一种蛋白质水解度测定方法
专利汇可以提供一种蛋白质水解度测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于产品检验技术领域，涉及一种 蛋白质 水 解 度测定方法：将蛋白水解液以高效凝胶过滤色谱法测定多肽分子量分布，计算不同分子量范围多肽的 质量 百分含量，进而计算获得多肽含量、游离 氨 基酸含量和蛋白水解度；还能够通过准确方法测定系列不同水解程度的蛋白质标准溶液中游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度，作出标准曲线更准确地定量。本发明利用高效凝胶过滤色谱法实现对样品中多肽含量、游离氨基酸含量和水解度的同时测定，与传统测定方法比较更加简单、快速。本发明的方法结果与传统方法的测定结果相关性、准确性高，为工业化生产寡肽的过程监测提供了快速、可靠的方法。，下面是一种蛋白质水解度测定方法专利的具体信息内容。
1.一种蛋白质水解度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将水解后的蛋白质溶液用缓冲液稀释成适当浓度的蛋白水解液；
（2）将蛋白水解液以高效凝胶过滤色谱法测定多肽分子量分布，计算不同分子量范围多肽的质量百分含量Xa，其中，a为相对分子量；
（3）结果与计算：
（a）样品中的多肽含量，按照下式计算：
多肽含量（%）= ΣXa，
其中，a = 200Da-10000 Da；
（b）样品中游离氨基酸的含量，按照下式计算：
游离氨基酸含量（%）= Xa，
其中，a < 200 Da；
（c）蛋白水解度，按照下式计算：
蛋白水解度（%）= Σ（128Xa/a’），
其中，128为氨基酸平均分子量，
a’为不同分子量范围多肽的平均分子量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，蛋白水解液的浓度为20-
200mg蛋白/mL。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述缓冲液的pH为6.5-
8.0；所述缓冲液的浓度为20-50mmol/L。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲溶液，磷酸缓冲溶液，Britton-Robinson广泛缓冲溶液，Clark-Lubs缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述高效凝胶过滤色谱法的色谱条件如下：
色谱柱：Superdex peptide 10/300 GL；
流动相：0.10-0.20M NaCl、20-50mM pH 7.2磷酸盐缓冲液；
流速：0.2-1.0mL/min；
检测波长：214nm；
压力：不超过1.8Mpa；
进样体积：20-100µL。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，还包括制备标准曲线并计算准确多肽含量、游离氨基酸含量和蛋白质水解度的步骤：
（i）将一系列不同水解程度的蛋白质标准溶液按照步骤（1）-（3）的方法分别测定游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度；
（ii）将（i）中的一系列不同水解程度的蛋白质标准溶液测定游离氨基酸和多肽的准确含量及准确的蛋白质水解度；
（iii）以（i）中游离氨基酸含量为纵坐标，以柱前衍生高效液相色谱法测定的游离氨基酸准确含量为横坐标做游离氨基酸含量标准曲线；
以（i）中多肽含量为纵坐标，以三氯乙酸沉淀法的多肽准确含量为横坐标做多肽含量标准曲线；
以（i）中蛋白质水解度为纵坐标，以茚三酮比色法测定的准确的蛋白质水解度为横坐标做蛋白质水解度标准曲线；
（iv）将测定获得的蛋白水解液的游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度分别代入（iii）中的标准曲线，计算获得准确的游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，步骤（ii）和（iii）中，所述游离氨基酸含量测定方法选自纸层析法或柱前衍生高效液相色谱法；
所述多肽含量测定方法选自双缩脲法、邻苯二甲醛法、紫外吸收法或三氯乙酸法；
所述蛋白质水解度选自pH-state法、三硝基苯磺酸法、甲醛滴定法或茚三酮比色法。
一种蛋白质水解度测定方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）将蛋白水解液以高效凝胶过滤色谱法测定多肽分子量分布，计算不同分子量范围多肽的质量百分含量Xa，其中，a为分子量；
（3）结果与计算：
（a）样品中的多肽含量，按照下式计算：
多肽含量（%）= ΣXa，
其中a = 200Da-10000 Da；
（b）样品中游离氨基酸的含量，按照下式计算：
游离氨基酸含量（%）= Xa，
其中a < 200 Da；
（c）蛋白水解度，按照下式计算：
蛋白水解度（%）= Σ（128Xa/a’），
其中128为氨基酸平均分子量，
a’为不同分子量范围多肽的平均分子量。
流动相：0.10-0.20M NaCl、20-50mM pH 7.2磷酸盐缓冲液；
