产生包含种系遗传修饰的动物的方法
阅读：2发布：2023-05-22
专利汇可以提供产生包含种系遗传修饰的动物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物例如禽类的方法，其包含靶向种系遗传修饰，其中核酸酶(可是CRISPR、ZFN或TALEN)在卵母细胞受精之前递送至精子。，下面是产生包含种系遗传修饰的动物的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物的方法，所述方法包括：
(i)向精子递送可编程核酸酶；
(ii)用所述精子使卵子受精，和
(iii)从所述卵子产生动物，
其中所述核酸酶将遗传修饰引入精子和/或卵子的DNA中。
2.权利要求1的方法，其进一步包括筛选得自步骤(iii)的动物的种系遗传修饰。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述核酸酶在包含转染剂的组合物中递送至所述精子。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述核酸酶选自：RNA向导的工程核酸酶(RGEN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。
5.权利要求4的方法，其中所述核酸酶是RNA引导的工程核酸酶(RGEN)。
6.权利要求2至5任一项的方法，其中所述转染剂包含阳离子脂质。
7.权利要求6的方法，其中所述转染剂包含选自以下的一种或多种单价阳离子脂质：
DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧基)-丙基]-N.N.N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1,2-双(油酰基氧基)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵)和DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)。
8.权利要求6或权利要求7的方法，其中所述转染剂包含选自以下的一种或多种多价阳离子脂质：DOSPA(2,3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐)和DOSPER(1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙酰胺、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油烯基精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)和TMDOS(四甲基二油烯基精胺)。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述遗传修饰导致所述动物和/或其子代中一种或多种基因和/或蛋白质的降低的表达。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中所述遗传修饰是缺失、取代或插入。
11.权利要求10的方法，其中所述插入是转基因。
12.权利要求1至11任一项的方法，其中步骤(ii)包括将所述精子人工授精至雌性动物。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中使用所述方法产生的至少10％的动物包含所述靶向种系遗传修饰。
14.权利要求1至13任一项的方法，其中所述动物的所有细胞包含所述靶向种系遗传修饰。
15.权利要求1至14任一项的方法，其中所述动物对于靶向种系遗传修饰是杂合的。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中所述靶向种系遗传修饰修饰所述动物的性状。
17.权利要求1至16任一项的方法，其中所述动物是禽类。
18.权利要求17的方法，其中所述禽类选自鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡或鹌鹑。
19.一种通过权利要求1至18任一项的方法产生的动物或其子代。
20.精子或卵子，由权利要求19的动物产生。
21.一种产生遗传修饰动物的方法，所述方法包括：
(i)将权利要求19的第一动物与同一物种的第二动物杂交，和
(ii)选择包含所述靶向种系遗传修饰的子代。
22.权利要求21的方法，其包括选择对于靶向种系遗传修饰是纯合的子代。
23.权利要求22的方法，其中所述第一和第二动物对于靶向种系遗传修饰是杂合的。
24.一种动物，通过权利要求21至23任一项的方法产生。
25.一种生产食物的方法，所述方法包括：
(i)获得权利要求19或权利要求24的动物，和
(ii)从所述动物产生食物。
26.权利要求25的方法，其中所述方法包括从所述动物收获肉和/或蛋。
产生包含种系遗传修饰的动物的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人动物(例如禽类)的方法。
背景技术
[0002] 制造转基因动物的总体目标是将遗传修饰稳定引入宿主动物的种系，并可以以孟德尔方式传递给后代。通过掺入遗传修饰，可以特异性改变动物的特征。转基因动物因多种目的而产生。它们可以用作基础研究模型、专门的非农业目的(如药品生产或异种移植)，也可以用于增强动物生产性状和产品。因此，对开发提高动物(特别是家畜动物包括鸟类)转基因过程的效率和特异性的方法很有兴趣。
[0003] 转基因和基因敲除禽类物种通过增加对人畜共患疾病的抵抗力、减少家禽产品的过敏原潜力和产生新的生物医学模型，在家禽业和医学界具有巨大潜力。使用目前的培养然后将生殖细胞转移到胚胎中，或将循环生殖细胞直接注射到胚胎中以建立转基因鸟类的繁殖群的方法，需要两代以及孵化和筛选数百只鸟。这是费时的且需要相当多的资源，并且对于许多禽类物种，没有长期培养生殖细胞的方法。寻找在一代中建立繁殖群的方法将节省时间和金钱，并大大减少使用鸟类的数量。
[0004] 目前产生转基因鸡的方法需要两代，因为在第一代只有一小部分最终成为精子和蛋的生殖细胞或繁殖细胞(reproductive cell)含有期望的转基因或敲除。这意味着当你繁殖这些动物时，下一代只有一小部分会具有期望的性状。这就是为什么必须孵化并筛选数百只雏鸟以获得足够的转基因鸟来建立繁殖群。开发在第一代产生种系转基因或基因编辑的鸟的方法将节省大量时间和资源。
[0005] 先前的研究已经将精子与期望的转基因DNA和膜结合剂混合，并用DNA和精子混合物对鸟类进行授精。这种方法被称为精子介导的基因转移(SMGT)，并且在多种物种(包括小鼠、绵羊、牛、猪、马和鸡)中取得了不同的成功(Lavitrano et al.,1989；Shemesh et al.,2000；Ball et al.,2008；García-Vázquez et al.,2009；Collares et al.,2011；
Pereyra-Bonnet et al.,2011)。SMGT依靠通过非同源末端连接(NHEJ)双链DNA断裂修复途径，随机整合DNA。这效率很低，因为即使发生随机整合，也不保证发生在有利于基因表达的基因组区域，并且第一代需要数百只鸟来产生转基因繁殖群。
Pereyra-Bonnet et al.,2011)。SMGT依靠通过非同源末端连接(NHEJ)双链DNA断裂修复途径，随机整合DNA。这效率很低，因为即使发生随机整合，也不保证发生在有利于基因表达的基因组区域，并且第一代需要数百只鸟来产生转基因繁殖群。
[0006] 需要开发用于产生包含遗传修饰的动物的改进方法，特别是允许在基因组中的预定位置进行靶向遗传修饰的方法。
[0007] 发明概述
[0009] 在第一方面，本发明提供了用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物的方法，所述方法包括：
[0010] (i)向精子递送可编程核酸酶，
