技术领域
[0001] 本
发明属于
植物基因工程领域，具体涉及一种控制水稻无侧根性状的突变基因Oslrt1、其检测及应用。
背景技术
[0002] 侧根是植物根系的重要组成部分，是植物从外界汲取水分和营养的重要器官。水稻是重要的粮食作物，研究侧根的发生有着重要的意义。
[0003] 研究发现一些Aux/IAA家族成员对侧根的发育起着十分重要的作用，总的来讲，在水稻中Aux/IAA家族的研究还是比较少的，2005年水稻基因组精细图的完成，加快了水稻的研究。
[0004] 2006年jain用
生物信息学的方法鉴定出水稻中Aux/IAA有31个家族成员，但是，关于具体成员的生物学功能知道的还不多。2006年，有人报道了一个Aux/IAA基因超表达后，发现转基因植株展现一系列生长素响应缺失表型，如对外源施用的生长素不敏感，不定根和侧根都大量的减少，重
力反应迟钝等等。
[0005] 2012年，朱振兴等报道水稻上的OsIAA11功能获得突变基因严重阻碍了侧根原基的发生，但其对冠状根的发育却没有影响。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种控制水稻无侧根性状的突变基因Oslrt1、其检测及应用，该突变基因使水稻侧根发育受阻，表现为突变体基本没有侧根生长，该控制无侧根突变性状基因位点与
现有技术中图位克隆到控制水稻侧根起始的基因OsIAA11位点不同。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 一种控制水稻无侧根性状的突变基因Oslrt1，其基因组全长2672bp，含有5个外显子，其第2外显子的第15位处有G-A的
碱基突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 进一步，所述突变基因Oslrt1的CDS全长711bp，CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 又，所述第2外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011] 所述控制水稻无侧根性状的突变基因Oslrt1编码的
蛋白质，其
氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012] 一种检测控制水稻无侧根性状突变基因Oslrt1的引物对，引物对的上游序列为：5’-TTCTTCCAACACCTCCTAATCA-3’，下游序列为：5’-AGGGGACATCACATAACACCAA-3’。
[0013] 一种检测控制水稻无侧根性状突变基因Oslrt1的
试剂盒，其包括所述检测控制水稻无侧根性状突变基因Oslrt1的引物对。
[0014] 所述控制水稻无侧根性状突变基因Oslrt1在水稻育种中的应用。
[0015] 水稻侧根突变体是研究侧根发生发育及侧根有关基因图位克隆的最理想材料。用NaN3处理‘大力’水稻
种子后，得到一个半显性的侧根异常水稻突变体材料RM109，该突变体杂合子侧根数量显著减少，纯合突变体表现出无侧根，对生长素基因OsIAA11测序对比验证发现，RM109与日本‘大力’的生长素基因OsIAA11序列无差异。
[0016] 水稻侧根突变体RM109的表皮细胞、外皮细胞核后壁细胞的形态也都表现出异常，细胞排列散乱、细胞壁变厚、根毛长度明显变短等。控制水稻侧根突变体RM109无侧根形成的基因功能与已经报道的侧根起始相关基因有很多的不同之处。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0018] 本发明以RM109无侧根突变体为研究材料，通过图位克隆方法，找到控制突变体性状的基因Oslrt1，该突变基因是水稻生长素相关基因OsIAA13的一个等位突变基因，具有控制水稻侧根发育的功能，使水稻侧根发育受阻，突变体无侧根伸长，利用突变基因Oslrt1，可在水稻育种中用于调控编码水稻无侧根性状蛋白质的表达，选育出根系优良的水稻。
附图说明
[0019] 图1为无侧根突变体RM109和野生型大力在正常条件下7天
水培幼苗根部照片对照。
[0020] 图2-3为本发明
实施例中对突变基因的初
定位结果，其中，图2表示BSA定位方法，图3表示初定位结果。
[0021] 图4为本发明水稻侧根性状突变基因的突变位点与野生型大力的DNA序列比对结果。
具体实施方式
[0022] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0023] 实施例本发明控制水稻无侧根性状的突变基因Oslrt1的定位过程[0024] 1.获得突变体
[0025] 用化学诱变剂叠氮化钠(10-3mol/L，NaN3)处理野生型水稻种子‘大力’6小时，育苗后获得M2种子，M2种子
播种于2,4-D水溶液(10-6mol/L，pH 5.0)，筛选根部区别于野生型的2，-D抗性突变体材料，获得M3种子，继续种植，进行2,4-D抗性鉴定，直至获得稳定的无侧根突变体材料RM109，如图1，参考文献郝再彬(核农学报，2002，16(1)：15-19)。
[0026] 2.基因定位
[0027] 将获得的无侧根突变体RM109与密阳23号杂交后自交，构建由257个个体组成的F2代分离群体，将其作为定位群体，利用亲本RM109、密阳23号及4个基因池(无侧根类型2个重复基因池B1、B3和正常侧根类型2个重复基因池B2、B4)，采用BSA定位方法对控制无侧根突变性状基因进行定位，将其初步定位在第3号
染色体RM1038附近(图2-3)。
[0028] 本实施例从F2代群体后代中选取了一个株系作为F3，选取的原则为：目标基因区间尽量保持基因型的杂合。
[0029] 之后，单株采集F3代个体的
叶片，进行基因型的检测；待成熟后，单株收取种子。
[0030] 根据F3个体的基因型表现，按照与F2代后代相同的选取原则，选取了2870个F4代单株，构建精细定位群体。之后采集F4代叶片，
收获单株籽粒，分别完成分子标记基因型和表型性状表现的检测。
[0031] 本实施例构建了包含2870个单株的精细定位群体，最终利用710株极性显性单株(完全无侧根)用于精细定位，利用初定位的紧密连
锁的SSR标记(RM15826和RM1038)对710株极性显性单株叶片的基因组DNA进行PCR分析，筛选出57个重组单株。
[0032] 开发出9对具有多态性的InDel标记，参见表1。
[0033] 利用在初定位区间的11个SSR标记(参见表2)及新开发的9对具有多态性的InDel标记，对57个重组单株进行基因分型，最终将目的基因精确定位于InDel1与R15909之间，大小为183Kb，位于水稻第3号染色体上。
[0034] 表1目标区间RM15826–RM1038内的新开发的InDel标记序列
[0035]
[0036] 表2精细定位的SSR多态性引物表
[0037]
[0038] 根据水稻基因组
数据库网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)提供的基因注释信息，进行候选基因分析，得知：该区间含有的一个注释基因LOC_Os03g53150第266个碱基由G变成A(GGT-GAT)，造成氨基酸由甘氨酸突变为天
门冬氨酸，该基因编码一个OsIAA13生长素
信号转导，而近年来的研究表明，OsIAA13基因参与调控水稻侧根起始，因此，本发明将该基因确定为lrt1的候选基因。
[0039] 3.基因预测和序列分析
[0040] 本实施例根据OsIAA13基因的CDS序列信息，设计扩增完整ORF的引物，引物上游序列为：5’-TTCTTCCAACACCTCCTAATCA-3’，下游序列为：5’-AGGGGACATCACATAACACCAA-3’。
[0041] 分别以无侧根突变体RM109与其野生型对照大力的根部cDNA为模板，用高保真酶扩增，PCR产物直接送上海
生物工程有限公司测序分析。测序比对分析发现，ORF的第267个碱基发生突变，无侧根突变体RM109中，由G突变为A(图4)，该突变引起OsIAA13编码蛋白第89位氨基酸由Gly(甘氨酸)突变成Asp(天冬氨酸)。
