FcDlce-05、FcDlce-06和FcDlce-07(其是源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(dreDlce)的变体)中的催化位点(G70至Asn585)的cDNA。表4中显示了野生型和每种变体的全长蛋白质之间的修饰程度(表示使用ClustalW计算的氨基酸序列同源性)。
[0270] 表4野生型和每种变体的全长蛋白质之间的氨基酸序列同源性(使用ClustalW计算)
[0271]
[0272] 使用这些cDNA作为模板以与实施例2中相同的方法获得包括编码以下各项的核苷酸序列的DNA片段：FcDlce-02的催化位点(G70至Asn585)、FcDlce-04的催化位点(G70至Asn585)、FcDlce-05的催化位点(G70至Asn585)、FcDlce-06的催化位点(G70至Asn585)和FcDlce-07的催化位点(G70至Asn585)。SEQ ID NO:69和70、SEQ ID NO:71和47、SEQ ID NO:72和47、SEQ ID NO:46和47或SEQ ID NO:46和47的组合分别用作引物。以与实施例2(2)中相同的方法获得质粒pMAL-MBP*-FcDlce-02(G70)、pMAL-MBP*-FcDlce-04(G70)、pMAL-MBP*-FcDlce-05(G70)、pMAL-MBP*-FcDlce-06(G70)和pMAL-MBP*-FcDlce-07(G70)。用所得的质粒转化大肠杆菌Origami B(DE3)。所得的细菌菌株命名为大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-02(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-04(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-05(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-06(G70)和大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-07(G70)，并用作表达经修饰的Dlce的细菌菌株。插入的片段的核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO:55、58、61、64和
67中，并且由其编码的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:56、59、62、65和68中。
67中，并且由其编码的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:56、59、62、65和68中。
[0273] 实施例6：野生型和经修饰的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(Dlce)的表达[0274] 大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-dreDlce(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-02(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-04(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-05(G70)、大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-06(G70)和大肠杆菌Origami B(DE3)/pMAL-MBP*-FcDlce-07(G70)用于通过与实施例3中相同的方法在微生物细胞中表达野生型和经修饰的Dlce以产生含有Dlce的无细胞提取物。
[0275] 实施例7：通过含有野生型或经修饰的Dlce的无细胞提取物进行C5-差向异构化反应
[0276] 以与实施例4中相同的方法进行通过含有野生型或经修饰的Dlce的无细胞提取物的C5-差向异构化反应和C5-差向异构化比率的定量。阴性对照与实施例4中的相同。
[0277] 从通过HPLC分析获得的GlcA-GlcN(NS)与IdoA-GlcN(NS)的比率计算C5-差向异构化比率，结果显示在表5中。证明了各自含有MBP*-FcDlce-02(G70)、MBP*-FcDlce-04(G70)、MBP*-FcDlce-05(G70)、MBP*-FcDlce-06(G70)和MBP*-FcDlce-07(G70)的无细胞提取物表现出相当于或高于含有MBP*-dreDlce(G70)的无细胞提取物的C5-差向异构化比率的C5-差向异构化比率。
[0278] 表5 C5-差向异构化比率
[0279]
[0280]
[0282] SEQ ID NO:1代表编码源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(GenBank登录号AY388517.1)的天然存在的全长核苷酸序列。
[0283] SEQ ID NO:2代表源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶(GenBank登录号AY388517.1)的天然存在的全长氨基酸序列。
[0284] SEQ ID NO:3代表编码源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:2中的GLY70至Asn585)的天然存在的核苷酸序列。
[0285] SEQ ID NO:4代表编码源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:2中的GLY70至Asn585)的密码子优化的核苷酸序列。
[0286] SEQ ID NO:5代表源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:2中的GLY70至Asn585)。
[0287] SEQ ID NO:6代表编码源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly101至Asn617)的核苷酸序列。
[0288] SEQ ID NO:7代表源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly101至Asn617)。
[0289] SEQ ID NO:8代表编码源自负鼠的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly100至Asn617)的核苷酸序列。
[0290] SEQ ID NO:9代表源自负鼠的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly100至Asn617)。
[0291] SEQ ID NO:10代表编码源自鸡的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly88至Asn605)的核苷酸序列。
[0292] SEQ ID NO:11代表源自鸡的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly88至Asn605)。
