一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用
阅读：449发布：2024-02-20
专利汇可以提供一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种谷 氨 酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用。本发明提供了一种 蛋白质 ，是将来源于乳酸菌的谷氨酸脱羧酶b蛋白的第37位丙氨酸和/或第153位丙氨酸进行突变得到的。实验证明，采用本发明所提供的谷氨酸脱羧酶突变体，较野生型漆酶相比，具有比活 力 高且酸性依赖弱的特点，在γ-氨基丁酸(GABA)的制备中有良好的应用前景。，下面是一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种蛋白质，是将来源于乳酸菌的谷氨酸脱羧酶b蛋白的第37位丙氨酸和/或第153位丙氨酸进行突变得到的。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是将来源于乳酸菌的谷氨酸脱羧酶b蛋白进行如下(a1)和/或(a2)的突变得到的：
(a1)第37位丙氨酸突变为丝氨酸；
(a2)第153位丙氨酸突变为苏氨酸。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是如下(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b4)将序列2所示的氨基酸序列经过除第37位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；
(b5)将序列3所示的氨基酸序列经过除第153位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质；
(b6)将序列4所示的氨基酸序列经过除第37位氨基酸残基和第153位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
4.编码权利要求1至3任一所述蛋白质的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(c1)-(c)中任一所述的DNA分子：
(c1)编码区如序列表中序列6所示的DNA分子；
(c2)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；
(c3)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；
(c4)在严格条件下与(c1)或(c2)或(c3)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1至3任一所述蛋白质的DNA分子；
(c5)与(c1)或(c2)或(c3)或(c4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求
1至3任一所述蛋白质的DNA分子。
6.含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
7.权利要求1至3任一所述蛋白质的应用，为如下(d1)-(d3)中至少一种：
(d1)作为谷氨酸脱羧酶；
(d2)催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸；
(d3)以谷氨酸为原料制备γ-氨基丁酸。
8.一种重组菌，是将权利要求4或5所述的基因导入宿主菌中得到的。
9.一种谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求8所述的重组菌，从重组菌中得到谷氨酸脱羧酶。
10.权利要求8所述的重组菌，或，权利要求9所述的方法，在制备谷氨酸脱羧酶产品中的应用。
一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用。
背景技术
[0002] 谷氨酸脱羧酶(GAD)是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶，催化L-谷氨酸进行不可逆的α-脱羧反应形成γ-氨基丁酸(GABA)。GABA具有降血压、抗焦虑与抑郁、改善肾机能和肝功能、促进生殖、抗热应激以及增加动物采食量等功能，在食品、医药和饲料行业中应用前景广泛。GAD广泛存在于真核生物和原核生物中，但是在不同物种中，GAD的功能是有差异的。高等动物中，GAD主要的功能是生成抑制性神经递质GABA，控制神经发生的基本过程；植物中，GAD受pH和结合在其C末端的Ca2+/钙调节蛋白的调控，参与保障植物正常生产和应激反应；微生物中，GAD转化酸性的L-Glu为中性的GABA并消耗质子，维持细胞内的pH稳定，是细菌耐酸系统的关键酶。
[0003] 乳酸菌是GARS认证的微生物，GABA生产能力强，是微生物法发酵生产GABA的主要菌种。乳酸菌的GAD属于胞内酶，一般为二聚体，由酸胁迫诱导产生，底物专一性高，最适反应温度为30-50℃，最适pH在4.0-5.0。乳酸菌基因组中有gadA和gadB两个编码基因，分别编码GADa和GADb两种GAD。GADb的脱羧活力较高且与GADa的保守性低，但两者均存在PLP依赖型脱羧酶的保守结构域和结合基序。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)是目前文献报道中GABA产量最高的乳酸菌，且异源表达其GADb的大肠杆菌工程菌不需额外添加辅酶PLP就能高效转化Glu为GABA。因此，若能获得短乳杆菌高比活力的GADb，同时再将其在大肠杆菌大量可溶表达，将具有重要的产业意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用。
