技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体涉及一种基于多个基因诊断肺癌患者的检测试剂盒。
背景技术
[0002] 肺癌是全世界发病率、死亡率最离的
恶性肿瘤，是威胁人类生命和健康的重大
疾病。世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)2014年发布的世界癌症报告显示：全球癌症负担在不断的加重，其中2012年新发常见癌症中肺癌居首，约为180万例，占常见癌症总数的13％；在常见死亡癌症中，肺癌也居首位，约为160万例，占总数的19.4％，其中中国病例约占1/3以上。另外，我国2013年肿瘤登记年报显示，肺癌的发病率在城市或者农村均居首位，城市中为55.92/10万，农村中为45.81/10万。在前十位发病率较高的癌症中，肺癌在男性中的发病率居首，占23％，女性中发病率占14.85％，仅次于
乳腺癌的16.97％。另外肺癌的死亡率在男性和女性中也均居榜首，男性中占29.50％，女性约为23.89％。
[0003] 由于肺癌的
预后较差，并且发现时大多为中晚期，如果能在早期发现并采用一定的有效
治疗方法即可大大降低肺癌的死亡率。虽然近几年来肺癌在诊断、手术治疗及研究等方面取得了一系列的进展，但是其五年生存率始终保持在较低的16％。其原因为患者往往在疾病的晚期才发现因而丧失了最佳的治疗时化，国外研究发现I期的非小细胞肺癌患者在接受了根治性手术治疗后，其5年的生存率可达到58％-73％。这说明若要提高肺癌患者的预后主要在于提高肺癌患者的早期诊断效率。
[0004] 目前，肺癌的诊断主要依靠影像学、痰脱落细胞学及
支气管镜活检等技术，这些诊断技术并没有在很大程度上改善肺癌患者的死亡率，因此，如何提高肺癌的生存率，依赖于肺癌的早期诊断，筛选和挖掘有价值的早期肺癌的生物学标志物成为亟待解决的问题，为早期的检测提供新的手段，利用一些肿瘤标志，例如CEA，
鉴别良恶性肿瘤诊断准确率也只有78％，作为一种筛查手段，必须要求这些分子生物学标志物可以在外周介质中可以获取，分子生物学标志物的出现给我们提供了一些方法，DNA甲基化的发生彰显了巨大的潜
力。
[0005] 长期以来，人们一直认为肿瘤的发生是基因突变累积的结果，然而近年随着表观遗传学的研究进展，已越来越清楚地发现表观遗传机制在肿瘤的发生中起着非常重要的作用。表观遗传修饰包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰和
染色体印迹等。而DNA甲基化是肿瘤中最常见的分子改变之一，CpG岛甲基化导致抑癌基因失活是引起细胞恶化的重要步骤。以种系特异性基因为例：
体细胞中需要保持永久关闭的关键基因在胚胎干细胞中被甲基化，然而一旦甲基化丢失则将导致细胞的去分化，并向着肿瘤相关的表型发展，如果抑癌基因再发生高甲基化或/和基因突变，则导致肿瘤的形成。DNA甲基化改变调控基因表达、与肿瘤的发生发展密切相关的概念是人类基因组计划完成之后，表观遗传学研究的一个重要的成果。启动子甲基化是肺癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态有望成为肺癌
风险预测有效指标。
[0006] DNA甲基化是基因表达调控的一种中间形式最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。
哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上
鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)。正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度从0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。
[0007] 迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常。研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化
水平紊乱，又称为甲基化重排，即促进增殖的基因低甲基化、高表达；促进细胞分化的基因高甲基化、低表达；DNA甲基化转移酶家族(DNMT family)高表达。癌症中甲基化重排涉及的基因包括：细胞周期调控基因、DNA修复基因、血管形成基因、细胞凋亡相关基因、细胞黏附迁移相关基因、
激素受体基因、核转录因子、酶类等等。通过对DNA甲基化修饰的研究，有可能为肿瘤发病机制的阐明、肿瘤早期诊断和治疗开辟新的有效途径，达到肿瘤治疗的目的。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因及其
片段的甲基化的试剂盒，包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊；引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；第一引物探针组合物甲中：特异性引物对甲为
序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对，封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示，探针甲的核苷酸序列如序列表的序列
9所示；第二引物探针组合物甲中：特异性引物对甲为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对，封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示，探针甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示；引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙；第三引物探针组合物乙中：特异性引物对乙为序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA组成的引物对，封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示，探针乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示；第四引物探针组合物乙中：特异性引物对乙为序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA组成的引物对，封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示，探针乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