[0001] 本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种来源于麒麟菜的十六肽及其在制备防治恶性肿瘤转移药物中的应用。

[0002] 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的这一过程。恶性肿瘤的这种特性，应该称为扩散。恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因。常见的肿瘤转移部位是肺、肝、骨、脑等。转移癌并不一定是癌症的晚期，某些癌症的早期也可发生转移。转移癌之所以不同于原发癌，是因为它的形成是一个多因素、多环节的连续动态过程。转移癌细胞具有更活跃的运动性和更强大的耐药性，特别是具备丰富的新生血管而增殖速度极大加快，而且对宿方免疫功能有更大的抗拒性。治疗转移癌，应该是多靶点、多导向的复合结构药物。肿瘤是21世纪的健康杀手，其发病率和死亡率仍在攀升，但目前尚缺乏有效的防治肿瘤转移药物。

[0003] 目前对肿瘤患者的治疗方法主要是化疗和放疗手段，对人体造成极大损害，肿瘤发生恶性转移后无论用何种方式都很难彻底治愈。所以寻找一种能彻底清除癌细胞而不损害到其他细胞的治疗方法成为全球肿瘤医学领域的研究热点。

[0004] 多种生物活性肽陆陆续续被发现具有抗肿瘤活性，这成为抗肿瘤药物研究开发的新方向。麒麟菜（Eucheuma），也叫鸡脚菜、鸡胶菜，属藻类的藻体肥厚多肉，圆柱状，扁压或扁平，辐射或两侧分枝，该属约有20种，中国约有5种，为热带性海藻，具有很高的药用价值。经检索发现，目前暂无文献报道麒麟菜来源多肽抑制恶性肿瘤转移的功能，在国内外均未发现用麒麟菜来源多肽作防治恶性肿瘤转移的药物或保健品使用的报道。

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种来源于麒麟菜的十六肽。该十六肽化合物能够显著地抑制恶性肿瘤细胞的转移和侵袭活性，具有显著的防治恶性肿瘤转移功能，可应用于生物制药领域。

[0006] 本发明的目的是提供一种来源于麒麟菜的功能多肽。

[0007] 本发明另一个目的是提供由上述的功能多肽或其模拟肽在制备预防或抑制恶性肿瘤转移、扩散的药物或保健品中的应用。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案来实现：

[0009] 本发明涉及一种功能多肽，该功能多肽为十六肽，其氨基酸序列为：

[0010] Xaa（1）-Xaa（2）-Gly-Ala-Cys-Phe-Cys-Xaa（8）-Xaa（9）-Tyr-Xaa（11）-Gly-Xaa（13）-Xaa（14）-Tyr-Pro（SEQ ID No.1）；

[0011] 其中，Xaa（1）=Arg或Lys（Arg、Lys同为碱性氨基酸），Xaa（2）=Thr或Ser（Thr、Ser同为含羟基氨基酸），Xaa（8）=Val或Ile或Leu（Val、Ile、Leu同为支链氨基酸），Xaa（9）=Ile或Val或Leu（Val、Ile、Leu同为支链氨基酸），Xaa（11）=Asn或Gln（Asn、Gln同为含氨酰胺基团氨基酸），Xaa（13）=Ile或Val或Leu（Val、Ile、Leu同为支链氨基酸），Xaa（14）=Leu或Ile或Val（Val、Ile、Leu同为支链氨基酸）；其中，

[0012] Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；

[0013] Lys表示英文名称为lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基；

[0014] Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；

[0015] Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；

[0016] Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；

[0017] Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；

[0018] Cys表示英文名称为Cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸的相应残基；

[0019] Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；

[0020] Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基；

[0021] Ile表示英文名称为IsoLeucine，中文名称为异亮氨酸的氨基酸的相应残基；

[0022] Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；

[0023] Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；

[0024] Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的相应残基；

[0025] Gln表示英文名称为Glutamine，中文名称为谷氨酰胺的氨基酸的相应残基；

[0026] Pro表示英文名称为proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基。

[0027] 优选地，所述的功能多肽缩写为RTGACFCVIYNGILYP，氨基酸序列为：Arg-Thr-Gly-Ala-Cys-Phe-Cys-Val-Ile-Tyr-Asn-Gly-Ile-Leu-Tyr-Pro（SEQ ID No.2）。

