技术领域
[0001] 本
发明属于生物医药制备方法技术领域，具体涉及一种生物素三肽-1液相合成方法。
背景技术
[0002] 1988年FDA批准了5％的米诺地尔用于脱发
治疗，1997年FDA批准了1mg的非那雄胺作为治疗脱发的口服药物，这两种药物在很多年中一直都是治疗脱发的最强组合。它们作为药物的有效成分不能添加到
化妆品中。化妆品中用于生发的肽活性最高的是Biotin-GHK。对于毛干的增长，2ppm浓度下与米洛地尔效果相当(增长58％)，5ppm浓度下比空白增长121(Sederma数据)。
[0003]
现有技术，生物素三肽-1是采用固相合成方法，首先将一个
氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上，在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了，然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后脱去保护基X，用HF
水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。
[0004] 固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，最终通过制备液相来纯化，放大会导致产品更加杂不易纯化，存在成本高、对环境的污染大，单批次生产量小的问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种生物素三肽-1液相合成方法，以解决上述问题。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 本发明一种生物素三肽-1液相合成方法，包括以下步骤：
[0008] 1)生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备：在反应装置中，搅拌下依次加入四氢呋喃、生物素、N-羟基琥珀酰亚胺和1,3-二环己基
碳二亚胺，升温回流反应，过滤，滤液减压浓缩得到白色固体；
[0009] 2)Biotin-Gly-OH的制备：在反应装置中，搅拌下依次加入水、四氢呋喃、步骤1)所得的生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯和甘氨酸，用30％氢
氧化钠溶液调pH＝8.5，室温反应，反应完后调pH＝2析出大量固体，过滤，
滤饼用水淋洗，
真空干燥得到白色固体；
[0010] 3)Biont-GHK(Boc)-OH的制备：在反应装置中，搅拌下依次加入四氢呋喃、步骤2)所得的Biontin-Gly-OH，
冰浴降温下加入N,N'-羰基二咪唑,当反应液不再冒气泡时把料液滴到His-Lys(Boc)-OH和三乙胺的四氢呋喃溶液中，滴完后室温反应，反应完减压浓缩得到油状物，加入水和乙酸乙酯，用
盐酸溶液调pH＝2.0～2.5,有机相用盐水洗涤；无水
硫酸镁干燥，减压浓缩得到黄色油状物；
[0011] 4)生物素三肽-1的制备：在反应装置中，搅拌下依次加入4M的盐酸和步骤3)所得Biotin-GHK(Boc)-OH，室温反应，反应完后向料液中滴加乙腈，静置养晶，24小时后过滤，真空干燥得到生物素三肽-1。
[0012] 步骤1)中回流反应时间控制为1-3小时。
[0013] 步骤2)中控制反应
温度为25±5℃，反应时间为1-2小时。
[0014] 步骤3)中控制反应温度为30±5℃，反应时间为2-3小时。
[0015] 步骤4)中控制反应温度为25±5℃，反应时间为1-2小时，养晶
温度控制为5±3℃。
[0016] 本发明的有益效果为：本发明一种生物素三肽-1液相合成方法，最终产品可以通过结晶的方法进行纯化，成功避免了固相合成最后需要液相纯化，降低了生产成本，增加了批次生产能
力。
具体实施方式
[0018] 一种生物素三肽-1液相合成方法，包括以下步骤：
[0019] 1)生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备：
[0020] 在装有
温度计、搅拌器的250ml三颈瓶中，搅拌下依次加入四氢呋喃100ml，生物素20g(81.9mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺10.4g(90.09mmol)，1,3-二环己基碳二亚胺20.27g(98.24mmol)，回流反应2小时，过滤，滤液减压浓缩得到27.2g白色固体，收率97.3％；
[0021] 2)Biotin-Gly-OH的制备：
[0022] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入水100ml，四氢呋喃100ml，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯15g(43.94mmol)，甘氨酸3.96g(52.73mmol)，用30％氢氧化钠溶液调pH＝8.5，并保持pH＝8.5，25℃反应1.5小时后，调pH＝2析出大量固体，过滤，滤饼用2ml水淋洗，干燥得到12.9g白色固体,摩尔收率97.4％；
[0023] 3)Biont-GHK(Boc)-OH的制备：
[0024] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入四氢呋喃50ml，Biontin-Gly-OH5g(16.59mmol)，冰浴降温下加入N,N'-羰基二咪唑2.82g(17.42mmol),当反应液不再冒气泡时把料液滴到His-Lys(Boc)-OH7.63g(19.91mmol)和三乙胺2.01g(19.91mmol)的四氢呋喃溶液中，滴完后30℃反应2小时后，减压浓缩得到油状物，加入20ml水,50ml乙酸乙酯,用6M盐酸调pH＝2.3,有机相用盐水洗涤15ml*3；加入5g无水
