苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物及其制备方法与应用
阅读：3发布：2020-06-17
专利汇可以提供苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种苯丙 氨 酸酰胺化的核苷酸衍 生物 及其制备方法与应用。本发明中化合物采用卤代苯丙氨酸与含有氨基的核苷类化合物的氨基进行结合，同时进行磷 酸化 ，通过 磷酸 酯、磷酰胺前药形式促进吸收、避开限速的一磷酸合成环节，减少或避免核苷类脱氨酶的作用，以增强药效，同时卤代苯丙氨酸具有抑制 蛋白质 合成的协同作用，起到在抗 肿瘤 以及抗乙肝病毒方面增加生物利用度、提高药效、减少耐药性的作用。，下面是苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.式I所示4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物：
式I中，X代表卤素，具体可为F、Cl、Br或I；
式I中， 代表核苷及其类似物；
式I中，4-卤素取代的苯丙氨酸与核苷碱基中的氨基形成酰胺键，所述碱基包括取代或未取代的4-氨基嘧啶、取代或未取代的2-氨基嘌呤、取代或未取代的6-氨基嘌呤、取代或未取代的2，6-二氨基嘌呤、取代或未取代1H-咪唑并[4,5-c]吡啶、取代或未取代吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪，其中的取代基为：甲基，甲氧基，环丙基，氨基，羰基，卤素；
式(I)中，核苷中的核糖或脱氧核糖中的5-羟甲基与磷酸形成酯键，
R1为苯基或取代苯基，萘基或取代萘基，C1-C18未取代的烷基，卤素/烷氧基取代的C1-C18烷基，C3-C6取代或未取代的环烷基；
R2为氨基酸侧链，或C1-C8烷基/环烷基、苯基；
R3为甲基、乙基、异丙基或苄基。
2.根据权利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于：所述碱基为如下任意一种：
3.根据权利要求1或2所述的核苷酸衍生物，其特征在于：所述核苷及其类似物为如下任意一种：
4.制备权利要求1-3中任一项所述的核苷酸衍生物的方法，包括如下步骤：1)使式II所示五氟苯酚磷酸酯活性中间体与核苷中的核糖或脱氧核糖的5-羟甲基反应，得到核糖或脱氧核糖5-羟甲基磷酸化的核苷酸；
式II中，R1、R2和R3的定义分别同权利要求1式I中R1、R2和R3的定义；
2)使得BOC-(4-X)苯丙氨酸与步骤2)所得核糖或脱氧核糖核苷酸的碱基中的氨基偶联形成酰胺键，即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述式II所示五氟苯酚磷酸酯活性中间体与核苷的摩尔为：1.0-2.0；
所述反应在叔丁基氯化镁催化下进行；
核苷与叔丁基氯化镁的摩尔比为：1:1.0-2.0；
所述反应在惰性气体保护下进行，所述惰性气体具体可为氮气；
所述反应在无水有机溶剂中进行，所述无水有机溶剂具体可为无水四氢呋喃；
所述反应的温度为：-20-10℃，时间为：8-24h。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述形成酰胺键的反应1-羟基苯并三唑存在下进行；
所述形成酰胺键的反应在羧基活化试剂存在下进行，所述羧基活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
所述核糖或脱氧核糖5-羟甲基磷酸化的核苷酸与BOC-(4-X)苯丙氨酸、1-羟基苯并三唑及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比依次为：1.0：1.0-1.5：1.0-
2.0：1.0-2.0；
所述反应的温度为室温，时间为3-8h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：如所述核苷中的核糖或脱氧核糖除了具有
5-羟甲基外，还有其他位置上的羟基，那么在步骤1)之前还包括先选择性地保护其他位置上的羟基的操作，
相应地，在步骤2)之后，还包括将步骤2)得到的产物在酸性条件下脱去羟基保护，得到目标产物的操作。
8.权利要求1-3中任一项所述的式I所示4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物在制备抗肿瘤和/或抗病毒的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为人胰腺癌肿瘤；
所述病毒为乙肝病毒。
苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 核苷酸是一类由碱基(主要是嘌呤、嘧啶碱的衍生物)、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸连接而成的化合物。也叫“核苷磷酸”，是构成核酸的基本单位。核苷酸也是构成DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的单位，生物的细胞中都存在。
[0003] 胞苷和腺苷为含有氨基的核苷类化合物，这两类化合物中有抗肿瘤药和抗乙肝病毒药，抗肿瘤药有吉西他滨、氟达拉滨等，抗乙肝病毒药有阿德福韦和替诺福韦等，含有氨基的核苷类化合物如吉西他滨，在核苷脱氨酶的作用下，90％转变成无活性的DFDU，仅少部分转变为三磷酸吉西他滨发挥药效，吉西他滨目前只有注射剂型上市销售。
[0004] 需要对现有的胞苷和腺苷的结构进行改造，以减少或避免核苷类脱氨酶的作用，从而增强药效。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是提供一种4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物。
[0006] 本发明所提供的4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物，其结构式如式I所示：
[0007]
[0008] 上述式I中，X代表卤素，具体可为F、Cl、Br或I；
[0009] 上述式I中， 代表核苷及其类似物；
[0010] 上述式I中，4-卤素取代的苯丙氨酸与核苷碱基中的氨基形成酰胺键，所述碱基包括取代或未取代的4-氨基嘧啶、取代或未取代的2-氨基嘌呤、取代或未取代的6-氨基嘌呤、取代或未取代的2，6-二氨基嘌呤、取代或未取代1H-咪唑并[4,5-c]吡啶、取代或未取代吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪，其中的取代基可为：甲基，甲氧基，环丙基，氨基，羰基，卤素(F、Cl、Br或I)。
[0011] 所述碱基具体可为如下任意一种：
[0012]
[0013] 上述式(I)中，核苷中的核糖或脱氧核糖中的5-羟甲基与磷酸形成酯键，R1可为苯基或取代苯基，萘基或取代萘基，C1-C18未取代的烷基，卤素/烷氧基取代的C1-C18烷基，C3-C6取代或未取代的环烷基，优选为苯基或萘基；R2可为氨基酸侧链(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)，也可为C1-C8烷基/环烷基、苯基；R3为甲基、乙基、异丙基、苄基，优选为苄基。
[0014] 所述核苷及其类似物可为常见的核糖核苷或脱氧核糖核苷及其类似物；具体可为如下任意一种：
[0015]
[0016]
[0017] 上述式I所示4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物具体可为如下化合物中的一种：
[0018] 1、
[0019] 2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(吉西他滨衍生物)；
[0020] 3、