[0005] 本发明提供了一种蛋白质，是将来源于乳酸菌的谷氨酸脱羧酶b蛋白的第37位丙氨酸和/或第153位丙氨酸进行突变得到的。
[0006] 所述蛋白质是将来源于乳酸菌的谷氨酸脱羧酶b蛋白进行如下(a1)和/或(a2)的突变得到的：
[0007] (a1)第37位丙氨酸突变为丝氨酸；
[0008] (a2)第153位丙氨酸突变为苏氨酸。
[0009] 所述乳酸菌具体可为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，更具体可为ATCC NO.367的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
[0010] 所述蛋白质是如下(b1)-(b6)中的任一种：
[0012] (b2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0013] (b3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014] (b4)将序列2所示的氨基酸序列经过除第37位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；
[0015] (b5)将序列3所示的氨基酸序列经过除第153位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质；
[0016] (b6)将序列4所示的氨基酸序列经过除第37位氨基酸残基和第153位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
[0017] 为了使(b1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0018] 为了使(b2)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0019] 为了使(b3)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0020] 表1标签的序列
[0021]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0022] 上述(b4)-(b6)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0023] 本发明还保护编码以上任一所述蛋白质的基因。
[0024] 所述基因为如下(c1)-(c)中任一所述的DNA分子：
[0025] (c1)编码区如序列表中序列6所示的DNA分子；
[0026] (c2)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；
[0027] (c3)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；
[0028] (c4)在严格条件下与(c1)或(c2)或(c3)限定的DNA序列杂交且编码以上任一所述蛋白质的DNA分子；
[0029] (c5)与(c1)或(c2)或(c3)或(c4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码以上任一所述蛋白质的DNA分子。
[0030] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
[0031] 本发明还保护含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
[0032] 所述重组表达载体具体可为在pBAD/hisB载体的多克隆位点(例如BglII和EcoRI酶切位点间)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0033] 所述重组表达载体具体可为在pBAD/hisB载体的多克隆位点(例如BglII和EcoRI酶切位点间)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0034] 所述重组表达载体具体可为在pBAD/hisB载体的多克隆位点(例如BglII和EcoRI酶切位点间)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0035] 本发明还保护以上任一所述蛋白质的应用，为如下(d1)-(d3)中至少一种：
[0036] (d1)作为谷氨酸脱羧酶；
[0037] (d2)催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸；
[0038] (d3)以谷氨酸为原料制备γ-氨基丁酸。
[0039] 本发明还保护一种重组菌，是将以上任一所述基因导入宿主菌中得到的。
[0040] 所述基因可通过含有所述基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。