[0011] (ii)用所述精子使卵子受精，和
[0012] (iii)从所述受精卵产生动物，
[0013] 其中所述核酸酶将遗传修饰引入精子和/或卵子的DNA中。
[0014] 在一个实施方案中，该方法进一步包括，筛选得自步骤(iii)的动物的种系遗传修饰。在一个实施方案中，筛选是对动物的包含DNA或RNA的样品(例如种系细胞)进行PCR和/或测序。在一个实施方案中，筛选确定动物是否对于遗传修饰是纯合的或杂合的。
[0015] 在一个实施方案中，将可编程核酸酶在包含转染剂的组合物中递送至精子。在一个替代实施方案中，使用电穿孔将可编程核酸酶递送至精子。
[0016] 在一个实施方案中，可编程核酸酶选自但不一定限于RNA向导的(RNA-guided)工程核酸酶(RGEN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和argonaute。在一个实施方案中，可编程核酸酶是RNA向导的工程核酸酶(RGEN)。在一个实施方案中，RGEN核酸酶是成簇的规则间隔的短回文重复序列相关蛋白9(Cas9)。
[0017] 在一个实施方案中，遗传修饰导致动物和/或其子代中一种或多个基因和/或蛋白质的降低的表达。
[0018] 在一个实施方案中，遗传修饰是缺失、取代或插入。
[0019] 在一个实施方案中，插入是转基因。
[0020] 在一个实施方案中，步骤(ii)包括将精子人工授精至雌性动物。
[0021] 在一个实施方案中，使用该方法产生的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少23％、至少24％、或至少25％、或至少26％、至少30％或至少40％的动物包含靶向种系遗传修饰。
[0022] 在一个实施方案中，动物的所有细胞包含靶向种系遗传修饰。
[0023] 在一个实施方案中，该动物对于靶向种系遗传修饰是杂合的。然而，在一个替代实施方案中，该动物对于靶向种系遗传修饰可是纯合的。
[0024] 在一个实施方案中，靶向种系遗传修饰修饰动物的性状。可以修饰的性状的实例包括但不限于对疾病(例如感染性疾病)的易感性、肌肉发育、骨骼发育、变应原性或性别。在一个实施方案中，性状是性/性别。在一个实施方案中，种系遗传修饰修饰DMRT1基因。在一个实施方案中，性状是生产性状。
[0025] 在一个实施方案中，动物是哺乳动物。在一个实施方案中，动物是有袋动物。在一个实施方案中，动物是单孔类动物。在一个实施方案中，动物是爬行动物。在一个实施方案中，动物是家畜动物，例如绵羊、牛、猪、鸭、鸡、山羊或马。在一个实施方案中，动物是禽类。在一个实施方案中，禽类选自但不一定限于鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡或鹌鹑。
[0026] 一方面，本发明提供了通过上述方面的方法产生的动物。
[0027] 另一方面，本发明提供了由本发明的动物产生的精子。
[0028] 另一方面，本发明提供了由本发明的动物产生的卵子。
[0029] 一方面，本发明提供了一种产生遗传修饰动物的方法，该方法包括：
[0030] (i)将本发明的第一动物与同一物种的第二动物杂交，
[0031] (ii)选择包含靶向种系遗传修饰的子代。
[0032] 在一个实施方案中，该方法包括选择对于靶向种系遗传修饰是纯合的子代。
[0033] 在一个实施方案中，该方法包括选择对于靶向种系遗传修饰是杂合的子代。
[0034] 另一方面，本发明提供了通过上述方面的方法产生的动物。
[0035] 另一方面，本发明提供了一种产生食物的方法，该方法包括：
[0036] (i)获得本发明的动物，和
[0037] (ii)从所述动物产生食物。
[0038] 在一个实施方案中，该方法包括从动物收获肉和/或蛋。
[0039] 除非另外具体说明，否则本文的任何实施方案应被视为加以必要的变通适用于任何其他实施方案。例如，如本领域技术人员将理解的，对于本发明的方法，以上概述的遗传修饰的实例同样适用于由本发明的方法产生的动物。
[0040] 本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制，其仅是为了举例说明的目的。功能等价的产品、组合物和方法明显在如本文描述的本发明的范围内。
附图说明
[0043] 图1.WT表型胚胎上GFP和β-肌动蛋白的PCR。A和B胚胎1-30作为GFP表达阳性对照，1-25作为阴性对照。GFP和DMRT1CRISPR介导的编辑的PCR。C.来自用2个GFP CRISPR向导序列(guides)或2个GFP CRISPR向导序列和2个DMRT1CRISPR向导序列靶向的流式细胞仪筛选的细胞池(pool)的PCR结果。较大的完整尺寸条带包含完整未经编辑的DNA和单一向导序列切割DNA，而下方条带含有来自细胞的DNA，其中两个向导序列切割特定基因，这被称为双切。
[0044] 图2.GFP PCR阳性胚胎的明场和荧光显微镜检查。A.胚胎1-30是GFP表达阳性对照，1-25是GFP PCR阴性对照。可以看出，1-8、1-10、1-13、1-23、1-52不表达GFP。B展开的鸟1-15的明场和荧光显微镜图像，其为嵌合GFP表达(箭头指出展开图中的小点)。
[0045] 图3.GFP序列。Inverted_pT2是用于产生原始GFP鸟的质粒，I_30是GFP表达胚胎，并且1-10、1-15和1-23是具有WT表型(分别为SEQ ID NO1至5)的GFP PCR阳性胚胎。当将质粒和胚胎对照与含有A→G突变的WT表型胚胎进行比较时，方框突出显示了ATG起始位点中出现的突变。方框突出显示起始位点-10和+24位置的突变。
[0047] 图5.明场显微镜。来自具有DMRT1突变以及非突变对照的第2.5天胚胎的明场显微图像。
[0048] 图6.序列比对。比对显示衍生自两种GFP向导序列靶向的培养细胞的完整GFP PCR产物。
[0049] 图7.序列比对。比对显示衍生自两种DMRT1向导序列靶向的培养细胞的完整DMRT1PCR产物。
[0050] 图8.序列比对。比对显示来自对照样品的GFP基因，包括来自GFP实验中使用的GFP系的起始镶嵌公鸡、祖辈公鸡、以及所有亲本公鸡。
[0051] 图9.序列比对。比对显示来自对照样品的DMRT1基因，包括来自对照授精(CI)的样品、来自能育鸡(FC)的样品和来自GFP实验的样品。
[0053] SEQ ID NO:1–用于产生GFP禽类的Inverted_pT2质粒的区域。
[0054] SEQ ID NO:2–来自表达GFP的I_30胚胎的对应于SEQ ID NO：1的区域。
[0055] SEQ ID NO:3–来自GFP PCR阳性的具有WT表型的I_10胚胎的对应于SEQ ID NO:1的区域。
[0056] SEQ ID NO:4–来自GFP PCR阳性的具有WT表型的I_15胚胎的对应于SEQ ID NO:1的区域。
[0057] SEQ ID NO:5–来自GFP PCR阳性的具有WT表型的I_23胚胎的对应于SEQ ID NO:1的区域。
[0058] SEQ ID NO:6–向导RNA sg-GFP-1。
[0059] SEQ ID NO:7–向导RNA sg-GFP-2。
[0060] SEQ ID NO:8–GFP PCR引物正向。
[0061] SEQ ID NO:9–GFP PCR引物反向。
[0062] SEQ ID NO:10–B-肌动蛋白PCR引物正向。
[0063] SEQ ID NO:11–B-肌动蛋白PCR引物反向。
[0064] SEQ ID NO:12–DMRT1 PCR引物正向。
[0065] SEQ OD NO:13–DMRT1 PCR引物反向。
[0066] SEQ ID NO:14–性别检查PCT引物正向。
[0067] SEQ ID NO:15–性别检查PCR引物反向。
[0068] SEQ ID NO:16–DMRT1 CRISPR向导序列1.
[0069] SEQ ID NO:17–DMRT1 CRISPR向导序列2.
[0070] SEQ ID NO:18–DMRT1 HDR寡核苷酸.