[0021] 2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(cytarabine 衍生物);
[0022] 2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯；
[0023] 5、
[0024] 2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)-4-氰基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯
[0025] 6、
[0026] 2-(((((2R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(扎西他滨衍生物)[0027]
[0028] 7、
[0029] 2-((((2S)-3-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2-羟丙氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯
[0030]
[0031] 8、
[0032] 2-(((((2S,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Lamivudine衍生物)[0033] 9、
[0034] 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Emtricitabine衍生物)
[0035] 10、
[0036] 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Aminoadenosine衍生物）
[0037] 2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-甲氧基-1H-嘌呤-9(6H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Nelarabine衍生物)
[0038] 12、
[0039] 2-(((((1R,4S)-4-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-(环丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基)环戊烯-2-烯-1-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯
[0040] 13、
[0041] 2-(((((1S,3R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-氧-1H-嘌呤-9(6H)-基)-5-羟基-2-亚甲基环戊基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Entecavir衍生物)
[0042] 14、
[0043] 2-(((((2R,3S,4S,5R)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯
[0044]
[0045] 15、
[0046] 2-(((((2S,3S,4S,5S)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Fludarabine衍生物)
[0047] 16、
[0048] 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Clorafaranbine衍生物)
[0049] 17、
[0050] 2-(((((2S,3S,5S)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Cladibine衍生物)[0051]
[0052] 18、
[0053] 2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯[0054] 19、
[0055] 2-(((((2R)-1-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Tenofovir衍生物)
[0056] 20、
[0057] 2-(((2-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)乙氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(Adefovir衍生物)
[0058] 本发明的式I所示4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物，根据图1所示的流程图，通过包括如下步骤的方法制备得到：
[0060]
[0061] 式II中，R1、R2和R3的定义分别同式I中R1、R2和R3的定义；
[0062] 2)使得BOC-(4-X)苯丙氨酸与步骤2)所得核糖或脱氧核糖核苷酸的碱基中的氨基偶联形成酰胺键，即得；
[0063] 上述方法步骤1)中，所述式II所示五氟苯酚磷酸酯活性中间体与核苷的摩尔比可为：1.0-2.0，具体可为1.2:1；
[0064] 所述反应在叔丁基氯化镁催化下进行；
[0065] 核苷与叔丁基氯化镁的摩尔比可为：1:1.0-2.0，具体可为1:1.2；
[0066] 所述反应在惰性气体保护下进行，所述惰性气体具体可为氮气；
[0068] 所述反应的温度可为：-20-10℃，具体可为0℃，时间可为：8-24h；
[0069] 上述方法步骤2)中，所述形成酰胺键的反应1-羟基苯并三唑存在下进行；
[0071] 所述核糖或脱氧核糖核苷酸与BOC-(4-X)苯丙氨酸、1-羟基苯并三唑及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比依次可为：1.0：1.0-1.5：1.0-2.0：1.0-2.0，具体可为1.0：1.0：1.0：1.3；
[0072] 所述反应的温度可为室温，时间可为3-8h，具体可为5h。
[0073] 如所述核苷及其类似物中的核糖或脱氧核糖除了具有5-羟甲基外，还有其他位置上的羟基(如3-羟基、4-羟基)，那么在步骤1)之前还包括先选择性地保护其他位置上的羟基的操作，其中，所用保护基包括但不限于叔丁氧羰基(BOC)、叔丁基二甲基硅基(TBS)；
[0074] 相应地，在步骤2)之后，还包括将步骤2)得到的产物在酸性条件下脱去羟基保护，得到目标产物的操作。
[0075] 上述式I所示4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物在制备抗肿瘤和/或抗病毒的药物中的应用也属于发明的保护范围。
[0076] 所述应用中，所述肿瘤具体可为：人胰腺癌肿瘤；所述病毒具体可为乙肝病毒；
[0077] 如，化合物1、3、11、15、16和17在制备抗肿瘤药物中的应用；
[0078] 如，化合物9、19、14和20在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。
[0079] 本发明中化合物采用卤代苯丙氨酸与含有氨基的核苷类化合物的氨基进行结合，同时进行磷酸化，通过磷酸酯、磷酰胺前药形式促进吸收、避开限速的一磷酸合成环节，减少或避免核苷类脱氨酶的作用，以增强药效，同时卤代苯丙氨酸具有抑制蛋白质合成的协同作用，起到在抗肿瘤以及抗乙肝病毒方面增加生物利用度、提高药效、减少耐药性的作用。附图说明
[0080] 图1为本发明中制备式I所示4-卤素取代的苯丙氨酸酰胺化的核苷酸衍生物的流程图；
具体实施方式
[0081] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0082] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0083] 实施例1、2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(吉西他滨衍生物)
