技术领域
[0001] 本
发明生物化学分离合成技术领域，特别涉及一种间接制备D-异抗坏血酸钠的方法。
背景技术
[0002] D-异抗环血酸（Erythorbic acid, EA），又名赤藻糖酸或阿拉伯抗坏血酸，是L-抗坏血酸钠的一种旋光异构体，简称异Vc。D-异抗环血酸及其钠盐（Sodium erythorbate, EN）具有很强的还原性，防腐抗
氧的效果大大优于维生素C，对热的
稳定性也比维生素C强，而价格只有维生素C的1/2。异抗坏血酸及其钠盐是安全、有效的
食品添加剂，广泛应用于各类食品中。异抗坏血酸钠为白色或微黄色针状晶体，无臭，味略咸，在空气中较稳定，遇光色渐变暗，在
水中易溶，在甲醇、已醇中微溶解。D-异抗坏血酸钠的制备方法主要有间接
发酵法、直接发酵法和酶法。目前工业生产上采用间接发酵法即发酵与合成相结合进行生产。
[0003] 2-
酮基-D-
葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid, 2-KGA）是食品添加剂（抗
氧化剂）D-异抗坏血酸及其钠盐工业化生产过程中的关键中间体。2-KGA分子式为C6H10O7，分子量为194。2-KGA外观上为白色细微结晶体，稍带咸味，无嗅，易溶于水且水溶液略显酸性，具有旋光性，其比旋光度为[α]25D= -88°。2-KGA的产生菌分布较为广泛，多数菌株为野生型，分属于假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)和
醋酸杆菌属(Acetobacter)。
[0004] 目前国内外2-KGA生产菌通常采用假单胞菌属的菌株，该种菌株的发酵液经过酯化等处理得到的D-异抗坏血酸钠得率和纯度较低。开发一种D-异抗坏血酸钠得率高且纯度高的方法意义重大。
[0005]
申请公布号为“CN 104830712 A”的中国发明
专利“一种产高纯度2-酮基-D-
葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株”公开了采用粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株发酵产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸，该菌株保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为N0.10548，保藏时间：2015年2月9日。
发明内容
[0006] 为了弥补
现有技术的不足，本发明提供了一种采用产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株的发酵液制备D-异抗环血酸的方法。
[0007] 本发明的技术方案为：
[0008] 一种间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，以粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株的发酵液为原料，经发酵液预处理、2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯化反应、转换反应得D-异抗坏血酸粗钠盐；再经精制纯化得D-异抗坏血酸钠产品；所述粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：10548，其保藏时间为：2015年2月9日。
[0009] 作为优选方案，所述间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，具体步骤为：
[0010] 1）菌种发酵
[0011] 按照8-12%的接种量将所述粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株的
种子液接种到发酵培养基中，在29-31℃、400-600r/min条件下发酵培养30-40h，得到2-酮基-D-葡萄糖酸发酵液；
[0012] 2）发酵液预处理
[0013] 所述2-酮基-D-葡萄糖酸发酵液离心后所得清夜中加入浓
硫酸，然后在50-95℃的水浴条件下，向
酸化后的清夜中加入
活性炭，搅拌脱色；脱色后滤除活性炭，所得滤液过阳离子交换
树脂柱，由阳离子交换树脂柱除杂后收集的处理液减压蒸馏，得固形物含量为70-90%得2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液；
[0014] 3）甲酯化反应
[0015] 向所述2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液中加入甲醇，并以硫酸作为催化剂，于60-100℃反应5-10h，反应完毕，浓缩、4℃下结晶，抽滤并烘干得2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐；
[0016] 4）转化反应
[0017] 将所述2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐加入甲醇中溶解，然后加入甲醇-氢氧化钠
混合液，在55-70℃下，反应13-20min，然后于4℃下放置结晶，抽滤得D-异抗坏血酸粗钠盐；
[0018] 5）D-异抗坏血酸钠的精制
[0019] 所得D-异抗坏血酸粗钠盐溶于水中，加入活性炭和
草酸，加热至50-70℃，保温搅拌3-8min，然后趁热抽滤得滤液；所得滤液冷却、结晶、抽滤并用90-100%
乙醇洗涤后干燥得D-异抗坏血酸钠产品。
[0020] 作为优选方案，步骤1）中获得种子液所用的种子培养基组成为蛋白胨5g/L、
氯化钠5 g/L、
牛肉膏3 g/L，pH值为7.0；所述发酵培养基组成为葡萄糖180 g/L、玉米浆9.01 g/L、硫酸二氢
钾1 g/L、
硫酸镁0.4 g/L、氯化锰0.037 g/L、硫酸亚
铁0.036 g/L、
碳酸
钙65 g/L。
[0021] 作为优选方案，步骤2）中活性炭的加入量为固形物含量的5-15%，脱色时间至少为0.5h。
[0022] 作为优选方案，步骤2）中，所述阳离子交换树脂柱为732#阳离子交换树脂柱，所述阳离子交换树脂柱高径比为9:1-10:1，流速每小时1-1.1倍柱体积。
[0023] 作为优选方案，步骤3）中甲醇的加入量满足：每克2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液中加入5-1.5mL甲醇。