[0071] 发明详述
[0072] 一般技术和选定的定义
[0073] 除非另外具体定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应被认为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、重组DNA生物学、转基因动物和生物化学)普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0074] 除非另有说明，否则本发明中使用的细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在以下来源的整篇文献中都有描述和解释，如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995和1996),和F.M.Ausubel et al.,(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括至今所有更新),Ed Harlow and David Lane
(editors)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),和J.E.Coligan et al.,(editors)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括至今所有更新)。
(editors)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),和J.E.Coligan et al.,(editors)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括至今所有更新)。
[0075] 术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为是指“X和Y”或“X或Y”，并且应被认为是对两种含义或任一含义提供明确的支持。
[0076] 在整个说明书中，词语“包含”或变体，例如“含有”或“包括”将被理解为指包括所陈述的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。
[0078] 如本文所用，术语“禽类”是指分类学鸟纲的任何物种、亚种或品种的生物，例如但不限于如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、母野鸡(game hen)、乳鸽、珍珠鸡、雉、鹦鹉、雀(finch)、鹰、乌鸦和包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡的平胸鸟。该术语包括原鸡(Gallus gallus，鸡)的各种已知品系，例如白来航鸡(White Leghorn)、褐来航鸡(Brown Leghorn)、Barred-Rock、苏塞克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(New Hampshire)、罗德岛鸡(Rhode Island)、澳洲黑鸡(Australorp)、考尼什鸡(White Leghorn)、米诺卡鸡(Minorca)、阿木鸡(Amrox)、加利福尼亚灰鸡(California Gray)、意大利山鹑色鸡(Italian Partidge-coloured)以及通常以商业规模饲养的火鸡、雉、鹌鹑、鸭、鸵鸟和其他家禽品系。
[0079] 术语“家禽”包括为肉或蛋而饲养、收获或驯养的所有禽类，例如鸡、火鸡、鸵鸟、母野鸡、乳鸽、珍珠鸡、雉、鹌鹑、鸭、鹅和鸸鹋。
[0080] 具有靶向种系遗传修饰的非人类动物
[0081] 本发明涉及用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物(例如禽类)的方法。如本文所用，术语“靶向种系遗传修饰”是指通过人类干预在基因组中的预定位置进行的任何遗传修饰，例如但不限于缺失、取代或插入。
[0082] 如本文所用，“遗传修饰的动物”是指任何动物，其中所述动物的一个或多个(优选全部)细胞含有靶向种系遗传修饰。
[0083] 在一个实施方案中，遗传修饰导致动物和/或其子代中一种或多种基因和/或蛋白质降低的表达。因此，在该实施方案中，可产生基因敲除动物。如本文所用，一种或多种基因和/或蛋白质的“降低的表达”是指使用本发明的方法产生的动物或其子代的细胞中多肽的翻译和/或基因的转录相对于缺乏所述遗传修饰的同基因动物减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％。
[0084] 在另一个实施方案中，遗传修饰是插入转基因。转基因靶向于感兴趣的位点的能力可能是有益的，因为转基因对已知或怀疑的不会对动物造成任何有害作用的位点感兴趣。转基因可以编码任何功能性蛋白质或多核苷酸(例如用于RNAi的反向多核苷酸或dsRNA)。在一个实施方案中，转基因编码在动物中表达的蛋白质。在一个实施方案中，转基因编码治疗性蛋白质如抗体。
[0085] 在一个实施方案中，转基因包含与感兴趣的开放阅读框(例如编码蛋白质)可操作地连接的一个或多个调节(启动子)元件。如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，它指的是转录调节元件与转录的序列的功能关系。例如，如果启动子在合适的细胞中刺激编码序列的转录，则该启动子与编码序列(例如编码开放阅读框)可操作地连接。一般而言，与转录的序列可操作地连接的启动子转录调节元件与转录的序列是物理邻接的，即它们是顺式作用的。
[0086] 转基因还可包含3'非翻译序列，例如约50至1,000个核苷酸碱基对，其可包含转录终止序列。3'非翻译序列可含有转录终止信号，其可包含或可不包含聚腺苷酸化信号和任何其他能够实现mRNA加工的调节信号。
[0088] 在一个实施方案中，遗传修饰至少被引入精子的DNA中。
[0089] 在另一个实施方案中，遗传修饰至少被引入(在单细胞阶段)受精卵的DNA中。如本领域技术人员将会理解的，在该实施方案中，可以将遗传修饰引入母本或父本、或两者衍生的DNA中。通常，预计父本DNA将被更频繁地修饰，因为精子很可能会较长时间地暴露于核酸酶。例外情况的实例是遗传修饰靶向于仅存在于动物的雌性染色体中的基因，例如禽类的W染色体。
[0090] 在一个实施方案中，动物的所有细胞包含靶向种系遗传修饰。
[0091] 在一些情况下，并非所有使用本发明方法产生的动物细胞(包括不是所有的种系细胞)都将具有遗传修饰。在这些情况下，核酸酶可能在受精卵开始分裂后引入了遗传修饰。使用本发明方法产生的这些动物可以使用常规技术(例如对于靶向遗传修饰的种系细胞的PCR和/或DNA测序分析)容易地鉴定并排除于进一步育种。
[0092] 可以筛选使用本发明方法产生的动物以确定靶向种系遗传修饰的存在。这个步骤可以使用本领域已知的任何合适的方法来进行。例如，可以使用标准DNA扩增和测序方法分析核酸样品(例如基因组DNA样品)以确定遗传修饰是否存在于基因组中的靶向位点(基因座)。
[0093] 在一个实施方案中，筛选还可确定动物是否对于遗传修饰是纯合的或杂合的。
[0094] 在另一个实施方案中，筛选动物以鉴定遗传修饰是否可以在种系细胞中发现，以使得它可以传递给其后代。
[0095] 产生具有靶向种系遗传修饰的非人类动物
[0096] 本发明提供了用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物的方法，所述方法包括：
[0097] (i)向精子递送可编程核酸酶，
[0098] (ii)用所述精子使卵子受精，和
[0099] (iii)从所述受精卵产生动物。
[0100] 本发明还提供了产生包含靶向种系遗传修饰的精子的方法，所述方法包括将可编程核酸酶递送至精子，其中核酸酶将遗传修饰引入精子的DNA中。
[0101] 本发明还提供了产生包含靶向种系遗传修饰的卵子的方法，所述方法包括：
[0102] (i)向精子递送可编程核酸酶，和
[0103] (ii)用所述精子使卵子受精，
[0104] 其中核酸酶将遗传修饰引入卵子的DNA中。
[0105] 向精子递送可编程核酸酶
[0106] 可编程核酸酶可以在体外或体内递送至精子，优选体外递送至精子。如本领域技术人员将理解的，在本发明的上下文中使用的术语“精子”通常以复数意义使用，因此当进行本发明时将存在数百万个个体精子细胞。
[0108] 在一个实施方案中，在添加待递送的可编程核酸酶之前，从精子中除去精浆。在一个实施方案中，精浆通过洗涤除去，例如在存在精液稀释剂(semen extender)的情况下。
[0109] 精液稀释剂是一种液体稀释剂，它被添加到精液中以保持其受精能力。它可以作为保护精子细胞免于自身有毒副产物的缓冲剂，在冷却和运输过程中保护精子细胞免受冷休克和渗透压休克(冷冻精子以减少新陈代谢并使其活得更长)。特殊的冷冻稀释剂的使用还允许精子的低温保存(“冷冻精液”)，其可以转运使用，或在以后的日子现场使用。如本领域技术人员将会理解的，许多不同的精液稀释剂可以从商业供应商如MOFA Global(Verona，WI，USA)和Minitube(Tiefenbach，Germany)获得。
[0110] 在用于本发明之前，可将精子储存在例如4℃或冷冻保存。