[0084]
[0085] 由下面五个步骤制备得到：
[0086] 1)、(2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基-叔丁基碳酸酯的合成
[0087]
[0088] 将无水碳酸钾(11.0g，79.8mmol，3.0eq.)溶解于水(25mL)中,分别加入四氢呋喃(100mL)、吉西他滨(7.0g，26.6mmol，1.0eq.)、二碳酸二叔丁酯(11.5g，53.2mmol，2.0eq.)，室温搅拌反应24h。TLC监测反应(DCM:MeOH＝10:1)。反应液加入乙酸乙酯(100mL*2)萃取，合并有机层，减压浓缩，粗品柱层析(DCM:MeOH＝10:1)纯化，得到6.8g白色固体(2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基-叔丁基碳酸酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),8.61(s,2H),6.33(m,1H),5.44(d,1H),4.92-
4.83(m,2H),4.44(s,1H),3.55(m,2H),1.38(s,9H).ESI-MS m/z:364.3[M+H]+.[0089] 2)、2-(((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
4.83(m,2H),4.44(s,1H),3.55(m,2H),1.38(s,9H).ESI-MS m/z:364.3[M+H]+.[0089] 2)、2-(((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
[0090]
[0091] 称取丙氨酸苄酯盐酸盐(8.0g，37.1mmol，1.0eq.)于250mL三口圆底反应瓶中，氮气保护，加入无水二氯甲烷(100mL)。反应液冷却至-20℃，快速加入二氯磷酸苯酯(7.8g，37.1mmol，1.0eq.)，然后缓慢滴加三乙胺(10.3g，74.2mmol，2.0eq.)的二氯甲烷(20mL)溶液，恒温反应2h。TLC监测反应(DCM:MeOH＝10:1)，直至原料丙氨酸苄酯盐酸盐消耗完毕，滴加五氟苯酚(6.8g，37.1mmol，1.0eq.)的二氯甲烷(20mL)溶液，然后滴加三乙胺(4.1g，
40.8mmol，1.1eq.)，0℃恒温反应16h。反应液减压浓缩，固体快速柱层析(PE:EA＝4:1)纯化，得到8.2g白色固体2-(((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3
400MHz)δ7.47-7.15(m,10H),5.33(s,2H),4.12(m,1H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:502.2[M+H]+.
40.8mmol，1.1eq.)，0℃恒温反应16h。反应液减压浓缩，固体快速柱层析(PE:EA＝4:1)纯化，得到8.2g白色固体2-(((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3
400MHz)δ7.47-7.15(m,10H),5.33(s,2H),4.12(m,1H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:502.2[M+H]+.
[0092] 3)、2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-((叔丁氧羰基)氧)-4,4-二氟四氢呋喃-2-yl)甲氧基(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苯酯的合成
[0093]
[0094] 称量化合物(2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-基-叔丁基碳酸酯(4.8g，13.3mmol，1.0eq.)于250mL圆底三口反应瓶中，氮气保护，加入无水四氢呋喃(80mL)。将反应液冷却至0℃，缓慢滴加叔丁基氯化镁的四氢呋喃溶液(16mL，15.9mmol,1.2eq.,1M)，析出白色固体。反应液恒温搅拌30min，滴加化合物2-(((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(8.2g，15.9mmol，1.2eq.)的四氢呋喃(20mL)溶液，0℃恒温反应16h，TLC监测反应(DCM:MeOH＝10:1)。滴加氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取(100ml*2),合并有机层，减压浓缩，粗品柱层析(DCM:MeOH＝10:1)纯化，得到7.7g白色固体2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-((叔丁氧羰基)氧)-4,4-二氟四氢呋喃-2-yl)甲氧基(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苯酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.20(d,1H),8.56(s,2H),7.47-7.18(m,10H),6.33(s,1H),5.44(d,1H),5.12(s,
2H),4.89(m,2H),4.66(m,2H),4.13(m,1H),1.38(s,9H),1.12(d,3H).ESI-MS m/z:681.2[M+H]+.
2H),4.89(m,2H),4.66(m,2H),4.13(m,1H),1.38(s,9H),1.12(d,3H).ESI-MS m/z:681.2[M+H]+.
[0095] 4)、2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-((叔丁氧羰基)氧)-4,4-二氟四氢呋喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
[0096]
[0097] 分别称量化合物2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-((叔丁基氧羰基)氧)-4,4-二氟四氢呋喃-2-yl)甲氧基(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苯酯(5.9g，8.68mmol，1.0eq.)、Boc-(4-F)苯丙氨酸(2.7g，9.55mmol，1.0eq.)、1-羟基苯并三唑(1.20g，8.68mmol，1.0eq.)溶解于四氢呋喃(50mL)，氮气保护。冰水浴冷却反应液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.20g,11.3mmol，1.3eq.)，室温反应5h，TLC检测反应(DCM:MeOH＝20:1)。乙酸乙酯(100mL)萃取反应液，有机相减压浓缩。粗品柱层析(PE:EA＝1:1)纯化，得到6.7g白色固体2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-((叔丁氧羰基)氧)-4,4-二氟四氢呋
1
喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),
7.47-7.18(m,14H),6.38(d,1H),5.41(d,1H),5.22(s,2H),4.91(m,2H),4.38(m,2H),4.12(m,2H),3.19(m,2H),1.38(s,18H),1.20(d,3H).ESI-MS m/z:946.3[M+H]+.