[0024] 作为优选方案，步骤4）中，2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中甲醇的加入量满足：每克2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中加入10-10.5mL甲醇；甲醇-氢氧化钠混合液的加入量满足：每克2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中加入4-4.5mL甲醇-氢氧化钠混合液。
[0025] 作为优选方案，步骤5）中，活性炭和草酸的加入量均为固形物含量的0.5%-0.7%。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 本发明以粘质沙雷氏菌为生产菌种发酵得到2-酮基-D-葡萄糖酸钙，结合多种除杂方式，将处理液转化合成D-异抗坏血酸钠，得到的发酵液2-酮基-D-葡萄糖酸产量高、转化率高，D-异抗坏血酸钠粗品纯度高，易于精制，总收率得到提高，具有良好的推广应用前景。
附图说明
[0028] 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0029] 图1为本发明
实施例1得到的D-异抗坏血酸钠样品；
[0030] 图2为本发明实施例1得到的D-异抗坏血酸钠样品液相色谱图；
[0031] 图3为标准D-异抗坏血酸钠样品液相色谱图。
[0032] 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为N0.10548，保藏时间：2015年2月9日。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅限于此。
[0034] 种子培养基组成为：蛋白胨5g/L、氯化钠5 g/L、牛肉膏3 g/L，pH值为7.0。
[0035] 发酵培养基组成为：葡萄糖180 g/L、玉米浆9.01 g/L、硫酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.4 g/L、氯化锰0.037 g/L、硫酸亚铁0.036 g/L、碳酸钙65 g/L。
[0036] 实施例1
[0037] 间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，具体步骤为：
[0038] 1）菌种发酵
[0039] 将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548菌株移接斜面活化。
[0040] 按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基，500ml三
角瓶装液量为50ml，121℃
蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，30℃培养12小时，得种子液，取种子液置600nm测吸光值为0.262；
[0041] 以5L
发酵罐按3L装液量配制发酵培养基，调整pH7.0，115℃实罐灭菌20分钟，
循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液300 ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为185 g/L。
[0042] 初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为350r/min，通气量0.7 0.8Nm3/h，罐内压
力~0.065MPa。发酵过程中控制发酵
温度30±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为
35%。
[0043] 发酵过程中每4小时取样，测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10 g/L时，每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，至发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量不再增加时结束发酵，发酵周期为36小时。
[0044] 发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸的含量分别为0.02g/L、188.9g/L，葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为102.11%。
[0045] 2）发酵液的预处理
[0046] 发酵液离心后测定Ca2+含量为0.66mol/L，加入0.66mol/L的浓硫酸，使Ca2+转化为硫酸钙沉淀下来，离心后得到酸化清液2.7L；固形物含量19.2%，于80℃水浴条件下，加入占固形物含量5%的活性炭，不断搅拌，脱色0.5h，脱色后抽滤；滤液经732#阳离子交换树脂，流出液3.1L；将经柱子除杂收集到的处理液于55℃进行减压浓缩，浓缩至固形物含量为80%，共501.3g。
[0047] 3）甲酯化反应
[0048] 取100g2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液，加入500ml甲醇，以浓硫酸作催化剂，于80℃水浴下反应7h，并向反应器中补充甲醇。浓缩后于4℃放置，经抽滤后，用甲醇清洗，洗液并入清液中。沉淀于40℃烘干，即得甲酯盐64.12g。
[0049] 4）转化反应
[0050] 将60g甲酯盐加入到600ml甲醇溶液中，搅拌使其完全溶解，加入甲醇-NaOH溶液250ml，65℃水浴下反应17min，于4℃放置一段时间后抽滤，得粗钠盐50.82g，纯度为98.1%。
其中，甲醇--NaOH溶液中甲醇与氢氧化钠的
质量比为10:1。
[0051] 5）D-异抗坏血酸钠精制
[0052] 将50.5g粗钠盐溶于水中，加入0.3g草酸及0.3g活性炭，水浴保温至60℃，保温搅拌5min，趁热抽滤得滤液150ml。经冷却结晶、抽滤，95%乙醇洗涤晶体，50℃干燥，制得D-异抗坏血酸钠产品48.82g，得率为95.6%，纯度为99.5%。将产品进行液相分析，表明产物为异抗坏血酸钠。
[0053] 实施例2
[0054] 间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法，具体步骤为：
[0055] 1） 菌种发酵
