L-草铵膦的生物合成制备方法
阅读：931发布：2024-02-11
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1.一种式II化合物的生物合成制备方法，其特征在于，由式IV化合物在酶的作用下反应制备，反应式如下：
其中，R选自烷基、硅烷基、硅醚保护基、苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、C2-C10直链或支链烯烷基、C2-C10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、Ar(CH2)n-基团中的一种，Ar代表芳基、杂芳基，n取1-6，所述酶包括生物酶和辅酶。
2.根据权利要求1所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述生物酶包括酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，所述辅酶为磷酸吡哆醛。
3.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，式IV化合物由式I化合物在腈水合酶的的作用下反应制备，反应式如下：
其中，R的定义与权利要求1中相同。
4.一种式II化合物的生物合成制备方法，其特征在于，由式I化合物在酶的的作用下经一锅法反应制备，反应式如下：
其中，R的定义与权利要求1中相同，所述酶包括生物酶和辅酶，所述生物酶包括腈水合酶、酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，辅酶为磷酸吡哆醛。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生物合成制备方法，其特征在于，L-草铵膦的生物合成制备方法，由式II化合物脱保护基得到，
其中，R的定义与权利要求1中相同。
6.根据权利要求5所述的生物合成制备方法，其特征在于，R为乙基，控制反应体系的pH为5-8。
7.根据权利要求5所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述腈水合酶基因包括但不限于来源于Rhodococcus rhodochrous，Pseudomonas chlororaphis，Brevibacterium，Agrohaeteriwn tumefadens，Myrothccium verrucaria，Corynehacterium，Pseudomonas putida，Pseudomonas fluorescens，Nocardia simplex，Rhodococcus sp，Nocardia brasiliensis，Pichia pastoris，Escherichia coli；酰胺消旋酶基因包括但不限于来源于Achromobacter obae，CRYPTOCOCCUS LAURENTII，Cryptococcus sp，Pseudomonas sp，Candida humicola，Achromobacter，Alcaligenes faecalis，Flavobacterium arborescens Trichosporon cutaneum，Escherichia coli；L-酰胺水解酶基因包括但不限于来源于Brevundimonas diminuta，Ochrobactrum anthropi，Streptomyces，Bacillus cereus，Comamonas acidovorans，Rhodococcus rhodochrous，Mycobacterium tuberculosis，Brevibacterium sp，Delftia acidovorans，Brevibacillus borstelensis，Variovorax paradoxus，Escherichia coli。
8.根据权利要求7所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述腈水合酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有腈水合酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有腈水合酶活性的蛋白质；所述酰胺消旋酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质，或SEQ ID NO：2经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有酰胺消旋酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺消旋酶活性的蛋白质；所述L-酰胺水解酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQ ID NO：
3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质。
9.根据权利要求4所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶的投量比控制为1︰0.8-2︰0.8-3。
10.根据权利要求1或4所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述步骤1中，反应体系中加入CoCl2，转化反应在溶剂中进行，所述溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
L-草铵膦的生物合成制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 草铵膦，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，由赫斯特公司(现德国拜耳公司)于上个世纪80年代开发生产，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，非选择性触杀型除草剂，其作为除草剂获得登记使用是1984年。2004年我国才有草铵膦原药登记，2005年我国才有产品登记。
[0003] 草甘膦自广泛应用以来，抗草甘膦杂草不断增加，危害逐步加重。百草枯是一种强烈的杀灭杂草除莠剂，对人畜有很强的毒性作用。2014年7月1日，我国撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。草铵膦是世界大吨位农药品种，也是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦毒性低，较为安全，在土壤中易于降解，对作物安全，不易飘移，除草谱广，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速，能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草，可用水做基剂，使用安全方便，这些是该品优于其他除草剂的特点，所以这个产品在出现了众多高效超高效的产品后，依然可以畅销。
[0004] 目前国内外草铵膦的合成技术路线较多，严海昌等(《农药》，2002，41(9)，46-48)做过综述报道，但各路线普遍存在反应步骤多，生产成本高的问题。拜尔公司在专利US4521348及US6359162中提出了以合成二氯甲基膦再合成甲基亚磷酸酯，经过一系列反应合成草铵膦的方法。该路线收率高、成本低，但起始路线二氯甲基膦合成原料、产物物化性质活泼，易燃易爆。合成过程处于500～600℃，如控制不稳定，容易产生极易自然的黄磷和磷化氢，危险性很大。另外，物料具有强腐蚀性，对反应设备材质选择及其加工制造工艺要求苛刻，目前国内加工制造水平难以满足生产要求。
[0005] 这些方法都是制备草铵膦的方法，草铵膦为L/D混合型，其中起主要作用的是L型；L-草铵膦可在土壤中经微生物降解，而D-型草铵膦较难降解，最终可导致土壤板结。因此，L-草铵膦比较传统草铵膦更加高效、更低成本、更加安全。
[0006] 因此，研发一种能提高原料利用率、降低生产成本同时避免工业化过程中的危险性的L-草铵膦的生物合成制备方法显得十分必要。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的问题就是要克服背景技术的不足，提供一种L-草铵膦的生物合成制备方法，能提高原料利用率、降低生产成本，并且适合工业化生产。
[0008] 本发明提供了式II化合物L-2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁酸的生物合成制备方法，由式IV化合物2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁酰胺在酶的作用下反应制备，[0009]
[0010] 其中，R选自烷基、硅烷基、硅醚保护基、苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、C2-C10直链或支链烯烷基、C2-C10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、Ar(CH2)n-基团中的一种，Ar代表芳基、杂芳基，n取1-6，所述酶包括生物酶和辅酶。
[0012] 进一步地，式IV化合物2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁酰胺由式I化合物2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁腈在腈水合酶的的作用下反应制备，
