一个kinase基因LeRLK1-V及其表达载体和应用
阅读：325发布：2024-02-15
专利汇可以提供一个kinase基因LeRLK1-V及其表达载体和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程领域，公开了一个kinase基因LeRLK1-V及其表达载体和应用。LeRLK1-V的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的 氨 基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS 染色 体臂上。LeRLK1-V在抗 白粉病 小麦品种南农9918中受白粉菌诱导表达增强。通过瞬间表达将该基因转化感病小麦品种扬麦158，结果表明LeRLK1-V的过量表达可以降低扬麦158的吸器指数。因此，LeRLK1-V可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。，下面是一个kinase基因LeRLK1-V及其表达载体和应用专利的具体信息内容。
1.一个kinase基因LeRLK1-V，来自小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上，其ORF序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的基因LeRLK1-V编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.LeRLK1-V的重组表达载体pBI220:LeRLK1-V。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的LeRLK1-V的表达载体pBI220:LeRLK1-V是以pBI220为出发载体，将LeRLK1-V基因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。
5.权利要求1所述的LeRLK1-V在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
6.权利要求3或4所述的LeRLK1-V的表达载体pBI220:LeRLK1-V在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
一个kinase基因LeRLK1-V及其表达载体和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，公开了一个kinase基因LeRLK1-V及其表达载体和应用。
背景技术
[0002] 小麦(Triticum aestivum)的整个生育期受到多种病虫的危害，其中由小麦白粉病菌(Blurmeria graminis f.sp.tritici，Bgt)侵染引起的小麦白粉病是小麦最严重的真菌病害之一。由于小麦白粉病菌生理小种多、毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化，会导致小麦白粉病的大爆发，给农业生产带来灾难性后果。广谱、持久抗病基因的发掘和利用对白粉病防治具有重要意义。
[0003] 簇毛麦(Haynaldia villosa，2n＝2x＝14，VV)携带的抗白粉病基因Pm21对小麦白粉病具有广谱、高抗特性，该基因定位于6V染色体短臂上。南京农业大学细胞遗传研究所利用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系，将含有Pm21基因的6VS导入普通小麦。普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系自1994年进入国内育种利用以来，在白粉病常发区进行了多年种植，对白粉病表现出了广谱、高抗特性，以之为亲本已经选育出一批高抗白粉病的小麦新品种，南农9918即选育出的其中一个品种，Pm21在育种中得到广泛应用。在6VS上筛选和鉴定具有白粉病抗性功能的基因，对分析Pm21介导的广谱抗性机理和克隆其候选基因对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0006] LeRLK1-V基因来自普通小麦(Triticum asetivum L.)南农9918，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
[0008] 含有所述的LeRLK1-V的重组表达载体pBI220:LeRLK1-V。
[0009] 所述的LeRLK1-V基因的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将LeRLK1-V基因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。
[0010] 所述的LeRLK1-V基因在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
[0011] 所述的LeRLK1-V基因的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
[0012] 有益效果：
[0013] 本发明从小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上克隆获得小麦中克隆得到了一个kinase基因LeRLK1-V及其所编码的蛋白质LeRLK1-V，将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。LeRLK1-V的超量表达载体用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够获得具备白粉病抗性的小麦种质。附图说明
[0014] 图1 LeRLK1-V在抗白粉病南农9918中受白粉菌诱导表达
[0015] 图2 pBI220:LeRLK1-V超量表达载体图谱
[0016] 图3与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞
[0017] A图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后未形成吸器；B图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后形成吸器；其中，co:分生孢子；pp:侵入钉；ha:吸器；hy:菌丝
[0018] 图4利用瞬间表达研究LeRLK1-V基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应[0019] 图5 LeRLK1-V转化扬麦158的T0代阳性植株的PCR分子鉴定
[0020] 泳道1为DNA ladder，泳道2为水对照，泳道3为未转化扬麦158对照，泳道4为包含目的基因的载体对照，泳道5-10为阳性转化植株。
[0021] 图6 LeRLK1-V转化扬麦158的T0代阳性植株的白粉病抗性鉴定
[0022] 上排是重复1的鉴定，下排是重复2的鉴定
具体实施方式
[0023] 实施例1小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个具有lectin和LRR结构域的kinase基因LeRLK1-V的克隆