[0056] 将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548菌株移接斜面活化。
[0057] 按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基，500ml三角瓶装液量为50ml，121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，30℃培养12小时，得种子液，取种子液置600nm测吸光值为0.265；
[0058] 以10L发酵罐按7L装液量配制发酵培养基，调整pH7.0，115℃实罐灭菌20分钟，循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液700 ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为180g/L。
[0059] 初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为350r/min，通气量0.8 0.9Nm3/h，罐内压力~0.065MPa。发酵过程中控制发酵温度30±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为
35%。
[0060] 发酵过程中每4小时取样，测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10 g/L时，每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，至发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量不再增加时结束发酵，发酵周期为35小时。
[0061] 发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸的含量分别为0.03g/L、183.12g/L，葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为101.73%。
[0062] 2）发酵液的预处理
[0063] 发酵液离心后测定Ca2+含量为0.67mol/L，加入0.67mol/L的浓硫酸，使Ca2+转化为硫酸钙沉淀下来，离心后得到酸化清液6.5L；固形物含量19.5%，于80℃水浴条件下，加入占固形物含量5%的活性炭，不断搅拌，脱色0.5h，脱色后抽滤；滤液经732#阳离子交换树脂柱，流出液7.2L；将经柱子除杂收集到的处理液于55℃进行减压浓缩，浓缩至固形物含量为79.5%，共1.1kg。
[0064] 3）甲酯化反应
[0065] 取100g2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液，加入500ml甲醇，以浓硫酸作催化剂，于80℃水浴下反应7h，并向反应器中补充甲醇。浓缩后于4℃放置，经抽滤后，用甲醇清洗，洗液并入清液中。沉淀于40℃烘干，即得甲酯盐64.10g。
[0066] 4）转化反应
[0067] 将60g甲酯盐加入到600ml甲醇溶液中，搅拌使其完全溶解，加入甲醇-NaOH溶液250ml，65℃水浴下反应17min，于4℃放置一段时间后抽滤，得粗钠盐50.93g，纯度为98.0%。
其中，甲醇--NaOH溶液中甲醇与氢氧化钠的质量比为9:1。
[0068] 5）D-异抗坏血酸钠精制
[0069] 将50.0g粗钠盐溶于水中，加入0.3g草酸及0.3g活性炭，水浴保温至60℃，保温搅拌5min，趁热抽滤得滤液155ml。经冷却结晶、抽滤，95%乙醇洗涤晶体，50℃干燥，制得D-异抗坏血酸钠产品48.79g，得率为96.1%，纯度为99.6%。将产品进行液相分析，表明产物为异抗坏血酸钠。
[0070] 对比例1
[0071] 将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens SDSPY-136）的发酵液替换为假单胞菌属的菌株的发酵液，其余同实施例1。
[0072] 该对比例D-异抗坏血酸钠的得率为90.2，纯度为93.3。
[0073] 对比例2
[0074] 删除步骤2）中“滤液经732#阳离子交换树脂柱”的操作，将滤液直接浓缩，其余与实施例1相同。
[0075] 该对比例D-异抗坏血酸钠的得率为85.2%，纯度为90.1%。
[0076] 对比例3
[0077] 步骤5）中，D-异抗坏血酸粗钠盐溶于水后，仅加入0.3g活性炭，而不加入草酸；其余与实施例1相同。
[0078] 该对比例D-异抗坏血酸钠的得率为87.3%，纯度为91.8%。
[0079] 上述葡萄糖按下述方法测定：
[0080] 使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型
膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
[0081] 上述2-酮基-D-葡萄糖酸按下述方法测定：
[0082] 使用碘量法测定。测定原理是：2-酮基-D-葡萄糖酸分子内含有可直接发生酯化反应的羧基和醇羟基，还含有可发生互变异构反应的羰基，在强酸性条件下加热2-酮基-D-葡萄糖酸水溶液可以将其定量转化为D-异抗坏血酸。利用D-异抗坏血酸与I2的
氧化还原反应可以定量测定D-异抗坏血酸的质量浓度，然后换算成2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度。
[0083] 上述2-酮基-D-葡萄糖酸转化率按下述方法测定：
[0084] 2-酮基-D-葡萄糖酸转化率（%）=2-酮基-D-葡萄糖酸产量(g/L）/[初始培养基中葡萄糖含量（g/L)-发酵后培养基中葡萄糖含量（g/L)]
[0085] 上述Ca2+测定按下述方法测定：GB/T 7476-1987 水质 钙的测定 EDTA滴定法[0086] 上述D-异抗坏血酸钠按下述方法测定：GB8273-2008 食品添加剂 D-异抗坏血酸钠的测定。
[0087] 上述的D-异抗坏血酸钠的鉴定按以下方法：高效液相色谱法。色谱条件为：UltiMate 3000系列VWD-3000可变
波长检测器；色谱柱为Prontosil 1202102 C18柱(10μm，
4.6mm i.d.×250mm)；流动相用二次蒸馏水配制0.1mol/L KH2PO4，
磷酸调节pH至2.5；流速为0.5mL/min；进样体积为20μL；检测波长为210 nm；柱温为30℃。