[0041] 所述重组表达载体具体可为在pBAD/hisB载体的多克隆位点(例如BglII和EcoRI酶切位点间)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0042] 所述重组表达载体具体可为在pBAD/hisB载体的多克隆位点(例如BglII和EcoRI酶切位点间)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0043] 所述重组表达载体具体可为在pBAD/hisB载体的多克隆位点(例如BglII和EcoRI酶切位点间)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0044] 所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株。
[0045] 本发明还保护一种谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到谷氨酸脱羧酶。
[0046] 所述“从重组菌中得到谷氨酸脱羧酶”具体可包括步骤(e1)和(e2)：
[0047] (e1)破碎所述重组菌菌体，得到含有谷氨酸脱羧酶的粗提液；
[0048] (e2)分离所述粗提液中的谷氨酸脱羧酶并进行脱盐处理，得到谷氨酸脱羧酶。
[0049] 所述分离所述粗提液中的谷氨酸脱羧酶可采用亲和层析的方法对所述粗提液中的谷氨酸脱羧酶进行纯化，具体可采用HisTrapFF亲和层析柱进行纯化。
[0050] 所述脱盐处理可采用脱盐柱的方法对所述粗提液中的谷氨酸脱羧酶进行纯化，具体可采用HiTrap脱盐柱进行纯化。
[0051] 本发明还保护所述重组菌或所述方法，在制备谷氨酸脱羧酶产品中的应用。
[0053] 图1为谷氨酸脱羧酶B突变体表达工程菌菌株细胞破碎得到的上清液的SDS-PAGE电泳。其中，泳道M为分子量为14-100KDa的蛋白质Marker；泳道1为pBAD/K12菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道2为KLG01菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道3为KLG02菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道4为KLG03菌株的细胞破碎后得到的上清液；泳道5为KLG04菌株的细胞破碎后得到的上清液。
[0054] 图2为γ-氨基丁酸(GABA)的标准曲线。
[0055] 图3为pBAD/K12菌株、KLG01菌株、KLG02菌株、KLG03菌株和KLG04菌株的γ-氨基丁酸产量的时间变化曲线。
具体实施方式
[0056] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0057] 下述实施例中的pBAD/hisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01。pBAD/hisB载体中位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为ara启动子，在ara启动子下游MCS上游有组氨酸标签，组氨酸标签带有起始密码子ATG，故而在MCS处插入的外源基因，可以没有起始密码子，只要三联密码子与之相符，没有移码即可。
[0058] 大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株：参考文献：Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillA Datsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner and Hirotada Moril.Construction of Escherichia coli K-12 in-frame，single-gene knockout mutants：the Keio collection.Molecular Systems Biology.(2006)：1-11).；公众可从福建师范大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0059] 实施例中的自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E；其中组分A、B、C、D和E的组成如下：
[0061] B-50×M：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1.25M Na2HPO4、1.25M KH2PO4、2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
[0062] C-50×5052：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：质量浓度为25％的甘油、质量浓度为2.5％的葡萄糖、质量浓度为10％的L-阿拉伯糖；
[0063] D：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：1M MgSO4；
[0064] E-1000×微量元素：由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，2mM CoCl2、2mM NiCl2、2mM Na2Mo4、2mM Na2SeO3和2mM H3BO3。
[0065] 实施例1、野生型谷氨酸脱羧酶B基因重组工程菌的构建
[0066] 一、野生型谷氨酸脱羧酶B基因重组质粒的构建