示；引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙；第五引物探针组合物丙中：特异性引物对丙为序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA组成的引物对，封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示，探针丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示；第六引物探针组合物丙中：特异性引物对丙为序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA组成的引物对，封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示，探针丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示；引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁；第七引物探针组合物丁中：特异性引物对丁为序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA组成的引物对，封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示，探针丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示；第八引物探针组合物丁中：特异性引物对丁为序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA组成的引物对，封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示，探针丁的核苷酸序列如序列表的序列37所示；引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊；第九引物探针组合物戊中：特异性引物对戊为序列表的序列38所示DNA和序列表的序列39所示DNA组成的引物对，封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列40所示，探针戊的核苷酸序列如序列表的序列41所示；第十引物探针组合物戊中：特异性引物对戊为序列表的序列42所示DNA和序列表的序列43所示DNA组成的引物对，封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列44所示，探针戊的核苷酸序列如序列表的序列45所示。
[0009] 需要说明的是，引物探针组合物甲用于检测SHOX2基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物乙用于检测PTGER4基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丙用于检测PCDHGA12基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丁用于检测HOXA9基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物戊用于检测FOXL2基因核酸序列的甲基化，不同的引物探针组合物分别检测对应基因靶区域核酸序列中至少一段核酸序列的甲基化；其中，靶区域分别选自序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示和序列表的序列5所示的序列中的连续的至少15个
碱基长度的片段；核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。试剂盒中，每种引物探针组合物均可以单独
包装。
[0010] 试剂盒还包括针对内参基因的内参引物和内参探针，内参基因为ACTB(NCBI基因库序列号：NM_001101.3)和/或GSTP1(NCBI基因库序列号：NM_000852.3)。
[0011] 内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA组成的引物对；内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列48所示；内参基因GSTP1的内参引物对为序列表的序列49所示DNA和序列表的序列50所示DNA组成的引物对；内参基因GSTP1的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列51所示。
[0012] 本发明的目的还在于提供一种用于诊断肺癌患者的试剂盒，包括如下五个引物探针组合物中的至少一种：引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊，不同的引物探针组合物包括的引物对、封闭引物和探针分别同上述的引物探针组合物。也就是说，引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊可以分别检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因及其片段的甲基化，五种甲基化结果共同用于诊断是否为肺癌患者；当然，也可以挑选引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊中的一种、两种、三种或四种引物探针组合物分别检测对应的基因及其片段的甲基化，根据一种、两种、三种或四种甲基化结果来诊断是否为肺癌患者。
[0013] 本发明提供的引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊(对应十种引物探针组)分别对SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因及其片段的甲基化具有较高的特异性，只是五种引物探针组合物联合诊断时的灵敏度最高。
[0014] 试剂盒还包括针对内参基因的内参引物和内参探针，内参基因为ACTB和/或GSTP1，基因序列同上所述，内参基因ACTB和GSTP1的内参引物对同上所述。
[0015] 试剂盒还包括DNA提取试剂和亚
硫酸氢盐试剂；DNA提取试剂包括裂解缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液；其中，裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶
抑制剂；清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，清洗缓冲液A包括
蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、
乙醇，清洗缓冲液B包括核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇；洗脱缓冲液包括核酸酶抑制剂和pH缓冲剂；蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、
盐酸胍和尿素中的一种或几种；去垢剂选自Tween20、Tween40、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或几种；pH缓冲剂选自Tris、
硼酸、
磷酸盐、MES和HEPES中的一种或几种；核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或几种；亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液；其中，亚硫酸氢盐缓冲液选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或几种；保护缓冲液包括
氧自由基清除剂，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、
没食子酸、Trolox、三羟基苯
甲酸和三羟基
苯甲酸衍生物中的一种或多种。
[0016] 本发明还保护上述试剂盒在制备检测肺癌产品中的应用。
[0017] 本发明还保护试剂盒检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因及其片段的甲基化的方法，包括如下步骤：S1：采用DNA提取试剂提取人源样本的DNA；S2：将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理；S3：以处理后的DNA为模板，采用引物探针组合物和内参基因的内参引物及内参探针进行PCR扩增。人源样本选自细胞系、
组织切片、活检组织、
石蜡包埋的组织、唾液、痰液、支气管液、胃液、体液、
粪便、结肠流出物、尿、
血浆、血清、
全血和从血液中分离的细胞中的一种或多种。
[0018] 具体地，S1采用DNA提取试剂提取人源样本(如血浆)的DNA包括如下步骤：(1)取1～5ml血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入终浓度为10～500mg/L的蛋白酶K和0.01～10μg/ml Carrier RNA，震荡混匀，55℃温育10～30min；(2)加入100μl
磁珠，振荡孵育0.5～
1小时；(3)用磁分离器
吸附磁珠，丢弃上清溶液；(4)加入0.5～2ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；(6)加入0.5～2ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干3～10min；(10)加入50～500ul洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；(12)洗脱后的DNA存放于4℃
冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。
[0019] 具体地，S2将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理包括如下步骤：(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液，用重亚硫酸钠、亚硫酸铵等配制1～12M缓冲液，根据DNA含量，可以选用不同浓度亚硫酸氢盐缓冲液；(2)配制保护缓冲液，用氧自由基清除剂的一种或者多种配制浓度0.01～5M保护缓冲液，浓度及组分取决于DNA含量及所用样本类型；(3)将100μl DNA溶液(DNA含量10pg～10μg)、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀；(4)热循环：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃；(5)将0.5～
5ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入20～200μl磁珠，震荡孵育30min～1h；(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(7)加入0.5～2ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；(9)加入0.5～2ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。(11)10000rpm快速离心
1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干3～10min；(13)加入50～500μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。
[0020] 具体地，S3以处理后的DNA为模板，采用引物探针组合物和内参基因的内参引物及内参探针进行PCR扩增。检测基因为SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因，内参基因为ACTB和/或GSTP1。引物探针组合物甲用于检测SHOX2基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物乙用于检测PTGER4基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丙用于检测PCDHGA12基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物丁用于检测HOXA9基因核酸序列的甲基化，引物探针组合物戊用于检测FOXL2基因核酸序列的甲基化。DNA甲基化标志物基因(SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因)的探针和内参基因(ACTB、GSTP1基因)的探针5'端报告