[0028] 进一步地，具有在所述SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上经过取代一个或几个氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽，也在本发明的保护范围之内。

[0029] 本发明还涉及所述的功能多肽或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗恶性肿瘤的药物或保健品中的应用。

[0030] 本发明还涉及所述的功能多肽或其药学上可接受的盐在制备预防或抑制恶性肿瘤转移、扩散的药物或保健品，或者在制备预防或抑制恶性肿瘤转移、扩散药物的有效成分，或者在制备预防或抑制恶性肿瘤转移、扩散的药物前体改造中的新用途。

[0031] 本发明所述的恶性肿瘤转移包括体内转移或体外转移。

[0032] 进一步地，所述的恶性肿瘤包括肝癌、肺癌或乳腺癌。

[0033] 更进一步地，所述肝癌为HepG2细胞，肺癌为A549细胞，乳腺癌为MCF-7细胞。

[0034] 本发明所述功能多肽可以单独使用，也可以与其他药物联合使用。

[0035] 本发明还涉及一种减轻或抑制恶性肿瘤转移扩散的药物，包含所述的功能多肽或其药学上可接受的盐、或所述功能多肽的前药。

[0036] 本发明所述功能多肽的药学上可接受的盐，优选为该功能多肽与酸形成的医学上可接受的盐。

[0037] 所述酸包括有机酸和无机酸。

[0038] 优选地，所述无机酸为盐酸、硫酸或磷酸，所述有机酸为醋酸、草酸、枸橼酸、富马酸、苹果酸或乳酸。

[0039] 所述功能多肽的前药或药物前体通常指一种物质，当用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变成所述功能多肽或其盐。

[0040] 优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料或载体。

[0041] 其中，所述的药学上可接受的载体不会破坏本发明所述功能多肽的药学活性，通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》（Handbookof Pharmaceutical excipients，第2版，由A.Wade 和P.J.Weller编辑；AmericanPharmaceutical Association出版，Washington and The Pharmaceutical Press，London，1994）等工具书中找到。

[0042] 本发明所述的减轻或抑制肿瘤转移扩散的药物，可以根据实际需要制作成片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。

[0043] 本发明所述的减轻或抑制肿瘤转移扩散的药物，可按本领域常规方法制备，并可以通过经胃肠道给药或非经胃肠道给药途径给药。

[0044] 优选地，所述的非经胃肠道给药途径选择注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。

[0045] 其中，非经胃肠道给药药剂可以选择注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等；经胃肠道给药制剂可以选择片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂或糖浆剂等。

[0046] 本发明所述的减轻或抑制肿瘤转移扩散的药物的给药途径可以为口服、舌下、经肌肉或皮下、静脉、尿道、阴道等。

[0047] 本发明所述的功能多肽在防治恶性肿瘤转移的应用可以有如下多种方法：

[0048] 例如：口服本发明的功能多肽化合物10～50 mg/kg，每天一次，连续服药至少35天；注射本发明的功能麒麟菜多肽化合物0.1～1 mg/kg，每3天一次，连续服药至少35天；与目前使用的治疗恶性肿瘤药物联合应用，口服麒麟菜多肽化合物10～50 mg/kg，每天一次。

[0049] 本发明所述的功能多肽可以从麒麟菜中分离纯化得到，也可以以氨基酸为原料，用多肽合成仪器，按照SEQ ID No.1所述的氨基酸序列人工合成，再用高效液相色谱纯化。

[0050] 本发明还提供了一种来源于麒麟菜的十六肽的分离、纯化和鉴定方法，包括以下步骤：

[0051] （1）采集麒麟菜，用自来水反复清洗2～3次，再用蒸馏水反复冲洗1～2次，晾干后称重；

[0052] （2）将晾干的麒麟菜置于pH=3～5的溶液中浸泡，匀浆打碎，8000 r/min离心30 min后收集上清液；

[0053] （3）向上清液中加入1%～2%的KCl后再次离心，收集上清液备用；

[0054] （4）将上清液用Sephadex G-50分离，15～25 mmol/L盐酸洗脱，流速1.0 mL/min，收集280 nm具光吸收峰物质，共收集洗脱峰，得到多肽溶液；

