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一种阿胶多肽及其制备方法

阅读：1发布：2020-06-28

专利汇可以提供一种阿胶多肽及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种阿胶多肽及其制备方法，属于分析化学技术领域。所述阿胶多肽的氨基酸序列为YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。所属阿胶多肽的制备方法为阿胶研磨成粉炖化制得阿胶提取液，然后经胰蛋白酶酶解、固相萃取柱分离纯化，液相色谱-质谱联用检测分析合成获得。本发明的阿胶多肽有羟基自由基清除活性和抗凝血活性，并且阿胶多肽呈浓度-功效相关性。，下面是一种阿胶多肽及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种阿胶多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。
2.如权利要求1所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）阿胶提取液的制备：阿胶研磨成粉，加去离子，在一定温度下炖化，冷却后冷藏过夜，离心取炖化液上清，制得阿胶提取液；
（2）阿胶多肽的制备：步骤（1）的阿胶提取液经胰蛋白酶酶解，取酶解液上清，经C18固相萃取柱分离纯化，洗脱液干燥后再溶解过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽；
（3）步骤（2）制备所得阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测；
（4）步骤（3）的检测结果进行数据分析,合成阿胶多肽氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）阿胶提取液的制备，具体为：阿胶研细成阿胶粉，加入20倍重量的去离子水，80℃炖化30 min，冷却后冷藏过夜，将炖化液于4℃以18000rpm离心5min，取上清液过滤后，得阿胶提取液。
4.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）阿胶多肽的制备，具体为：步骤（1）制备的阿胶提取液以10 % NaOH溶液调节pH =7.5，40℃水浴中以浓度为3×104 U/g 6×104 U/g胰蛋白酶酶解，酶解过程中每隔1 h调节一次pH，使pH值始终保持~
在7.5；酶解4 h后灭酶活，冷却后于4℃以18000rpm离心5min，取上清液3mL过C18固相萃取柱分离纯化，预先以3 mL甲醇、3 mL去离子水活化，以3×3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮吹干，以1 mL 1 %甲酸溶液溶解，过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽。
5.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中阿胶多肽液相色谱-质谱联用进行检测，其液相色谱分离纯化的条件为：Hypersil GOLD UPLC C18色谱柱，100m × 2.1 mm，1.9 µm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0~
50 min，乙腈10% 90%；50 55 min，乙腈90%；55 56 min，乙腈90% 10%；56 60 min，乙腈10%；
~ ~ ~ ~ ~
流速：0.3 mL/min；进样量：10 µL。
6.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中阿胶多肽液相色谱-质谱联用进行检测，其质谱条件为：扫描模式：Full MS/dd-MS2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100-1500 m/z，一级质谱分辨率：70000 at m/z，AGG target: le6，一级Maximum IT: 100 ms，Number of scan ranges: 1，动态排除Dynamic exclusion: 40.0 s一次，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window: 0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500 at m/z 200，Microscans: 1，二级Maximum IT: 50 ms，碰撞能量: 30 eV，Underfill ratio: 0.1%；电喷雾离子源ESI：载气为纯度>99.5%的高纯氮气，鞘气流速
40个arb单位，辅气流速15个arb单位；喷雾电压3.2 KV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、
35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率S-lens RF level为60，辅气热源温度350℃。
7.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（4）数据分析具体为：采用MaxQuant进行数据分析；搜索针对包含来自Uniprot的阿胶的蛋白质序列数据库；
蛋白FDR设置为0.01；最小氨基酸长度设置为3；可变修饰设为N-Acetyl和Oxidation；固定化修饰设置为Carbamidomethyl ；专一性酶设置为胰蛋白酶；最大裂解丢失设置为2，所有常见的污染物和相反的命中被删除。

说明书全文

一种阿胶多肽及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种阿胶多肽及其制备方法。

[0002] 技术背景：阿胶是我国传统名贵中药，与人参、鹿茸并称“中药三宝”，迄今已有3000年的药用历史，同时也被我国列为具有免疫调节及改善营养性贫血功能的药食同源产品，长期以来深受人们喜爱。

[0003] 阿胶以马科动物驴的皮去毛熬制成而成，我国诸版药典均以驴皮制胶为“阿胶”。根据《中华人民共和国药典》（2015版），阿胶的功能有补血滋阴、润燥、止血。

