调节SLC20A2基因的剪接和表达的疗法
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202311370896.8 | 申请日 | 2023-10-20 |
| 公开(公告)号 | CN119857144A | 公开(公告)日 | 2025-04-22 |
| 申请人 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心; 福建医科大学附属第一医院; | 申请人类型 | 科研院所 |
| 发明人 | 程学文; 陈万金; 熊志奇; 赵淼; 陈蕾; 曾一恒; | 第一发明人 | 程学文 |
| 权利人 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心,福建医科大学附属第一医院 | 权利人类型 | 科研院所 |
| 当前权利人 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心,福建医科大学附属第一医院 | 当前权利人类型 | 科研院所 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市徐汇区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市徐汇区岳阳路320号新生命科学实验大楼A1008室 | 邮编 | 当前专利权人邮编：200031 |
| 主IPC国际分类 | A61K45/00 | 所有IPC国际分类 | A61K45/00 ; A61K48/00 ; A61K49/00 ; C12N15/113 ; C12N9/22 ; C12N5/10 ; C12N15/85 ; C12N15/90 ; C12Q1/686 ; C12Q1/02 ; G01N33/68 ; A01K67/027 ; A61P25/00 ; A61P13/12 ; A61P9/00 ; A61P19/08 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 25 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 中国贸促会专利商标事务所有限公司 | 专利代理人 | 杨棽; |
| 摘要 | 本 发明 提供了能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的 试剂 ，及其用于调节功能性PiT2蛋白的表达从而 预防 和/或 治疗 疾病 的用途。本发明还提供了基于人SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的脑 钙 化模型及其制备方法，以及该模型用于指示和分析脑钙化病发病阶段、或用于作为研究脑内磷稳态失衡或脑钙化病疾病靶点的模型、或用于筛选药物的用途。 | ||
| 权利要求 | 1.能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病。 |
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| 说明书全文 | 调节SLC20A2基因的剪接和表达的疗法技术领域[0001] 本发明提供了能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂，及其用于调节功能性PiT2蛋白的表达从而预防和/或治疗疾病的用途。本发明还提供了基于人SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的脑钙化模型及其制备方法，以及该模型用于指示和分析脑钙化病发病阶段、或用于作为研究脑内磷稳态失衡或脑钙化病疾病靶点的模型、或用于筛选药物的用途。 背景技术[0002] 脑钙化是神经退行性疾病的一个标志，估计约有20‑30％的老年人(年龄大于60岁)有脑钙化。原发性家族性脑钙化(PFBC)是一种老龄化相关的神经遗传病，其特点是双侧钙化沉积，主要在基底神经节、丘脑、小脑，有时在皮质下白质。PFBC发生在20‑60岁，发病率为0.2％‑0.6％，可能影响数以亿计的人，其中一半人可能表现出广泛的神经或心理症状，如头痛、帕金森病样运动缺陷、认知能力下降、焦虑和抑郁。目前，临床上只对PFBC患者进行对症治疗，如抗惊厥药、抗精神病药、抗抑郁药和控制帕金森病样症状的药物。双磷酸盐，一种主要用于骨质疏松症患者的焦磷酸盐类似物，曾被推测为通过抑制羟基磷灰石晶体介导的成核过程来缓解大脑钙化过程。然而，据报道，口服双磷酸盐仅在一小部分PFBC患者中显示出轻微和短暂的症状改善，并且没有观察到抑制钙化的效果。因此，PFBC患者对新疗法的需求尚未得到满足。 [0003] 反义寡核苷酸(ASO)是化学修饰核酸的单链聚合物，在许多神经系统疾病中表现出明显的疾病表型逆转。ASO最普遍的功能是通过招募RNase‑H介导的RNA降解来沉默基因表达，如应用于肌萎缩性脊髓侧索硬化症、Angelman综合症和亨廷顿病。ASO的另一个重要作用是通过形成稳定的ASO‑RNA双链来调节剪接，立体地阻断剪接复合体与顺式调控序列的结合，如用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)的ASO药物和靶向杜兴氏肌萎缩症(DMD)的目标基因可变剪接外显子的ASO试剂。最近，ASO介导的剪接调控受到越来越多的关注，因为它能够有效调控常染色体显性单倍体的疾病相关基因的表达水平，最近的例子如Dravet综合征中的可上调SCN1A表达的ASO试剂。此外，高效率的全脑递送能力、基于碱基序列互补的目标导向特异性、有限的毒性和精确的剂量使ASO成为临床试验中很有前途的治疗方法。 [0004] 然而在PFBC治疗领域中，尚未有通过调控SLC20A2基因的剪接调控来抑制脑钙化的报道。 发明内容[0005] 遗传学研究发现，PFBC可能是由SLC20A2、PDGFRB、PDGFB或XPR1的常染色体杂合突变或MYORG、JAM2或CMPK2的常染色体双等位突变引起的；特别的，SLC20A2基因的显性杂合突变在所有已报道的PFBC病例中占比61％，表明PFBC可以通过针对相应基因的基因疗法进行治疗。然而，对PFBC致病机理的理解不足，以及缺乏有效的传递工具，很大程度上阻碍了PFBC的基因编辑治疗的发展。 [0006] 本申请的发明人对135名经全外显子测序(WES)确定为外显子突变或CNV阴性的PFBC患者，进行了全基因组测序(WGS)，从6个常染色体显性遗传的PFBC家族中发现了5个SLC20A2基因的内含子变异，并随后通过minigene检测和病人来源的细胞实验确定了SLC20A2 pre‑mRNA的内含子序列存在隐蔽外显子序列，而上述内含子突变增加了这些隐蔽外显子序列在mRNA加工过程中的整合概率；由于这些隐蔽外显子序列中包含了提前终止密码子，进而异常剪接的mRNA序列不能翻译产生有功能的蛋白产物PiT2。由此，本申请的发明人发现了一种因SLC20A2 mRNA异常剪接中先前未报告的隐蔽外显子插入而导致PiT2翻译的提前终止，该种机制为调节SLC20A2基因的mRNA剪接和表达提供了一种新的策略。 [0007] 基于上述发现，本申请的发明人在含有SLC20A2内含子突变的细胞和来自SLC20A2单倍体功能不足患者的成纤维细胞中，通过ASO介导的剪接调控方法能够增强正常SLC20A2 mRNA和PiT2蛋白的表达。进一步在模拟SLC20A2缺陷的PFBC患者的人源化SLC20A2小鼠模型中，通过脑室内(ICV)给药的ASO能够减少异常SLC20A2转录物并抑制脑钙化的发生和进展。 [0008] 由此，本申请的发明人提供了通过调控SLC20A2可变剪接过程，降低内含子中隐蔽外显子的整合来抑制脑钙化的疗法，为治疗PiT2功能缺陷有关的疾病(例如SLC20A2单倍体剂量不足导致的PFBC)提供了一种有希望的治疗方式。 [0009] 此外，基于所发现的SLC20A2内含子中的可变剪接，本申请的发明人进一步提供了脑钙化的细胞和动物模型及其制备方法，该模型可用于指示和分析脑钙化病发病阶段，用于作为研究脑内磷稳态失衡或脑钙化病疾病靶点的模型，以及用于筛选药物。 [0010] I、调控可变剪接在疾病治疗中的应用 [0011] 在第一方面，本发明涉及调节SLC20A2基因前体mRNA的剪接从而恢复或增强SLC20A2基因的蛋白产物PiT2的表达和功能的试剂、方法和应用。 [0012] 本发明的一个方面提供了能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病的用途；或者在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病。本发明还提供了用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂。所述PiT2功能缺陷包括表达量或活性缺乏。 [0013] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括隐蔽外显子插入(cryptic exon inclusion)，所述试剂调节(例如抑制或增强)所述隐蔽外显子从SLC20A2基因的前体mRNA中的剪接。在某些实施方案中，所述试剂由此调节(例如抑制或增强)从所述前体mRNA加工的成熟mRNA的水平，和/或调节(例如抑制或增强)PiT2蛋白的表达。 [0014] 在某些实施方案中，所述试剂抑制成熟SLC20A2 mRNA中所述隐蔽外显子插入，增加正确剪接的成熟SLC20A2 mRNA水平，降低异常剪接的成熟SLC20A2 mRNA水平，和/或增加功能性PiT2蛋白的产生。在本文中，措辞“增加正确剪接的成熟SLC20A2 mRNA的水平”是指与处理之前或对照处理之后的水平相比，本发明提供的试剂处理之后正确剪接的成熟SLC20A2 mRNA的水平的增加。 [0015] 在某些实施方案中，所述试剂促进成熟SLC20A2 mRNA中所述隐蔽外显子插入，抑制正确剪接的成熟SLC20A2SLC20A2 mRNA水平，增加异常剪接的成熟SLC20A2 mRNA水平；其中，所述隐蔽外显子序列上携带有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)，该隐蔽外显子的插入导致功能性PiT2蛋白的产生的减少或抑制。在本文中，措辞“降低异常剪接的成熟SLC20A2 mRNA的水平”是指与处理之前或对照处理之后的水平相比，本发明提供的试剂处理之后异常剪接的成熟SLC20A2 mRNA的水平的降低。所述异常剪接的成熟SLC20A2 mRNA包括本文中所定义的外显子2和3之间或外显子10和11之间的隐蔽外显子插入。 [0016] 内含子2中的可变剪接 [0017] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子2中的可变剪接。 [0018] 在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子2和3之间的隐蔽外显子在加工后的SLC20A2 mRNA序列中的插入。 [0019] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。 [0020] 在某些实施方案中，SLC20A2基因的c.289+1007C>G突变促进所述内含子2中的可变剪接。 [0021] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0022] 在某些实施方案中，所述试剂抑制内含子2中的可变剪接。如本文使用的措辞“抑制内含子2中的可变剪接”是指降低在SLC20A2基因的内含子2中发现的135nt长度的隐蔽外显子序列(SEQ ID NO:2)添加到成熟SLC20A2 mRNA中的发生率。 [0023] 内含子10中的可变剪接 [0024] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接。 [0025] 在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子10和11之间的隐蔽外显子在加工后的SLC20A2 mRNA序列中的插入。 [0026] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。 [0027] 在某些实施方案中，SLC20A2基因的c.1795‑1698A>G突变促进所述内含子10中的可变剪接。 [0028] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0029] 在某些实施方案中，所述试剂抑制内含子10中的可变剪接。如本文使用的措辞“抑制内含子10中的可变剪接”是指降低在SLC20A2基因的内含子10中发现的76nt长度的隐蔽外显子序列(SEQ ID NO:3)添加到成熟SLC20A2 mRNA中的发生率。 [0030] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括所述内含子2中的可变剪接或内含子10中的可变剪接。在某些实施方案中，所述试剂为抑制内含子2中的可变剪接的试剂，或抑制内含子10中的可变剪接的试剂。 [0031] 目标区域 [0032] 在某些实施方案中，所述试剂特异性结合SLC20A2基因或其前体mRNA中的目标区域，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有所述隐蔽外显子。 [0033] 在某些实施方案中，所述目标区域在所述隐蔽外显子上游至多约100个(例如至多约90个、至多约80个、至多约70个、至多约60个、至多约50个、至多约40个、至多约30个、至多约20个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处至所述隐蔽外显子下游至多约100个(例如至多约90个、至多约80个、至多约70个、至多约60个、至多约50个、至多约40个、至多约30个、至多约20个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处的区域内。 [0034] 在某些实施方案中，所述目标区域选自跨越所述隐蔽外显子剪接位点的区域、所述隐蔽外显子内的区域、位于所述隐蔽外显子上游100个核苷酸内的区域、或位于所述隐蔽外显子下游100个核苷酸内的区域。 [0035] 在某些实施方案中，所述目标区域选自所述隐蔽外显子5’剪接位点(splicing acceptor site,SA)上游的区域、跨5’剪接位点的区域、所述隐蔽外显子内的区域、跨3’剪接位点的区域或3’剪接位点(splicing donor site,SD)下游的区域。 [0036] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内。 [0037] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SEQ ID NO:8所示的序列内。 [0038] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内。 [0039] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SEQ ID NO:9所示的序列内。 [0040] 在某些实施方案中，所述目标区域包含跨越所述隐蔽外显子5’剪接位点(splicing acceptor site,SA)的区域。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点上游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点下游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处的区域内。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点上游至多约20个核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点下游至多约20个核苷酸处的区域内。 [0041] 在某些实施方案中，所述目标区域包含跨越所述隐蔽外显子3’剪接位点(splicing donor site,SD)的区域。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点上游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点下游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处的区域内。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点上游至多约20个核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点下游至多约20个核苷酸处的区域内。 [0042] 在某些实施方案中，所述目标区域位于所述隐蔽外显子内。在某些实施方案中，所述目标区域或其附近包含剪接调控元件，例如剪接增强子元件或剪接沉默子元件。 [0043] 在某些实施方案中，所述目标区域位于所述隐蔽外显子上游或下游的内含子区域内。在某些实施方案中，所述目标区域或其附近包含剪接调控元件，例如剪接分支元件(branch site)、剪接增强子元件或剪接沉默子元件。 [0044] 试剂 [0045] 在某些实施方案中，所述试剂为反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)。在某些实施方案中，所述试剂为基因编辑工具，例如DNA或RNA编辑系统，例如CRISPR/Cas、碱基编辑器或非Cas蛋白依赖的RNA编辑工具。在某些实施方案中，所述试剂为DNA编辑器，如CRISPR/Cas9。在某些实施方案中，所述试剂为RNA编辑器，如CRISPR/Cas13。在某些实施方案中，所述试剂为碱基编辑器Adenine/Cytosine base editor。在某些实施方案中，所述试剂为非CRISPR/Cas系统依赖的RNA编辑工具。 [0046] ASO [0047] 在某些实施方案中，所述试剂是反义寡聚核苷酸(ASO)，其特异性结合SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域，ASO与目标区域特异性以碱基互补原则结合，进而以空间位阻效应发挥调节pre‑mRNA剪接的功能。 [0048] 在某些实施方案中，所述ASO由10～30个(例如15～30个、15～25个、18～30个、18～25个、20～25个)连续核苷酸组成；优选地由18～25个连续核苷酸组成。 [0049] 在本文中，术语ASO包括含有能够与目标mRNA上的核酸碱基互补杂交的核酸碱基的任何形式的寡聚分子。ASO可包含天然存在的核苷酸、核苷酸类似物、修饰的核苷酸或前述两者或三者的任何组合。术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代的糖基团和/或具有修饰主链的核苷酸。ASO化学修饰对于本领域技术人员将显而易见。 [0050] 在某些实施方案中，所述ASO包含主链核苷酸和核苷酸连接键的修饰、核糖的修饰、核糖侧链碱基的修饰或它们的组合。在某些实施方案中，所述主链修饰选自硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联(phosphorodiamidate linkage)。在某些实施方案中，所述糖部分修饰包括但不限于：2’‑O‑甲氧基乙基(2’‑MOE)、吗啉代(morpholino)、2’‑O‑甲基(2’‑OMe)、2’‑氟基(2’‑F)、限制性乙基(constrained ethyl,cEt)、锁核酸(LNA)、肽核酸。 [0051] 在某些实施方案中，ASO的每个单体以相同方式被修饰，例如ASO的主链的每个键联包含硫代磷酸酯键联或每个核糖部分包含2'O‑甲基修饰。存在于ASO的单体组分中的每一个上的此类修饰被称为“均一修饰”。在某些实施方案中，可能需要不同修饰的组合，例如ASO可包含二氨基磷酸酯键联与包含吗啉环(吗啉代)的糖部分的组合。针对ASO的不同修饰的组合被称为“混合修饰”或“混合化学修饰(mixed chemistries)”。 [0052] 在某些实施方案中，所述ASO包含2’MOE修饰。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’MOE修饰。在某些实施方案中，所述ASO的修饰包含2’MOE和锁核酸(LNA)的组合。在某些实施方案中，所述ASO具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0053] 在某些实施方案中，所述ASO包含2’‑OMe修饰。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’‑OMe修饰。在某些实施方案中，所述ASO的修饰包含2’‑OMe和锁核酸(LNA)的组合。在某些实施方案中，所述ASO具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0054] 在某些实施方案中，所述ASO包含二氨基磷酸酯键联与包含吗啉环(吗啉代)的糖部分的组合，例如为磷酸二酰胺吗啉代低聚物(Phosphorodiamidate morpholino oligomer,PMO)。 [0055] 在某些实施方案中，所述ASO特异性结合位于SLC20A2前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内的目标区域。 [0056] 在某些实施方案中，所述ASO与SEQ ID NO:8内的核苷酸序列具有至少80％的互补性。在本文中，互补性(一个多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)可依据相对链中根据普遍接受的碱基配对规则预期彼此形成氢键的碱基的比例(例如，百分比)来量化。ASO的序列不必与同其所杂交的目标核酸的序列100％互补。在某些实施方案中，ASO可与其所靶向的目标核酸序列内的目标区域具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列互补性。例如，寡聚化合物的20个核碱基中的18个与目标区域互补，并且将因此特异性杂交的ASO将呈现90％互补性。 [0057] 在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:13‑46、63‑65任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:19‑22、25、26任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。 [0058] 在一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:13‑46任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且包含2’MOE修饰和/或硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’MOE修饰，并且具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0059] 在另一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:63‑65任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且所述ASO为PMO。 [0060] 在某些实施方案中，所述ASO特异性结合位于SLC20A2前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内的目标区域。 [0061] 在某些实施方案中，所述ASO与SEQ ID NO:9内的核苷酸序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的互补性。 [0062] 在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:47‑61、66‑68任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。 [0063] 在一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:47‑61任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且包含2’MOE修饰和/或硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’MOE修饰，并且具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0064] 在另一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:66‑68任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且所述ASO为PMO。 [0065] 基因编辑工具 [0066] 在某些实施方案中，所述试剂为基因编辑工具，例如DNA基因编辑系统或RNA碱基编辑工具，其典型地包含(i)具备碱基编辑活性的模块和(ii)能够与SLC20A2基因中的所述目标区域结合的模块。所述基因编辑工具通过将基因组或前体mRNA序列中的隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0067] 示例性的基因编辑工具包括但不限于CRISPR/Cas系统、DNA碱基编辑器、RNA编辑工具。 [0068] CRISPR/Cas系统 [0069] 在某些实施方案中，所述试剂为CRISPR/Cas系统。所述CRISPR/Cas系统典型地包含Cas蛋白和引导RNA(guiding RNA,gRNA)，所述gRNA能够与SLC20A2基因或其前体mRNA中的所述目标区域结合。 [0070] 在某些实施方案中，所述gRNA结合目标区域进而招募Cas酶的结合并发挥编辑活性。 [0071] 在某些实施方案中，所述CRISPR系统通过将隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0072] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内。 [0073] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内。 [0074] DNA碱基编辑器 [0075] 在某些实施方案中，所述试剂为DNA碱基编辑器(DNA base editor)。DNA碱基编辑器典型地包含(i)包括DNA碱基编辑结构域(例如脱氨酶)以及DNA结合结构域(例如Cas蛋白，如Cas9或Cas12)的融合蛋白和(ii)引导RNA(guiding RNA,gRNA)，所述gRNA能够与SLC20A2基因中的所述目标区域结合。 [0076] 在某些实施方案中，所述gRNA结合目标区域并进而招募所述融合蛋白的结合并发挥碱基编辑活性。 [0077] 在某些实施方案中，所述DNA碱基编辑器通过将隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行碱基突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0078] 在某些实施方案中，所述Cas蛋白为催化活性失活(catalytically inactive)的Cas蛋白或Cas切口酶(Cas nickase protein)。 [0079] 在某些实施方案中，所述碱基编辑器包含：ABE(Adenine base editor)或CBE(Cytosine base editor)，或通过分子进化/突变筛选获得的新型编辑器。 [0080] RNA编辑工具 [0081] 在某些实施方案中，所述试剂为RNA编辑工具。RNA编辑工具例如包含：基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器，非CRISPR/Cas系统依赖的编辑器，如基于寡聚核苷酸的碱基编辑器等。 [0082] 在某些实施方案中，所述基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器包含(i)包括RNA碱基编辑结构域(例如RNA脱氨酶)以及RNA结合结构域(例如Cas13)的融合蛋白和(ii)引导RNA(guiding RNA,gRNA)，所述gRNA能够与SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域结合。所述gRNA结合目标区域并进而招募所述融合蛋白的结合并发挥碱基编辑活性。 [0083] 在某些实施方案中，所述基于寡聚核苷酸的碱基编辑器包含(i)可招募内源RNA碱基编辑蛋白(例如RNA脱氨酶，如ADAR)的序列模块和(ii)能够与SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域结合的向导序列模块。所述向导序列模块结合目标区域并进而招募所述RNA碱基编辑蛋白的结合并发挥碱基编辑活性。 [0084] 在某些实施方案中，所述RNA编辑工具通过将pre‑mRNA中的隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行碱基突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0085] 应用 [0086] 在某些实施方案中，所述PiT2功能缺陷涉及SLC20A2基因中的突变。在某些实施方案中，所述突变选自非同义突变、无义突变、移码突变、剪接突变或结构变异。 [0087] 在某些实施方案中，所述突变位于外显子区域，所述受试者对于所述外显子区域的突变是杂合的。 [0088] 在某些实施方案中，所述突变是内含子突变，例如内含子2和/或内含子10内的突变。在某些实施方案中，所述突变位于内含子中的所述目标区域，所述受试者对于位于所述目标区域内含子突变可以是杂合、纯合或者复合杂合的。 [0090] 在某些实施方案中，所述PiT2功能缺陷为SLC20A2单倍体剂量不足。 [0091] 在某些实施方案中，所述药物通过增加受试者的细胞对PiT2蛋白或功能性RNA的表达来治疗所述疾病。因此，在某些实施方案中，本发明所涉及的疾病可以是任何由PiT2功能缺陷导致或涉及PiT2功能缺陷的疾病，只要所述疾病的治疗将受益于功能性PiT2蛋白或RNA表达的调控(例如增加)。 [0092] 在某些实施方案中，所述与PiT2功能缺陷有关的疾病为脑钙化。在某些实施方案中，所述脑钙化是原发性家族性脑钙化(PFBC)。 [0093] 在某些实施方案中，所述与PiT2功能缺陷有关的疾病为与Pi平衡异常有关的疾病。在某些实施方案中，所述与Pi平衡异常有关的疾病包括慢性肾脏病、心脏瓣膜钙化、动脉血管钙化，和/或磷稳态失衡相关的骨骼疾病。 [0094] 在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的试剂可以被配制成与其预期施用途径相兼容的剂型，例如可通过局部(local)给药(如直接注射或植入)、全身给药或皮下、静脉内、腹膜内或肠胃外途径给药，包括颅内(如脑室内、脑膜内或鞘内)、肌内、透皮、气道(气溶胶)、鼻腔、口腔、直肠或局部(topical)(包括颊和舌下)给药。 [0095] 在某些实施方案中，所述试剂通过吸入、鼻内给药、气管内给药或口咽吸入给药。可通过将所需量的活性成分掺入适当溶剂中，随后无菌过滤来制备适于吸入施用的制剂。 通常，用于吸入给药的制剂是生理pH下的无菌溶液，并且具有低粘度。可以将盐添加到制剂中以平衡张力。在一些情况下，可以添加表面活性剂或共溶剂以增加活性成分溶解度并改善气溶胶特性。在一些情况下，可以添加赋形剂以控制粘度，以便确保雾化液滴的大小和分布。 [0096] 在某些实施方案中，所述试剂可通过注射给药，例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内、关节内、眼内、腹膜内、脑室内(例如通过腰椎穿刺给药)或局部给药。适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。药物组合物在生产和储存条件下应保持稳定，并应防止细菌和真菌等微生物的污染作用。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的活性成分，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。 [0097] 在某些实施方案中，所述试剂选自ASO，所述药物组合物优选被配置为溶液、乳液、微乳液、泡沫体或含有脂质体的制剂(例如，阳离子脂质体或非阳离子脂质体)。在某些实施方案中，所述药物组合物优选被配置为用于脑室内注射(例如通过腰椎穿刺进行)、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射来施用。 [0098] 另一方面，本发明提供了调节细胞中PiT2蛋白表达的方法，其包括在体外将如上所述的能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂与所述细胞接触。 [0099] 在某些实施方案中，所述细胞包含SLC20A2基因中的突变。在某些实施方案中，所述突变选自非同义突变、无义突变、移码突变、剪接突变或结构变异。在某些实施方案中，所述细胞对于所述突变是杂合的。在某些实施方案中，所述细胞对于所述突变是纯合的，其中所述突变位于所述目标区域内。 [0100] II、靶向SLC20A2目标区域的试剂及其应用 [0101] 在第二方面，本发明涉及靶向SLC20A2中目标区域从而恢复或增强SLC20A2基因产物功能的试剂、方法和应用。 [0102] 本发明的一个方面提供了能够特异性结合SLC20A2基因或其前体mRNA中的目标区域的试剂，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有隐蔽外显子。 [0103] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于内含子2内。 [0104] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.289+901至c.289+1035。 [0105] 在某些实施方案中，SLC20A2基因的c.289+1007C>G突变促进所述内含子2中的隐蔽外显子插入。 [0106] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0107] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内。 [0108] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SEQ ID NO:8所示的序列内。 [0109] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于内含子10内。 [0110] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.1795‑1703至c.1795‑1627。 [0111] 在某些实施方案中，SLC20A2基因的c.1795‑1698A>G突变促进所述内含子10中的隐蔽外显子插入。 [0112] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0113] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内。 [0114] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SEQ ID NO:9所示的序列内。 [0115] 在某些实施方案中，所述目标区域在所述隐蔽外显子上游至多约100个核苷酸处至所述隐蔽外显子下游至多约100个核苷酸处的区域内。 [0116] 在某些实施方案中，所述目标区域选自跨越所述隐蔽外显子剪接位点的区域、所述隐蔽外显子内的区域、位于所述隐蔽外显子上游100个核苷酸内的区域、或位于所述隐蔽外显子下游100个核苷酸内的区域。 [0117] 在某些实施方案中，所述目标区域选自所述隐蔽外显子5’剪接位点(splicing acceptor site,SA)上游的区域、跨5’剪接位点的区域、所述隐蔽外显子内的区域、跨3’剪接位点的区域或3’剪接位点(splicing donor site,SD)下游的区域。 [0118] 在某些实施方案中，所述目标区域包含跨越所述隐蔽外显子5’剪接位点(splicing acceptor site,SA)的区域。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点上游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点下游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处的区域内。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点上游至多约20个核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的5’剪接位点下游至多约20个核苷酸处的区域内。 [0119] 在某些实施方案中，所述目标区域包含跨越所述隐蔽外显子3’剪接位点(splicing donor site,SD)的区域。优选地，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点上游至多约25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点下游至多约 25个(例如至多约22个、至多约20个、多约18个、多约15个、多约12个、至多约10个、至多约9个、至多约8个、至多约7个、至多约6个、至多约5个、至多约4个、至多约3个、至多约2个、至多约1个)核苷酸处的区域内。在某些实施方案中，所述目标区域在相对于所述隐蔽外显子的 3’剪接位点上游至多约20个核苷酸处至相对于所述隐蔽外显子的3’剪接位点下游至多约 20个核苷酸处的区域内。 [0120] 在某些实施方案中，所述目标区域位于所述隐蔽外显子内。优选地，所述目标区域或其附近包含剪接调控元件，例如剪接增强子元件或剪接沉默子元件。 [0121] 在某些实施方案中，所述目标区域位于所述隐蔽外显子上游或下游的内含子区域内。优选地，所述目标区域或其附近包含剪接调控元件，例如剪接分支元件(branch site)、剪接增强子元件或剪接沉默子元件。 [0122] 在某些实施方案中，所述目标区域长度不超过100个核苷酸，例如不超过90个、不超过80个、不超过70个、不超过60个、不超过50个、不超过40个、不超过30个或不超过25个核苷酸。 [0123] 在某些实施方案中，所述试剂选自反义寡核苷酸(ASO)或基因编辑工具(例如CRISPR/Cas、碱基编辑器或非Cas蛋白依赖的RNA编辑工具)。 [0124] 在某些实施方案中，所述试剂为antisense oligonucleotides(ASOs)。在某些实施方案中，所述试剂为基因编辑工具，例如DNA或RNA编辑系统，例如CRISPR/Cas、碱基编辑器或非Cas蛋白依赖的RNA编辑工具。在某些实施方案中，所述试剂为DNA编辑器，如CRISPR/Cas9。在某些实施方案中，所述试剂为RNA编辑器，如CRISPR/Cas13。在某些实施方案中，所述试剂为碱基编辑器Adenine/Cytosine base editor。在某些实施方案中，所述试剂为非Cas蛋白依赖的RNA编辑工具。 [0125] ASO [0126] 在某些实施方案中，所述试剂是反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)，其特异性结合SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域，进而实现对SLC20A2基因的剪接调节和表达调控。 [0127] 在某些实施方案中，所述ASO由10～30个(例如15～30个、15～25个、18～30个、18～25个、20～25个)连续核苷酸组成；优选地由18～25个连续核苷酸组成。 [0128] 在某些实施方案中，所述ASO包含主链核苷酸和核苷酸连接键(例如磷酸二酯键)的修饰、核糖的修饰、核糖侧链碱基的修饰或它们的组合。在某些实施方案中，所述主链修饰选自硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联(phosphorodiamidate linkage)。在某些实施方案中，所述糖部分修饰选自但不限于：2’‑O‑甲氧基乙基(2’‑MOE)、吗啉代(morpholino)、2’‑O‑甲基(2’‑OMe)、2’‑氟基(2’‑F)、限制性乙基(constrained ethyl,cEt)、锁核酸(LNA)、肽核酸。 [0129] 在某些实施方案中，ASO的每个单体以相同方式被修饰，例如ASO的主链的每个键联包含硫代磷酸酯键联或每个核糖部分包含2'O‑甲基修饰。存在于ASO的单体组分中的每一个上的此类修饰被称为“均一修饰”。在某些实施方案中，可能需要不同修饰的组合，例如ASO可包含二氨基磷酸酯键联与包含吗啉环(吗啉代)的糖部分的组合。针对ASO的不同修饰的组合被称为“混合修饰”或“混合化学修饰(mixed chemistries)”。 [0130] 在某些实施方案中，所述ASO包含2’MOE修饰。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’MOE修饰。在某些实施方案中，所述ASO的修饰包含2’MOE和锁核酸(LNA)的组合。在某些实施方案中，所述ASO具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0131] 在某些实施方案中，所述ASO包含2’‑OMe修饰。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’‑OMe修饰。在某些实施方案中，所述ASO的修饰包含2’‑OMe和锁核酸(LNA)的组合。在某些实施方案中，所述ASO具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0132] 在某些实施方案中，所述ASO包含二氨基磷酸酯键联与包含吗啉环(吗啉代)的糖部分的组合，例如为磷酸二酰胺吗啉代低聚物(Phosphorodiamidate morpholino oligomer,PMO)。 [0133] 在某些实施方案中，所述ASO特异性结合位于SLC20A2前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内的目标区域。 [0134] 在某些实施方案中，所述ASO与SEQ ID NO:8内的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列互补性。在某些实施方案中，所述ASO与SEQ ID NO:8内的核苷酸序列100％互补。 [0135] 在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:13‑46、63‑65任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:19‑22、25、26任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。 [0136] 在一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:13‑46任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且包含2’MOE修饰和/或硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’MOE修饰，并且具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0137] 在另一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:63‑65任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且所述ASO为PMO。 [0138] 在某些实施方案中，所述ASO特异性结合位于SLC20A2前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内的目标区域。 [0139] 在某些实施方案中，所述ASO与SEQ ID NO:9内的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列互补性。在某些实施方案中，所述ASO与SEQ ID NO:9内的核苷酸序列100％互补。 [0140] 在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:47‑61、66‑68任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。在某些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列。 [0141] 在一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:47‑61任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且包含2’MOE修饰和/或硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，所述ASO的每个核苷酸都具有2’MOE修饰，并且具有硫代磷酸酯键联的主链。 [0142] 在另一些实施方案中，所述ASO包含SEQ ID NOs:66‑68任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的序列，并且所述ASO为PMO。 [0143] 基因编辑工具 [0144] 在某些实施方案中，所述试剂为基因编辑工具，例如DNA基因编辑系统或RNA碱基编辑工具，其典型地包含(i)具备碱基编辑活性的模块和(ii)能够与SLC20A2基因中的所述目标区域结合的模块。所述基因编辑工具通过将基因组或前体mRNA序列中的隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0145] 示例性的基因编辑工具包括但不限于CRISPR/Cas系统、DNA碱基编辑器、RNA编辑工具。 [0146] CRISPR/Cas系统 [0147] 在某些实施方案中，所述试剂为CRISPR/Cas系统。所述CRISPR/Cas系统典型地包含Cas蛋白和引导RNA(guiding RNA,gRNA)，所述gRNA能够与SLC20A2基因或其前体mRNA中的所述目标区域结合。 [0148] 在某些实施方案中，所述gRNA结合目标区域进而招募Cas酶的结合并发挥编辑活性。 [0149] 在某些实施方案中，所述CRISPR系统通过将隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0150] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内。 [0151] 在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内。 [0152] DNA碱基编辑器 [0153] 在某些实施方案中，所述试剂为DNA碱基编辑器(DNA base editor)。DNA碱基编辑器典型地包含(i)包括DNA碱基编辑结构域(例如脱氨酶)以及DNA结合结构域(例如Cas蛋白，如Cas9或Cas12)的融合蛋白和(ii)引导RNA(guiding RNA,gRNA)，所述gRNA能够与SLC20A2基因中的所述目标区域结合。 [0154] 在某些实施方案中，所述gRNA结合目标区域并进而招募所述融合蛋白的结合并发挥碱基编辑活性。 [0155] 在某些实施方案中，所述DNA碱基编辑器通过将隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行碱基突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0156] 在某些实施方案中，所述Cas蛋白为催化活性失活(catalytically inactive)的Cas蛋白或Cas切口酶(Cas nickase protein)。 [0157] 在某些实施方案中，所述碱基编辑器包含：ABE(Adenine base editor)或CBE(Cytosine base editor)，或通过分子进化/突变筛选获得的新型编辑器。 [0158] RNA编辑工具 [0159] 在某些实施方案中，所述试剂为RNA编辑工具。RNA编辑工具例如包含：基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器，基于寡核苷酸的碱基编辑器等。 [0160] 在某些实施方案中，所述基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器包含(i)包括RNA碱基编辑结构域(例如RNA脱氨酶)以及RNA结合结构域(例如Cas13)的融合蛋白和(ii)引导RNA(guiding RNA,gRNA)，所述gRNA能够与SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域结合。所述gRNA结合目标区域并进而招募所述融合蛋白的结合并发挥碱基编辑活性。 [0161] 在某些实施方案中，所述基于寡核苷酸的碱基编辑器包含(i)可招募内源RNA碱基编辑蛋白(例如RNA脱氨酶，如ADAR)的序列模块和(ii)能够与SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域结合的向导序列模块。所述向导序列模块结合目标区域并进而招募所述RNA碱基编辑蛋白的结合并发挥碱基编辑活性。 [0162] 在某些实施方案中，所述RNA编辑工具通过将隐蔽外显子的剪接受体(splicing acceptor,SA)或剪接供体(splicing donor,SD)序列进行碱基突变，破坏其SA或SD功能，进而抑制隐蔽外显子在mRNA中的整合。 [0163] 另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含如上所述的试剂或其组合，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。 [0164] 在某些实施方案中，所述药物组合物被配制成与其预期施用途径相兼容的剂型，例如可通过局部(local)给药(如直接注射或植入)、全身给药或皮下、静脉内、腹膜内或肠胃外途径给药，包括颅内(如脑室内、脑膜内或鞘内)、肌内、透皮、气道(气溶胶)、鼻腔、口腔、直肠或局部(topical)(包括颊和舌下)给药。 [0165] 在某些实施方案中，所述药物组合物通过吸入、鼻内给药、气管内给药或口咽吸入给药。可通过将所需量的活性成分掺入适当溶剂中，随后无菌过滤来制备适于吸入施用的制剂。通常，用于吸入给药的制剂是生理pH下的无菌溶液，并且具有低粘度。可以将盐添加到制剂中以平衡张力。在一些情况下，可以添加表面活性剂或共溶剂以增加活性成分溶解度并改善气溶胶特性。在一些情况下，可以添加赋形剂以控制粘度，以便确保雾化液滴的大小和分布。 [0166] 在某些实施方案中，所述药物组合物可通过注射给药，例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内、关节内、眼内、腹膜内、脑室内(例如通过腰椎穿刺给药)或局部给药。适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。药物组合物在生产和储存条件下应保持稳定，并应防止细菌和真菌等微生物的污染作用。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的活性成分，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。 [0167] 在某些实施方案中，所述试剂选自ASO，所述药物组合物优选被配置为溶液、乳液、微乳液、泡沫体或含有脂质体的制剂(例如，阳离子脂质体或非阳离子脂质体)。在某些实施方案中，所述药物组合物优选被配置为用于脑室内注射(例如通过腰椎穿刺进行)、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射来施用。 [0168] 另一方面，本发明提供了如上所述的试剂或药物组合物在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷(例如量或活性缺乏)有关的疾病的用途，或者在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷(例如量或活性缺乏)有关的疾病。本发明还提供了用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如上所述的试剂或药物组合物。 [0169] 在某些实施方案中，所述与PiT2功能缺陷有关的疾病为脑钙化，例如原发性家族性脑钙化(PFBC)。在某些实施方案中，所述与PiT2功能缺陷有关的疾病为Pi平衡异常有关的疾病，例如慢性肾脏病、心脏瓣膜钙化、动脉血管钙化，和/或磷稳态失衡相关的骨骼疾病。在某些实施方案中，所述药物通过调节(例如增加)受试者的细胞对PiT2蛋白或功能性RNA的表达来治疗疾病。 [0170] 在某些实施方案中，所述受试者包含SLC20A2基因中的突变。在某些实施方案中，所述突变选自非同义突变、无义突变、移码突变、剪接突变或结构变异。 [0171] 在某些实施方案中，所述突变位于外显子区域，所述受试者对于所述外显子区域的突变是杂合的。 [0172] 在某些实施方案中，所述突变是内含子突变，例如内含子2和/或内含子10内的突变。在某些实施方案中，所述突变位于内含子中的所述目标区域，所述受试者对于位于所述目标区域内含子突变可以是杂合、纯合或者复合杂合的。 [0173] 在某些实施方案中，所述PiT2功能缺陷为SLC20A2单倍体剂量不足。 [0174] 在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者为人。 [0175] 另一方面，本发明还提供了调节细胞中PiT2蛋白表达的方法，其包括在体外将如上所述的试剂或药物组合物与所述细胞接触。 [0176] 在某些实施方案中，所述细胞包含SLC20A2基因中的突变。在某些实施方案中，所述突变选自非同义突变、无义突变、移码突变、剪接突变或结构变异。在某些实施方案中，所述突变位于外显子区域，所述细胞对于所述外显子区域的突变是杂合的。在某些实施方案中，所述突变是内含子突变，例如内含子2和/或内含子10内的突变。在某些实施方案中，所述突变位于内含子中的所述目标区域，所述细胞对于位于所述目标区域内含子突变可以是杂合、纯合或者复合杂合的。 [0177] III、筛选方法 [0178] 在第三方面，本发明涉及调控PiT2表达的试剂的筛选方法。 [0179] 本发明的一个方面提供了鉴定能够调节细胞中PiT2表达的试剂的方法，所述方法包括：i)鉴定靶向PiT2基因或其前体mRNA中的目标区域的试剂，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有隐蔽外显子，所述目标区域在所述隐蔽外显子上游至多约100个核苷酸处至所述隐蔽外显子下游至多约100个核苷酸处的区域内；ii)将步骤i)中鉴定的试剂递送至所述细胞；和iii)测量步骤ii)的细胞中PiT2的表达水平。 [0180] 在某些实施方案中，所述方法在体外实施。 [0181] 在某些实施方案中，所述方法还包括：iv)将步骤iii)中测量的表达水平与用对照处理的细胞中PiT2的表达水平进行比较。当相比于对照组升高时，表明该试剂是活化剂。当相比于对照组降低时，表明该试剂是抑制剂。 [0182] 在某些实施方案中，所述PiT2的表达水平是指功能性PiT2的表达水平，例如包括正确剪接产物的mRNA水平或其所编码蛋白的水平。 [0183] 在某些实施方案中，所述表达水平通过RT‑PCR、qPCR或通过蛋白质印迹来测量。 [0184] 在某些实施方案中，所述目标区域选自所述隐蔽外显子5’剪接位点(splicing acceptor site,SA)上游的区域、跨5’剪接位点的区域、所述隐蔽外显子内的区域、跨3’剪接位点的区域或3’剪接位点(splicing donor site,SD)下游的区域。 [0185] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内。 在某些实施方案中，所述目标区域位于SEQ ID NO:8所示的序列内。 [0186] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。在某些实施方案中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.1795‑1803至c.1795‑1527的区域内。在某些实施方案中，所述目标区域位于SEQ ID NO:9所示的序列内。 [0187] 在某些实施方案中，所述试剂靶向SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域。在某些实施方案中，所述试剂为antisense oligonucleotides(ASOs)。在某些实施方案中，所述试剂为RNA编辑器，如CRISPR/Cas13。在某些实施方案中，所述试剂为非Cas蛋白依赖的RNA编辑工具。 [0188] 在某些实施方案中，所述试剂靶向SLC20A2基因中的所述目标区域。在某些实施方案中，所述试剂为DNA编辑器，如CRISPR/Cas9。在某些实施方案中，所述试剂为碱基编辑器Adenine/Cytosine base editor。 [0189] 在第四方面，本发明涉及调节SLC20A2 mRNA剪接的试剂的筛选方法。 [0190] 本发明的一个方面提供了核酸构建体，其包含人SLC20A2基因的minigene片段序列，所述minigene片段序列包含外显子exon2和exon3以及二者之间的内含子序列，或包含外显子exon10和exon11以及二者之间的内含子序列，其中所述内含子序列包含可改变SLC20A2基因剪接的突变。 [0191] 在某些实施方案中，所述核酸构建体包含与所述minigene片段序列可操作连接的启动子。 [0192] 在某些实施方案中，所述可改变SLC20A2基因剪接的突变导致或增强内含子2中的可变剪接。在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子2和3之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。 [0193] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0194] 在某些实施方案中，所述突变包括SLC20A2基因的c.289+1007C>G突变。 [0195] 在某些实施方案中，所述包含exon2和exon3及其之间内含子序列的minigene片段序列包含SEQ ID NO:4所示的序列。 [0196] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接。 [0197] 在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子10和11之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。 [0198] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0199] 在某些实施方案中，所述突变包括SLC20A2基因的c.1795‑1698A>G突变。 [0200] 在某些实施方案中，所述包含exon10和exon11及其之间内含子序列的minigene片段序列包含SEQ ID NO:5所示的序列。 [0202] 在某些实施方案中，所述核酸构建体还包含报告基因，如荧光蛋白(如GFP,mCherry)或荧光素酶。 [0203] 另一方面，本发明提供了表达载体，其包含如上所述的核酸构建体。在本文中，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。 [0204] 另一方面，本发明提供了筛选能够调节SLC20A2 mRNA剪接的试剂的方法，其包括：提供(i)包含如上所述的核酸构建体的细胞、(ii)本发明的经遗传修饰的非人动物或细胞、或(iii)由本发明的制备脑钙化模型方法获得的脑钙化模型；将受试试剂与(i)‑(iii)任一项接触；检测SLC20A2mRNA的可变剪接。在某些实施方案中，所述方法用于非诊断治疗目的。 在某些实施方案中，所述方法在体外实施。 [0205] 在某些实施方案中，所述细胞来自例如哺乳动物，如啮齿动物(如小鼠或大鼠)，非人灵长类或人类。 [0206] 在某些实施方案中，选择能够抑制可变剪接(例如减少包含隐蔽外显子插入的表达产物的量)的受试试剂，进而增加功能性PiT2蛋白的产生。 [0207] 在某些实施方案中，选择能够增强可变剪接(例如增加包含隐蔽外显子插入的表达产物的量)的受试试剂，进而减少功能性PiT2蛋白的产生。 [0208] 在某些实施方案中，所述检测包括对SLC20A2 mRNA表达产物的长度进行分析。 [0209] 在某些实施方案中，所述可变剪接是内含子2中的可变剪接。在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子2和3之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0210] 在某些实施方案中，所述检测包括使用跨外显子exon2和exon3的引物进行PCR分析。在某些实施方案中，产生包含长度约为135nt的隐蔽外显子插入的扩增子。在某些实施方案中，所述引物包含SEQ ID NO:123所示的正向引物和SEQ ID NO:124所示的反向引物。 [0211] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接。在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子10和11之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0212] 在某些实施方案中，所述检测包括使用跨外显子exon10和exon11的引物进行PCR分析。在某些实施方案中，产生包含长度约为76nt的隐蔽外显子插入的扩增子。在某些实施方案中，所述引物包含SEQ ID NO:127所示的正向引物和SEQ ID NO:128所示的反向引物。 [0213] 在某些实施方案中，所述方法包括在体外将受试试剂与包含所述核酸构建体的细胞接触并检测所述核酸构建体的可变剪接。在某些实施方案中，所述方法包括将如上所述的核酸构建体或包含该核酸构建体的载体引入(例如转染)细胞，以提供包含该核酸构建体的细胞。在某些实施方案中，所述检测包括对所述核酸构建体的mRNA表达产物的长度进行如上所述的分析。在某些实施方案中，所述检测包括对所述核酸构建体包含的报告基因的表达进行分析。在某些实施方案中，报告基因的表达指示可变剪接。在某些实施方案中，报告基因的表达指示正确剪接。 [0214] IV、脑钙化模型及其制备 [0215] 在第五方面，本发明涉及基于SLC20A2基因的内含子中的可变剪接构建脑钙化模型。 [0216] 本发明的一个方面提供了制备脑钙化模型的方法，其中，所述方法包括修饰目标基因组，使其内源Slc20a2基因的exon2和exon3之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，或其内源Slc20a2基因的exon10和exon11之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，其中所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段包含可改变SLC20A2基因剪接的突变，由此提供脑钙化模型。在某些实施方案中，所述目标基因组对于所述替换为纯合或杂合。 [0217] 在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段至少包含隐蔽外显子。在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段至少包含所述隐蔽外显子上游约100个核苷酸至所述隐蔽外显子下游约100个核苷酸的区域。 [0218] 在某些实施方案中，所述可改变SLC20A2基因剪接的突变导致或增强内含子2中的可变剪接。在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子2和3之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。 [0219] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0220] 在某些实施方案中，所述突变包括人SLC20A2基因的c.289+1007C>G突变。 [0221] 在某些实施方案中，所述exon2和exon3之间替换的人SLC20A2基因的内含子基因组片段包含SEQ ID NO:10所示的序列。 [0222] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接。 [0223] 在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子10和11之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于人SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。 [0224] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0225] 在某些实施方案中，所述突变包括人SLC20A2基因的c.1795‑1698A>G突变。 [0226] 在某些实施方案中，所述exon10和exon11之间替换的人SLC20A2基因的内含子基因组片段包含SEQ ID NO:11所示的序列。 [0227] 在某些实施方案中，用于替换的供体序列具有以下结构：Exon2(3'‑patial)‑intron‑crpE2(or crpE10)‑intron‑exon3(5'‑partial)。 [0228] 在某些实施方案中，用于替换的供体序列具有以下结构：Exon10(3'‑partial)‑intron‑crpE2(or crpE10)‑intron‑exon11(5'‑partial)。 [0229] 在某些实施方案中，所述经修饰的内源Slc20a2基因的表达处于在目标基因组中内源性Slc20a2基因座处的调节元件的控制下。 [0230] 将内源Slc20a2基因的内含子序列替换为人SLC20A2基因相对应的内含子序列的方法可通过本领域已知的各种合适的基因组编辑技术进行。在某些实施方案中，所述替换的方法包括：基因敲除，基因编辑，RNA干扰，表观遗传学抑制或其任意组合。 [0231] 在某些实施方案中，所述的基因敲除包括：基于同源重组的干细胞打靶技术，基因编辑技术，化学分子诱变基因组突变，转座子定点失活或其任意组合。 [0232] 在某些实施方案中，所述的基因编辑包括：CRISPR/Cas系统(例如cas9、Cas12a(Cpf1))，TALEN，锌指核酸酶，Base editing或其任意组合。 [0233] 在某些实施方案中，所述替换的方法包括将侧接有5'和3'同源臂的携带插入核酸(例如，待引入的人SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段序列)的靶向载体引入细胞中。在某些实施方案中，插入核酸还含有选择性标记基因(例如，含有选择性标记基因的自缺失盒)，所述基因可以侧接有或包含位点特异性重组位点(例如，loxP、Frt等)。在某些实施方案中，插入核酸还含有报告基因。 [0234] 在某些实施方案中，所述模型为非人动物模型，所述目标基因组为非人动物的基因组。 [0235] 在某些实施方案中，所述模型为哺乳动物模型。在某些实施方案中，所述动物模型为啮齿动物模型，例如小鼠或大鼠模型。在某些实施方案中，所述动物模型为非人灵长类类模型。 [0236] 在某些实施方案中，所述方法包括：对非人动物胚胎干(ES)细胞的基因组进行修饰，以使得所述经修饰的基因组在内源Slc20a2基因中包含所述替换；使用包含所述经修饰的基因组的非人动物ES细胞来制作非人动物，由此获得人源化脑钙化动物模型。在某些实施方案中，可以通过例如电穿孔将靶向载体引入非人动物ES细胞中。 [0237] 在某些实施方案中，所述的模型为细胞模型，所述目标基因组为目标细胞的内源基因组。在某些实施方案中，所替换的人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段(含或不含突变)相对于所述目标细胞为外源引入。 [0238] 在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞为人的表皮成纤维细胞或脑胶质细胞。 [0239] 在某些实施方案中，所述方法包括：对目标细胞的基因组进行修饰，以使得所述经修饰的基因组在内源Slc20a2基因中包含所述替换；由此获得包含所述经修饰的基因组的细胞模型。 [0240] 另一方面，本发明提供了经遗传修饰的非人动物，其基因组包含：内源Slc20a2基因的exon2和exon3之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，或内源Slc20a2基因的exon10和exon11之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，其中所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段包含可改变SLC20A2基因剪接的突变。在某些实施方案中，所述非人动物对于所述替换为纯合或杂合。 [0241] 在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段至少包含隐蔽外显子。在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段至少包含所述隐蔽外显子上游约100个核苷酸至所述隐蔽外显子下游约100个核苷酸的区域。 [0242] 在某些实施方案中，所述可改变SLC20A2基因剪接的突变导致或增强内含子2中的可变剪接。在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子2和3之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于人SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。 [0243] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0244] 在某些实施方案中，所述突变包括SLC20A2基因的c.289+1007C>G突变。 [0245] 在某些实施方案中，所述exon2和exon3之间替换的人SLC20A2基因的内含子基因组片段包含SEQ ID NO:10所示的序列。 [0246] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接。 [0247] 在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子10和11之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。 [0248] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0249] 在某些实施方案中，所述突变包括SLC20A2基因的c.1795‑1698A>G突变。 [0250] 在某些实施方案中，所述exon10和exon11之间替换的人SLC20A2基因的内含子基因组片段包含SEQ ID NO:11所示的序列。 [0251] 在某些实施方案中，所述非人动物为啮齿动物，例如小鼠或大鼠。 [0252] 在某些实施方案中，所述非人动物为非人灵长类。 [0253] 在某些实施方案中，所述经遗传修饰的非人动物为脑钙化的动物模型。 [0254] 另一方面，本发明提供了经遗传修饰的细胞，其基因组包含：内源SLC20A2基因的exon2和exon3之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，或内源SLC20A2基因的exon10和exon11之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，其中所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段包含可改变SLC20A2基因剪接的突变。在某些实施方案中，所述细胞对于所述替换为纯合或杂合。 [0255] 在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段至少包含隐蔽外显子。在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段至少包含所述隐蔽外显子上游约100个核苷酸至所述隐蔽外显子下游约100个核苷酸的区域。 [0256] 在某些实施方案中，所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段相对于所述细胞为外源引入。“外源引入”是指来源于靶细胞之外的核酸。外源核酸可由人工或重组产生，也可以从异源细胞中分离出来，并导入靶细胞中。 [0257] 在某些实施方案中，所述可改变SLC20A2基因剪接的突变导致或增强内含子2中的可变剪接。在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子2和3之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.289+901至c.289+1035。 [0258] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。 [0259] 在某些实施方案中，所述突变包括SLC20A2基因的c.289+1007C>G突变。 [0260] 在某些实施方案中，所述exon2和exon3之间替换的人SLC20A2基因的内含子基因组片段包含SEQ ID NO:10所示的序列。 [0261] 在某些实施方案中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接。 [0262] 在某些实施方案中，所述内含子2中的可变剪接是在外显子10和11之间的隐蔽外显子插入。在某些实施方案中，所述隐蔽外显子位于SLC20A2基因的c.1795‑1703至c.1795‑1627。 [0263] 在某些实施方案中，所述隐蔽外显子具有如SEQ ID NO:3所示的序列。 [0264] 在某些实施方案中，所述突变包括SLC20A2基因的c.1795‑1698A>G突变。 [0265] 在某些实施方案中，所述exon10和exon11之间替换的人SLC20A2基因的内含子基因组片段包含SEQ ID NO:11所示的序列。 [0266] 在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。 [0267] 在某些实施方案中，所述细胞为人的表皮成纤维细胞或脑胶质细胞。 [0268] 在某些实施方案中，所述经遗传修饰的细胞为脑钙化的细胞模型。 [0269] V、脑钙化模型的应用 [0270] 在第六方面，本发明还涉及上述脑钙化模型在疾病研究和药物筛选等方面的应用。 [0271] 本发明的一个方面提供了本发明的脑钙化模型、或经遗传修饰的非人动物或经遗传修饰的细胞用于指示和分析脑钙化病发病阶段，或用于作为研究脑内磷稳态失衡或脑钙化病疾病靶点的模型的用途。 [0272] 另一方面，本发明提供了本发明的脑钙化模型、或经遗传修饰的非人动物或经遗传修饰的细胞用于作为筛选治疗脑钙化病或脑内磷稳态失衡相关疾病的候选药物或治疗方案的模型的用途。 [0273] 在某些实施方案中，所述疾病为脑钙化疾病。 [0274] 在某些实施方案中，所述药物为预防或治疗脑钙化的药物。 [0275] 在某些实施方案中，所述药物为修复脑内磷稳态药物的药物。 [0276] 另一方面，本发明提供了本发明的脑钙化模型、或经遗传修饰的非人动物或经遗传修饰的细胞用于作为筛选磷稳态失衡相关疾病的候选药物或治疗方案的模型的用途。 [0277] 在某些实施方案中，所述磷稳态失衡相关疾病包括但不限于慢性肾脏病、心脏瓣膜钙化、动脉血管钙化，和/或磷稳态失衡相关的骨骼疾病等。 [0278] 在某些实施方案中，所述药物为调节SLC20A2 mRNA剪接进而调节其编码产物PiT2表达量的药物。 [0279] 在某些实施方案中，所述药物为调节SLC20A2 mRNA剪接进而调节其编码产物PiT2功能的药物。 [0280] 在某些实施方案中，所述药物抑制SLC20A2 mRNA可变剪接进而增加功能性PiT2蛋白的产生。 [0281] 在某些实施方案中，所述药物促进SLC20A2 mRNA可变剪接进而抑制功能性PiT2蛋白的产生。 [0282] 另一方面，本发明提供了筛选治疗脑钙化病或脑内磷稳态失衡相关疾病的候选药物或治疗方案的方法，所述方法包括：向本发明的脑钙化模型、或经遗传修饰的非人动物或经遗传修饰的细胞施用所述候选药物或治疗方案；评价所述候选药物或治疗方案是否能够(i)增加SLC20A2全长mRNA转录本和/或其编码蛋白产物PiT2的表达量，(ii)增加目标细胞(如脑内胶质细胞，如星形胶质细胞)的磷转运能力，和/或(iii)降低脑脊液中的无机磷酸根水平。 [0283] 在某些实施方案中，所述疾病为脑钙化疾病。 [0284] 在某些实施方案中，所述药物为预防或治疗脑钙化的药物。 [0285] 在某些实施方案中，所述药物为修复脑内磷稳态药物的药物。 [0286] 在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够增加SLC20A2全长mRNA转录本和/或其编码蛋白产物PiT2的表达量，例如上调至少30％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％等。在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够增加SLC20A2正确剪接的mRNA转录本和/或其编码的功能性PiT2蛋白产物的表达量，例如上调至少30％、至少 50％、至少100％、至少150％、至少200％等。 [0287] 在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够增加目标细胞(如脑内胶质细胞，如星形胶质细胞)的磷转运能力，例如增加至少30％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％等。 [0288] 在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够降低脑脊液中的无机磷酸根水平，例如将脑脊液中异常升高的无机磷酸根水平下调至少75％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少或25％，例如下调至接近正常参考值水平(例如健康对照)。 [0289] 另一方面，本发明提供了筛选治疗磷稳态失衡相关疾病的候选药物或治疗方案的方法，所述方法包括：向本发明的脑钙化模型、或经遗传修饰的非人动物或经遗传修饰的细胞施用所述候选药物或治疗方案；评价所述候选药物或治疗方案是否能够(i)增加SLC20A2全长mRNA转录本和/或其编码蛋白产物PiT2的表达量，(ii)增加目标细胞(如脑内胶质细胞，如星形胶质细胞)的磷转运能力，和/或(iii)降低脑脊液中的无机磷酸根水平。 [0290] 在某些实施方案中，所述磷稳态失衡相关疾病包括但不限于慢性肾脏病、心脏瓣膜钙化、动脉血管钙化，和/或磷稳态失衡相关的骨骼疾病等。 [0291] 在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够增加SLC20A2全长mRNA转录本和/或其编码蛋白产物PiT2的表达量，例如上调至少30％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％等。在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够增加SLC20A2正确剪接的mRNA转录本和/或其编码的功能性PiT2蛋白产物的表达量，例如上调至少30％、至少 50％、至少100％、至少150％、至少200％等。 [0292] 在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够增加目标细胞(如脑内胶质细胞，如星形胶质细胞)的磷转运能力，例如增加至少30％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％等。 [0293] 在某些实施方案中，所述候选药物或治疗方案能够降低脑脊液中的无机磷酸根水平，例如将脑脊液中异常升高的无机磷酸根水平下调至少75％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少或25％，例如下调至接近正常参考值水平(例如健康对照)。 [0294] 在某些实施方案中，所述药物为调节SLC20A2 mRNA剪接进而调节其编码产物PiT2表达量的药物。 [0295] 在某些实施方案中，所述药物为调节SLC20A2 mRNA剪接进而调节其编码产物PiT2功能的药物。 [0296] 在某些实施方案中，所述药物抑制SLC20A2 mRNA可变剪接进而增加功能性PiT2蛋白的产生。 [0297] 在某些实施方案中，所述药物促进SLC20A2 mRNA可变剪接进而抑制功能性PiT2蛋白的产生。 [0298] 定义 [0299] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。 [0300] 如本文中所使用的，术语“SLC20A2”是指编码溶质载体家族20成员2(solute carrier family 20member 2)的基因(参见例如人基因NCBI ID:6575)，其编码的蛋白产物为一个652个氨基酸的磷转运体，称为PiT2蛋白，或PiT‑2蛋白(参见例如NP_006740)。SLC20A2的mRNA序列是本领域技术人员熟知的，可参见例如NCBI:NM_006749、NM_001257181或NM_001257180。在本文中，当涉及对SLC20A2基因的mRNA序列位置进行描述时，例如为描述隐蔽外显子的位置，以NCBI:NM_006749所示的序列作为参考。 [0301] 如本文中所使用的，措辞“剪接的调节”是指影响由SLC20A2天然前体mRNA产生的任何RNA或mRNA变体的水平的变化。例如，调节可以意味着例如引起包含隐蔽外显子插入的异常SLC20A2 mRNA水平的增加或降低，引起正常全长SLC20A2 mRNA水平的增加或降低，和/或引起包含过早终止密码子(无义密码子)的异常SLC20A2 RNA或mRNA水平的增加或降低。容易理解，SLC20A2剪接变体之间的比率的任何变化也被认为是剪接调节的结果。每种可能性代表本发明的单独实施方案。在某些实施方案中，调节意味着增加正常全长SLC20A2 mRNA的水平和/或降低异常(例如包含隐蔽外显子插入)SLC20A2 mRNA的水平。 [0302] 如本文中所使用的，术语“互补”或“互补性”是指核酸例如寡核苷酸、多核苷酸等彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行多核苷酸链中核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以Watson‑Crick方式(例如，A对T，A对U，C对G)或以允许形成双链体的任何其他方式进行碱基配对。如本领域技术人员所知，当使用RNA而不是DNA时，被认为与腺苷互补的碱基是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。然而，当在本发明的上下文中表示U时，除非另外说明，否则暗示了替换T的能力。“至少部分互补”是指两条序列可以是完全互补的，或者总体上不多于6个、5个、4个、3个、2个或1个错配碱基配对，同时保留了在相关条件下杂交的能力。本领域技术人员能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定最适用于测试两条序列的互补性的条件。此类条件可以例如是严格条件，例如在体外测试体系中，400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃进行12‑16小时，接着进行洗涤。其它条件，例如在生物体内可能遇到的生理相关条件也可应用。 [0303] 如本文中所使用的，除非另外规定，否则单链核酸(例如前mRNA转录物、寡聚核苷酸、ASO等)序列的左侧端是5'端，并且单链或双链核酸序列的左侧方向被称为5'方向。类似地，核酸序列(单链或双链)的右侧端或右侧方向是3'端或3'方向。一般而言，核酸中在参考点5'的区域或序列被称为“上游”，并且核酸中在参考点3'的区域或序列被称为“下游”。一般而言，mRNA的5'方向或端是起始密码子(initiation codon/start codon)所处位置，而3'端或方向是终止密码子所处位置。在一些方面中，核酸中参考点上游的核苷酸可以负数表示，而参考点下游的核苷酸可以正数表示。例如，参考点(例如，mRNA中的外显子‑外显子连接处)可表示为“零”位点，并且与所述参考点直接相邻且在其上游的核苷酸表示为“减一”，例如“‑1”，而与所述参考点直接相邻且在其下游的核苷酸表示为“加一”，例如“+1”。 [0304] 如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的。“药学上可接受的载体和/或赋形剂”在预期剂量下不发挥或不旨在发挥治疗作用。此类成分可以起到以下作用：a)在制造期间帮助药物递送系统的加工，b)保护、支持或增强活性成分的稳定性、生物利用度或患者可接受性，c)辅助产品鉴定，和/或d)增强在储存和使用期间活性成分的总体安全性、有效性、递送等任何其他属性的作用。例如，本发明的siRNA可以通过递送载体包裹。“药学上可接受的载体和/或赋形剂”包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween‑80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。 [0305] 如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。 [0306] 如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量，例如改善患者所患疾病的至少一个临床参数或降低所患疾病的至少一个临床参数的严重性所必需的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。 [0307] 本发明的有益效果及总结 [0308] 本发明首先发现并鉴定了SLC20A2 mRNA异常剪接中的先前未报道的隐蔽外显子插入，并由此发明了调节该异常剪接的试剂及方法。在脑钙化病人细胞和SLC20A2‑KI小鼠模型中，通过调节该异常剪接能够上调SLC20A2基因产物PiT2蛋白的表达，逆转CSF Pi水平的升高，从而抑制脑钙化的进展。 [0309] 本发明提供的实施例中，调节SLC20A2的异常剪接进而上调SLC20A2基因产物PiT2蛋白的表达的方法主要可以通过反义寡聚核苷酸(ASOs)的作用实现。但基于本发明描述的方法逻辑和实现路径，本领域技术人员将理解本发明也可以通过DNA碱基编辑永久的在基因组层面改变SLC20A2的mRNA剪接方式，或者通过RNA碱基编辑在RNA层面改变SLC20A2的mRNA剪接方式来实现。 [0310] 此外，由于PiT2高度分布于大脑、肾脏、心血管系统和骨骼，并参与Pi的平衡，由此对PiT2的表达进行剪接调节，也可用于恢复与Pi平衡异常有关的其它综合症，包括慢性肾脏病、心脑血管动脉硬化和骨骼疾病。 [0311] 特别地，本发明所提供的调节SLC20A2 mRNA异常剪接的方法在健康细胞中依然能够提高PiT2蛋白表达水平，表明该方法可以拯救不局限于具体突变形式的SLC20A2单倍体功能不足，从而挽救占更大人群比例的非内含子突变导致SLC20A2功能缺失突变患者的PiT2表达。 [0312] 基于此，本发明提供了一种全新的基于调节SLC20A2基因的mRNA剪接来治疗SLC20A2单倍体剂量不足的策略，对于脑钙化病或磷稳态失衡相关疾病的治疗具有重要临床价值。 [0313] 下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。 附图说明[0314] 图1：通过WGS在PFBC家族中检测到的SLC20A2内含子变异。 [0315] a,具有SLC20A2内含突变的六个PFBC家族的血缘关系。实心符号、空心符号、灰色符号或斜线符号分别表示受脑钙化影响的个体、无脑钙化的个体、尚未出现症状的个体和已死亡的个体。带问号(？)的符号表示没有脑CT成像数据的个体。"#"和"&"分别表示被选中进行全外显子组测序(WES)或全基因组测序(WGS)的个体。b,六个PFBC家族中患者的代表性脑CT图像。c,SLC20A2基因座中五个内含子突变的分布。浅紫色框为外显子，其下的编号为外显子编号。外显子中间的线标示内含子。内含子突变标示中，斜体加粗字体为标示的是预测不产生新的剪接受体(acceptor)或供体(donor)的突变，提示可能通过影响潜在隐蔽外显子发挥作用；而斜体未加粗的突变则可能产生了剪接受体(acceptor)或供体(donor)的突变。 [0316] 图2：SLC20A2隐蔽外显子因内含子突变改变SLC20A2 mRNA的正常剪接和PiT2蛋白的表达。 [0317] a‑b,SLC20A2内含子突变c.289+937G>A和c.289+1007C>G的minigene构建和转录产物示意图(a)。