[0067] 采用序列表的序列5所示的双链DNA分子(来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC NO.367的谷氨酸脱羧酶B的编码基因LbgadB)替代pBAD/hisB载体的BglII和EcoRI酶切位点之间的片段，得到野生型谷氨酸脱羧酶B基因重组质粒pBAD/hisB-LbgadB(已经测序验证)。序列表的序列5所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质(谷氨酸脱羧酶B，命名为LbGADb)。
[0068] 二、野生型谷氨酸脱羧酶B基因重组工程菌及对照工程菌的构建
[0069] 1、将步骤一制备的重组质粒pBAD/hisB-LbgadB导入大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株中，得到野生型谷氨酸脱羧酶B基因重组工程菌LbgadB/K12。重组工程菌LbgadB/K12破碎后离心得到的上清液经SDS-PAGE电泳验证可见谷氨酸脱羧酶B(LbGADb)(53KD)有表达(图1中泳道2)。
[0070] 2、将pBAD/hisB载体导入大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株中，得到对照工程菌pBAD/K12。pBAD/K12菌株破碎后离心得到的上清液经SDS-PAGE电泳检测结果见图1的泳道1。
[0071] 实施例2、谷氨酸脱羧酶突变体基因的获得及重组工程菌的构建
[0072] 一、谷氨酸脱羧酶LbGADbA37S编码基因及其重组工程菌的构建
[0073] 1、以实施例1得到的重组质粒pBAD/hisB-LbgadB为模板，采用引物LbgadBA37S-F和引物LbgadBA37S-R组成的引物对利用定点突变试剂盒(TransGen，货号：FM111-01)进行定点突变，筛选得到突变成功的重组质粒，将其命名为重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA37S。
[0074] LbgadBA37S-F：5’-AAATTGGCAAAGCACTCGCTCGAGCC-3’(SEQ ID No.6的第93-119位序列，下划线部分为与序列5相比突变位点)；
[0075] LbgadBA37S-R：5’-AGTGCTTTGCCAATTTATATTTGGGG-3’(SEQ ID No.6的第84-109位的反向互补序列，下划线部分为与序列5相比突变位点)。
[0076] 经测序，重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA37S是采用序列表的序列6所示的双链DNA分子替代pBAD/hisB载体的BglII和EcoRI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。序列表的序列6所示的DNA分子编码序列表的序列2所示的蛋白质(谷氨酸脱羧酶B，命名为LbGADbA37S)。
[0077] 2、将步骤1得到的重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA37S导入大肠杆菌(Escherichia A37S A37Scoli)K12菌株中，得到重组工程菌LbgadB /K12。重组工程菌LbgadB /K12破碎后离心得到的上清液经SDS-PAGE电泳验证可见谷氨酸脱羧酶B(LbGADbA37S)(53KD)有表达(图1中泳道3)。
[0078] 二、谷氨酸脱羧酶LbGADbA153T编码基因及其重组工程菌的构建
[0079] 1、以实施例1得到的重组质粒pBAD/hisB-LbgadB为模板，采用引物LbgadBA153T-F和引物LbgadBA153T-R组成的引物对利用定点突变试剂盒(TransGen，货号：FM111-01)进行定点突变，筛选得到突变成功的重组质粒，将其命名为重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA153T。
[0080] LbgadBA153T-F：5’-GGTCTTGACTTAACTACCCATCAACC-3’(SEQ ID No.7的第442-467位序列，下划线部分为与序列5相比突变位点)；
[0081] LbgadBA153T-R：5’-TAGTTAAGTCAAGACCGTTCGCTTTG-3’(SEQ ID No.7的第432-457位的反向互补序列，下划线部分为与序列5相比突变位点)。
[0082] 经测序，重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA153T是采用序列表的序列7所示的双链DNA分子替代pBAD/hisB载体的BglII和EcoRI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。序列表的序列7所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质(谷氨酸脱羧酶B，命名为LbGADbA153T)。
[0083] 2、将步骤1得到的重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA153T导入大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株中，得到重组工程菌LbgadBA153T/K12。重组工程菌LbgadBA153T/K12破碎后离心得到的上清液经SDS-PAGE电泳验证可见谷氨酸脱羧酶B(LbGADbA153T)(53KD)有表达(图1中泳道4)。