[0013]
[0014] 其中，R选I自烷基、硅烷基、硅醚保护基、IV苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、C2-C10直链或支链烯烷基、C2-C10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、Ar(CH2)n-基团中的一种，Ar代表芳基、杂芳基，n取1-6。
[0015] 进一步地，式II化合物由式I化合物在酶的的作用下经一锅法反应制备，R的定义如上所述，所述酶包括生物酶和辅酶。其中，生物酶包括腈水合酶、酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，辅酶为磷酸吡哆醛。反应式如下：
[0016]
[0017] 本发明还提供了L-草铵膦的生物合成制备方法，当用上述方法制备好式II化合物后，由式II化合物脱保护基得到，
[0018]
[0019] 其中，R的定义如上所述。
[0020] 优选地，R为乙基，控制反应体系的pH为5-8。
[0021] 进一步地，腈水合酶基因包括但不限于来源于Rhodococcus rhodochrous，Pseudomonas chlororaphis，Brevibacterium，Agrohaeteriwn tumefadens，Myrothccium verrucaria，Corynehacterium，Pseudomonas putida，Pseudomonas fluorescens，Nocardia simplex，Rhodococcus sp，Nocardia brasiliensis，Pichia pastoris，Escherichia coli；酰胺消旋酶基因包括但不限于来源于Achromobacter obae，CRYPTOCOCCUS LAURENTII，Cryptococcus sp，Pseudomonas sp，Candida humicola，Achromobacter，Alcaligenes faecalis，Flavobacterium arborescens Trichosporon cutaneum，Escherichia coli；L-酰胺水解酶基因包括但不限于来源于Brevundimonas diminuta，Ochrobactrum anthropi，Streptomyces，Bacillus cereus，Comamonas acidovorans，Rhodococcus rhodochrous，Mycobacterium tuberculosis，Brevibacterium sp，Delftia acidovorans，Brevibacillus borstelensis，Variovorax paradoxus，Escherichia coli。
[0022] 进一步地，腈水合酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有腈水合酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有腈水合酶活性的蛋白质；所述酰胺消旋酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质，或SEQ ID NO：2经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有酰胺消旋酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺消旋酶活性的蛋白质；所述L-酰胺水解酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQ ID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质。
[0023] 进一步地，腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶的投量比控制为1︰0.8-2︰0.8-3，优选为1︰1︰1。
[0024] 进一步地，酶转化反应体系中加入CoCl2。
[0026] 腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶均可为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。
[0027] 本发明生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
[0028] 本发明的优点主要体现在如下几方面：
[0029] 其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；
[0030] 其二，本发明底物利用率高，纯化后L-草铵膦晶体纯度达到95％以上，光学纯度为99％以上；
[0033] 图2为L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸标准品的液相图。
具体实施方式
[0034] 以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
[0035] 实施例1
[0036] 1、腈水合酶的制备
[0037] 重 组 腈 水 合 酶 基 因 工 程 菌 ，具 体 制 备 方 法 是 ：选 择 来 源 于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组腈水合酶的重组腈水合酶基因工程菌。
[0038] 将重组腈水合酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0 .1mM ，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞。
[0039] 采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
[0040] 所得腈水合酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。
[0041] 2、酰胺消旋酶的制备
[0042] 重组酰胺消旋酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组酰胺消旋酶的重组酰胺消旋酶基因工程菌。
[0043] 将重组酰胺消旋酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞。
[0044] 采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
[0045] 所得酰胺消旋酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。
[0046] 3、L-酰胺水解酶的制备
[0047] 重组L-酰胺水解酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组L-酰胺水解酶的重组L-酰胺水解酶基因工程菌。
[0048] 将重组L-酰胺水解酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞。
[0049] 采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
[0050] 所得L-酰胺水解酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。
[0051] 实施例2
[0052] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0053] 步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液为溶剂重悬3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、3g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、3g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。转化时间为16h，转化率为99.1％。对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。反应式如下：
[0054]
[0055] 步骤2：向装有纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％(质量分数)的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦的ee值为99.7％。1H NMR(400MHz，D2O)1.267(s，3H)，1.603～1.742(m，2H)，1.989～2.080(m，2H)，3.876～
3.905(m，1H)，11.013～11.106(1H)。MS(ESI)：m/z 182.05[M+H]+反应式如下：
3.905(m，1H)，11.013～11.106(1H)。MS(ESI)：m/z 182.05[M+H]+反应式如下：
[0056]
[0057] 实施例3