1
喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),
7.47-7.18(m,14H),6.38(d,1H),5.41(d,1H),5.22(s,2H),4.91(m,2H),4.38(m,2H),4.12(m,2H),3.19(m,2H),1.38(s,18H),1.20(d,3H).ESI-MS m/z:946.3[M+H]+.
[0098] 5)、2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成[0099]
[0100] 称量化合物2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3-((叔丁氧羰基)氧)-4,4-二氟四氢呋喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯(6.7g，8.66mmol，1.0eq.)溶解于二氯甲烷(15mL)中，冰水浴冷，滴加三氟乙酸(15mL)，室温反应2h，TLC监测反应(DCM:MeOH＝10:1)。反应液加入冰水，乙酸乙酯萃取(100ml*2),有机层用饱和碳酸氢钠水溶液中和，减压浓缩,柱层析纯化(PE:EA＝1:10)，得到4.6g白色固体2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3400MHz)δ9.16(d,1H),7.48-7.19(m,14H),6.39(m,1H),5.40(d,1H),
5.33(s,2H),5.01(s,2H),4.4-3.95(m,5H),4.21(m,2H),3.32(m,2H),1.21(d,3H).ESI-MS m/z:746.2[M+H]+.
5.33(s,2H),5.01(s,2H),4.4-3.95(m,5H),4.21(m,2H),3.32(m,2H),1.21(d,3H).ESI-MS m/z:746.2[M+H]+.
[0101] 2、2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(NUC-1031)
[0102]
[0103] 综合实施例1的制备方法，以吉西他滨为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4,4-二氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),8.58(d,2H),7.46-7.28(m,10H),6.39(m,1H),5.40(d,1H),5.34(s,2H),5.01(s,2H),4.40-3.58(m,6H),
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:581.1[M+H]+.
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:581.1[M+H]+.
[0104] 3、2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(cytarabine衍生物)
[0105]
[0106] 综合实施例1的制备方法，以阿糖胞苷为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.18(d,1H),7.47-7.21(m,14H),5.93(m,1H),5.40(d,1H),5.30(s,2H),5.01(s,2H),4.51-
3.85(m,7H),3.58-3.77(m,2H),3.37(m,2H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:726.1[M+H]+.[0107] 4、2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
3.85(m,7H),3.58-3.77(m,2H),3.37(m,2H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:726.1[M+H]+.[0107] 4、2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
[0108]
[0109] 综合实施例1的制备方法，以4-氨基-1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)吡啶-2(1H)-酮为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ
9.16(d,1H),7.38-7.11(m,14H),6.11(m,1H),5.40(d,1H),5.34(s,2H),4.40-3.85(m,7H),
3.34-3.16(m,2H),1.47(s,3H),1.22(d,3H).ESI-MS m/z:742.2[M+H]+.
9.16(d,1H),7.38-7.11(m,14H),6.11(m,1H),5.40(d,1H),5.34(s,2H),4.40-3.85(m,7H),
3.34-3.16(m,2H),1.47(s,3H),1.22(d,3H).ESI-MS m/z:742.2[M+H]+.
[0110] 5、2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)-4-氰基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成[0111]
[0112] 综合实施例的1制备方法，以(2S,3R,4R,5S)-2-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-甲氰为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,3R,4R,
5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)-4-氰基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3400MHz)δ9.20(d,1H),
7.48-7.19(m,14H),5.80(m,1H),5.40(d,1H),5.34(s,2H),4.40-3.65(m,8H),3.34-3.16(m,2H),1.22(d,3H).ESI-MS m/z:735.2[M+H]+.
5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)-4-氰基-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3400MHz)δ9.20(d,1H),
7.48-7.19(m,14H),5.80(m,1H),5.40(d,1H),5.34(s,2H),4.40-3.65(m,8H),3.34-3.16(m,2H),1.22(d,3H).ESI-MS m/z:735.2[M+H]+.
[0113] 6、2-(((((2R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(扎西他滨)
[0114]
[0115] 综合实施例1的制备方法，以扎西他滨为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,5S)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-yl)四氢呋喃-2-基)1
甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),7.44-7.19(m,14H),5.85(m,1H),5.40(d,1H),5.35(s,2H),4.28-3.36(m,5H),3.34-3.16(m,2H),
1.94-1.63(m,6H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:694.2[M+H]+.
甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),7.44-7.19(m,14H),5.85(m,1H),5.40(d,1H),5.35(s,2H),4.28-3.36(m,5H),3.34-3.16(m,2H),
1.94-1.63(m,6H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:694.2[M+H]+.
[0116] 7、2-((((2S)-3-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2-羟丙氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
[0117]
[0118] 综合实施例的1制备方法，以(S)-4-氨基-1-(2,3-二羟丙基)嘧啶-2(1H)-酮为原料，合成得到白色泡沫状固体2-((((2S)-3-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2-羟丙氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.18(d,
1H),7.46-7.19(m,14H),5.40(d,1H),5.35(s,2H),4.29-2.98(m,8H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:668.3[M+H]+.
1H),7.46-7.19(m,14H),5.40(d,1H),5.35(s,2H),4.29-2.98(m,8H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:668.3[M+H]+.
[0119] 8、2-(((((2S,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Lamivudine衍生物)
[0120]
[0121] 综合实施例的1制备方法，以拉米夫定为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-1,3-氧硫杂环1
戊烷-2-基)甲氧基)(甲氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),
7.48-7.19(m,14H),5.40(d,1H),5.35(s,2H),5.12(m,1H),4.66(m,2H),3.97-2.71(m,7H),
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:712.1[M+H]+.