[0084] 三、谷氨酸脱羧酶LbGADbA37S/A153T编码基因及其重组工程菌的构建
[0085] 1、以步骤一得到的重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA37S为模板，采用引物LbgadBA153T-F和引物LbgadBA153T-R组成的引物对利用定点突变试剂盒(TransGen，货号：FM111-01)进行定A37S/A153T点突变，筛选得到突变成功的重组质粒，将其命名为重组质粒pBAD/hisB-LbgadB 。
[0086] 经测序，重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA37s/A153T是采用序列表的序列8所示的双链DNA分子替代pBAD/hisB载体的BglII和EcoRI酶切位点之间的片段得到的重组质粒。序列表的序列8所示的DNA分子编码序列表的序列4所示的蛋白质(谷氨酸脱羧酶B，命名为LbGADbA37S/A153T)。
[0087] 2、将步骤1得到的重组质粒pBAD/hisB-LbgadBA37S/A153T导入大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株中，得到重组工程菌LbgadBA37S/A153T/K12。重组工程菌LbgadBA37S/A153T/K12破碎后离心得到的上清液经SDS-PAGE电泳验证可见谷氨酸脱羧酶B(LbGADbA37S/A153T)(53KD)有表达(图1中泳道5)。
[0088] 实施例3、谷氨酸脱羧酶B的比活力测定
[0089] 待测菌：对照工程菌pBAD/K12、重组工程菌LbgadB/K12、重组工程菌LbgadBA37S/K12、重组工程菌LbgadBA153T/K12和重组工程菌LbgadBA37S/A153T/K12。
[0090] 1、将待测菌接种于含有100μg/mL氨卞青霉素的LB固体培养基中，37℃培养12h。
[0091] 2、完成步骤1后，挑取单菌落，接种于含有100μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡过夜培养。
[0092] 3、完成步骤2后，取培养物，按照1％(体积百分比)的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，30℃、200rpm振荡过夜16h。
[0093] 4、完成步骤3后，取培养体系，4℃，8000g条件下离心10min，收集菌体沉淀，采用缓冲液(50mM磷酸钠、20mM咪唑、300mM氯化钠，pH 7.4)重悬菌体沉淀后进行冰浴超声波破碎(超声，功率35％，工作5s，停顿5s，总时间5min)，超声结束后4℃，10000g离心5min，取上清液(粗酶液)。
[0094] 5、将步骤4得到的粗酶液经0.22μm水系膜过滤后，采用HisTrapFF亲和层析柱(GE Healthcare，货号：17-5255-01)进行分离纯化，采用洗脱液(50mM磷酸钠、250mM咪唑、300mM氯化钠，pH 7.4)进行洗脱，收集洗脱液(酶液)。
[0095] 6、将步骤5得到的洗脱液(酶液)用HiTrap脱盐柱(GE Healthcare，货号：17-1408-01)脱盐，脱盐缓冲液为200mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.6)，收集蛋白峰值处的流出液，获得纯酶液。采用改良型Bradford法试剂盒(上海生工，货号：SK3041)测定纯酶液的蛋白浓度(见表2)。
[0096] 表2不同谷氨酸脱羧酶B的浓度(单位：mg/mL)
[0097]LbGADb LbGADbA37S LbGADbA153T LbGADbA37S/A153T
9.76 7.28 8.05 6.39
9.76 7.28 8.05 6.39
[0098] 7、将20μl步骤6得到的纯酶液(45℃下预热5min)和980μl200mM的醋酸钠缓冲液(含有0.02mM PLP、200mM L-谷氨酸钠，pH 4.6，45℃下预热5min)混合后，45℃下酶促反应30min，然后迅速煮沸10min终止反应，离心后取上清(待测液)，测定其中的γ-氨基丁酸(GABA)浓度。
[0099] GABA浓度的测定采用高效液相色谱(HPLC)方法，具体测定步骤如下：
[0100] (1)GABA标准曲线的绘制
[0101] 准确称取0.0848g GABA标准品(Sigma，货号：A2129)置于100mL容量瓶中，加入50mL高纯水，搅拌使其完全溶解后再用高纯水定容至100mL；摇匀后采用高纯水依次稀释成不同浓度(0.848g/L、0.6784g/L、0.424g/L、0.2544g/L、0.1272g/L、0.0763g/L和0.0513g/L)的GABA标准溶液。
[0102] 将配制的不同浓度的GABA标准溶液进行衍生反应，衍生反应的具体方法如下：将衍生剂A、衍生剂B和GABA标准溶液按照体积比1∶1∶2的比例进行混合得到衍生反应体系，将衍生反应体系在40℃温度条件下进行衍生反应1小时，得到衍生反应后的溶液。向衍生反应后的溶液中加入等体积的正己烷并进行涡旋混匀，静置反应10min，得到衍生液。
[0103] 衍生剂A：将0.12mL的异硫氰酸苯酯用乙腈定容于10mL容量瓶中获得的体积百分比浓度为1.2％的异硫氰酸苯酯溶液。