[0004] 近年来，研究人员应用了多种技术手段以期揭示阿胶的功效作用。然而，对阿胶化学成分的研究并未发现阿胶中含有明确具有药理作用的物质，现有的文献针对的都是阿胶本身进行的功效研究，也因此对于阿胶功效出现争议。阿胶的基本成分是驴皮所含原胶原的降解物，蛋白类含量约60% 80%左，蛋白经酶解后生成的肽涉及生物体内多种细胞功能~的生物活性，是机体完成各种复杂的生理活性必不可少的参与者，涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，细胞的功能活动受肽的调节。阿胶作为药品或食品服用后，进入人体经消化过程同样是酶解成肽后被再人体吸收，因此，以肽为目标物对阿胶功效进行评价是科学可行的。基于此考虑，本发明提出了一种通过分离遴选阿胶中的肽段，以考察肽段的活性来验证阿胶功效的方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种阿胶多肽及其制备方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种阿胶多肽，其氨基酸序列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。

[0007] 上述一种阿胶多肽的制备方法，包括以下步骤：（1）阿胶提取液的制备：阿胶研磨成粉，加去离子，在一定温度下炖化，冷却后冷藏过夜，离心取炖化液上清，制得阿胶提取液；
（2）阿胶多肽的制备：步骤（1）的阿胶提取液经胰蛋白酶酶解，取酶解液上清，经C18固相萃取柱分离纯化，洗脱液干燥后再溶解过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽；
（3）步骤（2）制备所得阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测；
（4）步骤（3）的检测结果进行数据分析,合成阿胶多肽氨基酸序列。

[0008] 上述步骤（1）阿胶提取液的制备，具体为：阿胶研细成阿胶粉，加入20倍重量的去离子水，80℃炖化30 min，冷却后冷藏过夜，将炖化液于4℃以18000rpm离心5min，取上清液过滤后，得阿胶提取液。

[0009] 上述步骤（2）阿胶多肽的制备，具体为：步骤（1）制备的阿胶提取液以10 % NaOH溶4 4
液调节pH =7.5，40℃水浴中以浓度为3×10 U/g 6×10 U/g胰蛋白酶酶解，酶解过程中每~
隔1 h调节一次pH，使pH值始终保持在7.5；酶解4 h后灭酶活，冷却后于4℃以18000rpm离心
5min，取上清液3mL过C18固相萃取柱分离纯化（预先以3 mL甲醇、3 mL去离子水活化），以3×3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮吹干，以1 mL 1 %甲酸溶液溶解，过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽。

[0010] 上述步骤（3）中所述阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测，其中液相色谱条件为：Hypersil GOLD UPLC C18色谱柱，100m × 2.1 mm，1.9 µm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0 50 min，乙腈10% 90%；50 55 min，乙腈90%；55 56 min，乙腈~ ~ ~ ~90% 10%；56 60 min，乙腈10%；流速：0.3 mL/min；进样量：10 µL。
~ ~

[0011] 上述步骤（3）中阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测，其中质谱条件为：扫描模式：Full MS/dd-MS2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100-1500 m/z，一级质谱分辨率：70000 at m/z，AGG target: le6，一级Maximum IT: 100 ms，Number of scan ranges: 1，动态排除(Dynamic exclusion): 40.0 s一次，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window: 0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500 at m/z 200，Microscans: 1，二级Maximum IT: 50 ms，碰撞能量: 30 eV，Underfill ratio: 0.1%；电喷雾离子源(ESI)：载气为高纯氮气(纯度>99.5%)，鞘气流速40个单位(arb)，辅气流速15个单位(arb)；喷雾电压3.2 KV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率(S-lens RF level)为60，辅气热源温度350℃。

[0012] 上述步骤（4）对步骤（3）的检测结果进行数据分析，具体为：采用MaxQuant(版1.6.1.0)进行数据分析；搜索针对包含来自Uniprot的阿胶(uniprot-donkey-hide gelatin.fasta)的蛋白质序列（https://www.uniprot.org，2018年11月3日下载）数据库；
蛋白FDR设置为0.01；最小氨基酸长度设置为3；可变修饰设为N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修饰设置为Carbamidomethyl(C)；专一性酶设置为胰蛋白酶；最大裂解丢失设置为2，所有常见的污染物和相反的命中被删除。

[0013] 一种阿胶多肽的功效评价：检测上方法制备所得阿胶多肽的羟基自由基清除活性和抗凝血活性。

[0014] 羟基自由基清除活性检测方法：在酶标板中依次加入40 uL浓度为1.865 mmol/L邻菲啰啉溶液、80 uL步骤2过0.45 µm滤膜所得阿胶多肽样液、40 uL浓度为1.865 mmol/L的 FeS04·7H20溶液和40 uL浓度为0.03 % (v/v) 的H202溶液；将酶标板于37℃恒温60 min，536nm处测定吸光值，以同浓度抗坏血酸标准溶液作对照。