[0024] 小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广谱抗白粉病基因Pm21的小麦品种(公知公用，陈佩度，张守忠，王秀娥，王苏玲，周波，冯祎高，刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438-1444)。前期已经在南农9918的6VS上开发了多个6VS的转化序列，进一步利用小片段插入易位系NAU418将Pm21限定在6EST258和CINAU15之间，并且在Pm21所在染色体区间还有
6EST243和6EST238两个标记(公知公用，Radiation-induced translocations with reduced Haynaldia villosa chromatin at the Pm21locus for powdery mildew resistance in wheat.Molecular breeding,2013,31:477–484)。
6EST243和6EST238两个标记(公知公用，Radiation-induced translocations with reduced Haynaldia villosa chromatin at the Pm21locus for powdery mildew resistance in wheat.Molecular breeding,2013,31:477–484)。
[0025] 将6EST258、CINAU15、6EST243、6EST238序列与水稻(http://rice.plantbiology.msu.edu)、大麦(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)、短柄草(http://plants.ensembl.org/Brachypodium_distachyon/Info/Index)的序列数据库进行Blastn比对分析，分别提取出水稻、大麦、短柄草中位于6EST258和CINAU15所在染色体区间的序列。根据其中一个大麦的序列morex_contig_368490(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/blastresult.php？jobid＝
148384578557&opt＝none)设计引物，在南农9918受白粉菌诱导的cDNA样品中进行扩增，获得LeRLK1-V全长序列。cDNA样品准备及扩增流程如下：
148384578557&opt＝none)设计引物，在南农9918受白粉菌诱导的cDNA样品中进行扩增，获得LeRLK1-V全长序列。cDNA样品准备及扩增流程如下：
[0026] 具体流程如下：(1)将抗白粉病小麦南农9918的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，一叶期把从感白粉病小麦材料上搜集的白粉菌孢子接种到苗上进行诱导，并于接种不同时间段取样(0h,1h,6h,12h,24h)，分别提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol试剂提取)，并且反转录成cDNA样品(用Takara公司的AMV反转录酶反转)。(2)以南农9918经白粉菌诱导24小时的cDNA为模板，以LeRLK1-V基因引物P1(AGGAAGCATGGATCTATGCGT,SEQ ID NO.3)和P2(GCAAGGAACAGACGGAGGAT,SEQ ID NO.4)为引物进行RT-PCR，获得LeRLK1-V基因的cDNA全长片段。对该基因片段进行测序和比对，发现该基因为一个具有lectin和LRR结构域的kinase基因，命名为LeRLK1-V。对LeRLK1-V进行生物信息学分析，发现ORF(开放阅读框)2691bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码896个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0027] 实施例2 LeRLK1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中受白粉菌诱导表达[0028] 以小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导不同时间段的cDNA样品为模板，以根据LeRLK1-V设计的引物P3(TCCGCAGTTATCACATCAGC,SEQ ID NO.5)和P4(CATTCTTGCATCCACAATGC，SEQ ID NO.6)为引物进行Q-PCR分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uL PCR反应体系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明：在南农9918中，LeRLK1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导上调表达(图1)。
[0029] 实施例3 LeRLK1-V基因瞬间表达载体的构建
[0030] 以经白粉菌诱导的南农9918中克隆的LeRLK1-V基因cDNA为模板，使用引物对NLR1-V-BamHI-F(GGAGAGAACACGGGGGATCCATGGATCTATGCGTAGTGATTCTCC，SEQ IDNO.7)和NLR1-V-StuI-R(AACGTCGTATGGGTAAGGCCTCTATCTCATTGCAGGACCAGCAG，SEQ IDNO.8)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和StuI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和StuI双酶切后的载体pBI220(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUSfusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6:3901-3907.)，将LeRLK1-V置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因LeRLK1-V克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:LeRLK1-V(图1)。经测序验证，表明载体构建成功。
[0031] 实施例4利用瞬间表达方法将LeRLK1-V基因转入小麦叶片
[0032] 瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。本研究利用瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击TaNACs细胞的白粉菌吸器指数与未轰击LeRLK1-V细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。
[0033] 载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：
[0034] 制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH2O水，涡旋混匀后，离心弃上清(重复三次)。最后加入500μl 50％甘油涡旋混匀，以备用。