[0104] 衍生剂B：将1.39mL的三乙胺用乙腈定容于10mL容量瓶中获得的体积百分比浓度为13.9％的三乙胺溶液。
[0105] 吸取衍生液中的下层液相，采用0.22μm的有机系滤头进行过滤，收集滤液，采用HPLC进行定量测定，以254nm吸收峰的峰面积为横坐标，GABA标准品浓度为纵坐标，绘制GABA的标准曲线(结果见图2)。
[0106] HPLC测定条件如下：
[0107] 色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18反相柱(5μm，250×4.6mm)；
[0108] 柱温：40℃；
[0109] 检测波长：254nm；
[0110] 流动相：0.05M的乙酸-乙酸钠溶液：乙腈(v∶v)＝80∶20；
[0111] 流速：0.8mL/min。
[0112] (2)反应液中GABA浓度的测定
[0113] 将待测液稀释20倍后开始衍生反应，按照步骤(1)中的方法获得衍生液，吸取衍生液中的下层液相，采用0.22μm的有机系滤头进行过滤，收集滤液，采用HPLC进行定量测定。根据转化液在254nm处吸收峰的峰面积和GABA的标准曲线换算出反应液中的GABA质量浓度。衍生方法与HPLC测定条件与GABA标准品的衍生和测定方法一致。
[0114] GABA含量的计算：CGABA＝0.10086×Pst+0.00145
[0115] 其中：其中A为反应液的稀释倍数；Pst为反应液在254nm处吸收峰的峰面积(Pst单位：Au)。
[0116] 1个酶活力的定义(U)：在上述反应条件下，每分钟催化1mmol的谷氨酸钠脱羧生成1mmol的γ-氨基丁酸所需要的酶量。
[0117] 酶活力(U)的计算：
[0118]
[0119] 其中：CGABA为反应液中GABA的浓度(g/L)，V为反应液的体积(L)，M为GABA的分子量(103.1g/mol)，t为酶促时间(min)，1000为mg和g的换算系数。
[0120] 比活力的计算：
[0121]
[0122] 其中：U为酶活力，C蛋白为反应液中酶的浓度。
[0123] 结果如表3所示。结果显示，三种谷氨酸脱羧酶突变体对底物的比活力较野生型均有大幅度的提高。其中，突变体LbGADbA37S/A153T的比活力比野生型提高了76.99％，突变体LbGADbA37S的比活力比野生型提高了44.08％，突变体LbGADbA153T的比活力比野生型提高了20.96％。结果表明，三种谷氨酸脱羧酶突变体，特别是双突变体LbGADbA37s/A153T，在比活力上较野生型谷氨酸脱羧酶具有明显的优势，在GABA生产方面有巨大的应用潜能。
[0124] 表3不同谷氨酸脱羧酶B的比活力(单位：U/mg)
[0125]A37S A153T A37S/A153T
LbGADb LbGADb LbGADb LbGADb
35.16±0.568 50.66±0.453 42.53±0.536 62.23±0.749
LbGADb LbGADb LbGADb LbGADb
35.16±0.568 50.66±0.453 42.53±0.536 62.23±0.749
[0126] 实施例4、工程菌全细胞催化Glu能力的分析
[0127] 待测菌：对照工程菌pBAD/K12、重组工程菌LbgadB/K12、重组工程菌LbgadBA37S/A153T A37S/A153TK12、重组工程菌LbgadB /K12和重组工程菌LbgadB /K12。
[0128] 1、将待测菌接种于含有100μg/mL氨卞青霉素的LB固体培养基中，37℃培养12h。
[0129] 2、完成步骤1后，挑取单菌落，接种于含有100μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡过夜培养。
[0130] 3、完成步骤2后，取培养物，按照1％(体积百分比)的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，30℃、200rpm振荡过夜16h。
[0131] 4、完成步骤3后，收集培养体系，4℃，8000g条件下离心10min，收集菌体。采用浓度为10mM的氯化钠水溶液洗涤菌体1次后以相同的离心条件再次收集菌体。
[0132] 5、完成步骤4后，采用浓度为3M谷氨酸水溶液重悬菌体沉淀，得到初始转化液。初始转化液中菌体含量以湿重计为10g/L。将初始转化液在45℃、100rpm条件下进行谷氨酸到γ-氨基丁酸的转化，分别收集1、2、3、4、5、6和7h的转化液。
[0133] 实验设三次重复，每次重复每个时间点设5个转化体系。
[0134] 采用高效液相色谱(HPLC)对转化液中的GABA产量进行测定，测定方法同实施例3。
[0135] 结果见图3。重组工程菌LbgadBA37S/A153T/K12转化5h，GABA产量高达301.91g/L，转化率达到97.61％，转化速率为60.38g/L·h；重组工程菌LbgadBA153T/K12转化5h，GABA产量为255.73g/L，转化率为82.68％，转化速率为51.15g/L·h；重组工程菌LbgadBA37S/K12转化5h，GABA产量高达279.02g/L，转化率为90.21％，转化速率为55.81g/L·h；对照工程菌pBAD/K12转化5h，GABA产量只有226.41g/L，转化率为73.20％，转化速率为45.28g/L·h；重组工程菌LbgadB/K12转化5h，GABA产量也仅有12.54g/L，转化率仅为4.05％，转化速率为
2.51g/L·h。
2.51g/L·h。
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