[0111] 递送可编程核酸酶的方法包括但不限于使用转染剂、电穿孔和生物射弹(bolistic)(即将核酸装载到金或其他金属颗粒上并且射击或注入细胞中)。
[0112] 电穿孔是一种将电场施加到细胞以增加细胞膜通透性的技术，允许化学品、药物或DNA被引入细胞。在这个过程中通常在几毫米的距离中使用几百伏特电压。技术人员可以容易地使用标准尝试与错误实验来确定给定精子样品的最佳电穿孔条件。Gagne等人(1991)描述了牛精子如何被电穿孔的实例，而Nakanishi和Iritani(1993)描述了鸡精子如何能被电穿孔的实例。
[0113] 如本文所用，术语“转染剂”是指用于增强精子摄入可编程核酸酶的组合物。尽管可以使用本领域已知的适合转染真核细胞的任何转染剂，但是本发明人已经发现包含阳离子脂质的转染剂在本发明的方法中特别有用。
[0114] 在一个实施方案中，单价阳离子脂质选自以下的一种或多种：DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1,2-双(油酰基氧基)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵)或DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)。优选的多价阳离子脂质是脂精胺(Lipospermine)，特别是DOSPA(2,3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐)和DOSPER(1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙酰胺，以及二和四烷基四甲基精胺，包括但不限于TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油烯基精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)和TMDOS(四甲基二油烯基精胺)。阳离子脂质任选地与非阳离子脂质，特别是中性脂质组合，例如如下脂质：DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇。由DOSPA和DOPE 3:1(w/w)的混合物或DOTMA和DOPE 1:1(w/w)的混合物组成的阳离子脂质组合物通常用于本发明的方法中。合适的商业可得的包含阳离子脂质的转染剂的非限制性实例包括Lipofectamine(Life Technologies)和Lipofectamine 2000(Life Technologies)。
[0115] 例如第5代或更高代(G5或更高)的树状聚体(dendrimer)可以用作转染剂，其中G5-G10之间的代是特别感兴趣的。可用于本发明的树状聚体包括具有NH3或乙二胺核的树状聚体、GX(NH3)或GX(EDA)，其中X＝代数。其中优选X＝5-10的树状聚体。可用于本发明的树状聚体包括其中内层的重复单元为酰胺(以形成聚酰胺，即PAMAM)的树状聚体。有用的树状聚体包括其中所述树状聚体的外表面处的末端官能团(例如像末端氨基官能团一样)提供正电荷密度的树状聚体。树状聚体外表面的表面电荷和化学性质可以通过改变表面上的官能团来改变，例如通过部分或全部表面氨基的反应。特别感兴趣的是通过与阳离子氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)反应而官能化的树状聚体。在例如WO 96/22321和WO 96/31549中描述，并在US5,266,106中提及的接枝的树状聚体可用于本发明的方法中。活化的树状聚体(Haensler and Szoka,1993；Tang et al.,1996)也可用于本发明的方法中。
[0116] 转染剂的其他实例包括二甲基亚砜DMSO和Triton-X。
[0117] 转染剂可进一步包含来自病毒、细菌或动物蛋白和其他来源的肽序列，包括可增强转染剂(包括阳离子脂质和树状聚体)介导的真核细胞转染效率的肽、蛋白质或其片段或部分。这种肽描述于US20030069173中，并且包括例如流感病毒、腺病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、HIV、肝炎、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒或猿猴病毒40的病毒肽或蛋白质，更具体地包括前述每一种的RGD-肽序列、NLS肽序列和/或VSVG-肽序列以及修饰的肽或蛋白。
[0118] 可编程核酸酶可根据制造商的说明书或已知方案与转染剂混合(或“复合”)。在可编程核酸酶例如通过一个或多个RNA、DNA和杂种RNA/DNA序列编程的情况下，根据制造商的说明书或已知方案，可编程核酸酶和一个或多个编程序列可以独立地或共同地与转染剂混合(或“复合”)。举例来说，当转染通过一个或多个序列(与核酸酶物理分离的)编程的可编程核酸酶时，可将30μL的Lipofectamine 2000CD转染剂(Invitrogen，Life Technologies)与200μL的Opti-Pro培养基组合。可将Cas9mRNA(8μg)与100μl Opti-Pro培养基组合。可将约4μg向导RNA(gRNA)与100μl Opti-Pro培养基结合。可将115μl lipofectamine 2000CD+Opti-Pro培养基溶液分别加入到mRNA和gRNA混合物中。然后可将所得混合物在室温下孵育5至30分钟。然后可将合适体积的转染混合物递送至精子。本领域技术人员将会理解，根据本说明书的教导，可以优化用于混合转染剂和可编程核酸酶以及递送至精子的方案。
[0119] 在一个实施方案中，在用精子对卵子受精前，将可编程核酸酶和精子在包含转染剂的组合物中孵育至少5、或至少10、或至少15、或至少20、或至少25、或至少30分钟。
[0120] 用精子给卵子受精
[0121] 可以使用任何标准的受精方法来进行用精子使卵子(在本领域中通常称为蛋)受精的步骤。卵子可以在体外受精(即体外受精)，然后植入雌性动物(其可能是或可能不是卵子的来源)。受精卵(合子)可以短时间培养以产生胚泡，然后植入雌性动物中。或者，通过用包含可编程核酸酶的精子授精雌性动物，使卵子在体内受精(即人工授精)。
[0122] 该步骤可以使用单个卵子或多个卵子。
[0123] 体外受精和非人类动物的人工授精方法在本领域中是众所周知的。
[0124] 生成遗传修饰的动物
[0125] 允许包含受精卵的雌性正常孕育并生下后代。如本文所述，可以使用本领域已知的标准技术筛选后代的遗传修饰。
[0126] 后代可以被允许成熟并用于繁殖包含靶向遗传修饰的子代。在一个实施方案中，使用可编程核酸酶产生的动物对于遗传修饰是杂合的。在这种情况下，在优选的实施方式中，(第一)动物与相同物种的第二动物杂交，所述第二动物也对于靶向遗传修饰是杂合的。在这种情况下，第一和第二动物可以是兄弟姐妹，或者可以是使用本发明的方法，使用两种不同的亲本雌性动物产生动物的结果。通常在该实例中，筛选后代以鉴定对于靶向遗传修饰是杂合的后代。
[0127] 正如本领域技术人员将会意识到的，在一些动物中，多个后代由同一亲本(或代孕)产生。在一个实施方案中，当进行本发明时使用多种不同的亲本(或代孕)动物。
[0128] 可编程核酸酶
[0129] 如本文所用，术语“可编程核酸酶”涉及可“靶向”(“编程”)以识别和编辑基因组中的预定位点的核酸酶。当根据本发明递送至精子时，核酸酶已经被适当地编程，使得它能够将遗传修饰引入精子和/或卵子(一旦精子已经用于使卵子受精)的DNA。
[0130] 在一个实施方案中，可编程核酸酶可以在预定的位置诱导位点特异性DNA切割。在一个实施方案中，可编程核酸酶可以被编程以识别具有DNA结合蛋白结构域或DNA结合蛋白结构域的组合的基因组位置。在一个实施方案中，可编程核酸酶可以被编程以通过DNA结合锌指蛋白(ZFP)结构域的组合来识别基因组位置。ZFP识别DNA序列中特定的3-bp，ZFP的组合可用于识别特定基因组位置。在一个实施方案中，可编程核酸酶可以被编程以通过类转录激活因子效应物(TALE)DNA结合结构域识别基因组位置。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以被编程为通过一个或多个RNA序列识别基因组位置。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过一个或多个DNA序列进行编程。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过一个或多个杂种DNA/RNA序列进行编程。在一个替代实施方案中，可编程核酸酶可以通过RNA序列、DNA序列和杂种DNA/RNA序列中的一个或多个进行编程。
[0131] 根据本公开可以使用的可编程核酸酶包括但不限于源自细菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统的RNA向导的工程核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)和argonaute。