[0055] （5）进一步用高效液相色谱分别纯化步骤（4）得到的多肽溶液，并鉴定活性；将有活性的多肽用LC-MS/MS仪器分析多肽序列。

[0056] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0057] （1）本发明首次合成了该功能多肽，该功能多肽具有很好的防治恶性肿瘤转移扩散的效果，在生物医药领域中有良好的应用前景。

[0058] （2）本发明的功能多肽可以制备防治恶性肿瘤转移的药物或药物的有效成分或药物前体或保健品。

[0059] （3）本发明含有功能多肽的药物或保健品，可以制成粉剂或注射针剂或产品等多种形式，可以单独作为成品使用，也可以作为有效成分与生理盐水、葡萄糖溶液等佐剂配组成组合物，或者也可以与目前使用的治疗恶性肿瘤转移药物联合使用。附图说明

[0060] 图1为所述功能多肽体外抑制癌细胞转移。

[0061] 图2为所述功能多肽体外抑制癌细胞侵袭。

[0062] 图3为所述功能多肽体内抑制癌细胞肺部转移。

[0063] 图4为所述功能多肽体内抑制癌细胞肝脏转移。

[0064] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0065] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0066] 实施例1  功能多肽（十六肽）制备

[0067] 1、一种来源于麒麟菜的十六肽的分离、纯化和鉴定方法，包括以下步骤：

[0068] （1）从海南琼海采集麒麟菜，用自来水反复清洗2～3次去掉麒麟菜表面的泥沙杂物，再用蒸馏水反复冲洗1～2次，晾干称重后备用；

[0069] （2）将晾干的麒麟菜置于pH=3的溶液中浸泡，匀浆打碎，得到匀浆液，用离心机8000 r/min离心30 min匀浆液后收集上清液；

[0070] （3）向上清液中加入1.5%的KCl后再次离心，收集上清液备用；

[0071] （4）将上清液用Sephadex G-50分离，20 mmol/L盐酸洗脱，流速1.0 mL/min，收集280 nm具光吸收峰物质，共收集洗脱峰，得到多肽溶液；

[0072] （5）进一步用高效液相色谱分别纯化步骤（4）得到的多肽溶液，并鉴定活性；将有活性的多肽用LC-MS/MS仪器分析多肽序列。

[0073] 2、结果：得到纯度95%以上的产品，并经LC-MS/MS鉴定，最终分析确定所得到的多肽为十六肽，其缩写为RTGACFCVIYNGILYP，氨基酸序列为：Arg-Thr-Gly-Ala-Cys-Phe-Cys-Val-Ile-Tyr-Asn-Gly-Ile-Leu-Tyr-Pro。

[0074] 实施例2  防治肿瘤转移的实验

[0075] 1、多肽的体外抑制活性：Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭的情况[0076] （1）Transwell侵袭实验：

[0077] 1）加入Matrigel，包括以下步骤：

[0078] ①将从Corning Costar公司购买的Matrigel分装到无菌的1.5 mL的EP管，用封口膜封好后置于-20℃保存；实验前24小时，将含有Matrigel的EP管取出，放置冰上，然后放于4℃，使其缓慢溶解备用；

[0079] ②将融化后的Matrigel置于冰上，Transwell板和24孔板放于-20℃预冷备用，然后从4℃冰箱取出无血清的DMEM培养基按照体积比为1：3（Matrigel：培养基）稀释Matrigel，混匀后置于冰上备用；

[0080] ③从-20℃中取出transwell板和24孔板，用镊子将transwell小室置于24孔板孔中，然后向上室中加入稀释后的Matrigel，每孔100 µL；

[0081] ④“8”字摇晃24孔板，使Matrigel在上室中分布均匀，实验操作时要注意避免产生气泡，避免戳破微孔膜，然后将24孔板置于37℃，含5% CO2的培养箱中孵育30～50 min。

[0082] 2）细胞培养

[0083] ①取对数生长期的肿瘤细胞（包括人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和人乳腺癌MCF-7细胞），消化后细胞计数，用无血清的DMEM培养基制备细胞密度为2.5×105/mL的细胞悬液备用；

[0084] ②从培养箱中取出加有Matrigel的24孔板，小心弃除各上室中的培养基，用镊子提起上室，向下室中加入600 µL含有10%胎牛血清和不同浓度十六肽（RTGACFCVIYNGILYP）的DMEM完全培养基，然后轻轻将上室放回下室，注意避免产生气泡；然后在各上室中加入100 µL细胞悬液，盖上盖子，摇晃混匀，置于37℃，含5%CO2的培养箱中培养24 h；