(b)是minigene的PCR检测内含子突变后剪接产物发生的改变。在分别转染了携带c.289+937G>A、c.289+1007C>G和c.289+1021G>C突变的SLC20A2 minigene的Neuro‑2A细胞样品所进行的RT‑PCR分析显示，下面的条带所代表是正确剪接的外显子，而上面的条带代表SLC20A2外显子2和3之间插入了隐蔽外显子(cryptic exon)的转录本PCR产物。c‑d,包含有人SLC20A2内含子10的且c.1795‑1698A>G突变的SLC20A2 minigene构建体示意图(c)和的转录产物的PCR检测分析(d)。下面的条带所代表是正确剪接的转录本产物，而上面的条带代表SLC20A2外显子10和11之间插入了隐蔽外显子(cryptic exon)的转录本PCR产物。e,两个内含子突变造成异常剪接的SLC20A2 CDS构建体的示意图(每个都有一个N端HA标签)。f,用HA标记的SLC20A2 CDS构建体转染Neuro‑2A细胞后，蛋白免疫印迹(WB)检测SLC20A2内源性突变的对PiT2蛋白产物的影响。g‑h,携带c.289+1007C>G突变(P1)、SLC20A2基因杂合缺失(P2)的PFBC患者或健康对照(C1和C2)的成纤维细胞提取物中的SLC20A2基因产物PiT2的免疫印迹结果显示，内含子突变导致与外显子突变一样的PiT2的表达量下降，(h)为统计结果。 [0318] 图3：来自人脑的细胞产生的SLC20A2转录本中存在隐蔽外显子crpE2和crpE10。 [0319] a,通过RT‑PCR分析HEK293T和A172细胞中SLC20A2基因的mRNA相邻外显子之间是否存在隐蔽外显子插入事件。CHX，环己胺(一种广泛使用的可以抑制异常转录本降解的化合物)。一般的，底部条带代表正常的转录物；上部条带表示含有某种隐蔽外显子的异常转录物(用星号标记，命名为crpE2和crpE10)。b，对图a中HEK293T和A172细胞中隐蔽外显子(crpE2和crpE10)的上部条带进行Sanger测序，发现其序列与图2的minigene实验中发现的隐蔽外显子具有同样的序列，显示这些隐蔽外显子是内源存在的，只是突变显著增加了其整合入mRNA的概率。c,来自人类细胞系包括HEK293T,HeLa,HepG2,A172,以及健康对照组(C1,C2)的人类成纤维细胞的crpE2和crpE10的RT‑PCR产物；一名具有SLC20A2杂合c.289+1007C>G突变的PFBC患者(P1)；以及一名具有SLC20A2杂合缺失的PFBC患者(P2)。 [0320] 图4：ASO抑制minigene中SLC20A2的隐蔽外显子的整合 [0321] a,PMO修饰的ASO(PMO‑1,PMO‑2,PMO‑3)和MOE修饰的aso(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)靶向minigene上SLC20A2基因组序列携带c.289+1007C>G突变的隐蔽外显子示意图。b,c,与对照ASO(PMO‑NC和MOE‑NC)相比，在转染SLC20A2 c.289+1007C>G minigene后的Neuro‑2A细胞中，经PMO修饰的ASO(PMO‑1,PMO‑2,PMO‑3)(b)，或MOE修饰的ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)(c)干预，处理后的细胞提取RNA后，针对crpE2隐蔽外显子整合情况的RT‑PCR分析和统计结果。上面的条带代表非生产性转录物crpE2(729bp)；下面的条带代表正常转录物(594bp)。d,PMO修饰的ASO(PMO‑7,PMO‑8,PMO‑9)和MOE修饰的ASO(MOE‑G,MOE‑H,MOE‑I)靶向minigene上SLC20A2基因组序列携带c.1795‑1698突变的隐蔽外显子的示意图。e,f,与对照ASO(PMO‑NC和MOE‑NC)相比，转染SLC20A2 c.1795‑1698A>G突变后的Neuro‑2A细胞中，经PMO修饰的ASO(PMO‑7,PMO‑8,PMO‑9)(e)，或MOE修饰的ASO(MOE‑G,MOE‑H,MOE‑I)(f)干预，处理后的细胞提取RNA后，针对crpE10隐蔽外显子整合情况的RT‑PCR分析和统计结果。上面条带是插入了crpE10的转录本(261bp)，下面条带是正常转录本(185bp)。红线代表MOE修饰的ASO；蓝线代表PMO修饰的ASO。整合了隐蔽外显子的剪接事件的量化值(％)是根据RT‑PCR条带的强度计算的，具体如下：(整合隐蔽外显子的转录本/(整合隐蔽外显子的转录本+正常转录本))×100。相对的PiT2蛋白是以Tubulin作为内参(即PiT2/Tubulin)来评估的。*P< 0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Student’s t‑test。 [0322] 图5：ASO抑制内含子突变导致的SLC20A2 mRNA的隐蔽外显子的整合并上调PiT2的蛋白表达 [0323] a,在来自携带SLC20A2 c.289+1007C>G内含子突变的PFBC患者(P1)的成纤维细胞经培养后，采用MOE修饰的ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)可以靶向携带c.289+1007C>G内含子突变染色体以及不携带突变的正常染色体上SLC20A2基因转录的pre‑mRNA上的隐蔽外显子，进而抑制SLC20A2异常剪接的示意图。b,经稳定培养源自携带SLC20A2c.289+1007C>G内含子突变的PFBC患者(P1)的成纤维细胞，经MOE修饰的ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C,或对照MOE‑NC)处理后提取RNA，针对crpE2隐蔽外显子整合入SLC20A2 mRNA水平的RT‑PCR检测和统计分析。c,与MOE‑NC相比，MOE修饰的ASOs(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)干预后，P1衍生的成纤维细胞的PiT2蛋白水平的western blot结果和统计分析。红线代表MOE修饰的ASO。整合了隐蔽外显子的剪接事件的量化值(％)是根据RT‑PCR条带的强度计算的，具体如下：(整合隐蔽外显子的转录本/(整合隐蔽外显子的转录本+正常转录本))×100。相对的PiT2蛋白是以Tubulin作为内参(即PiT2/Tubulin)来评估的。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Student’s t‑test。 [0324] 图6：ASO通过调节正常人成纤维细胞中SLC20A2隐蔽外显子参与的剪接事件也可以增加PiT2表达。 [0325] a,来自健康对照的人成纤维细胞经培养后，正常染色体上的SLC20A2基因转录的pre‑mRNA上，采用MOE修饰的ASO(靶向crpE2:MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C；靶向crpE10，MOE‑J,MOE‑K,MOE‑L)调节隐蔽外显子crpE2或crpE10的剪接事件，进而提高SLC20A2 mRNA和PiT2蛋白表达的示意图。b,用MOE修饰的ASOs(MOE‑A，MOE‑B，MOE‑C，或对照组MOE‑NC)处理来自健康对照(C1)的人类成纤维细胞后，其插入crpE2隐蔽外显子的SLC20A2 mRNA转录本的表达水平的RT‑PCR检测和统计分析。上面的条带是插入crpE2的转录本(699bp)，下面的条带是正常转录本(564bp)。c,与MOE‑NC相比，用MOE修饰的ASOs(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)干预后的健康对照(C1)的人类成纤维细胞后，其PiT2蛋白水平的Western blot检测结果和统计分析。d,用MOE修饰的ASOs(MOE‑A，MOE‑B，MOE‑C，或对照组MOE‑NC)处理来自健康对照(C2)的人类成纤维细胞后，其插入crpE2隐蔽外显子的SLC20A2mRNA转录本的表达水平的RT‑PCR检测和统计分析。上面的条带是插入crpE2的转录本(699bp)，下面的条带是正常转录本(564bp)。e,与MOE‑NC相比，用MOE修饰的ASOs(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)干预后的健康对照(C2)的人类成纤维细胞后，其PiT2蛋白水平的Western blot检测结果和统计分析。f,与MOE‑NC相比，经MOE修饰的ASOs(MOE‑G，MOE‑H，MOE‑I)处理的来自健康对照(C1)的人类成纤维细胞后，其插入crpE10隐蔽外显子的SLC20A2 mRNA转录本的表达水平的RT‑PCR检测和统计分析。上面的条带是插入crpE10的转录本(199bp)，下面的条带是正常转录本(123bp)。g,与MOE‑NC相比，MOE修饰的ASOs(MOE‑G,MOE‑H,MOE‑I)干预后，来自健康对照C1的人成纤维细胞的PiT2蛋白水平。整合了隐蔽外显子的剪接事件的量化值(％)是根据RT‑PCR条带的强度计算的，具体如下：(整合隐蔽外显子的转录本/(整合隐蔽外显子的转录本+正常转录本))×100。相对的PiT2蛋白是以Tubulin作为内参(即PiT2/Tubulin)来评估的。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Student’s t‑test。 [0326] 图7：调节SLC20A2剪接的ASO序列的扩大筛选 [0327] a,在N2A细胞上转染minigene，通过PCR分析minigene的表达的剪接产物对ASO的反应，包括靶向crpE2剪接调节的新的ASO序列(cr5E2‑m1, [0328] cr5E2‑5,cr5E2‑6,cr5E2‑8,5crE2‑9,cr5E2‑10,cr5E2‑12,5crE2‑13,[0329] cr5E2‑13L,cr5E2‑13S,cr5E2‑14,cr5E2‑16,cr5E2‑17,cr5E2‑18,cr5E2‑19,[0330] cr5E2‑20,cr5E2‑21,cr5E2‑22,cr5E2‑23,cr5E2‑24,cr3E2‑5,cr3E2‑8,[0331] cr3E2‑9,cr3E2‑10,cr3E2‑11,cr3E2‑12,cr3E2‑13,cr3E2‑14,cr3E2‑15,[0332] cr3E2‑16),以及靶向crpE10剪接调节的新的ASO序列(cr5E10‑9,cr5E10‑11,cr5E10‑12,cr5E10‑13,cr5E10‑15,cr5E10‑16,cr5E10‑19,cr3E10‑9,cr3E10‑14,cr3E10‑15)，它们的序列和相关信息在附表中列出。b,minigene筛选出的ASO序列进一步在健康的人成纤维细胞上的筛选。分析ASOs对内源表达的SLC20A2的剪接调控效果，经过多次重复的PCR和蛋白WB检测来评估。上述只列出部分序列的实验结果。c,两轮筛选的综合分析后，获得具有较好效果的数个ASO序列。 [0333] 图8：ASO调节SLC20A2杂合缺失病人的SLC20A2 mRNA剪接并上调PiT2的蛋白表达[0334] a.来自携带SLC20A2基因组大片段杂合缺失患者(P2)的成纤维细胞经培养后，在另一条正常染色体上的SLC20A2基因转录的pre‑mRNA上，可以采用MOE修饰的ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)靶向其中的隐蔽外显子crpE2的剪接事件，进而提高SLC20A2 mRNA和PiT2蛋白表达的示意图。b,来自携带SLC20A2基因组大片段杂合缺失患者(P2)的成纤维细胞经稳定培养后，经MOE修饰的ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)或对照MOE‑NC处理后提取RNA，针对crpE2隐蔽外显子整合入SLC20A2 mRNA水平的RT‑PCR检测和统计分析。c,与MOE‑NC相比，用MOE修饰的ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)干预后，P2成纤维细胞的PiT2蛋白水平的western blot结果和统计分析。红线代表MOE修饰的ASO。整合了隐蔽外显子的剪接事件的量化值(％)是根据RT‑PCR条带的强度计算的，具体如下：(整合隐蔽外显子的转录本/(整合隐蔽外显子的转录本+正常转录本))×100。相对的PiT2蛋白是以Tubulin作为内参(即PiT2/Tubulin)来评估的。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Student’s t‑test。 [0335] 图9：人源化SLC20A2内含子敲入(SLC20A2‑KI)模型小鼠的构建和SLC20A2表达分析。 [0336] a,人源化SLC20A2基因内含子2的SLC20A2‑KI小鼠模型构建示意图。使用CRISPR/Cas9在基因组SLC20A2内含子2位置产生切口，再通过导入的靶向供体序列(donor sequence)引导基于同源重组的修复，进而将小鼠SLC20A2内含子2和两侧与外显子2以及外显子3桥接部分的序列替换为携带c.289+1007C>G突变的人SLC20A2内含子2的序列，最终序列产生的转录本和小鼠的Slc20a2整体的读码框是匹配的。b，RT‑PCR分析杂合和纯合SLC20A2‑KI小鼠以及野生型小鼠脑组织中的整合了人源化crpE2的SLC20A2转录的表达水平。上面的条带代表了由c.289+1007C>G突变的人源化内含子2产生的异常转录本(crpE2)；下面的条带对应于正常的SLC20A2转录物。WT，野生型；HET，杂合；HOM，纯合；Ctx，大脑皮层； Hip，海马；Tha，丘脑。c,d，WT、HET和HOM SLC20A2‑KI小鼠大脑中SLC20A2转录水平的qPCR分析(c)和PiT2水平的western blot结果(d)均显示人源化突变小鼠具有和Slc20a2 KO小鼠类似的Slc20a2 mRNA和PiT2蛋白表达缺陷。e,相对于野生型小鼠，杂合型和纯合SLC20A2‑KI小鼠的CSF Pi水平呈现梯次升高的现象，与Slc20a2 KO小鼠类似。 [0337] 图10：人源化SLC20A2(SLC20A2‑KI)模型小鼠的脑部钙化的micro‑CT和RIS染色分析。 [0338] a,纯合SLC20A2‑KI小鼠模型在5月，7月和9.5月龄时，经PFA灌注固定后的大脑经micro‑CT扫描(voxel resolution:9um x 9um x 9um)的钙化影响。从左到右分别为中脑背侧段冠状面、基底前脑冠状面和一侧半脑矢状面的micro‑CT图像。白点代表钙化结节。b,采用荧光染料RIS‑AF647(一种携带AlexaFluo‑647nm荧光基团的可以结合双膦酸钙盐的成像试剂)对对5月、7月、9.5个月大的纯合子SLC20A2‑KI小鼠脑切片进行染色，用VS120显微镜采集的脑钙化影像。图片是对每组三只小鼠的分析结果的代表。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Student’s t‑test。比例尺，1mm。 [0339] 图11：人源化SLC20A2(SLC20A2‑KI)模型小鼠的脑部钙化的组织化学染色分析。 [0340] 纯合SLC20A2‑KI小鼠在7月龄(a)、10月龄(b)和12月龄(c)时，固定后的小鼠大脑进行OCT冰冻切片,分别进行五种不同的组织化学染色，包括alizarin red,Von Kossa,Alcian blue,H&E,and PAS。其中alizarin red,Von Kossa主要显示的是钙化沉积，而Alcian blue和PAS主要显示钙化灶中附着的粘多糖成分，这是钙化沉积灶的一种普遍特征。比例尺,500μm. [0341] 图12：ASO脑室干预SLC20A2‑KI小鼠脑内修复SLC20A2的表达并下调脑脊液的磷酸根水平。 [0342] a,对纯合SLC20A2‑KI小鼠进行ASO脑室注射(ICV)给药的实验设计方案。小鼠在3个月大时用MOE‑NC、MOE‑A或MOE‑B进行ICV给药，治疗时间为4个月。每个MOEs的剂量为50μg、100μg、200μg或400μg。从7个月大的小鼠身上采集脑组织，分析隐蔽外显子整合(cryptic exon inclusion)的SLC20A2转录本、PiT2蛋白水平、脑脊液的磷酸根水平和脑钙化情况。b，在SLC20A2‑KI小鼠5个月大时，ICV注射2个月后，原位杂交分析MOE‑A在整个小鼠大脑(皮质、海马、丘脑和小脑)的分布。RNA探针被设计为与MOE‑A的序列特异结合。MOE‑A被染色为红色，DAPI被染色为蓝色。c,SLC20A2‑KI小鼠进行MOE‑NC、MOE‑A或MOE‑B给药4个月后，与年龄相符的WT小鼠和未干预的纯合SLC20A2‑KI小鼠相比，荧光定量PCR分析正常的SLC20A2 mRNA转录产物的表达情况。d,RT‑PCR分析ICV注射MOE‑NC、MOE‑A和MOE‑B 4个月后，插入隐蔽外显子crpE2的转录本和正常SLC20A2转录本的情况。最上面的条带代表插入隐蔽外显子crpE2的mRNA的转录本(crpE2)，而底部的条带代表正常的SLC20A2转录物。e,SLC20A2‑KI小鼠ICV注射MOE‑A 4个月后丘脑的PiT2蛋白水平，与对照MOE和未处理的小鼠进行比较，出现了明显的表达修复，说明ASO的作用是有效的。f,除了目标基因的表达，与脑钙化直接相关的生物标记物，即脑脊液的无机磷酸根水平也出现了差异性下降，进一步说明ASO的有效性。 [0343] 图13：ASO脑室干预SLC20A2‑KI小鼠脑内显著抑制脑内钙化的发生和进展[0344] a,3月龄的SLC20A2‑KI小鼠进行ICV注射不同剂量(50、100、200、400μg)的MOE‑NC、MOE‑A和MOE‑B 4个月后，脑部钙化的micro‑CT成像的脑部矢状图；白色亮点为脑部钙化结节。b,3个月大的SLC20A2‑KI小鼠在ICV注射不同剂量(50,100,200,400μg)的MOE‑NC、MOE‑A和MOE‑B 4个月后，即达到7月龄时，分布在丘脑、下丘脑、中脑和基底前脑的钙化结节的数量和面积量化。