[0132] 在一个实施方案中，可编程核酸酶是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶(Barrangou，2012)。CRISPR是一种涉及防御侵入的噬菌体和质粒的微生物核酸酶系统。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因的组合，以及能够编程CRISPR介导的核酸切割的特异性的非编码RNA元件。在广泛的细菌宿主中已鉴定出三种类型的CRISPR系统(I-III)。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在一系列重复序列(直接重复序列)，其被短段的非重复序列(间隔区)分隔。非编码CRISPR阵列在直接重复序列内被转录并切割成含有单独的间隔区序列的短crRNA，其将Cas核酸酶引导至靶位点(前间区)。
[0133] II型CRISPR在四个连续步骤中执行靶向DNA双链断裂(例如参见Cong et al.,2013)。首先，从CRISPR基因座转录两种非编码RNA(pre-crRNA阵列和tracrRNA)。其次，tracrRNA与pre-crRNA的重复区域杂交，并介导pre-crRNA加工成含有单独间隔区序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA：tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔区与前间区序列邻近基序(PAM)旁边的靶DNA上的前间区之间的Wastson-Crick碱基配对，将Cas9引导至靶DNA，这是靶识别的额外要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割，从而在前间区内产生双链断裂。CRISPR系统也可用于在基因组中产生单链断裂。因此，CRISPR系统可用于RNA向导的(或RNA编程的)位点特异性基因组编辑。
[0134] 在一个实施方案中，核酸酶是RNA向导的工程核酸酶(RGEN)。在一个实施方案中，RGEN来自古细菌基因组或是其重组版本。在一个实施方案中，RGEN来自细菌基因组或是其重组版本。在一个实施例中，RGEN来自I型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一个实施方案中，RGEN来自II型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一个实施方案中，RGEN来自III型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一个实施方案中，核酸酶是I类RGEN。在一个实施方案中，核酸酶是II类RGEN。在一个实施方案中，RGEN是多成分酶。在一个实施方案中，RGEN是单成分酶。在一个实施方案中，RGEN是CAS3。在一个实施方案中，RGEN是CAS10。在一个实施方案中，RGEN是CAS9。在一个实施例中，RGEN是Cpf1。在一个实施方案中，RGEN被单一RNA或DNA靶向。在一个实施方案中，RGEN被多于一种RNA和/或DNA靶向。在一个实施方案中，RGEN是重组和/或高保真核酸酶。
[0135] 在一个实施方案中，可编程核酸酶可以是类转录激活因子效应物(TALE)核酸酶(参见例如Zhang et al.,2011)。TALE是来自植物病原体黄单胞菌属的转录因子，其可以容易地改造来结合新的DNA靶标。TALE或其截短版本可以与内切核酸酶如Fokl的催化结构域连接以产生称为TALE核酸酶或TALEN的靶向内切核酸酶。
[0136] 在一个实施方案中，可编程核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施方案中，ZFN的每个单体包含3个或更多个基于锌指的DNA结合结构域，其中每个基于锌指的DNA结合结构域与3bp亚位点结合。在其他实施方案中，ZFN是嵌合蛋白，其包含可操作地连接至独立核酸酶的基于锌指的DNA结合结构域。在一个实施方案中，独立的内切核酸酶是FokI内切核酸酶。在一个实施方案中，核酸酶试剂包含第一ZFN和第二ZFN，其中第一ZFN和第二ZFN中的每一个可操作地连接至FokI核酸酶，其中第一和第二ZFN识别靶DNA序列的每条链中的两个连续靶DNA序列，其被约6bp至约40bp切割位点或约5bp至约6bp切割位点分开，并且其中FokI核酸酶二聚化并形成双链断裂(参见例如US20060246567、US20080182332、US20020081614、US20030021776、WO/2002/057308、US20130123484、US20100291048和WO/2011/017293)。
[0137] 在一个实施方案中，可编程核酸酶可以是DNA编程的argonaute(WO14/189628)。原核和真核argonaute是参与RNA干扰途径的酶。argonaute可以通过与设计的核酸靶向酸形成复合物，结合和切割靶核酸。切割可以在靶核酸中引入双链断裂，其可以通过非同源末端连接机制进行修复。可以引导DNA“向导”或“编程”argonaute在DNA中的预定位置引入双链DNA断裂。
[0138] 性状
[0139] 与缺乏遗传修饰的同基因动物相比时，本发明的方法通常引入靶向种系遗传修饰以改变动物的性状。可以修饰的性状的实例包括但不限于疾病恢复力、肌肉发育(包括肌肉质量)、骨骼发育、变应原性、性别和营养含量。
[0140] 在一个实施方案中，所述动物是哺乳动物，并且所述性状可以是性别、青春期年龄、繁殖潜力、出生体重、寿命、目标时间点的对象体重、平均断奶重量、增重率、达到目标体重的天数、肉质、饲料效率、肌肉含量、肌肉质量、脂肪含量(瘦肉)、抗病性、疾病易感性、采食量、蛋白质含量、骨含量、维持能量需求、成熟大小、氨基酸谱、脂肪酸谱、应激易感性和反应、消化能力和肌肉生长抑制素活性、脂肪沉积模式、能育性、排卵率、最佳饮食、受孕率或治疗性蛋白质的产生。
[0141] 在另一个实施方案中，所述动物是禽类，并且所述性状可以是性别、产蛋量、饲料效率、存活率、肉产量、寿命、白肉产量、黑肉产量、抗病性、疾病易感性、最佳饮食到成熟时间、达到目标体重时间、目标时间点的体重、平均日增重、肉质、肌肉含量、肌肉质量、脂肪含量、采食量、蛋白质含量、骨含量、维持能量需求、成熟大小、氨基酸谱、脂肪酸谱、应激易感性和反应、消化能力、肌肉生长抑制素活性、脂肪沉积模式、能育性、排卵率或受孕率。在一个实施方案中，所述性状是对沙门氏菌感染、腹水和李斯特氏菌感染的抗性。蛋性状可以是无过敏原、质量、尺寸、形状、保存期、新鲜度、胆固醇含量、颜色、生物素含量、钙含量、蛋壳质量、蛋黄颜色、卵磷脂含量、蛋黄数量、蛋黄含量、蛋白含量、维生素含量、维生素D含量、营养密度、蛋白质含量、蛋清含量、蛋白质质量、抗生物素蛋白含量、脂肪含量、饱和脂肪含量、不饱和脂肪含量、内部蛋质量、血斑数量、气室尺寸、等级、水华特征、卵黄细带患病率或外观、剥皮容易度、限制蛋的可能性、沙门氏菌含量。
[0142] 在一个实施方案中，疾病恢复力由编码结合导致疾病的病原体蛋白质的抗体的转基因赋予。
[0143] 可作为靶向修饰疾病恢复力性状的基因的实例包括病毒受体，例如禽白血病病毒的Tva受体和其他蛋白质如天然抗性相关巨噬细胞蛋白1(Nramp-1)(Zekarias et al.，2002)、PrP、v-rel禽类网状内皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、β-酪蛋白(βCN)、溶葡萄球菌素(LSS)和溶菌酶(LZ)(Laible et al.，2014)。
[0144] 在另一个实例中，将编码病原体抑制性多核苷酸和/或由其编码的多肽的转基因插入基因组中。病原体抑制性多核苷酸可以是例如shRNA或反向多核苷酸。例如，转基因可编码多种抗禽流感病毒shRNA，如WO2008/138072和WO 2014/138792中所述。在另一个实例中，抑制性多核苷酸是口蹄疫病毒(FMD)shRNA或朊病毒蛋白(PrP)shRNA(Laible et al.，2014)。
[0145] 可以靶向的病原体的实例包括病毒、细菌、真菌、原生动物、线虫和感染性蛋白质(朊病毒)。病毒的实例包括流感病毒、禽白血病病毒、蓝舌病毒、新城疫病毒、鸡贫血病毒、传染性法氏囊病病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、古典猪瘟病毒(classical swine fever virus)、蓝舌病毒、阿卡班病毒(akabane virus)、传染性造血器官坏死病病毒(infectious hematopoietic necrosis virus)、病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus)、罗斯河病毒(ross river virus)和传染性胰腺坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus)。
[0146] 细菌的实例包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、钩端螺旋体属(Leptospira)、Anaplama ovis、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、关节液支原体(Myoplasma synoviae)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、败毒梭菌(Clostridium septicum)、鹌鹑梭菌(Clostridium colinum)、雏白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、鸡沙门氏菌(Salmonella