[0015] 抗凝血活性检测方法：酶标仪温度为37℃，测定波长405 nm；以Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.2 7.4）配制浓度为0.1%纤维蛋白原溶液和12 U/mL凝血酶溶液；在酶标~板中加入140 μL纤维蛋白原溶液和40 μL样品溶液，混匀后读数（ASB）；再加入10 μL凝血酶溶液开始反应，37℃恒温培养箱反应10 min后，酶标仪测读数（AS）；取40 μL Tris-HCl 缓冲液代替样品溶液，分别在凝血酶加入前、后测得吸光值（凝血酶加入前酶标仪读数以ACB表示，凝血酶加入后读数以AC表示）。以市售华法林钠片（有效成分为3-（3-氧代-1-苯基丁基）-4-羟基-2H-1-苯并吡喃二酮钠盐，分子式为C19H15NaO4）作对照，按有效成分换算并配制成同浓度溶液。按下式计算样品抑制凝血酶催化纤维蛋白原形成纤维蛋白的能力：
本发明的优点在于：本发明公开了一种阿胶多肽及其制备方法。其中种阿胶多肽的氨基酸序列明确，为YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。本发明的阿胶多肽具有羟基自由基清除活性和抗凝血活性，并且阿胶多肽具有浓度-功效相关性。
附图说明

[0016] 图1阿胶胰蛋白酶酶解肽的羟基自由基清率功效验证图。

[0017] 图2阿胶胰蛋白酶酶解肽的抗凝血活性功效验证图。

[0018] 图3 阿胶胰蛋白酶酶解产物的总离子流谱图。

具体实施方式

[0019] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

[0020] 仪器与装置Dionex 3000高效液相色谱仪，Q-Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国ThermoFisher公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；台式冷冻离心机（日立公司）；冷冻干燥机（LABCONCO公司）。

[0021] 材料与试剂氢氧化钠、硫酸铁、邻菲啰啉、抗坏血酸、双氧水为分析纯，购自国药集团；质谱测序级胰蛋白酶、色谱纯乙腈、甲酸、甲醇购自Thermo Fisher公司；C18 SPE柱（500mg/6mL）购自Agilent公司。

[0022] 多肽委托上海波泰生物技术有限公司合成，通过 RPLC-MS 检测其纯度为98 %以上。

[0023] 抗凝血药物华法林钠片为上海福达制药有限公司生产。

[0024] 实施例1 一种阿胶多肽的制备在研细后的阿胶粉中加入20倍量的去离子水，80℃炖化30 min，冷却后冷藏过夜。将提取液于4℃以18000rpm离心5min，取上清液过滤后，得阿胶提取液。以10 % NaOH溶液调节pH =7.5，40℃水浴中以浓度为6×104 U/g胰蛋白酶酶解，酶解过程中每隔1 h调节一次pH，使pH值始终保持在7.5。酶解4 h后灭酶活，冷却后于4℃以18000rpm离心5min，取上清液3mL过C18 SPE固相萃取柱（预先以3 mL甲醇、3 mL去离子水活化）分离纯化，以3×3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮吹干，以1 mL 1 %甲酸溶液溶解，过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽待测，过滤后的阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测。

[0025] 液相色谱条件为：Hypersil GOLD UPLC C18色谱柱，100m × 2.1 mm，1.9 µm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0 50 min，乙腈10% 90%；50 55 min，乙~ ~ ~腈90%；55 56 min，乙腈90% 10%；56 60 min，乙腈10%；流速：0.3 mL/min；进样量：10 µL。
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[0026] 质谱条件为：扫描模式：Full MS/dd-MS2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100-1500 m/z，一级质谱分辨率：70000 at m/z，AGG target: le6，一级Maximum IT: 100 ms，Number of scan ranges: 1，动态排除(Dynamic exclusion): 40.0 s一次，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window: 0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500 at m/z 200，Microscans: 1，二级Maximum IT: 50 ms，碰撞能量: 30 eV，Underfill ratio: 0.1%。

[0027] 电喷雾离子源(ESI)：载气为高纯氮气(纯度>99.5%)，鞘气流速40个单位(arb)，辅气流速15个单位(arb)；喷雾电压3.2 KV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率(S-lens RF level)为60，辅气热源温度350℃。

[0028] 采用MaxQuant(版1.6.1.0)进行数据分析。搜索针对包含来自Uniprot的阿胶(uniprot-donkey-hide gelatin.fasta)的蛋白质序列（https://www.uniprot.org，2018年11月3日下载）数据库。蛋白FDR设置为0.01；最小氨基酸长度设置为3；可变修饰设为N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修饰设置为Carbamidomethyl(C)；专一性酶设置为胰蛋白酶；最大裂解丢失设置为2，所有常见的污染物和相反的命中被删除。