戊烷-2-基)甲氧基)(甲氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.16(d,1H),
7.48-7.19(m,14H),5.40(d,1H),5.35(s,2H),5.12(m,1H),4.66(m,2H),3.97-2.71(m,7H),
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:712.1[M+H]+.
[0122] 9、2-(((((2S,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Emtricitabine衍生物)
[0123]
[0124] 综合实施例1的制备方法，以恩曲他滨为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-1,3-氧硫1
杂环戊烷-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3400MHz)δ7.58-
7.19(m,15H),5.34(s,2H),5.22(m,1H),5.12(s,2H),4.66(m,2H),3.95-2.71(m,7H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:730.1[M+H]+.
杂环戊烷-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。H NMR(CDCl3400MHz)δ7.58-
7.19(m,15H),5.34(s,2H),5.22(m,1H),5.12(s,2H),4.66(m,2H),3.95-2.71(m,7H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:730.1[M+H]+.
[0125] 10、2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成[0126]
[0127] 综合实施例1的制备方法，以2,6-二氨基嘌呤核苷为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.35(s,1H),7.47-7.18(m,17H),6.99(s,2H),6.16(m,1H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),
4.75-3.19(m,11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:765.1[M+H]+.
4.75-3.19(m,11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:765.1[M+H]+.
[0128] 11、2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-甲氧基-1H-嘌呤-9(6H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Nelarabine衍生物)
[0129]
[0130] 综合实施例1的制备方法，以奈拉滨为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,3R,4R,5S)-5-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-甲氧基-1H-嘌呤-9(6H)-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ7.92(s,1H),7.47-7.18(m,14H),6.16(m,1H),5.34(s,2H),5.26(s,1H),5.11(s,2H),4.75-3.44(m,11H),3.30(s,3H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:782.1[M+H]+.
[0131] 12、2-(((((1R,4S)-4-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-(环丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基)环戊烯-2-烯-1-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成()[0132]
[0133] 综合实施例1的制备方法，以阿巴卡韦为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((1R,4S)-4-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-(环丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基)环戊烯-2-烯-1-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.05(s,1H),7.47-7.18(m,14H),6.05-5.60(m,2H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.48-3.19(m,7H),
2.36-2.17(m,3H),1.35(m,1H),1.28(d,3H),0.88(m,4H).ESI-MS m/z:769.1[M+H]+.[0134] 13、2-(((((1S,3R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-氧-1H-嘌呤-9(6H)-基)-5-羟基-2-亚甲基环戊基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Entecavir衍生物)
2.36-2.17(m,3H),1.35(m,1H),1.28(d,3H),0.88(m,4H).ESI-MS m/z:769.1[M+H]+.[0134] 13、2-(((((1S,3R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-氧-1H-嘌呤-9(6H)-基)-5-羟基-2-亚甲基环戊基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Entecavir衍生物)
[0135]
[0136] 综合实施例1的制备方法，以恩替卡韦为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((1S,3R,5R)-3-(2-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-6-氧-1H-嘌呤-9(6H)-基)-5-羟基-2-亚甲基环戊基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ7.97(s,1H),7.47-7.18(m,14H),5.34(s,2H),5.26-5.11(d,3H),4.37-3.19(m,9H),2.33-2.01(m,3H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:760.1[M+H]+.
[0137] 14、2-(((((2R,3S,4S,5R)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
[0138]
[0139] 综合实施例1的制备方法，以阿糖腺苷为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,3S,4S,5R)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.60(s,1H),8.35(s,1H),7.47-7.18(m,14H),6.16(m,1H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.75-3.19(m,
11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:750.1[M+H]+.
11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:750.1[M+H]+.
[0140] 15、2-(((((2S,3S,4S,5S)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Fludarabine衍生物)
[0141]
[0142] 综合实施例1的制备方法，以氟达拉宾为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,3S,4S,5S)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.35(s,1H),7.47-7.18(m,14H),6.16(m,1H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.75-3.19(m,11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:768.1[M+H]+.
[0143] 16、2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Clorafaranbine衍生物)
[0144]
[0145] 综合实施例1的制备方法，以克罗拉滨为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-yl)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.35(s,1H),7.47-7.18(m,14H),6.22(m,1H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.40-3.19(m,10H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:786.1[M+H]+.
[0146] 17、2-(((((2S,3S,5S)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Cladibine衍生物)
[0147]
[0148] 综合实施例1的制备方法，以克拉屈滨为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2S,3S,5S)-5-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.35(s,1H),7.47-7.18(m,14H),5.95(m,1H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.40-3.19(m,9H),2.56(m,2H),
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:768.1[M+H]+.
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:768.1[M+H]+.
[0149] 18、2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成
[0150]
[0151] 综合实施例1的制备方法，以(2R,3R,4S,5R)-2-(4-4氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-甲腈为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ9.78(s,1H),7.47-7.18(m,14H),5.89-5.72(m,2H),5.34(s,2H),5.11(s,
2H),4.51-3.19(m,11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:774.1[M+H]+.
2H),4.51-3.19(m,11H),1.28(d,3H).ESI-MS m/z:774.1[M+H]+.
[0152] 19、2-(((((2R)-1-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Tenofovir衍生物)
[0153]
[0154] 综合实施例1的制备方法，以(R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-yl)丙基-2-醇为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((((2R)-1-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.60(s,1H),8.05(s,1H),7.47-7.18(m,14H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.18-3.19(m,7H),1.28(d,3H),1.18(d,3H).ESI-MS m/z:676.1[M+H]+.