gallinarum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、Hemophilus gallinarum、诡谲丹毒丝菌(Erysipelothrix insidiosa)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
gallinarum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、Hemophilus gallinarum、诡谲丹毒丝菌(Erysipelothrix insidiosa)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
[0147] 真菌的实例包括小孢子菌属物种(Microsporum spp)、曲霉属物种(Aspergillus spp)、隐球酵母属物种(Cryptococcus spp)、金孢子菌属物种(Chrysosporium spp)、发癣菌属物种(Trichophyton spp)、Enterocytozoon spp、镰刀菌属物种(Fusarium spp)、鳞斑霉属物种(Malassezia spp)、小孢霉子菌属物种(Microsporum spp)、被孢霉属物种(Mortierella spp)、Phaeohyphomycosis spp、假丝酵母属物种(Candida spp)和Histoplasmosis spp。
[0148] 原生动物的实例包括球虫(Coccidia)和禽组织滴虫(Histomanas meleagridis)。
[0149] 线虫的实例包括鸡异刺线虫(Heterakis gallinae)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、环纹背带线虫(Teladorsagia circumcincta)、毛圆线虫(Trichostrongylus spp)和短古柏线虫(Cooperia curticei)。
[0150] 可以靶向修饰作为禽类性状的肌肉发育的基因的实例包括肌肉生长抑制素(MSTN)、生长分化因子-8(GDF-8)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、肌原细胞分化1(MyoD1)、生长激素(GH)、生长激素释放因子(GRF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、c-ski、白介素-15(IL-15)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)(US7732571、WO1991000287、WO1996037223、WO2007062000、US7732571)。
[0151] 可以靶向修饰作为性状的骨骼发育的基因的实例包括ALX同源异型框1(ALX1)和IGF1。
[0152] 可以靶向修饰作为性状的变应原性的基因的实例包括卵类粘蛋白(Gald1)、卵清蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白、卵黄蛋白、apovitillin、鸡血清白蛋白和YGP42以及卵黄高磷蛋白(Dhanapale et al.，2015)。
[0153] 可以靶向修饰作为性状的性别的基因的实例包括doublesex和mab-3相关转录因子1(DMRT1)、PKC抑制剂/相互作用蛋白(WPKCI)的改变形式、R-spondin、叉头框L2(FOXL2)、FOX9、芳香化酶、抗苗勒氏管激素(AMH)和β-连环蛋白。
[0154] 可以靶向修饰营养含量和/或动物衍生食物的基因的实例包括酪蛋白、β-乳球蛋白(BLG)、α-乳白蛋白(αLac)、乳铁蛋白(LF)、溶菌酶(LZ)、Fat-1、MSTN、GH、GRF、中间丝角蛋白(IF)、脂肪酸去饱和2(FAD2)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)和肌醇六磷酸酶(Laible et al.，2014)。
[0155] 在一个实施方案中，转基因可编码治疗性蛋白质。在一个实例中，治疗性蛋白质是抗体。治疗性蛋白质的其他实例包括C1抑制剂(Ruconest)、抗凝血酶(ATryn)、人血清白蛋白、α1抗胰蛋白酶、蜘蛛丝蛋白和人丁酰胆碱酯酶(Maksimenko et al.，2013)。实施例
[0156] 实施例1：鸡的靶向种系修饰
[0157] 材料和方法
[0158] CRISPR、TALEN和同源重组构建体评估
[0159] 使用表达GFP的PGC和成纤维细胞系，在使用前预筛选靶向GFP的TALEN和CRISPR以鉴定有效向导序列并比较CRISPR和TALEN的效率。
[0160] 简而言之，使用稳定表达GFP的鸡成纤维细胞DF-1细胞筛选针对GFP和DMRT1的候选CRISPR向导RNA。使DF-1细胞在5％CO2、含有4.5g/l葡萄糖、1.5g/l碳酸氢钠、10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、补充有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM)中生长。按照制造商(Thermo Fisher)说明书，使用Lipofectamine2000CD将分别含有Cas9基因和候选向导序列的质粒转染到GFP DF-1细胞中。
[0161] 使用含有靶向GFP的向导序列的质粒转染细胞群，同时用含有靶向GFP和DMRT1的向导序列的质粒共转染另一群。在装有488nm激光器和530/30发射滤光器的BD FACSAria II流式细胞仪(BD Biosciences，USA)上，对细胞进行GFP表达分选。根据制造商(Qiagen)方案，从非绿色细胞群中分离DNA，对细胞群进行PCR以扩增GFP或DMRT1(表1)。
[0162] 在1.2％TAE琼脂糖凝胶上分析PCR产物以确定扩增子的长度。使用GelQuant软件(biochemlabsolutions.com)评估凝胶条带强度。将PCR产物克隆到pGEM-Teasy质粒载体中并送测序(Micromon，Monash University，Melbourne，Australia)。
[0163] CRISPR mRNA和向导RNA制备
[0164] Cas9mRNA购自Sigma-Aldrich。使用Ambion T7MEGAshortscriptTM试剂盒，按照制造商的方案从质粒合成向导RNA。
[0165] 动物
[0166] 公鸡和母鸡被安置在有厚垫草的鸡圈中，并且可以随意取水并取食商业肉鸡饮食。它们保持在8/16暗/光周期中。每天收集蛋并保持在15℃，直到置于37℃的孵化器中。所有孵出的雏鸟共同饲养在带有提供温暖的加热灯的鸡圈中，并可随意取食商业雏鸟饲料。
[0167] RNA/lipofectamine孵育
[0168] 将CRISPR-30μl lipofectamine 2000CD与200μl Opti-Pro培养基组合。将Cas9mRNA(8μg)与100μl Opti-Pro培养基组合。对于GFP敲除，使用两种向导RNA并将2μg的每种向导RNA(gRNA)(SEQ ID NO 6和7)与100μl的Opti-Pro培养基组合。将Lipofectamine 2000CD+Opti-Pro培养基溶液(115μl)分别加入到mRNA和gRNA混合物中。所得混合物在室温下孵育5至30分钟。
[0169] 对于DMRT1敲除实验，一半的授精使用两种gRNA(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)中的每种2μg进行，而另一半使用4μg的向导序列1(SEQ ID NO：16)和100μM设计的同源性定向修复(HDR)寡核苷酸(SEQ ID NO：18)，两种组合均在100μl Opti-Pro培养基中制备。
[0170] 在Opti-Pro培养基中稀释Cas9mRNA和gRNA/寡核苷酸后，将115μl前述组合的Lipofectamine 2000CD+Opti-Pro培养基溶液加入到Cas9mRNA和gRNA/寡核苷酸混合物中。将所得混合物在室温下单独孵育5至30分钟，然后与洗涤后的精子组合。
[0171] 精液收集
[0172] 在实验开始前，所有公鸡均采用Lake(1957)的改良方法接受精液收集训练。简而言之，训练有素的工作人员会抚摸鸟的背部，另一名工作人员会从泄殖腔中收集精液。对于GFP实验，收集来自GFP和野生型公鸡的精液并单独汇集，而对于DMRT1实验，所有公鸡都是野生型，因此汇集所有精液。
[0173] 精子制备
[0174] 从半合子的GFP公鸡中收获精液，其产生50％GFP精子，而WT公鸡的精子中没有GFP。WT和GFP精液分开处理。将精子在Lakes稀释剂中通过20℃以300g离心12分钟洗涤两次。在洗涤后，将之前制备的mRNA/lipofectmine、gRNA/lipofectmine、在Opti-Pro培养基中稀释的混合物加入到每个精子样品(精子和PGE混合物)中，并在4℃孵育30分钟。