图片是对每组两到三只小鼠进行分析的代表。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Student’s t‑test。比例尺，1mm。 [0345] 图14：ASO药物ICV注射可以遏制已经出现脑钙化SLC20A2‑KI小鼠的大脑内钙化的进一步恶化。 [0346] a,纯合SLC20A2‑KI小鼠ICV注射PMO修饰的ASO的实验设计。小鼠在5个月大时已经出现全脑多区域明显的钙化沉积，在这个时间点进行ICV注射PMO‑NC或PMO‑1，干预时间为2个月。每个PMO的剂量为25μg或75μg。从7个月大的小鼠身上采集脑组织，并分析隐蔽外显子包含和脑部钙化情况。在PMO用药前和用药结束时(即5和7个月)提取CSF进行分析。b,纯合SLC20A2‑KI小鼠在PMO‑NC和PMO‑1给药前后的CSF Pi水平的变化。c,接受对照和治疗性ASO在ICV注射25μg和75μg剂量的干预后，7个月大的纯合SLC20A2‑KI小鼠脑部钙化的micro‑CT成像的矢状图。白色亮点是大脑钙化结节。图片是对每组两到三只小鼠进行分析的代表。****P<0.0001，Student’s t‑test。比例尺，1mm。实施例 [0347] 现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。 [0348] 本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，一般可以通过市购获得的常规产品。 [0349] 材料与方法 [0350] 1、受试者招募、全基因组测序和遗传分析 [0351] 我们在2012‑2023年间从福建医科大学附属第一医院神经内科招募了778名PFBC拟诊患者。PFBC诊断标准如下：a)CT扫描检测到的钙化是双侧出现并且在基底节和/或齿状核对称；b)钙化总分(TCS)超过以前报告的特定年龄阈值；c)没有生化异常，血清中钙、磷和甲状旁腺激素(PTH)浓度正常；d)没有感染、中毒或外伤原因。神经系统检查和临床评估由至少两名高级神经病学专家进行。对于所有疑似患者，我们首先使用全外显子组测序(WES)来排除含有SLC20A2、PDGFRB、PDGFB、XPR1、MYORG、JAM2和CMPK2等已知PFBC关联基因的整个编码区以及外显子序列段突变的病例，进而在剩下的样本集合中鉴定PFBC关联的内含子突变病例和家系。本研究得到了福建医科大学附属第一医院机构审查委员会的批准，所有参与者在入组前都有书面的知情同意书。 [0352] 为了进行全基因组测序，在获得脑钙化病人的血液基因组DNA后，根据相关测序建库试剂盒制造商的说明，采用人的DNA样本制备成双端DNA文库(Illumina Truseq文库构建)。所构建的DNA文库采用Illumina NovaSeq 6000进行双端150bp长度的二代测序。平均测序深度从31.35到57.77不等，90.1％到99.2％的全基因组被至少覆盖20个。然后，使用SpeedSeq将测序结果(无条形码)与人参考基因组hg19进行了比对。接着，使用Genome Analysis Toolkit v4.1对单核苷酸变异和插入/缺失(insertions/deletions,Indels)进行calling分析。通过SpeedSeq提取病人基因组中潜在的基因组结构变异和拷贝数变异在；或用ANNOVAR进行单核苷酸突变、indels、结构变异和拷贝数变异的注释。 [0353] 进行参数连锁分析时，从家系1的45名家庭成员的全血中分离出DNA样本，并使用HumanOmniZhongHua‑8 BeadChip(Illumina)进行全基因组的连锁分析。基因型calling和质量控制用GenomeStudio基因分型模块(Illumina)处理。具有Mendelian errors或calling rate低于100％的SNP被删除。使用Merlin(v1.1.2)进行参数连锁分析，其中指定罕见疾病等位基因频率(rare disease allele frequency)为0.0001的罕见优势模型(rare dominant model)。 [0354] 2、Minigene质粒的构建 [0355] 为了建立通过RT‑PCR快速分析潜在隐蔽外显子参与的剪接事件，我们将人类SLC20A2基因中包含外显子2‑内显子2‑外显子3、外显子6‑内显子6‑外显子7、外显子10‑内显子10‑外显子11的野生型或突变型基因组序列的DNA片段构建在带有CMV启动子的minigene骨架质粒上。为了测试与突变相关的隐蔽外显子插入后可能导致的SLC20A2 mRNA的翻译产物的改变，我们使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme)将相应的包含隐蔽外显子插入的SLC20A2 cDNA克隆到pCMV6‑Entry质粒(Origene)。接着，通过重叠PCR或Mut Express II快速诱变试剂盒(Vazyme)产生源自患者的突变。扩增这些片段的引物列于表3。 [0356] 3、反义寡核苷酸(ASO) [0357] 反义寡聚核苷酸技术是一种基于化学修饰的短寡聚核苷酸(12‑24nt)的药物开发策略，通过Watson‑Crick碱基配对与其RNA靶标结合。ASO的序列是根据ASO设计指南设计的。具有MOE和PS修饰的ASO(带有硫代磷酸酯骨架的2′‑O‑甲氧基乙基糖)委托Integrated DNA Technologies公司合成并经过HPLC纯化。具有PMO修饰(磷酰二胺基吗啉骨架)的ASO由Gen‑Tools,LLC合成。所有的ASO在体外培养的细胞实验中溶解在无核酸酶的水中，在小鼠体内实验中溶解在人工脑脊液(aCSF)中。详细的序列在表1中提供。 [0358] 4、SLC20A2‑KI小鼠模型的构建 [0359] 为了构建人源化的SLC20A2小鼠模型，利用CRISPR/Cas9技术将小鼠SLC20A2基因的外显子2至外显子3的基因组片段替换为编码框架匹配的、携带c.289+1007C>G突变的人SLC20A2基因的基因组序列。简而言之，将具有双侧1.4kb同源臂的靶向序列与sgRNAs、Cas9 RNA共同微注射到C57BL/6J小鼠的子宫内。为了筛选出具有正确基因敲入序列的founder(F0)小鼠，从小鼠尾部提取的基因组DNA被用于基因分型。通过与C57BL/6J野生型小鼠杂交产生F1 KI小鼠，验证了F0 KI小鼠的种系传递。为了进一步验证具有正确同源重组的目标小鼠，我们还对F1小鼠进行了长段测序和southern‑blot分析。选择杂合和纯合的SLC20A2‑KI小鼠进行生物化学和表型分析。sgRNA序列和基因分型引物列于表3。 [0360] 5、细胞培养和转染 [0361] HEK293T、Neuro‑2A、A172、HepG2、HeLa细胞(中国科学院细胞库)和原代人成纤维细胞使用补充有10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)的DMEM在6孔板或12孔板(Corning)中培养。人类成纤维细胞来自于具有SLC20A2杂合c.289+1007C>G突变和SLC20A2杂合缺失的PFBC患者，以及自愿捐献的健康人对照。 [0362] 质粒转染时，用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher)将大约3μg的minigene或cDNA质粒转染到HEK293T和Neuro‑2A细胞中。对于western‑blot，在转染24小时后收细胞。对于使用RT‑PCR的剪接分析，在培养24小时后用MOE或PMO修饰的ASOs转染细胞。 [0363] 对于MOE修饰的ASOs，使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher)以100nM的终浓度转染细胞，持续48小时。对于PMO修饰的ASOs，用6μL/mL Endo‑Porter(Gene‑Tools,LLC)将4μM PMO转染细胞48小时。为了抑制NMD介导的RNA降解，在收获前将环己酮(CHX，50μg/mL)与培养的人类成纤维细胞孵化6小时。 [0364] 6、RNA提取和剪接分析 [0365] 根据制造商提供的操作说明，使用TRIzol(Invitrogen)从HEK293T、Neuro‑2A、HepG2、HeLa、A172细胞或人类成纤维细胞中提取总RNA，然后使用iScript cDNA Synthesis Kit(Bio‑Rad)将1μg RNA逆转录为cDNA。为了进行剪接分析，转录的cDNA被用来进行PCR，使用跨越SLC20A2基因的相应外显子的引物对，引物序列列于表3。 [0366] 7、蛋白质提取和Western‑blot分析 [0367] 将细胞或小鼠大脑收集在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中，并将裂解液在14,000g下离心15分钟。为了检测PiT2，蛋白提取物在37℃下孵育10分钟，然后用9％SDS‑PAGE凝胶分离，并在PVDF膜上印迹。膜用5％的脱脂牛奶阻断，然后用PiT2‑7B5(1:1000，采用PiT2蛋白loop区免疫小鼠获得的单克隆抗体)、HA‑tag(1:5000，#3724，Cell Signaling)、GAPDH(1:3000，KC‑5G5，KANGCHEN)、α‑Tubulin(1:5000，66031‑1‑Ig，Proteintech)和相应的HRP标记二级抗体(1:2000，Cell Signaling)检测。用ECL(TIANGEN)观察条带，用Image J软件测量。 [0368] 8、小鼠脑内(ICV)注射ASO [0369] 所有的动物手术都在标准的无菌条件下进行。用异氟醚麻醉小鼠(5％用于诱导，1.5％用于维持)，并置于小动物立体架(Model 68528,RWD life science)上，用加热垫保持体温。在SLC20A2‑KI小鼠的切口处注射2％的利多卡因，并使用脱毛膏剃毛。用甜菜碱和 75％的酒精对手术部位的头皮进行三次消毒后，做一个中线切口，去除头皮以暴露头骨，用棉签和手术刀清洗骨膜和其他与头骨相连的软组织。头骨干燥后，使用组织粘合剂(3M Vetbond Tissue Adhesive)将头骨周围的皮肤粘在暴露的头骨边缘。将头骨平面调整到立体定向的水平，并确定前囟门。在额骨上和周围涂上一层蓝色光固化自蚀胶(3M ESPE Single Bond Universal,3M Deutschland Gmbh)以帮助固定。然后，用牙胶将定制的头板平整地固定在额骨上。在保持硬膜完整的情况下，小心地钻出一个小的环形开颅术(AP+ 0.25mm；ML‑0.75mm)。用抗生素软膏和快速固化硅树脂弹性体覆盖保护硬膜。用1.5％的异氟醚将小鼠移至特制的固定板上，并从鼓室收集脑脊液。之后，在注射ASO之前，让小鼠恢复至少一周的时间。 [0370] 为了进行ICV注射，用异氟醚麻醉小鼠(5％用于诱导，1％用于维持)，并将小鼠头部固定在带有加热垫的立体仪上以保持体温。将ASO粉末溶于过滤后的定制改性人工脑脊液(125mM NaCl,20mM NaHCO3,3mM KCl,1.2mM MgSO4,1mM NaH2PO4.H2O,1.5mM CaCl2)，工作浓度为25μg/μL。用Nano‑injector(Nanoject III,Drummond Scientific Company)以1nL/s的速度将总剂量为50μg、100μg、200μg或400μg的SLC20A2‑ASO或对照‑ASO的注射到右侧脑室(中心坐标：AP+0.25mm；ML‑0.75mm；DV‑1.85mm)。玻璃吸管在注射后至少10分钟后抽出。用蓝光固化的可流动树脂对开颅手术进行密封，以避免感染。让小鼠在加热垫上从麻醉中恢复，然后再回到它们的笼子。 [0371] 9、CSF采集和Pi的测量 [0372] 根据实验室建立的方法流程，使用立体定位架(Model 68528,RWD life science)将小鼠固定好，采用另外一个有超微尺度可三向可调节的支架夹持采集针管，针管中装载拉制的玻璃针，从麻醉的成年小鼠大脑后的延髓脑池部位穿刺进入脑室，然后轻微加载负压以引导CSF流入玻璃针内。收集约5‑10μL CSF，然后离心5分钟(2000g，4℃)以去除细胞碎片。使用PiColorLock gold phosphate detection kit(303‑0030,Innova Biosciences)检测CSF中无机磷酸盐的浓度，然后用SpectraMax(Molecular device)在635nm处读取。 [0373] 10、原位杂交(ISH)检测小鼠大脑中的ASO的分布 [0374] ISH分析中使用的所有试剂都是用碳酸二乙酯(DEPC)制备的。使用MOE‑A和MOE‑NC的7个月大的SLC20A2‑KI小鼠被水合氯醛麻醉，用4％PFA灌注，并连续用15％和30％蔗糖脱TM水。根据制造商的说明，使用miRNAscope Assay Red(Advanced Cell Diagnostics，Cat.No.324500)和定制的MOE‑A探针(Advanced Cell Diagnostics，Cat.No.1123181‑S1)制备厚度为18‑μm的脑切片进行ISH。使用VS120显微镜(Olympus,Japan)用40×物镜对MOE‑A的全脑表达进行成像。 [0375] 11、micro‑CT和组织化学染色分析脑钙化 [0376] 为了评估脑部钙化，使用水合氯醛对SLC20A2‑KI和WT小鼠进行麻醉，并用4％PFA的PBS进行灌注。对于micro‑CT扫描，通过X射线微型CT扫描仪器(Bruker,Skyscan 1172)获得小鼠大脑的三维图像；在高分辨率模式下评估石蜡包埋的小鼠大脑，X射线管电压为90kV，电流为88μA，voxel size为72μm。 [0377] 为了对脑部钙化进行组织化学染色，在石蜡包埋前，小鼠脑部经过一系列梯度的乙醇脱水处理后，制备厚度为4微米的切片。脑部钙化的评估是按照领域内广泛认可的常规方法进行的：这些染色方法包括alizarin red,Von Kossa,Alcian blue,periodic acid‑Schiff(PAS)以及H&E。每个分析重复三次。 [0378] 13、统计学分析 [0379] 数据以平均数±平均数的标准误差(SEM)表示。统计学意义由Student's t‑test来评估。差异在<0.05时被认为具有统计学意义，表示如下：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,和****p<0.0001。 [0380] 实施例1：PFBC患者中SLC20A2内含子突变的鉴定，及其导致SLC20A2剪接和翻译异常的分析 [0381] 发明人经多年的辛苦积累了数百例脑钙化病例并构建家系图谱，并通过外显子测序的遗传学分析在53个PFBC家族中的33个(62.2％)家系中，发现了已知的PFBC致病基因(SLC20A2、PDGFB、PDGFRB、XPR1、MYORG和JAM2)的外显子中发现了致病突变。此外，通过CNVs分析确定了另外3个家族中SLC20A2基因侧翼的外显子区段缺失。在其余的17个家族中，对一个未检测到任何外显子突变的大家族(1号家族)(图1a)进行了连锁分析。使用Affymetrix 250K Nsp SNP芯片对该家族45名成员的基因组DNA样本进行关联图谱分析，发现8号染色体上有一个32Mb的区段(hg19 chr8:29042453‑61341711)与家族中的钙化表型有连锁关系，LOD评分为4.5。进一步通过WGS分析，我们在SLC20A2中发现了c.289+1007C>G的深内含子变异(deep‑intronic variant)，Sanger测序验证了该变异与该家族的脑钙化有共同关联。使用SpliceAI对这一变异进行计算机评估in‑silico evaluation，acceptor gain score为0.11，donor gain score为0.11，表明可能从SLC20A2的内含子2剪接引入了未报告过的隐蔽外显子(表2)。 [0382] 使用类似的WGS分析与Sanger测序方法来筛选其余缺乏明确的遗传诊断的PFBC家系患者，我们在四个家系的SLC20A2基因中发现了另外三个位于深部内含子区域的遗传变异(图1a)：内含子2(intron 2)中的c.289+937G>A(家族2和3)，内含子6(intron 6)中的c.730+768C>T(家族4)，内含子10(intron 10)中的c.1795‑1698A>G(家族5)。这四个内含子突变(图1c)在主要的人类群体遗传学数据库中都未见注册登记，而且在SliceAI分析中都被预测为影响剪接过程(表2)。我们还发现，在这五个家族中，这些突变与脑部钙化有共同关联(图1b)。受检者的年龄从30岁到60岁不等。其中四人(1、3、4、5号家族)报告头痛，其中一人(2号家族)患有头晕。CT成像显示基底神经节和齿状核(1‑5号家族)、丘脑(1‑3号家族)和皮质下白质(2号家族)有中度至重度脑钙化(TCS，16‑39)(图1b)。所有患者的血清钙、磷和PTH水平正常(表1)。这些结果支持SLC20A2的内含子变异可能是造成PFBC的遗传原因。 [0383] 在哺乳动物中，目前已经比较清楚内含子的5'剪接供体位点(5’splice donor site)和3'剪接受体位点(3’splice acceptor site)是保守的。内含子突变通过破坏剪接位点和/或剪接调节元件，或通过改变mRNA分子的二级结构而影响mRNA加工过程。进一步序列预测提示，内含子2(intron 2)中的c.289+937G>A突变，以及内含子6(intron 6)中的c.730+768C>T突变均可能直接产生新的剪接受体或者供体，进而改变原来的剪接机制；然而，内含子2(intron 2)的c.289+1007C>G突变，以及内含子10(intron 10)中的c.1795‑1698A>G突变，并没有产生特征性的剪接受体或者供体，提示其可能是通过别的机制，比如调节隐蔽外显子的剪接整合(splicing inclusion)几率。 [0384] 为了验证遗传预测，我们首选进行了Minigene分析，以探索在2个家族中发现的内含子突变如何改变SLC20A2的隐蔽内含子的剪接。具体的来说，我们通过克隆SLC20A2基因组序列(包含其内含子2的上下游外显子2‑3接头序列、包含内含子10的外显子10和外显子11的接头序列)，将其装入由CMV启动子驱动的骨架质粒中，以构建Minigene的野生型质粒，然后使用定点诱变产生与2个PFBC家族的c.289+937G>A和c.1795‑1698A>G内含子突变相对应的点突变(图2a，c)。 [0385] 通过Minigene检测证实，对于家族1和家族5，虽然c.289+1007C>G和c.1795‑1698A>G突变没有导致新生的剪接位点发生，但RT‑PCR和Sanger测序显示在内含子2和内含子10中分别有增加的135‑nt和76‑nt的隐蔽外显子的剪接整合(图2b，d)。相反，没有表达这两个突变的野生型SLC20A2 minigene的细胞在上述突变minigene检测中没有检测到明显水平的异常转录物，这意味着这两个突变可能通过影响相邻的剪接调控元件来改变隐蔽外显子的剪接插入几率。 [0386] 进一步，我们通过插入上述135‑nt和76‑nt隐蔽外显子到N端HA标记的SLC20A2的CDS相对应的序列位置，进一步分析其对蛋白产物的影响。根据序列预测，这两个隐蔽外显子的插入，在新的编码框中引入了过早终止密码子(premature termination codon)(图2g)，进而使得无法翻译合成具有功能的PiT2蛋白。在培养的Neuro‑2A细胞上，转染了含有这2个隐蔽外显子的HA标记的SLC20A2 minigene构建体，或含有另外两个新生剪接受体/供体产生的新生外显子的SLC20A2 minigene构建体，，western blot结果显示了与预测相符的截短的PiT2蛋白产物(图2h)。根据经验，由于在体情况下这些异常转录本存在PTC突变，引发异常转录本的NMD降解机制，最终可能并不会产生有明显表达量的蛋白产物。为此，我们比较了健康对照组成纤维细胞，发现源自携带c.289+1007C>G突变的患者的成纤维细胞中全长PiT2水平出现了明显的下降(图2i)。这些发现共同支持了一种新的且重要的分子遗传学病理机制，即SLC20A2基因的内含子突变导致内源隐蔽外显子的剪接整合增加，从而导致SLC20A2单倍体功能不足，并引发PFBC家族的突变携带者出现脑钙化。 [0387] 实施例2：人脑中存在内源的隐蔽外显子参与形成SLC20A2可变剪接异构体[0388] 上述实施例中的体外证据提示，c.289+1007C>G和c.1795‑1698A>G突变具备在内含子2和内含子10发生mRNA剪接过程中引入隐蔽外显子的能力，并且经in silico分析证明其没有预测产生剪接位点。重要的问题是，这些隐蔽外显子是否本身就存在于人类细胞中，只是正常的剪接情况下以较低比例产生的这些异常的剪接异构体被降解了。 [0389] 我们在HEK293T细胞(肾源性细胞系)和A172细胞(脑源性细胞系)中探索了SLC20A2每个内含子中是否存在潜在的剪接调节的隐蔽外显子。RT‑PCR分析检测经CHX处理抑制异常剪接转录本降解的细胞内RNA转录本显示，在HEK293T和A172细胞中存在外显子2和外显子3之间的隐蔽外显子包含事件(cryptic exon inclusion event)(c.289+901～c.289+1035，命名为"crpE2")；在A172细胞中观察到明显的外显子10和外显子11之间的隐蔽外显子包含事件(cryptic exon inclusion event)(c.1795‑1703～c.1795‑1628，命名为"crpE10")(图3a,b)。值得提及的是，这些异常剪接转录本包含隐蔽外显子crpE2或crpE10的表达水平是对环己胺(CHX)敏感的，因为CHX是评估NMD途径潜在参与的小分子抑制剂，这表明通常情况下整合有crpE2或crpE10的转录本可能在大脑中通过NMD途径进行降解。crpE2和crpE10的sanger测序证实它们正是携带c.289+1007C>G和c.1795‑1698A>G突变的minigenes的135‑nt和76‑nt剪接产物(图3b)。这些结果表明，这两个隐蔽外显子的引入确实在人类细胞中自然存在(而且当存在c.289+1007C>G和c.1795‑1698A>G的内含子突变时，这种情况明显增加)。 [0390] 对更广泛的人类细胞(HeLa细胞、HepG2细胞、HEK293T细胞、A172细胞和来自表皮的人类成纤维细胞)的RT‑PCR分析，进一步验证了crpE2和crpE10在SLC20A2 mRNA转录本中的剪接整合可以发生在多种组织来源的不同细胞类型中(图3c)，提示这一剪接机制可以用于旨在通过调节PiT2表达来干预疾病的场景。 [0391] 实施例3：ASO可以纠正crpE2或crpE10参与的异常剪接并提高有功能的PiT2蛋白的翻译生产效率 [0392] 为了评估ASO是否能抑制隐蔽外显子依赖的可变剪接，我们将SLC20A2 minigenes构建体转染到Neuro‑2a细胞中，并通过共同转染靶向crpE2和/或crpE10的剪接位点的ASO制剂，以抑制异常剪接的转录物的生产水平。在各种ASO修饰中，2′‑O‑甲氧基乙基(2′‑O‑methoxyethyl,MOE)和磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(morpholino oligomers,PMO)是已上市的神经系统ASO药物采用的最普遍的修饰形式，我们也采用这两类修饰的ASO分别进行分析。对于含有c.289+1007C>G突变的minigene，我们检测到4μM的PMO‑ASO(PMO‑1,PMO‑2,PMO‑3)(PMO‑1:65.38±3.081％；PMO‑2:67.17±5.045％；PMO‑3:63.27±3.078％)和100nM的MOE‑ASO(MOE‑A,MOE‑B,MOE‑C)(MOE‑A:99.64±0.2714％；MOE‑B:99.34±0.4810％；MOE‑C: 99.76±0.2441％)使crpE2的剪接整合程度明显下降(图4a‑c)。对于具有c.1795‑1698A>G突变的minigene，crpE10的剪接整合同样被4μM的PMO‑ASO(PMO‑7、PMO‑8、PMO‑9)(PMO‑7: 17.51±2.599％；PMO‑8:18.58±2.594％；PMO‑9:19.40±2.619％)或100nM的MOE‑ASO(MOE‑G MOE‑H、MOE‑I)(MOE‑G:36.76±1.073％；MOE‑H:36.76±1.073％；MOE‑I:36.76± 1.073％)大大降低(图4d‑f)。这些结果支持了ASO干预调节PiT2表达以治疗脑钙化疾病的潜在应用价值。 [0393] 为了进一步测试ASO对纠正内源性异常剪接的效果，我们将MOE‑ASOs转染到来自携带内含子突变的PFBC患者的人类成纤维细胞。我们首先培养了来自一个携带杂合子SLC20A2 c.289+1007C>G突变的患者的表皮成纤维细胞(P1)。与溶媒组(vehicle)或对照组MOE‑ASO(MOE‑NC)相比，我们发现MOE‑A和MOE‑B可以在很大程度上去除crpE2插入SLC20A2 mRNA(MOE‑A:14.35±5.2645％；MOE‑B:15.62±5.206％；MOE‑C:15.48±5.200％)(图5a,b)，并导致PiT2蛋白质水平增加(MOE‑A:21.24±7.787％；MOE‑B:29.53±10.26％；MOE‑C:6.632±12.11％)(图5c)。这些发现支持ASO介导的抑制异常剪接作为一种可行的方法来挽救具有内含子突变的PFBC患者的SLC20A2表达剂量不足。 [0394] 考虑到到ASO可以调节野生型等位基因的非生产性可变剪接(nonproductive alternative splicing)，并增加正常的SLC20A2转录本的水平。为了从另一个角度验证这一问题，我们培养了两株健康对照人群的自愿捐赠者的成纤维细胞(C1,C2)。ASO细胞干预实验显示(图6a‑e)，在健康对照的成纤维细胞中也可以观察到MOE‑A和MOE‑B对SLC20A2 mRNA的剪接调节效果，并可以上调PiT2蛋白的表达水平(C1,C2)。靶向crpE10的MOEs(MOE‑J、MOE‑K、MOE‑L)也减少了crpE10的插入，并使野生型成纤维细胞中PiT2蛋白表达升高(图6f‑g)。这一结果说明，对于常染色体显性单倍体功能不足疾病的目标基因，其另一条染色体上没有致病突变的正常基因可以用ASO的干预来调节其表达，并达到改变疾病进展的目的。鉴于实际应用价值的扩大，我们在健康对照的成纤维细胞上扩大了ASO序列的筛选范围，包括靶向crpE2剪接调节的新的ASO序列(cr5E2‑m1,cr5E2‑5, [0395] cr5E2‑6,cr5E2‑8,5crE2‑9,cr5E2‑10,cr5E2‑12,5crE2‑13,cr5E2‑13L,[0396] cr5E2‑13S,cr5E2‑14,cr5E2‑16,cr5E2‑17,cr5E2‑18,cr5E2‑19,cr5E2‑20,cr5E2‑21,cr5E2‑22,cr5E2‑23,cr5E2‑24,cr3E2‑5,cr3E2‑8,cr3E2‑9, [0397] cr3E2‑10,cr3E2‑11,cr3E2‑12,cr3E2‑13,cr3E2‑14,cr3E2‑15,cr3E2‑16),以及靶向crpE10剪接调节的新的ASO序列(cr5E10‑9,cr5E10‑11, [0398] cr5E10‑12,cr5E10‑13,cr5E10‑15,cr5E10‑16,cr5E10‑19,cr3E10‑9,cr3E10‑14,cr3E10‑15)，它们的序列和相关信息在表1中列出。首先，在N2A细胞上转染minigene，通过PCR分析minigene的表达的剪接产物对ASO的反应，过滤掉大部分效果较差的序列(图7a,c)。接着，为了评估剩下的ASO序列对内源表达的SLC20A2的剪接调控效果，我们将其转染到健康对照的人成纤维细胞里，经过多次重复的PCR和蛋白WB检测(图7b,c)，我们最后圈定了7条ASO序列在促进SLC20A2或PiT2的表达上显示比较好的效果，它们包括靶向crpE2剪接调节的ASO序列cr5E2‑10,MOE‑B(cr5E2‑11),cr5E2‑12,cr5E2‑13,cr5E2‑14 MOE‑A(cr5E2‑15)，以及靶向crpE10剪接调节的ASO序列cr5E10‑12。限于检测条件的局限性，这个结果不能排除靶向其它专利所述区域的ASO序列也有比较好的效果，这里只是展示发明过程的分析流程。 [0399] 在PFBC疾病中，SLC20A2基因的杂合显性突变占比达到了60％，这凸现ASO干预可以用于修复不局限于突变形式(包括内含子突变、外显子突变，转录调节区域突变等)的SLC20A2基因的单倍体剂量不足现象。为了测试MOE‑A和MOE‑B是否也能挽救占更大人群比例的非内含子突变导致SLC20A2功能缺失突变患者的PiT2表达，我们培养了来自一个覆盖SLC20A2的基因组片段杂合性缺失患者(P2)的表皮成纤维细胞。与溶剂组或对照组ASO相比，MOE‑A和MOE‑B可以在很大程度上减少内源性crpE2‑插入的SLC20A2 mRNA的产生(MOE‑A:2.024±0.1775％；MOE‑B:2.267±0.16915％；MOE‑C:2.386±0.1278％)(图7a，b)，并促使PiT2蛋白的明显增加(MOE‑A:15.99±4.225％；MOE‑B:13.53±4.951％；MOE‑C:11.25±4.507％)(图8c)。总之，这些结果表明，ASO介导的隐蔽外显子依赖性可变剪接的校正，可以拯救SLC20A2内含子突变，甚至其他非内含子突变导致的SLC20A2单倍体功能不足。 [0400] 实施例4：人源化SLC20A2内含子小鼠模型(SLC20A2‑KI)的构建和进行性脑钙化分析[0401] 为了在动物水平评估ASO治疗是否可以有效干预脑钙化的发生和进展，我们接下来开发了一个人源化小鼠模型。在保持读码框匹配的设计条件下通过敲入了携带SLC20A2 c.289+1007C>G突变的整个人类内含子2和两侧接头序列(图9a)，使得小鼠模型中的嵌合型SLC20A2基因的转录产物包含有crpE2隐蔽外显子，进而可以被适用于人的ASO制剂进行结合和干预。具体的，利用CRISPR/Cas9技术，结合同时导入的打靶DNA片段，将小鼠SLC20A2基因的外显子2至外显子3的基因组片段替换为编码框架匹配的、携带c.289+1007C>G突变的人SLC20A2基因的基因组序列。简而言之，将具有双侧1.4kb同源臂的靶向序列与sgRNAs、Cas9 RNA共同微注射到C57BL/6J小鼠的子宫内。为了筛选出具有正确基因敲入序列的founder(F0)小鼠，从小鼠尾部提取的基因组DNA被用于基因分型。通过与C57BL/6J野生型小鼠杂交产生F1 KI小鼠，验证了F0 KI小鼠的种系传递。为了进一步验证具有正确同源重组的目标小鼠，我们还对F1小鼠进行了长段测序和southern‑blot分析。选择杂合和纯合的SLC20A2‑KI小鼠进行生物化学和表型分析。 [0402] 在杂合子和纯合子KI小鼠中，RT‑PCR和测序分析观察到显著增加的crpE2插入SLC20A2 mRNA(图9b)，与此伴随的是这些动物的SLC20A2mRNA和PiT2蛋白水平显著降低(图9c，d)。对脑脊液中的无机磷酸根分析显示，杂合子和纯合子SLC20A2‑KI小鼠脑脊液(CSF)中的无机磷酸盐(Pi)水平明显增加(图9e)，从而在代谢上再现了SLC20A2突变的PFBC患者的大脑Pi平衡障碍。这表明在携带SLC20A2 c.289+1007C>G突变的可以成功用于SLC20A2单倍体功能不足模型化应用。 [0403] 我们随后使用micro‑CT、可识别钙化沉积的荧光RIS染色(图10a,b)，以及组织学染色(包括alizarin red,Von Kossa,Alcian blue,periodic acid‑Schiff(PAS),and H&E)来检查SLC20A2‑KI小鼠的大脑钙化情况。microCT扫描显示(图10a),大约71％的SLC20A2‑KI小鼠在5个月大时开始在双侧基底前脑、下丘脑和中脑背侧区域出现明显的对称性脑部钙化，这比的SLC20A2‑KO小鼠晚3个月。在7个月大时，纯合SLC20A2‑KI小鼠的钙化沉积广泛分布在许多脑区，如基底前脑、丘脑、下丘脑、中脑和小脑齿状核区域(图10a)。并且在9.5月龄时，钙化结节的数量和体积都继续有所增加，在丘脑出现了显著的较大的钙化沉积灶，与PFBC病人高度相似。采用可识别钙化沉积的荧光RIS‑AF647染色，也可以看到microCT类似脑区的钙化沉积(图10b)，但荧光显示的钙化灶更加清晰，适合进行量化统计。再者，总之，组织学染色分析，包括alizarin red,Von Kossa,Alcian blue,periodic acid‑Schiff(PAS),and H&E)，进一步显示小鼠模型的钙化灶在形态上与人类的脑钙化沉积是高度一致的(图11)，说明它们是由同样的病理机制驱动。这些结果表明，我们的人源化SLC20A2‑KI小鼠模型可以再现SLC20A2单倍体功能不足、脑Pi障碍以及SLC20A2突变的PFBC患者的脑钙化分布模式。 [0404] 实施例5：ASO干预有效抑制SLC20A2‑KI小鼠的脑钙化 [0405] 鉴于SLC20A2基因的突变是PFBC最常见的原因，我们的人源化SLC20A2‑KI小鼠模型因此代表了一个有价值的模型，用于测试基于ASO的新型疗法来治疗脑钙化。我们将其称为ASO纠正表达的钙化抑制(Calcification Repression by ASOCorrected Expression,CRACE)疗法。我们设计了四种剂量的MOE‑ASOs(50、100、200、400μg)来评估在3个月发生脑钙化之前，单剂量的ASO脑室注射介导的剪接校正是否能抑制SLC20A2‑KI小鼠的脑钙化(图12a)。由于在细胞实验中展现了显著的修复PiT2表达的效果，因此选择MOE‑A和MOE‑B(统称为治疗性MOE)进行体内给药。 [0406] 在单次200μg ICV注射MOE‑A 4个月后，通过使用特异识别MOE‑A的探针进行原位杂交，显示了全脑广泛分布的ASO信号(图12b)，表明MOEs在大脑中的可以有效进行扩散，并长期存在发挥作用。在目标基因的表达方面，与注射了对照MOE的SLC20A2‑KI小鼠相比，在注射了治疗性MOEs的纯合SLC20A2‑KI小鼠的丘脑中检测到包含crpE2插入的异常SLC20A2转录物发生了显著的降低，而正常的SLC20A2转录物则出现了明显的表达增加，进而其翻译产物PiT2蛋白的水平也明显增强(图12c,d,e)。同时，SLC20A2‑KI小鼠在4个月的100μg和200μg治疗性MOE‑ASOs干预后，CSF Pi水平也明显下降(图12f),提示脑内异常的磷酸根稳态得到修复。 [0407] 在脑钙化方面，通过3月龄鼠进行ICV给药100‑400μg治疗性MOE‑ASOs后四个月，7个月大的小鼠脑micro‑CT扫描显示，丘脑、下丘脑、中脑和前脑背侧的脑钙化在体积和钙化灶数目上均呈现显著的下降(图13a,b)。因此，MOE修饰的ASOs介导的剪接校正可以防止人源化SLC20A2‑KI小鼠模拟的PFBC的大脑钙化的发生。 [0408] 为了进一步评估ASO对已经发生钙化的小鼠进行脑室注射的干预效果，我们在5个月大的纯合SLC20A2‑KI小鼠脑内进行ASO脑室注射，根据图9的结果，此时小鼠脑内已经出现了钙化。之前在细胞上的实验显示MOE修饰的ASO和PMO修饰的ASO均可以修复SLC20A2的表达，此此动物实验我们选择25μg和75μg PMO‑ASOs用于5个月大的纯合SLC20A2‑KI小鼠(图14a)。在PMO‑1给药结束时，检测到SLC20A2‑KI小鼠丘脑中正常的SLC20A2转录物表达水平有明显增加(图14b)，而且CSF中Pi浓度也明显下降(图14c)。同样，micro‑CT显示，与PMO‑NC相比，单次使用25μg或75μg PMO‑1干预，7个月大的SLC20A2‑KI小鼠的脑部钙化分布明显减少(图15d)。总的来说，这些发现表明CRACE疗法能有效地提高PiT2的表达，修复脑部Pi的平衡，并遏制或降低SLC20A2‑KI小鼠的脑部钙化。因而，这些数据和发明支持ASO介导的CRACE疗法可用于PFBC病人的脑钙化治疗。 [0409] [0410] [0411] [0412] [0413] [0414] [0415] [0416] [0417] [0418] [0419] [0420] [0421] [0422] [0423] [0424] [0425] [0426] [0427] [0428] [0429] [0430] |
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