荧光基团为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox和Cy5中的一种或多种；甲基化基因的探针和内参基因的探针3'端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种；甲基化基因的封闭引物3'端修饰集团为C3Spacer、C6Spacer、inverted 3'end中的一种或多种。荧光定量PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1μM目的基因检测引物、0.1～1μM目的基因荧光探针、0.1～1μM目的基因封闭引物、0.1～1μM内参基因引物、0.1～1μM内参基因荧光探针、0.001～2ng/μl模板DNA、0.01～0.10U/μl
热启动TaqDNA聚合酶。dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，PCR缓冲液中包含Tris-HCl、氯化
钾、硫酸铵和氯化镁。荧光定量PCR扩增反应的具体过程为：92～97℃预变性5～35分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～30s，50～65℃
退火延伸10～60s，并进行40～55个循环。
[0021] SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因的甲基化情况是潜在的肺癌(尤其是早期肺癌)诊断、预后评估及疗效监测的有意义的临床指标。本发明对于深入了解早期肺癌的发病机制，认识其发生发展规律，提高我国早期肺癌诊治水平具有重要的价值，也为寻求新的早期肺癌靶向治疗策略奠定
基础。本发明提供的试剂盒，可以应用于诊断肺癌，为多发性肺癌的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。
[0022] 本发明的技术方案中，可以将SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9或FOXL2基因单独进行甲基化检测而进行肺癌筛查，也可以将SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因结合在一起进行肺癌筛查，通过将分别检测SHOX2基因、PTGER4基因、PCDHGA12基因、HOXA9基因和FOXL2基因及其片段的甲基化核酸序列联合使用，使得肺癌检测的灵敏度和特异性提高，尤其是灵敏度显著提高。单独检测SHOX2的灵敏度为62％、PTGER4的灵敏度为54％、PCDHGA12的灵敏度为64％、HOXA9的灵敏度为72％，FOXL2的灵敏度为74％，五个标志物联合检测时，灵敏度提高到95％。本发明能够根据实时荧光定量PCR的循环
阈值(Ct)来快速、便捷地判断样本是否阳性，提供了一种可以用于快速、准确的检测肺癌的试剂盒。
[0023] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0024] 图1为本发明
实施例五中检测血浆中SHOX2基因的ROC曲线；
[0025] 图2为本发明实施例五中检测血浆中PTGER4基因的ROC曲线；
[0026] 图3为本发明实施例五中检测血浆中PCDHGA12基因的ROC曲线；
[0027] 图4为本发明实施例五中检测血浆中HOXA9基因的ROC曲线；
[0028] 图5为本发明实施例五中检测血浆中FOXL2基因的ROC曲线；
[0029] 图6为本发明实施例五中检测血浆中联合检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因的ROC曲线。
具体实施方式
[0030] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0031] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0032] 实施例一：DNA提取
[0033] DNA提取试剂由裂解缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液组成，见表1；裂解缓冲液由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成；蛋白变性剂为：盐酸胍(购自sigma公司)；去垢剂为：Tween20(购自sigma公司)；pH缓冲剂为：Tris-HCl(购自阿拉丁公司)；核酸酶抑制剂为：EDTA(购自sigma公司)。
[0034] 表1 DNA提取所用试剂
[0035]
[0036]
[0037] 本实施例以血浆样本(购自北京301医院)为例，提取血浆循环肿瘤DNA，提取方法包括如下步骤：(1)取1ml血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K和Carrier RNA，使其终浓度分别为100mg/L和1μg/ml，震荡混匀，55℃温育30min；(2)加入100μl磁珠，振荡孵育1小时；(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(4)加入1ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；(6)加入1ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干10min；(10)加入100ul洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。
[0038] 实施例二：亚硫酸氢盐处理DNA
[0039] 亚硫酸氢盐处理DNA是采用亚硫酸氢盐试剂进行处理，亚硫酸氢盐试剂由亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液组成；亚硫酸氢盐缓冲液为亚硫酸氢钠(购自Sigma公司)和水的
混合液体；保护缓冲液为氧自由基清除剂对苯二酚(购自sigma公司)和水的混合液体。蛋白变性剂为盐酸胍(购自sigma公司)；pH缓冲剂为Tris-HCl(购自阿拉丁公司)；核酸酶抑制剂为EDTA(购自sigma公司)。本实施例试剂配方见表2。
[0040] 表2亚硫酸氢盐处理DNA所用试剂
[0041]