[0035] 包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl 2.5M CaCl2，然后加入20μl 0.1M亚精氨(现配先用)，涡旋3min。静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl 70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl 100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl 100％酒精，充分涡旋，以备使用。
[0036] 实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因的表达载体pAHC25(Christensen A H,Quail P H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research,1996,5:213-218.)与钨粉包裹；当实施NLR1-V与GUS基因共转化时，将含有LeRLK1-V基因的表达载体pBI220:LeRLK1-V与含有GUS基因的表达载体pAHC25按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。当GUS基因与LeRLK1-V基因进行共转化时，Marker基因GUS转入的细胞也是LeRLK1-V转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为LeRLK1-V的表达细胞。
[0037] 基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，
18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：
0.1mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。
18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：
0.1mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。
[0038] 实施例5在单细胞水平对LeRLK1-V抗病功能的分析
[0039] 白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，吸器会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认(图3)。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。
[0040]
[0041] 当单转化GUS基因时，感病小麦扬麦158的平均吸器指数为55.75％(共统计了910个互作细胞，重复1吸器指数为50.00％，重复2吸器指数为47.97％，重复3吸器指数为69.29％)，当GUS基因与LeRLK1-V共转化感病小麦扬麦158后，统计了GUS基因表达(即LeRLK1-V表达)且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当LeRLK1-V转入后，扬麦158的平均吸器指数为37.15％(共统计了758个细胞，重复1吸器指数为29.22％，重复2吸器指数为35.39％，重复3吸器指数为46.84％)(图4)。该结果说明，LeRLK1-V能显著降低吸器指数，对白粉菌具有抗病作用。
[0042] 实施例6 LeRLK1-V转化普通小麦扬麦158及LeRLK1-V的白粉病抗性鉴定[0043] 挑取预培养7天约2000块扬麦158幼胚愈伤组织，将携有目的基因LeRLK1-V的过量表达载体pBI220:LeRLK1-V通过基因枪轰击法转化到扬麦158，轰击前在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理4–5小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+4mg/L Bialaphos，pH5.8)，筛选培养2周。然后将具有除草剂抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺l mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/
2MS+KT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中。至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共75棵。
2MS+KT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中。至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共75棵。
[0044] 提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用基因内部引物P7(TCCAACCACGTCTTCAAAGC，SEQ ID NO.9)和载体上终止子引物P8(CTCCATGCTGAAAGAACCGG，SEQ ID NO.10)进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序：10-50ng/ul基因组模板，10μM的P7和P8各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃45秒，55℃
45秒，72℃1分钟，33个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测。其中6株可以扩增出与质粒对照一致的约600bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为：
HP5、HP13、HP48、HP49、HP58、HP59(图5)。
45秒，72℃1分钟，33个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测。其中6株可以扩增出与质粒对照一致的约600bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为：
HP5、HP13、HP48、HP49、HP58、HP59(图5)。
[0045] 对所有鉴定的阳性植株和对照扬麦158进行白粉病抗性鉴定，鉴定方法为：在植株生长到2叶1心期时，剪取第二叶平铺在琼脂平板上(1％琼脂粉，20mg/L的6-BA)；将感病品种苏麦三号上繁殖的白粉菌孢子(南京地区混合白粉菌孢子)抖落在琼脂平板上的待鉴定叶片上；将接种了白粉菌的平板放置在智能培养箱中(16小时光照、25度/8小时黑暗、22度，80％湿度)，7天后观察拍照。鉴定结果表明：在两个重复鉴定实验中，感病对照扬麦158上白粉菌正常发育，而转基因T0代阳性植株HP5、HP13、HP48、HP49、HP58、HP59的叶片上孢子密度明显降低，与未转化扬麦158相比，转基因植株的白粉病抗性水平显著提高(图6)。
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