硫酸镁搅拌半小时后过滤，减压浓缩得到10.9g黄色油状物，摩尔收率98.5％
[0025] 4)生物素三肽-1的制备：
[0026] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入4mol/L的盐酸30ml，Biotin-GHK(Boc)-OH5g(7.50mmol)，25℃反应1小时，向料液中滴加乙腈30ml，5℃静置养晶，24小时后过滤，真空干燥得到98％纯度的产品4.3g，摩尔收率95.1％。
[0027] 实施例2
[0028] 一种生物素三肽-1液相合成方法，包括以下步骤：
[0029] 1)生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯制备：
[0030] 在装有温度计、搅拌器的250ml三颈瓶中，搅拌下依次加入四氢呋喃100ml，生物素20g(81.9mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺10.4g(90.09mmol)，1,3-二环己基碳二亚胺20.27g(98.24mmol)，回流反应2.5小时，过滤，滤液减压浓缩得到27.1g白色固体,摩尔收率
96.9％；
[0031] 2)Biotin-Gly-OH的制备：
[0032] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入水100ml，四氢呋喃100ml，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯15g(43.94mmol)，甘氨酸3.96g(52.73mmol)，用30％氢氧化钠溶液调pH＝8.5，并保持pH＝8.5，25℃反应2小时后，调pH＝2析出大量固体，过滤，滤饼用2ml水淋洗，干燥得到12.8g白色固体,摩尔收率96.7％；
[0033] 3)Biont-GHK(Boc)-OH的制备：
[0034] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入四氢呋喃50ml，Biontin-Gly-OH5g(16.59mmol)，冰浴降温下加入N,N'-羰基二咪唑2.82g(17.42mmol),当反应液不再冒气泡时把料液滴到His-Lys(Boc)-OH7.63g(19.91mmol)和三乙胺2.01g(19.91mmol)的四氢呋喃溶液中，滴完后30℃反应2.5小时后，减压浓缩得到油状物，加入20ml水,50ml乙酸乙酯,用6M盐酸调pH＝2.3,有机相用盐水洗涤15ml*3；加入5g无水硫酸镁搅拌半小时后过滤，，减压浓缩得到10.6g黄色油状物,摩尔收率95.8％；
[0035] 4)生物素三肽-1的制备：
[0036] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入4mol/L的盐酸30ml，Biotin-GHK(Boc)-OH5g(7.50mmol)，25℃反应1.5小时，向料液中滴加乙腈30ml，3℃静置养晶，24小时后过滤，真空干燥得到98％纯度的产品4.4g,，摩尔收率97.3％。
[0037] 实施例3
[0038] 一种生物素三肽-1液相合成方法，包括以下步骤：
[0039] 1)生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯制备：
[0040] 在装有温度计、搅拌器的250ml三颈瓶中，搅拌下依次加入四氢呋喃100ml，生物素20g(81.9mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺10.4g(90.09mmol)，1,3-二环己基碳二亚胺20.27g(98.24mmol)，回流反应3小时，过滤，滤液减压浓缩得到27.0g白色固体,摩尔收率96.7％；
[0041] 2)Biotin-Gly-OH的制备：
[0042] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入水100ml，四氢呋喃100ml，生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯15g(43.94mmol)，甘氨酸3.96g(52.73mmol)，用30％氢氧化钠溶液调pH＝8.5，并保持pH＝8.5，25℃反应1小时后，调pH＝2析出大量固体，过滤，滤饼用2ml水淋洗，干燥得到12.7g白色固体,摩尔收率95.9％；
[0043] 3)Biont-GHK(Boc)-OH的制备：
[0044] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入四氢呋喃50ml，Biontin-Gly-OH5g(16.59mmol)，冰浴降温下加入N,N'-羰基二咪唑2.82g(17.42mmol),当反应液不再冒气泡时把料液滴到His-Lys(Boc)-OH7.63g(19.91mmol)和三乙胺2.01g(19.91mmol)的四氢呋喃溶液中，滴完后30℃反应3小时后，减压浓缩得到油状物，加入20ml水,50ml乙酸乙酯,用6M盐酸调pH＝2.3,有机相用盐水洗涤15ml*3；加入5g无水硫酸镁搅拌半小时后过滤，，减压浓缩得到10.4黄色油状物，摩尔收率94.0％；
[0045] 4)生物素三肽-1的制备：
[0046] 在装有温度计、搅拌器的500ml三颈瓶中，搅拌下依次加入4mol/L的盐酸30ml，Biotin-GHK(Boc)-OH5g(7.50mmol)，25℃反应2小时，向料液中滴加乙腈30ml，7℃静置养晶，24小时后过滤，真空干燥得到98％纯度的产品4.2g,摩尔收率92.9％。