[0042] 本实施例二以实施例一提取得到的DNA为处理对象，采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体方法包括：(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液，称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液。(2)配制保护缓冲液，称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液。(3)将100μl DNA溶液(DNA含量100ng)、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀。(4)热循环：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃。(5)将1ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μl磁珠，震荡孵育1h。(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。(7)加入0.5ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min。(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清。(9)加入0.5ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min。(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液。(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干10min。(13)加入
50μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min。(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。
[0043] 实施例三：荧光定量PCR检测DNA甲基化
[0044] 本实施例检测基因为SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因，内参基因为ACTB。内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA组成的引物对；内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列48所示。本实施例是采用实施例二经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行PCR扩增。
[0045] 荧光定量PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1×PCR缓冲液(购自NEB公司)、0.5mM dNTPs(购自NEB公司)、0.5μM目的基因检测引物、0.2μM目的基因荧光探针、1μM目的基因封闭引物、0.3μM内参基因引物、0.3μM内参基因荧光探针、2ng/μl模板DNA、0.10U/μl热启动TaqDNA聚合酶(购自NEB公司)。引物和探针均购自上海生工公司，dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，PCR缓冲液中包含50mM Tris-HCl、20mM
氯化钾、10mM硫酸铵和2mM氯化镁。
[0046] 荧光定量PCR扩增反应的具体过程为：95℃预变性10分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性10s，60℃退火延伸60s，并进行50个循环。
[0047] 待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔(平行样)检测，PCR仪孔板加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No Template Control)，S代表检测样本(Sample)。
[0048] 表3 PCR反应加样布局表
[0049] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A PC PC PC S6 S6 S6
B NC NC NC S7 S7 S7
C NTC NTC NTC S8 S8 S8
D S1 S1 S1 S9 S9 S9
E S2 S2 S2 S10 S10 S10
F S3 S3 S3 S11 S11 S11
G S4 S4 S4 S12 S12 S12
H S5 S5 S5 S13 S13 S13
[0050] 实施例四：引物、探针封和闭引物筛选
[0051] 对于SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因，可以设计很多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行筛选。DNA甲基化标志物基因的探针和内参基因的探针5'端报告荧光基团为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox、Cy5中的一种或多种；甲基化基因的探针和内参基因的探针3'端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一种或多种。甲基化基因的封闭引物3'端修饰集团为C3Spacer、C6Spacer、inverted 3'end中的一种或多种。本发明使用HeavyMethyl的方法检测基因甲基化，所以除了设计普通Taqman引物和探针外，还设计了封闭引物，封闭引物3’-OH引入化学修饰，DNA聚合酶无法扩增，因此用封闭引物结合到样本中没有发生甲基化的模板上，阻止其扩增，提高检测反应的特异性。本实施例中，用人工处理的甲基化和非甲基化模板对SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因的引物和探针进行筛选。具体步骤如下：
[0052] 设计SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2的各种引物和探针，只要其分别能等同于、互补于或杂交于序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示和序列表的序列5所示的序列的至少15个核苷酸及其互补序列；再用人工合成的甲基化和非甲基化核酸序列作为模板验证引物和探针的有效性；最后通过PCR扩增结果筛选出以下10套最佳的引物和探针组合：
[0053] 引物和探针组1(扩增甲基化SHOX2基因)
[0054] 引物1：SEQ ID NO 6:5’-GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT-3’
[0055] 引物2：SEQ ID NO 7:5’-CCTCCTACCTTCTAACCC-3’
[0056] 封闭引物：SEQ ID NO 8:5’-TAATTTTTGTTTTGTTTGTTTGATTGGGGTTGTATGA-C3-3’[0057] 探针：SEQ ID NO 9:FAM-5’-CTCGTACGACCCCGATCG-BHQ1-3’