[0155] 20、2-(((2-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)乙氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯的合成(Adefovir衍生物)
[0156]
[0157] 综合实施例1的制备方法，以2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙醇为原料，合成得到白色泡沫状固体2-(((2-(6-(2-氨基-3-(4-氟苯基)丙氨)-9H-嘌呤-9-基)乙氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸苄酯。1H NMR(CDCl3 400MHz)δ8.60(s,1H),8.05(s,1H),7.47-7.18(m,14H),5.34(s,2H),5.11(s,2H),4.51(m,4H),3.95(m,1H),3.63(m,1H),3.44-3.19(m,2H),
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:662.1[M+H]+.
1.28(d,3H).ESI-MS m/z:662.1[M+H]+.
[0158] 实施例21
[0159] 实施例1、2、3、11、15、16、17的化合物以及吉西他滨体内抗肿瘤活性实验在PANC-1异种移植模型中评估了ZONK1802系列化合物的抗肿瘤活性。向雌性裸鼠植入PANC-1细胞。在第8天(植入后8天)平均肿瘤体积达到约247mm3。在第8天(植入后8天)，根据肿瘤体积将荷瘤小鼠随机分成9组，并用空白对照、吉西他滨(ip，285mM/kg)，实施例1(po，285mM)、实施例2(ip，285mM/kg)、实施例3(po，285mM)、实施例11(po，285mM)、实施例15(po，285mM)、实施例16(po，285mM)、实施例17(po，285mM)。观察肿瘤体积和体重，每周记录两次，持续21天。在研究结束时(d29)，将动物安乐死并解剖载体对照的肿瘤并称重。计算肿瘤T/C(％)值(相对肿瘤增值率):T/C(％)＝100％×RTVT/RTVC
[0160] RTVT:给药后肿瘤相对体积
[0161] RTVC:给药前肿瘤相对体积
[0162] 溶剂：Solutol HS15:北京耦合科技有限公司,批号.20180226
[0163] PEG 400:Damas-beta,批号.P1471409生理盐水:四川科伦制药有限公司批号.A18111004-2
[0164] 动物：72只动物：6周龄的雌性BALB/c裸鼠，并饲养在含有玉米芯的塑料笼(3-5只小鼠/笼)中，并保持在无特定病原体的设施中(20-26℃，40-70％湿度)，12小时光照和黑暗循环，随意获取食物和过滤水。
[0165] 人肿瘤细胞株：PANC-1
[0166] 细胞悬液在侧腹中植入无胸腺BALB/c裸鼠建立肿瘤模型；
[0167] 对照组采用：15％Solutol HS15+85％PEG 400
[0168] 实验药物组采用生理盐水(5ml)溶解
[0169] 当平均肿瘤体积达到约247mm3时，根据肿瘤体积将荷瘤小鼠随机分为8组，并进行治疗；每周两次测量肿瘤大小和体重；在观察期间，观察动物的任何临床相关异常并记录；终点：用CO2处死动物，解剖载体对照的肿瘤并称重。实验组和剂量(mM/kg)
[0170]组别 药物 剂量 给药途径 给药方案 动物数
A 空白对照 PO BIW×6次 6
B 吉西他滨 285 ip BIW×6次 6
C 实施例2 285 ip BIW×6次 6
D 实施例1 285 PO BIW×6次 6
E 实施例3 285 PO BIW×6次 6
F 实施例11 285 PO BIW×6次 6
G 实施例15 285 PO BIW×6次 6
H 实施例16 285 PO BIW×6次 6
I 实施例17 285 PO BIW×6次 6
A 空白对照 PO BIW×6次 6
B 吉西他滨 285 ip BIW×6次 6
C 实施例2 285 ip BIW×6次 6
D 实施例1 285 PO BIW×6次 6
E 实施例3 285 PO BIW×6次 6
F 实施例11 285 PO BIW×6次 6
G 实施例15 285 PO BIW×6次 6
H 实施例16 285 PO BIW×6次 6
I 实施例17 285 PO BIW×6次 6
[0171] 相对肿瘤增值率T/C％
[0172]
[0173]
[0174] 由上表可以看出，实施例2的化合物(C组)与吉西他滨(B组)差异不明显，实施例1、3、11、15、16和17的化合物与吉西他滨(B组)差异明显，相对肿瘤增值率明显低于阳性对照吉西他滨。
[0175] 各组体重减少百分比％
[0176]组别 第8天 第12天 第15天 第19天 第22天 第26天 第29天
A -1.57％ -1.86％ -1.86％ -2.25％ -2.35％ -2.35％ -1.57％
B 1.10％ 2.58％ 2.20％ 1.10％ 1.96％ 1.14％ 1.10％
C 0.10％ 1.58％ 1.31％ 1.22％ 2.25％ 1.50％ 1.15％
D -0.20％ -0.40％ -1.99％ -3.58％ -4.77％ -4.57％ -2.20％
E -0.10％ -0.50％ -1.66％ -2.50％ -3.66％ -3.42％ -0.86％
F -0.30％ -0.35％ -1.35％ -2.88％ -3.67％ -3.88％ -0.97％
G -0.21％ -0.36％ -2.33％ -3.78％ -4.21％ -4.56％ -1.20％
H -0.55％ -0.64％ -1.88％ -3.67％ -3.96％ -4.23％ -1.56％
I -0.32％ -0.54％ -2.99％ -2.58％ -3.69％ -4.78％ -1.25％
A -1.57％ -1.86％ -1.86％ -2.25％ -2.35％ -2.35％ -1.57％
B 1.10％ 2.58％ 2.20％ 1.10％ 1.96％ 1.14％ 1.10％
C 0.10％ 1.58％ 1.31％ 1.22％ 2.25％ 1.50％ 1.15％
D -0.20％ -0.40％ -1.99％ -3.58％ -4.77％ -4.57％ -2.20％
E -0.10％ -0.50％ -1.66％ -2.50％ -3.66％ -3.42％ -0.86％
F -0.30％ -0.35％ -1.35％ -2.88％ -3.67％ -3.88％ -0.97％
G -0.21％ -0.36％ -2.33％ -3.78％ -4.21％ -4.56％ -1.20％
H -0.55％ -0.64％ -1.88％ -3.67％ -3.96％ -4.23％ -1.56％
I -0.32％ -0.54％ -2.99％ -2.58％ -3.69％ -4.78％ -1.25％
[0177] d8:移植瘤后的第8天；“-”：动物体重增加.