[0175] 授精
[0176] 使用注射器对母鸡进行人工授精，将100μl至150μl的精子和PGE混合物递送至泄殖腔。将GFP精子授精至WT母鸡( WT♀)，而WT精子授精至GFP母鸡( GFP♀)。以3至7天的间隔连续进行六次人工授精。对于DMRT1实验，连续12次使用WT公鸡和母鸡进行授精。在授精后收集蛋(卵子)并在15℃孵育不超过7天，然后在37℃孵育直至筛选。
[0177] 筛选
[0178] 胚胎第2.5天筛选
[0179] 在胚胎发育的第2.5天筛选一部分蛋，范围从Hamburger Hamilton阶段14到17(Hamburger和Hamilton，1951)。对光检查蛋，在能育蛋上开一个小窗口以目视筛选它们的GFP表达。使用Leica DFC 290数码相机在Leica MZ95显微镜上拍摄正在发育的胚胎的照片，然后收集胚胎用于DNA分析。从2个表达GFP的胚胎和所有不表达GFP(WT表型)胚胎收集血液样品。蛋被重新密封并放回到培养箱中。在胚胎发育的第7天，所有GFP基因PCR阳性(PCR+)的样品用于胚胎性腺的细胞点样(cyto-spotting)。
[0180] 胚胎第7天筛选
[0181] 在胚胎发育的第7天，对来自GFP实验的一部分蛋进行筛选。在能育蛋上开一个小窗口，以目视筛选它们的GFP表达。使用具有Leica DC 300F数码相机的Leica DMLB荧光显微镜拍摄整个胚胎和胚胎性腺的明场和荧光照片。从选定的表达GFP的胚胎和所有不表达GFP(WT表型)胚胎收集组织样品。
[0182] 胚胎第11天筛选
[0183] 在胚胎发育的第11天对来自GFP和DMRT1实验的一部分蛋进行筛选。首先对光检查所有的蛋以确定能育性，并且在能育蛋上开一个小窗口。对于DMRT1实验，从蛋中取出胚胎，并取一小部分发育中的翅或腿进行DNA提取和PCR分析性别(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)。使用Leica MZ95显微镜和Leica DFC 290数码相机拍摄性腺并取生殖巢的样品。对于GFP实验，在能育蛋上开一个小窗口以目视筛选GFP表达之后，从选定的表达GFP的胚胎和所有不表达GFP(WT表型)的胚胎收集用于显微镜检查和DNA分析的组织样品。使用带有Leica DC 300F数码相机的Leica DMLB荧光显微镜，使用4X物镜拍摄收集组织的明场和荧光照片，其中一些样品使用20X和40X物镜进行进一步研究。
[0184] 7日龄雏鸟筛选
[0185] 将来自GFP实验的一部分蛋孵化并目视筛选雏鸟的GFP表达。所有WT表型雏鸟和2只表达GFP的雏鸟养至7日龄时安乐死，尸体解剖，收集性腺、肌肉、肠和皮肤组织样品。使用具有Leica DC 300F数码相机的Leica DMLB荧光显微镜在4X放大倍数下拍摄收集组织的明场和荧光照片，其中一些样品在20X和40X放大倍数下进一步研究。
[0186] 来自血液和组织样品的PCR
[0187] 根据制造商的方案(Qiagen，DNeasy Blood&Tissue Kit(目录号：69504))，从血液和组织样品中分离基因组DNA。针对以下设计了PCR引物：两个CRISPR向导RNA的GFP 5'和3'(正向5'-AGCCTCTGCTAACCATGTTC-3'(SEQ ID NO：8)，反向5'-CGTCCATGCCGTGAGTGATC-3'(SEQ ID NO：9))，以及鸡β-肌动蛋白(正向5'-CAACACAGTGCTGTCTGGTGG-3'(SEQ ID NO：10)，反向5'-ATCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3'(SEQ ID NO：11))，和两个DMRT1向导序列(正向5'AGCAAGCCCAGGAAGAGGAG 3'(SEQ ID NO：12)，反向5'GTTCCAGTGTAGTGCAGGAG 3'(SEQ ID NO：13))。使用GoTaq Green Master Mix(Promega)、100ng基因组DNA和终浓度为0.5μM的引物进行PCR。循环条件为94℃2分钟的初始变性步骤，然后是30个循环的94℃变性30秒、60℃退火30秒和72℃延伸1分钟。将PCR产物在4℃储存，直至在1.2％琼脂糖凝胶上电泳(图1A和B)。
[0188] 组织显微镜检查
[0189] 将从第7天和第11天胚胎收集的组织样品用于显微镜检查。使用GFP滤光片，在放大倍数为4X的情况下，在倒置显微镜(Leica)下，在明场和荧光条件下拍摄来自第11天胚胎的组织(图2)。
[0190] 测序
[0191] 将PCR产物克隆到PGem质粒中并测序(Micromon，Melbourne Australia)。使用Clone Manager 9Professional Edition对序列与来自于表达GFP的鸡和用于产生GFP鸡系的原始质粒的对照序列进行比对(图2)。而对于DMRT1研究，对照样品得自对照授精产生的没有基因编辑成分的胚胎。作为GFP实验中的额外对照，对来自祖辈公鸡的GFP基因和来自GFP表达系的镶嵌起始公鸡进行测序，而对于DMRT1项目，对能育鸡中的DMRT1基因进行测序。另外，在来自GFP实验的选定的胚胎和雏鸟中，对DMRT1基因进行测序。
[0192] 结果
[0193] CRISPR向导序列鉴定
[0194] 体外实验鉴定了有效切割GFP基因的2条CRISPR向导序列(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)，且2条向导序列彼此相距约165个碱基对，其中切割的DMRT1基因被鉴定出(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)。对于GFP实验，大约4％的用2条向导序列转染的DF-1细胞表现得不再表达GFP(未发表结果)。对来自表现得不再表达GFP的细胞池的GFP PCR产物的凝胶条带强度进行分析表明，那些细胞中的85.5％仍保留全长转录物，而14.5％具有比全长转录物短约240个碱基对的截短转录物(图1C)。对于DMRT1DF-1实验，来自共选细胞池的PCR结果表明大约90.7％的细胞保留了全长转录物，而9.3％具有比全长转录物短约165个碱基对的截短转录物(图1C)。
[0195] 来自DF-1细胞的测序结果
[0196] 对来自GFP细胞培养实验的全长和截短转录物的样品进行测序。8个全长转录物中的3个在CRISPR位点上游或下游的100个碱基对范围内具有单碱基对突变(图6)。其余5个样品没有突变，可能来自低GFP表达的细胞，其在流式细胞术中被错误表征。截短转录物在两个CRISPR位点之间缺少DNA区域，表明两个CRISPR都能够切割并且两者之间的DNA段缺失。
[0197] 对于DMRT1实验，全长和截短转录物也被送去测序。送去的7个全长转录物中都含有突变。六个样品在第一CRISPR位点具有突变，且六个样品中一个样品在第二CRISPR位点也有单碱基对突变，这是第二CRISPR位点发现的唯一突变。在第一CRISPR位点突变的六个样品中，有四个在CRISPR位点上游和下游的5到150个碱基对之间也有额外的单碱基对突变。在第一CRISPR位点没有突变的一个样品在第一CRISPR位点上游约35个碱基对处有单碱基对突变(图7)。截短转录物在两个CRISPR位点之间缺少DNA区域，表明两个CRISPR都能够切割并且两者之间的DNA区域缺失。
[0198] GFP
[0199] 祖辈、亲本和同龄组测序
[0200] 对来自GFP鸡系的镶嵌起始公鸡、祖辈公鸡、亲本公鸡以及实验期间产生的表达GFP的胚胎和鸟类的测序，表明GFP基因中没有突变(表1和图8)。
[0201] GFP♀组
[0202] GFP♀授精产生了111个蛋，其中所有蛋均在胚胎第7天(ED 7)进行筛选。这些蛋中有18个(16％)在ED7存活，这18个中有13个具有GFP表型、5个具有WT表型(表2)。WT表型胚胎中的1个的GFP基因是PCR阳性的。显微镜检查显示胚胎具有一致的WT表型，并且测序表明了GFP区域中的DNA突变(表1，图3和图4)。
[0203] WT♀组
[0204] WT♀授精总共产生了159个蛋。其中19个在ED7进行筛选，12个(63％)被发现存活，其中8个具有GFP表型，4个具有WT表型(表2)。WT表型胚胎的GFP基因均不是PCR阳性。在胚胎第11天(ED 11)筛选80个蛋，其中32个(40％)在ED 11存活，并且在那32个中，11个表达GFP并且21个具有WT表型。PCR显示21个WT表型胚胎中有4个的GFP基因是PCR阳性的(表2)。
[0205] 荧光显微镜检查显示4个PCR阳性的ED 11胚胎中，3个被证实具有一致的WT表型(图3和图4)，而1个是镶嵌的(数据未显示)，并且测序表明了所有这4个胚胎中的GFP区域中的各种DNA突变，然而在镶嵌胚胎中都发现了突变和野生型序列(表2)(图4)。剩下的60个蛋被孵化出来，其中11个孵化存活，5个显著发育但未孵出(FTH)。在16个雏鸟/FTH胚胎中，目视筛选显示8个表达GFP、8个具有WT表型。在具有WT表型的8个中，2个对于GFP(一个雏鸟和一个FTH胚胎)为PCR阳性，并且荧光显微镜检查显示两者具有一致的WT表型(图3和图4)，同时测序显示GFP区域中的各种DNA突变(表1)。
[0206] 表1:样品中发现的突变列表
[0207]