[0058] 引物和探针组2(扩增甲基化SHOX2基因)
[0059] 引物1：SEQ ID NO 10:5’-TTTTTTTTATATTTTTTTCGTTTTTTTC-3’
[0060] 引物2：SEQ ID NO 11:5’-ACGACCGCAACAACCCGACA-3’
[0061] 封闭引物：SEQ ID NO 12:5’-TTTGTTTTTTTTGTTGTTGTTTTTGTTTTTTTTGTTG-C3-3’[0062] 探针：SEQ ID NO 13:FAM-5’-CCGAACGACCGACGAAAACGACGACG-BHQ1-3’[0063] 引物和探针组3(扩增甲基化PTGER4基因)
[0064] 引物1：SEQ ID NO 14:5’-TTAGATATTTGGTGTTTTATCGATT-3’
[0065] 引物2：SEQ ID NO 15:5’-AAAAACTAAAACCCGCGTACAT-3’
[0066] 封闭引物：SEQ ID NO 16:5’-TTTTATTGATTGGATTATTAATGTGATGGTGTATGTTG-C3-3’[0067] 探针：SEQ ID NO 17:5’-JOE-ATAAACGACGTACGCCGTCACGTTAATA-BHQ1-3’[0068] 引物和探针组4(扩增甲基化PTGER4基因)
[0069] 引物1：SEQ ID NO 18:5’-TTTCGTTGTTTTTTTAGTTTTGTCG-3’
[0070] 引物2：SEQ ID NO 19:5’-AATAAATAAAATAACCATCTAAATC-3’
[0071] 封闭引物：SEQ ID NO 20:5’-GTTTTGTTGTGTTTTAGTGATTTTTGGTGTTGTTG-C3-3’[0072] 探针：SEQ ID NO 21:5’-JOE-CGACGCCCGCGATACGACGAAAACTCCG-BHQ1-3’[0073] 引物和探针组5(扩增甲基化PCDHGA12基因)
[0074] 引物1：SEQ ID NO 22:5’-TGTTTATTATTTGGTTTTTACGGT-3’
[0075] 引物2：SEQ ID NO 23:5’-TTATCGTTCGCATCCAAAACC-3’
[0076] 封闭引物：SEQ ID NO 24:5’-TTTTTATGGTTTTTGATGGGGGTGATTTGGTGTG-C3-3’[0077] 探针：SEQ ID NO 25:5’-TEXAS RED-CGCGAATACGCGCGATACCTATACGC-BHQ2-3’[0078] 引物和探针组6(扩增甲基化PCDHGA12基因)
[0079] 引物1：SEQ ID NO 26:5’-CGTTTGTTTAAGGTTAGCGAGTCG-3’
[0080] 引物2：SEQ ID NO 27:5’-TTAAACGCGTCTCTATCCAACAA-3’
[0081] 封闭引物：SEQ ID NO 28:5’-TAGTGAGTTGGGATTTTTTTTGGTGGGTTTGTATATG-C3-3’[0082] 探针：SEQ ID NO 29:5’-TEXAS RED-CTCGCGCCGTACGCACCTCGCCCGT-BHQ2-3’[0083] 引物和探针组7(扩增甲基化HOXA9基因)
[0084] 引物1：SEQ ID NO 30:5’-GGGTTTTAGTTAGGAGCGTATGT-3’
[0085] 引物2：SEQ ID NO 31:5’-CCATCACCACCACCCCTACG-3’
[0086] 封闭引物：SEQ ID NO 32:5’-GAGTGTATGTATTTGTTGTTTGGTGTTGTTGTTG-C3-3’[0087] 探针：SEQ ID NO 33:5’-CY5-CGCCCGTAACGACGACGACGCCG-BHQ3-3’
[0088] 引物和探针组8(扩增甲基化HOXA9基因)
[0089] 引物1：SEQ ID NO 34:5’-GAAGTATAGTTATTTAATAAGTTG-3’
[0090] 引物2：SEQ ID NO 35:5’-TTTACGCGTTATTATTCTACTAA-3’
[0091] 封闭引物：SEQ ID NO 36:5’-TTAATAAGTTGTTGGTGTTTGTGTTTTTATTGGTTG-C3-3’[0092] 探针：SEQ ID NO 37:5’-CY5-CGAACACGTAACGCGCACGACCAA-BHQ3-3’
[0093] 引物和探针组9(扩增甲基化FOXL2基因)
[0094] 引物1：SEQ ID NO 38：5’-GGTTTAGAGGGTGTGAGGTTAGG-3’
[0095] 引物2：SEQ ID NO 39：5’-CGATACAAACGAATACGAAAATAC-3’
[0096] 封闭引物：SEQ ID NO 40：5’-GTGAGGTTAGGTTGGTGGTGGTGTTGTTGGTT-C3-3’[0097] 探针：SEQ ID NO 41：5’-FAM-CGCGCGACGCCGACCCCGATCG-BHQ1-3’
[0098] 引物和探针组10(扩增甲基化FOXL2基因)
[0099] 引物1：SEQ ID NO 42：5’-GGGCGTTAGGTAGTCGTAGTCG-3’
[0100] 引物2：SEQ ID NO 43：5’-CACTTCCAACCCGACAAAAAAC-3’
[0101] 封闭引物：SEQ ID NO 44：5’-GTTGTAGTTGTTGGTTTTGGTGTTTGTTATGTTG-C3-3’[0102] 探针：SEQ ID NO 45：5’-FAM-CGAAACCGAAAACGCCGCAAACGAATACG-BHQ1-3’[0103] 实验结果证明引物和探针的设计是合理的，10组引物和探针均能区分甲基化和非甲基化模板，分别可以作为检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因甲基化的引物和探针，检测Ct值见表4，其中“No”表示“No Ct”。虽然不同的引物和探针组合效果略有不同，但是以上引物和探针分别适用于SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因的甲基化检测。
[0104] 表4不同组合物检测甲基化和非甲基化模板的Ct值均值
[0105] 组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8 组9 组10
甲基化模板 36.12 35.81 37.12 37.37 33.94 34.35 34.77 34.41 33.59 34.03非甲基化模板 No No No No No No No No No No