[0178] 实施例22
[0179] 药物在雄性BALB/c裸小鼠血浆和肿瘤中ZONK1802-5,dfdu和dfdctp药物浓度。
[0180] Dfdu为吉西他滨在动物体内的主要代谢产物，也是无效的成分，dfdctp是吉西他滨在动物体内的主要活性成分，因此dfdu的减少意味着核苷酸结构的氨基部分氧化减少，dfdctp活性成分增加，作用机制改变。
[0181] 1.1.1供试品和内标化合物
[0182] 供试品：ZONK1802-3，ZONK1802-4,ZONK1802-5,dfdu和dfdctp，分子量分别为745.6、788.7、299.7、264和505由广东中科药物研究有限公司提供。
[0183] 内标化合物：
[0184] 甲苯磺丁脲，批号为MKBR6717V，购自Sigma。
[0185] 盐酸普萘洛尔，批号为BCBD8251V，购自Sigma。
[0186] 双氯酚酸，批号为BCBK6371V，购自Sigma。
[0187] 1.1.2试验试剂
[0188] 二甲基亚砜(DMSO)：批号为L1712018，购自Aladdin。
[0189] 乙腈：批号为175164，购自Fisher Scientific。
[0190] 甲酸：批号为L0980250，购自CNW Technologies。
[0191] 超纯水：由纯水仪制备，临用现取。
[0192] 空白小鼠血浆和肿瘤：本部门体内组采自小鼠。
[0193] 动物来源：
[0194] 由生物体内提供。
[0195] 动物及分组：从生物体内获得BALB/c裸小鼠18只，6只/组；
[0196] 给药方式：IP和PO
[0197] 溶剂配制
[0198] 溶剂I：15％Solutol HS15+85％PEG 400
[0199] 50-60℃水浴加热Solutol HS15(聚乙二醇15羟硬脂酸酯)至液体后，吸取1.8mL Solutol HS15至15mL离心管中，加入10.2mL PEG 400，涡旋振荡混匀，配制成含15％Solutol HS15和85％PEG 400的混合制剂，2-8℃保存待用，每周配制一次。
[0200] 给药制剂配制
[0201] 对照样品：ZONK1802-5(盐酸吉西他滨)摩尔剂量为285mM/kg(75mg/kg)的给药制剂配制(供试品浓度为8.56mg/mL)
[0202] 称取适量ZONK1802-5供试品置于5mL离心管中，加入适量生理盐水，涡旋振荡至药物完全溶解，配制成供试品浓度为8.56mg/mL的给药制剂，用于动物给药，现配现用。
[0203] 受试样品：ZONK1802-3(实施例1化合物)摩尔剂量为570mM/kg(423mg/kg)的给药制剂配制(供试品浓度为42.3mg/mL)
[0204] 称取适量ZONK1802-3供试品置于5mL离心管中，加入适量溶剂I，涡旋振荡至药物完全溶解，配制成供试品浓度为42.3mg/mL的给药制剂，用于动物给药。现用现配。
[0205] 受试样品：ZONK1802-4(实施例2化合物)摩尔剂量为570mM/kg(450mg/kg)的给药制剂配制(供试品浓度为45.3mg/mL)
[0206] 称取适量ZONK1802-4供试品置于5mL离心管中，加入适量溶剂I，涡旋振荡至药物完全溶解，配制成供试品浓度为45.3mg/mL的给药制剂，用于动物给药。现用现配。
[0207] 溶剂对照：15％Solutol HS15+85％PEG 400
[0208] 动物编号、给药剂量给药体积如下表：
[0209]
[0210] 进食/饮水情况:
[0211] 给药前禁食12小时以上，给药后禁食4小时，自由饮水。
[0212] 抗凝剂：EDTA-K2
[0213] 样品采集时间点：给药后1h、2h、4h，其中101-102、201-202和301-302为1h的动物；103-104、203-204和303-304为2h的动物；105-106、205-206和305-306为4h的动物，收集血浆和肿瘤，肿瘤需称量重量。采集全血至EDTA-K2抗凝管，管子中加入tetrahydrouridine(25ug/mL)用于抑制CDA的活性，离心前血液样品置于碎冰上，半小时内，离心取血浆(6000转，8分钟，4℃)，干冰冻存备用。肿瘤使用冰冷的生理盐水清洗三遍，用滤纸吸去水分，称重。
[0214] 所有样品收集好之后放于-80冰箱冷冻保存待分析。
[0215] 分析方法及检测
[0216] 本实验采用液质联用方法测定雄性BALB/c裸小鼠血浆和肿瘤中ZONK1802-5,dfdu和dfdctp药物浓度。每个分析批次至少建立一条至少包含6个标准浓度点的标准曲线，计算该分析批样品中待测物的浓度，并随行质控样品。血浆和肿瘤标准曲线中3/4以上浓度点的准确度在80％-120％以内。若定量下限或定量上限超出接受范围，则剔除该点重新建立新的线性范围。每个分析批次设有高、中、低不同浓度的质控样品(QC)，每个浓度至少平行双样本，质控样品数量大于等于每批样品数量的5％。根据每一分析批次的标准曲线计算质控样品的浓度。血浆质控样品中最多允许1/3且为不同浓度的样品超出理论值的±20％，否则此批数据不被接受，重新测定。