流速：0.2-1.0mL/min；
检测波长：214nm；
压力：不超过1.8Mpa；
进样体积：20-100µL。
（ii）将（i）中的一系列不同水解程度的蛋白质标准溶液测定游离氨基酸和多肽的准确含量及准确的蛋白质水解度；
（iii）以（i）中游离氨基酸含量为纵坐标，以游离氨基酸准确含量为横坐标做游离氨基酸含量标准曲线；
以（i）中多肽含量为纵坐标，以多肽准确含量为横坐标做多肽含量标准曲线；
以（i）中蛋白质水解度为纵坐标，以准确的蛋白质水解度为横坐标做蛋白质水解度标准曲线；
（iv）将测定获得的蛋白水解液的游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度分别代入（iii）中的标准曲线，计算获得准确的游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度。
所述蛋白质水解度可以用pH-state法，三硝基苯磺酸法、甲醛滴定法或茚三酮比色法。
附图说明
图3是大米蛋白水解液游离氨基酸含量标准曲线；
图4是BSA蛋白水解液多肽含量标准曲线；
图5是大米蛋白水解液多肽含量标准曲线；
图6是-NH2基含量标准曲线；
图7是BSA蛋白水解液蛋白水解度标准曲线；
图8是大米蛋白水解液蛋白水解度标准曲线。
具体实施方式
6h时分别取10mL样品，样品取出后立刻置于100℃水浴10min灭酶处理，获得不同水解度的蛋白质水解样品。
（1）多肽分子量标准曲线：将标准分子量的多肽：细胞色素C（Mw 12500）、抑肽酶（Mw
6512）、氧化型谷胱甘肽（Mw 615）、还原型谷胱甘肽（Mw 310）、甘氨酸（Mw 6512）、抑肽酶（Mw
75）分别以20mM pH8.0磷酸盐缓冲溶液配制成浓度为10mg/mL的溶液；
（2）色谱条件：色谱柱：Superdex peptide 10/300 GL；流动相：0.15M NaCl、50mM pH
7.2磷酸盐缓冲液；检测波长：214nm；流速：0.5ml/min；压力：不超过1.8Mpa；洗脱体积：30mL（60min）；进样体积：50µL；柱温：室温；
（3）检测：将实施例1中不同水解度的蛋白质水解液和标准分子量的多肽溶液按照步骤（2）中的色谱条件进行检测；
（4）样品分子量分布的计算方法：用Aglient G2182AA GPC数据处理软件（A.02.02），将样品的色谱数据代入多肽分子量标准曲线中进行计算，即可得到样品的分子量分布范围。
用峰面积归一法按下式计算不同分子量范围肽的相对百分比：
式中：
Xa—试样中某相对分子质量肽段所占肽段的质量分数%
A—某相对分子质量肽段的峰面积；
A总—各相对分子质量肽段的峰面积之和。
多肽含量（%）= ΣXa
其中a = 200 Da -10000 Da；
（b）样品中游离氨基酸的含量，按照下式计算：
游离氨基酸含量（%）= Xa
其中a < 200 Da；
（c）蛋白水解度，按照下式计算：
蛋白水解度（%）= Σ（128Xa/a’）
其中128为氨基酸平均分子量，
a’为不同分子量范围多肽的平均分子量。
表1 标准分子量多肽的保留时间和保留体积
。
表3 不同酶解时间大米蛋白酶解液的多肽分子量分布
。
。
。
。
色谱条件：Venusil AA氨基酸分析柱4.6×250nm，5μm；柱温：40℃；检测波长：254nm；流动相A：称取15.2g无水乙酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140mL，混匀，用0.45μm滤膜过滤；流动相B：80%乙腈水溶液；流动相梯度如下：
。
式中：
f1 —样品溶液中某种氨基酸峰面积/内标峰面积；
f2 —混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积；
C —某种氨基酸对照品浓度（μg/mL）。
V —样品溶液的定容体积（mL）；
W —样品的质量（g）。
式中：
X—多肽的含量（%）；
V—样品消耗HCl标准溶液的体积（mL）；
V0—空白消耗HCl标准溶液的体积（mL）；
N—HCl标准溶液的浓度（mol/L）；
0.014—1 mol/LHCl标准溶液1 mL相当于氮的克数；
m—样品的质量（g）；
F—氮的换算系数（大米蛋白为5.95，BSA为6.25）。
100ml得20μg/mL的溶液。取此液再分别稀释成含量为2-20μg/mL的溶液用于标准曲线的绘制。取2.00mL测定用稀释液于试管中加入1.00mL显色剂，混匀后沸水浴中加热15min，同时作空白试验；然后冷水冷却，加入5.00mL 40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色皿，以空白管调零与570nm处测定A值。
DH（%）=
式中：
N —氮含量，mg/mL；
h —被裂解的肽键数，mmol/g。
表10 茚三酮比色法测定蛋白水解度
表10数据和表6数据可知，利用凝胶过滤色谱法和茚三酮比色法测定的BSA样品和大米蛋白样品的蛋白水解度变化趋势相同、结果相近。
100℃水浴10min灭酶处理，获得蛋白质水解样品。
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