[0058] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0059] 步骤1：反应在500mL摇瓶中进行，以20g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用200mL磷酸盐缓冲溶液重悬2g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化至底物完全消耗完，纯化得到2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酰胺。MS(ESI)：m/z 209.11[M+H]+反应式如下：
[0060]
[0061] 步骤2：反应在500mL摇瓶中进行，以10g纯化后的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酰胺为底物，用200mL磷酸盐缓冲溶液重悬1.6g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、6g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为5mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为0.5mM，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化率为88.4％。反应式如下：
[0062]
[0063] 步骤3：向含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.3％。反应式如下：
[0064]
[0065] 实施例4
[0066] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0067] 步骤1：反应在500mL摇瓶中进行，以20g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用200mL磷酸盐缓冲溶液重悬2g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、1.6g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、6g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为5mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为0.5mM，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min。
[0068] 转化时间为18.5h，转化率为91.3％。
[0069] 步骤2：向含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.5％。
[0070] 反应式如实施例2。
[0071] 实施例5
[0072] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0073] 步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液重悬10g/L的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶的基因工程菌全细胞、10g/L的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶的基因工程菌全细胞、20g/L的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为150r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
[0074] 转化时间为15.3h，转化率为98.6％。
[0075] 对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
[0076] 步骤2：向装有纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.6％。
[0077] 反应式如实施例2。
[0078] 实施例6
[0079] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0080] 步骤1：反应在5L烧杯中进行，以200g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用2L磷酸盐缓冲溶液重悬20g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、30g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、16g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向烧杯中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向烧杯中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为35℃；机械搅拌转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
[0081] 转化时间为17.8h，转化率为97.8％。
[0082] 对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
[0083] 步骤2：向纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.6％。
[0084] 反应式如实施例2。
[0085] 实施例7
[0086] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0087] 步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、6g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、4.5g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为7，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
[0088] 转化时间为20.7h，转化率为97.2％。
[0089] 对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
[0090] 步骤2：向纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦晶体纯度达到96.1％，光学纯度为99.5％。
[0091] 反应式如实施例2。
[0092] 实施例8
[0093] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0094] 步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，以300mL MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞破碎酶液、3g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞破碎酶液、3g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞破碎酶液，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
[0095] 转化时间为17.9h，转化率为97.3％。
[0096] 对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
[0097] 步骤2：向纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦晶体纯度达到95.3％，光学纯度为99.5％。
[0098] 反应式如实施例2。
[0099] 实施例9
[0100] L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
[0101] 步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶、来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶、来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶共表达的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
[0102] 转化时间为18.4h，转化率为92.8％。
[0103] 对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
[0104] 步骤2：向装有纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦晶体纯度达到95.9％，光学纯度为99.5％。
[0105] 反应式如实施例2。
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