[0085] ③将24孔板从培养箱中取出，用移液枪去除上室和下室的培养基，向下室中加入600 µL的PBS缓冲液轻轻漂洗细胞，漂洗三次；

[0086] ④用棉签将上室微孔膜上面的Matrigel和细胞擦净，然后将小室置于加有600 µL甲醇的下室中固定，室温静置30 min，然后将小室置于加有600 µL的PBS缓冲液的下室中漂洗三次，每次5 min；

[0087] ⑤漂洗完后，将上室倒置在24孔板盖上，使上室的下表面在通风处自然风干；

[0088] ⑥将风干的上室置于加有600 µL吉母萨染液的下室中进行染色，室温静置30 min；

[0089] ⑦染色后将上室放入PBS缓冲液中进行漂洗，漂洗三次，每次5 min；

[0090] ⑧将上室倒置在载玻片上，在正置显微镜下观察并拍照；随机选取5个高倍视野（×100）进行细胞计数，重复实验三次，并进行统计学分析。

[0091] （2）Transwell迁移实验：

[0092] 不加Matrigel，其余实验步骤与上述侵袭实验相同。

[0093] （3）实验结果

[0094] 实验结果分别如图1和图2所示。Transwell侵袭实验结果显示，与空白对照组相比，给药组10 μg/mL和20 μg/mL的十六肽均能显著抑制肝癌、肺癌和乳腺癌细胞的侵袭能力；另外，Transwell迁移实验结果显示，与空白对照组相比，给药组10 μg/mL和20 μg/mL的十六肽能显著抑制肝癌、肺癌和乳腺癌细胞的迁移能力（**，与对照组比较P<0.01）。实验结果说明，本发明的十六肽能够显著恶性肿瘤的转移和扩散。

[0095] 2、体内肿瘤转移实验

[0096] （1）实验方法：

[0097] 1）建立人癌裸鼠移植瘤模型：采用培养细胞异体移植法建立动物肿瘤模型，首先大量培养人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和人乳腺癌MCF-7细胞，然后分别将各组细胞进行常规消化并收集，用移液枪轻轻吹打细胞使其分散均匀，用台盼蓝染色细胞并计数活细胞，当活细胞数大于95%可用于后续实验；

[0098] 2）1000 r/min，离心5 min，并去除完全培养基，然后加入不含血清的DMEM培养基洗涤细胞一次，1000 r/min，离心5 min，去除上清液；

[0099] 3）加入适量的PBS或不含血清DMEM培养基重悬细胞，然后进行细胞计数，使细胞悬液密度为5×107/mL，30 min内尽快接种，以防止细胞成活下降；

[0100] 4）选取裸鼠尾静脉为接种部位；局部消毒后，用1 mL注射器准确吸取已混匀的细胞悬液，注射0.2 mL细胞悬液至裸鼠尾静脉，接种完毕后轻轻按压数秒钟，以防细胞悬液流出；整个操作过程严格遵守无菌操作原则；

[0101] 5）接种细胞后所有裸鼠正常饮食、饮水，并每天喂食不同浓度的十六肽（RTGACFCVIYNGILYP）。

[0102] 6）观察小鼠每天的生活情况；静脉注射细胞后第六周，以颈椎脱臼法处死动物结束实验，将裸鼠解剖，取出裸鼠的肝脏、肺等各种组织器官；寻找转移的肿瘤，比较三组裸鼠在组织中肿瘤转移的情况。

[0103] 7）取材肺组织用10%中性甲醛固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋，供后续病理切片，HE染色；显微镜拍摄；每只裸鼠肺组织切10片病理切片。

[0104] （2）实验结果

[0105] 体内肿瘤转移的实验结果如图3和图4所示。由尾静脉注射癌细胞转移实验结果可知，本发明的来源于麒麟菜的十六肽在体内显著减少了肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和人乳腺癌MCF-7细胞等癌细胞在肺部和肝脏形成的癌灶数量（**，与对照组比较P<0.01）。实验结果说明，该十六肽具有抑制恶性肿瘤体内转移的功能。

[0106] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。