[0208]
[0209] +表示阳性对照
[0210] *样品1-15是嵌合的并且还含有非突变GFP的序列。
[0211] 通过ATG起始位点计算GFP的CRISPR和突变位置，从DMRT1外显子2的开始计算DMRT1的CRISPR和突变位置。
[0212] 表2.能育性，表型和基因型结果
[0213]
[0214] *FTH表示显著发育但未能孵化的胚胎。
[0215] NV表示不存活的胚胎。
[0216] 筛选出总共143个第11天的蛋，其中53个发现有存活胚胎。由 WT♀授精产生的32个存活胚胎和由 GFP♀授精产生的21个存活胚胎(表2)。目视筛选衍生自WT♀的胚胎中，11个表达GFP且21个有WT表型，而 GFP♀胚胎中，10个表达GFP且11个有WT表型。PCR显示来自 WT♀组的21个WT表型胚胎中，5个GFP基因是PCR阳性的。来自GFP♀组的11个WT表型胚胎中，1个GFP基因是PCR阳性的(图1)。
[0217] 在PCR阳性胚胎上进行荧光显微镜检查以确认WT表型。在6个PCR阳性胚胎中，5个被证实具有WT表型(图2A)，而1个是嵌合型(图2B)。对具有WT表型或嵌合表型的PCR阳性胚胎以及作为阳性对照的GFP表型动物的含有GFP基因的基因组区域进行测序。测序显示起始密码子中的突变以及突变+24、-5、-10和-15(图3)。
[0218] 来自GFP实验的能育鸡群和子代的测序
[0219] 对来自对照授精中产生的胚胎的测序和对来自能育鸡群的测序显示DMRT1基因中没有突变。对选定的表现GFP突变的胚胎进行测序，显示在DMRT1中也没有突变(表1和图9)。
[0220] DMRT1gRNA 1和2
[0221] 包括DMRT1gRNA1和2的授精总共产生了249个蛋。其中在胚胎第2.5天(ED2.5)筛选出93个蛋，61个(66％)被归类为存活胚胎，3个(3％)为不存活的，29个(31％)为不育的。从所有存活的和早期死亡的胚胎制备DNA样品，产生64个样品。PCR分析后，来自ED 2.5组的6个样品被送去测序，但没有一个在DMRT1区域中发现具有突变。剩余的156个蛋于ED11筛选，58个(37％)被归类为存活胚胎，14个(9％)为不存活的，84个(54％)为不育的。从所有存活的胚胎制备DNA样品并进行性别的表型和基因型评估。表型评估确定有20个雌性(34.5％)，
35个(60.5％)雄性和3个(5％)未分类胚胎，而基因型评估显示有29个雌性(50％)和29个(50％)雄性胚胎，意味着多个雌性胚胎被错误分类为雄性，并且3个未分类的胚胎都是雌性。PCR分析后，将来自ED 11组的16个样品送去测序，没有发现在DMRT1区域中具有突变的样品。
35个(60.5％)雄性和3个(5％)未分类胚胎，而基因型评估显示有29个雌性(50％)和29个(50％)雄性胚胎，意味着多个雌性胚胎被错误分类为雄性，并且3个未分类的胚胎都是雌性。PCR分析后，将来自ED 11组的16个样品送去测序，没有发现在DMRT1区域中具有突变的样品。
[0222] DMRT1gRNA 1和HDR寡核苷酸
[0223] 包括gRNA 1和HDR寡核苷酸的授精总共产生了286个蛋。其中在ED2.5时筛选出92个蛋，70个(76％)被归类为存活胚胎，1个(1％)为不存活的，19个(21％)为不育的，2个(2％)蛋在打开时由于操作员失误而未能分类(表2)。只可从存活的胚胎制备DNA样品，产生70个样品。PCR分析后，将来自ED2.5组的15个样品送去测序，并且发现3个在DMRT1区域中具有突变，然而没有一个发现整合有HDR寡核苷酸(表1和图1C)。基因型评估表明，编辑的胚胎中有2个是雄性，1个是雌性。在含有DMRT1突变的胚胎中没有明显的表型差异(图5)，然而其中一个DMRT1突变的胚胎在收集期间受损，所以没有显微图像可用。其余194个蛋在ED 11筛选。其中筛选出的这68个(35％)被归类为存活胚胎，6个(3％)被归类为不存活的，120个(62％)归类为不育的(表2)。从所有存活胚胎和1个不存活胚胎制备DNA样品并进行性别的表型和基因型评估，产生69个样品。其中33个(48％)表型分类为雌性，30个(43％)表型分类为雄性，6个(9％)未分类(5个由于样品采集过程中操作者失误)。基因型评估显示37个(54％)胚胎是雌性，32个(46％)是雄性。1个真正的未分类的胚胎是基因型雌性，而5个操作者失误的胚胎中2个是雄性，3个是雌性。PCR分析后，将来自ED 11组的3个样品送去测序，并且没有一个发现在DMRT1区域中具有突变。
[0224] 讨论
[0225] 由本发明人在鸡中进行精子转染辅助基因编辑方法(STAGE方法)的检测工作，并采用Lipofectamine转染系统将CRISPR/Cas9工具递送到精子胞质溶胶中。在GFP实验中，STAGE方法证明是有效的，平均效率为14％。发现观察到的一些编辑与CRISPR位点相距50至200个碱基对。还观察到多个单碱基对改变和多碱基对插入。
[0226] 当使用STAGE靶向DMRT1时，在4个组中的一组中观察到突变，其是用单个DMRT1CRISPR向导序列(向导序列1；SEQ ID NO：16)和HDR寡核苷酸靶向的第2.5天胚胎。就所观察到的突变类型而言，DMRT1的结果与GFP实验中的观察到的结果相似，其中一些突变发生在CRISPR位点上游直至60个碱基对处。这些结果与用DMRT1CRISPR向导序列靶向的培养细胞中观察到的结果相似，其在CRISPR位点外也显示出单碱基突变和多碱基缺失。但是，大多数样品还包含存在于DMRT1CRISPR向导序列1位点中的编辑。值得注意的是，敲除DMRT1功能有可能是致死的，DMRT1编辑的胚胎在胚胎发生早期可能已经死亡。由于第11天胚胎的初始筛选涉及对蛋进行对光检查以观察发育中的血管结构，因此可能在粗壮的血管系统发育之前死亡的胚胎可能被错误地表征为不育并且未被采样。能育性数据表明，第11天组中至少有一些在胚胎发生早期死亡的胚胎可能以这种方式被错误分类，因为在第2.5天筛选的蛋的平均能育性为72％(其中70％归类为存活，2％为早期死亡)，而第11天筛选的平均能育性仅为42％(其中36％为存活，6％为死亡)。只有在递送1DMRT1CRISPR向导序列(向导序列1；SEQ ID NO：16)中观察到的突变能够表明STAGE需要某个阈值数量的向导序列。此外，来自细胞培养实验的数据显示，86％的来自递送了两种向导序列的细胞的全长测序的转录物在DMRT1向导序列1CRISPR位点中具有编辑，而仅有14％在向导序列2(SEQ ID NO：17)CRISPR位点中具有编辑。这表明DMRT1向导序列1通常更有效，这可能是仅在提供较高剂量的DMRT1向导序列1而不是较低剂量的两种向导序列时才观察到突变的另一原因。筛选有效的CRISPR向导序列和确定所需向导序列的浓度/剂量的方法将为本领域技术人员所知。
[0227] 注意到GFP敲除有明确的表型筛选过程，这对于DMRT1是不可能的。DMRT1的初始筛选过程涉及评估PCR产物的大小，然而在DMRT1基因中观察的突变由小的插入和缺失组成，并且一些含有突变的胚胎有可能不能通过PCR而发现，因而没有测序。
[0228] 由于STAGE过程将CRISPR组件放置在如此接近于父本基因组的位置，所以GFP实验设计为测试STAGE是否可以诱导来自母本和父本种系的突变。从GFP实验中，编辑事件中的6个在父本等位基因中，而3个在母本等位基因中。这表明STAGE能够诱导父本和母本等位基因的突变。同样值得注意的是，所有完全镶嵌(mosaicism throughout)胚胎(1-15)具有父本GFP等位基因，部分镶嵌性腺的鸡(212)具有母本GFP等位基因，表明当使用STAGE时，可以在来自任一亲本的等位基因中看到镶嵌。总体而言，STAGE是在一代中产生基因编辑鸡的新颖且有效的方法，并且具有应用于其他鸟类的潜力。
[0229] 本领域技术人员将会理解，如同被广泛描述的那样，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改，而不脱离本发明的精神或范围。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
[0230] 本申请要求于2015年8月7日提交的名称为“method for producing an animal comprising a germline genetic modification”的澳大利亚临时申请第2015903164号的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本文。
[0231] 本文讨论和/或参考的所有出版物均整体并入本文。
[0232] 已经包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、物品等的任何讨论仅是为了提供本发明的背景的目的。由于在本申请的每项权利要求的优先权日之前存在，并不视为承认任何或全部这些主题构成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识。
[0233] 本文公开或在本申请说明书中单独或共同指出步骤、特征、整数、组合物和/或化合物，以及两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
[0234] 参考文献
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