[0217] 标准曲线和质控样品的制备
[0218] 分别取空白雄性BALB/c裸小鼠血浆和肿瘤45μL，分别加入5μL上述配制好的标曲工作溶液及质控工作液，涡旋混匀，得到各个化合物相应的的标准曲线及质控样品。对于血样样品需要稀释的化合物，分别取雄性BALB/c裸小鼠血浆和肿瘤57μL，分别加入3μL浓度为100μg/mL的对应化合物的稀释质控工作溶液，涡旋混匀，得到浓度分别为5000ng/mL质控(QC)样品，接着取5μL上述质控样品加入到45μL雄性BALB/c裸小鼠血浆和肿瘤，涡旋混匀，得到浓度为500ng/mL稀释质控样品(N＝3)，稀释因子为：10。
[0219] 1.1.3液相色谱条件
[0220] 对于dfdu
[0221] 高效液相系统：SHIMADZU LC30AD
[0222] 色谱柱：Phenomenex Gimini C18 5μm 4.6*50mm
[0223] 柱温：室温；
[0224] 流速：0.8mL/min；
[0225] 流动相：A相：含0.1％甲酸的水溶液，B相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
[0226] 高效液相系统：SHIMADZU LC30AD
[0227] 色谱柱：Thermo SCINTIFIC Hypersil GOLD C8 50*2.1mm
[0228] 柱温：室温；
[0229] 流速：0.5mL/min；
[0230] 流动相：A相：含2mM乙酸铵的水溶液，B相：乙腈溶液；
[0231] 表 雄性BALB/c裸小鼠血浆中dfdu药物检测浓度(ng/mL)
[0232]
[0233]
[0234] 实施例23含有氨基的核苷酸类药物的4-氟苯丙氨酸酰化衍生物对于抗乙肝病毒的药效学实验比较
[0235] 实施例中化合物对于乙肝病毒(DHBV-DNA)抑制作用的体内实验
[0236] 试剂：
[0237] 阳性对照药：
[0238] 拉米夫定
[0239] α-32P-Dctp(北京福瑞生物技术工程公司)
[0240] 缺口翻译试剂盒(Promega公司)
[0242] 实验动物及病毒：1日龄北京麻鸭，体重60-100g；DHBV-DNA强阳性血清，采自南京麻鸭，-70℃保存。
[0243] 试验方法：1日龄北京鸭，经腿静脉注射DHBV-DNA阳性血清0.2ml/只，雏鸭经DHBV感染第7天随机分为组，分别为：病毒对照组(生理盐水，PO)；实施例9，实施例19，实施例20，实施例14，阳性对照药拉米夫定组(LA)，各实验组按照相同的摩尔数量口服灌胃给药，采用DMSO溶解，给药量300mM/kg。感染DHBV后第7天(即T0时间点)开始给药，2次/天，连续给药10天。分别在HDBV感染后第七天(T0)用药前，用药第5天，用药第10天，及停药后第3天，自鸭腿静脉取血，离心分离血清，-70℃保存待检。严格按照缺口翻译试剂盒说明书测定血清DHBV-DNA水平。用32P标记DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。按以下公式计算药物在各时间点对动物血清DHBV-DNA的抑制率：
[0244] DNA抑制率(％)＝给药前(T0)OD值-给药后OD值/给药前(T0)OD值*100％[0245] 实验结果：DHBV感染后T0、T5、T10、P3时间点鸭血清DHBV-DNA经斑点杂交法测定，所有4组实验动物感染DHBV后，血清DHBV-DNA均呈强阳性。酶标仪检测各实验样本在490nm处OD值表明，口服实施例化合物后5-10天动物血清DHBV-DNA浓度呈极显著下降，且较拉米夫定有较明显优势，其它实施例化合物较实施例2具有优势。停药3天后仍显著抑制DHBV-DNA。各组不同时间点的OD值见下表：
[0246]时间点 T0 T5 T10 P3
病毒对照组 1.83±0.21 1.76±0.15 1.66±0.23 1.75±0.25
LA 1.86±0.31 1.56±0.21 1.26±0.35 1.61±0.28
实施例9 1.91±0.36 1.50±0.21 1.11±0.25 1.12±0.32
实施例19 1.79±0.29 1.45±0.24 1.10±0.11 1.02±0.16
病毒对照组 1.83±0.21 1.76±0.15 1.66±0.23 1.75±0.25
LA 1.86±0.31 1.56±0.21 1.26±0.35 1.61±0.28
实施例9 1.91±0.36 1.50±0.21 1.11±0.25 1.12±0.32
实施例19 1.79±0.29 1.45±0.24 1.10±0.11 1.02±0.16
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