[0106] 采用不同癌症患者和正常人DNA作为模板进一步筛选引物和探针组合物。将5例肺癌、3例肝癌和5例正常人的血浆样本(购自北京301医院)采用实施例一的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例二的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板，利用上述10组引物和探针，采用实施例三的方法进行荧光定量PCR实验。分别测得癌症样本和正常人样本的各种甲基化基因Ct值，具体见表5。
[0107] 表5不同组合物检测癌症和正常人样本的Ct值
[0108] 组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8 组9 组10
肺癌1 35.88 36.06 36.34 37.09 33.77 35.14 34.51 33.12 33.37 33.82
肺癌2 35.28 34.47 35.77 36.68 34.91 35.06 35.09 34.33 33.68 34.33
肺癌3 35.3 35.35 36.12 37.21 35.42 34.61 34.74 34.15 34.21 33.98
肺癌4 35.4 35.77 36.89 35.78 34.35 35.62 34.81 33.54 33.53 34.34
肺癌5 34.84 36.13 36.92 36.72 33.56 34.71 35.09 34.43 33.62 33.73
肝癌1 No 45.14 No 43.61 46.56 No 43.65 45.88 No 44.35
肝癌2 No No 45.32 No No 44.35 No No 46.51 No
肝癌3 49.46 45.35 No 43.15 46.67 43.37 47.35 45.42 No 44.25
正常人1 No 48.11 No 47.24 46.46 No 46.23 No No No
正常人2 No No 48.12 No No 47.12 No No 49.34 No
正常人3 No No No 47.42 No No 48.72 No No 48.63
正常人4 No 46.89 No No 47.35 No No 48.51 No No
正常人5 No No 47.38 No No 47.88 No No 47.36 No
[0109] 从以上癌症患者和正常人样本的SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因甲基化检测的Ct值可以看出，以上10组引物和探针对肺癌甲基化DNA有高度扩增，其它癌症和正常人无扩增或者扩增Ct值大于40。虽然不同组的引物和探针对肺癌样本的扩增Ct值有些差异，但都明显区别于其它癌症很正常人样本，因此以上引物组均适用于肺癌早期检测。在实际应用中可采用单组引物和探针检测目的基因甲基化，也可以两组或两组以上联合使用。
[0110] 实施例五：试剂盒检测肺癌、正常人血浆的灵敏度和特异性
[0111] 本实施例采用300例正常人和300例肺癌患者的血浆样本(购自北京301医院)为检测对象测试我们的肺癌检测试剂的灵敏度和特异性。采用实施例一的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例二的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板，利用实施例四的探针引物组，采用实施例三的内参基因ACTB的内参引物和相关方法进行荧光定量PCR实验，检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因和内参基因ACTB，最后得出正常人和肺癌患者样本的Ct值。检测SHOX2基因采用的是引物和探针组2，检测PTGER4基因采用的是引物和探针组3，检测PCDHGA12基因采用的是引物和探针组5，检测HOXA9基因采用的是引物和探针组8，检测FOXL2基因采用的是引物和探针组9，内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA组成的引物对；内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列48所示。
[0112] 根据SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2各自的ROC曲线，见图1-5所示，确定各自的Cutoff值为36.6、37.4、36、35.5和35，即样本Ct值小于Cutoff值为阳性，样本Ct值大于Cutoff值为阴性，在此判定标准下单标志物的灵敏度最高。将五个标志物组合在一起来检测肺癌，只要有一个基因为阳性，即判定该样本为阳性，其它视为阴性，ROC曲线见图6。根据上述判定标准以及表6的检测结果，SHOX2的灵敏度为62％、PTGER4的灵敏度为54％、PCDHGA12的灵敏度为64％、HOXA9的灵敏度为72％，FOXL2的灵敏度为74％，五个标志物联合检测时，灵敏度提高到95％，特异性为75.67％。
[0113] 表6检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因甲基化诊断肺癌灵敏度和特异性
[0114]
[0115] 为了达到不同的预期用途和目的，本发明提供的检测试剂盒可通过调整Cutoff值达到不同的灵敏度和特异性指标。在实施例五中，为了提高灵敏度，设定Cutoff值并不代表本发明仅能用此为Cutoff值，可根据本发明提供的ROC曲线，选取不同的Cutoff值作为判定标准。
[0116] 本发明提供的技术方案，通过联合利用分别用于检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因及其片段的甲基化的核酸序列，使得肺癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。并且，通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2这五个生物标记物的同时检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种用于无创性的快速癌症的检测方法的试剂盒。最后，本
申请还公开了至少一组的效果较好的、设计达到最优化的用于检测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9和FOXL2基因及其片段是否甲基化的引物和探针组合及其筛选方法，确保检测效果达到最优化。
[0117] 需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明
说明书的范围中。