[0293] SEQ ID NO:12代表编码源自蛙的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly92至Asn607)的核苷酸序列。
[0294] SEQ ID NO:13代表源自蛙的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Gly92至Asn607)。
[0295] SEQ ID NO:14代表编码源自海鞘的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(K92至Asn637)的核苷酸序列。
[0296] SEQ ID NO:15代表源自海鞘的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(K92至Asn637)。
[0297] SEQ ID NO:16代表编码源自果蝇的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Y66至Asn614)的核苷酸序列。
[0298] SEQ ID NO:17代表源自果蝇的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的部分氨基酸序列(Y66至Asn614)。
[0299] SEQ ID NO:18代表编码源自秀丽隐杆线虫的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的全长氨基酸序列的核苷酸序列。
[0300] SEQ ID NO:19代表源自秀丽隐杆线虫的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的全长氨基酸序列。
[0301] SEQ ID NO:20代表pMAL-c2x质粒的核苷酸序列。
[0302] SEQ ID NO:21代表pMAL-MBP*质粒的核苷酸序列。
[0303] SEQ IN NO:22至31代表用于构建实施例1中hepC基因表达质粒的的引物和片段的核苷酸序列。
[0304] SEQ ID NO:22代表引物P1的核苷酸序列。
[0305] SEQ ID NO:23代表引物P2的核苷酸序列。
[0306] SEQ ID NO:24代表Pnlp0启动子的PaeI-SalI片段的核苷酸序列。
[0307] SEQ ID NO:25代表引物P3的核苷酸序列。
[0308] SEQ ID NO:26代表引物P4的核苷酸序列。
[0309] SEQ ID NO:27代表包括约300bp的rrnB基因中的终止子区域(SEQ ID NO:6)的DNA片段的核苷酸序列。
[0310] SEQ ID NO:28代表引物P5的核苷酸序列。
[0311] SEQ ID NO:29代表引物P6的核苷酸序列。
[0312] SEQ ID NO:30代表引物P7的核苷酸序列。
[0313] SEQ ID NO:31代表引物P8的核苷酸序列。
[0314] SEQ ID NO:32代表实施例1中克隆的hepC基因的核苷酸序列。
[0315] SEQ ID NO:33代表由SEQ ID NO:32的核苷酸序列编码的肝素酶III(HepC)的氨基酸序列。
[0316] SEQ ID NO:34和35代表实施例2中用于制备MBP*的引物的核苷酸序列。
[0317] SEQ ID NO:36和37代表实施例2中用于获取源自人的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0318] SEQ ID NO:38和39代表实施例2中用于获取pMAL-MBP*的DNA片段的引物的核苷酸序列。
[0319] SEQ ID NO:40和41代表实施例2中用于获取源自负鼠的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0320] SEQ ID NO:42和43代表实施例2中用于获取源自鸡的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0321] SEQ ID NO:44和45代表实施例2中用于获取源自蛙的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0322] SEQ ID NO:46和47代表实施例2中用于获取源自斑马鱼的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0323] SEQ ID NO:48和49代表实施例2中用于获取源自海鞘的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0324] SEQ ID NO:50和51代表实施例2中用于获取源自果蝇的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0325] SEQ ID NO:52和53代表实施例2中用于获取源自秀丽隐杆线虫的D-葡糖醛酸基C5-差向异构酶的片段的引物的核苷酸序列。
[0326] SEQ ID No:54代表变体FcDlce-02的全长氨基酸序列。
[0327] SEQ ID No:55代表编码变体FcDlce-02的部分氨基酸序列Gly70至Asn585的核苷酸序列。
[0328] SEQ ID No:56代表变体FcDlce-02的部分氨基酸序列Gly70至Asn585。
[0329] SEQ ID No:57代表变体FcDlce-04的全长氨基酸序列。
[0330] SEQ ID No:58代表编码变体FcDlce-04的部分氨基酸序列Gly70至Asn585的核苷酸序列。
[0331] SEQ ID No:59代表变体FcDlce-04的部分氨基酸序列Gly70至Asn585。
[0332] SEQ ID No:60代表变体FcDlce-05的全长氨基酸序列。
[0333] SEQ ID No:61代表编码变体FcDlce-05的部分氨基酸序列Gly70至Asn585的核苷酸序列。
[0334] SEQ ID No:62代表变体FcDlce-05的部分氨基酸序列Gly70至Asn585。
[0335] SEQ ID No:63代表变体FcDlce-06的全长氨基酸序列。
[0336] SEQ ID No:64代表编码变体FcDlce-06的部分氨基酸序列Gly70至Asn585的核苷酸序列。
[0337] SEQ ID No:65代表变体FcDlce-06的部分氨基酸序列Gly70至Asn585。
[0338] SEQ ID No:66代表变体FcDlce-07的全长氨基酸序列。
[0339] SEQ ID No:67代表编码变体FcDlce-07的部分氨基酸序列Gly70至Asn585的核苷酸序列7。
[0340] SEQ ID No:68代表变体FcDlce-07的部分氨基酸序列Gly70至Asn5857。
[0341] SEQ ID NO:69和70代表实施例5中用于获取变体FcDlce-02的片段的引物的核苷酸序列。
[0342] SEQ ID No:71代表实施例5中用于获得变体FcDlce-04的片段的引物的核苷酸序列。
[0343] SEQ ID No:72代表实施例5中用于获得变体FcDlce-05的片段的引物的核苷酸序列。
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