[0029] 以上述实验方法，三次重复鉴定后有63条肽段（见表1），其中19条有明确生物来源，结果如表12：表1 三次重复鉴定的63条肽段
表2 经检测鉴定后明确生物来源的阿胶多肽
实施例2 一种阿胶多肽的功效评价
1羟基自由基清除活性
羟基自由基清除活性检测参照文献徐晓冰. 提高阿胶抗氧化性能的研究[D].北京: 北京化工大学,2018.，在酶标板中依次加入40 uL浓度为1.865 mmol/L邻菲啰啉溶液、80 uL实施例1过0.45 µm滤膜所得阿胶多肽样液、40 uL浓度为1.865 mmol/L的 FeS04·7H20溶液和40 uL浓度为0.03 % (v/v) 的H202溶液。将酶标板于37℃恒温60 min，536nm处测定吸光值，以同浓度抗坏血酸标准溶液作对照。

[0030] 2抗凝血活性抗凝血活性实验参照文献贾俊强. 超声对酶法制备小麦胚芽抑制肽的影响及其作用机理[D].江苏: 江苏大学,2009.，酶标仪温度为37℃，测定波长405 nm。以Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.2 7.4）配制浓度为0.1%纤维蛋白原溶液和12 U/mL凝血酶溶液；在酶标~
板中加入140 μL纤维蛋白原溶液和40 μL实施例1过0.45 µm滤膜所得阿胶多肽样液，混匀后读数（ASB）；再加入10 μL凝血酶溶液开始反应，37℃恒温培养箱反应10 min后，酶标仪测读数（AS）；取40 μL Tris-HCl 缓冲液代替样品溶液，测得吸光值（凝血酶加入前酶标仪读数以ACB表示，凝血酶加入后读数以AC表示）。以市售华法林钠片（有效成分为3-（3-氧代-1-苯基丁基）-4-羟基-2H-1-苯并吡喃二酮钠盐，分子式为C19H15NaO4）作对照，按有效成分换算并配制成同浓度溶液。按下式计算样品抑制凝血酶催化纤维蛋白原形成纤维蛋白的能力：
氧化胁迫一直被认为是造成衰老和某些疾病的原因。生物体并不能完全利用氧，结果可能会产生可破坏蛋白质、脂肪和DNA等生物分子的自由基。一些天然产物如维生素C、多酚类物质等具有抗氧化作用，可延迟、预防或抑制目标分子的氧化损伤，这一过程主要涉及电子的转移以及自由基的清除[1]。而末端具有疏水性氨基酸或含肽段内具有芳香族氨基酸、亲核氨基酸的肽也可以通过释放氢原子、供给电子等方式捕获并清除自由基，从而达到抗氧化的效果。

[0031] 凝血机理包括凝血、抗凝两部分，二者处于动态平衡是维持机体内血液正常流动的关键[2]。在正常生理状态下，血液中的凝血因子不断地被激活，产生凝血酶，形成微量纤维蛋白，沉着于血管内膜上。这些微量的纤维蛋白又不断地被激活了的纤维蛋白溶解系统所溶解，同时被激活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬，使机体内凝血系统和纤维蛋白溶解系统处于动态平衡。当产生病变时，凝血异常可形成血栓，临床使用抗凝血药物抑制凝血。现已有部分肽类如蛇毒抗凝血活性肽已被发现具有抗凝血活性，其结构也在进一步鉴定中。

[0032] 本发明从重复鉴定得到的65条肽段中选取并合成了9条肽段，其中QHASQVLIRR、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、YQCLKGTGK4条肽段生物来源明确； ANKGFLEEVR、FAAFIDK、IAVGGFR、LASYLDK、LYEEEIR5条肽段无明确生物来源。结果发现，有5条肽段具有羟基自由基清除活性，按活性由大到小排列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR。其中YQCLKGTGK的半抑制浓度（IC50值）远小于0.5 mg/mL，2.5 mg/mL时羟基自由基清除率高达(95.62±0.04) %，基本与抗坏血酸相同（图1）。5条多肽表现出抗凝血活性，且随着浓度的升高，对凝血酶抑制活性越强；在浓度为2.5 mg/mL时，抗凝血活性从大到小依次是MDNPDTFYSLKYQIK、QHASQVLIRR、LYEEEIR、LASYLDK、CTTPPPSSGPKYQCLK。其中MDNPDTFYSLKYQIK的半抑制浓度（IC50值）约为1.9 mg/mL，2.5 mg/mL时抗凝血活性高达(80.78±0.06) % （图2）。

[0033] 由图1、图2中可见，无论是羟基自由基清除率还是抗凝血活性，5条肽段均表现出了浓度-功效相关性，且功效作用与对照物相当。本发明验证的2种功效也验证了传统中医认为的阿胶具有活血、美容等作用。

[0034] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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