专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 实质审查; |
专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
申请号 | CN202411018152.4 | 申请日 | 2024-07-29 |
公开(公告)号 | CN118718105A | 公开(公告)日 | 2024-10-01 |
申请人 | 哈尔滨医科大学; | 申请人类型 | 学校 |
发明人 | 康凯; 孙昊博; 展旭; 解万东; 秦思达; 靳元; 孙哲; 张金凤; | 第一发明人 | 康凯 |
权利人 | 哈尔滨医科大学 | 权利人类型 | 学校 |
当前权利人 | 哈尔滨医科大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
省份 | 当前专利权人所在省份:黑龙江省 | 城市 | 当前专利权人所在城市:黑龙江省哈尔滨市 |
具体地址 | 当前专利权人所在详细地址:黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路157号 | 邮编 | 当前专利权人邮编:150081 |
主IPC国际分类 | A61L27/38 | 所有IPC国际分类 | A61L27/38 ; A61L27/54 ; C12N5/09 |
专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
专利代理机构 | 哈尔滨市伟晨专利代理事务所 | 专利代理人 | 李晓敏; |
摘要 | 本 发明 涉及促心梗后心肌再血管化的 肿瘤 源外泌体的制备方法及应用,属于 生物 医用材料领域。为解决现有心脏贴片搭载的外泌体促血管新生疗效不确切,培育难度大无法应对批量生产的问题,本发明提供了促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体的制备方法及应用,将促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体应用于制备 治疗 缺血性心脏病的心脏贴片中。本发明证实肿瘤源外泌体具有促血管生成的确切疗效,且能够满足转化应用和批量生产的要求。本发明利用肿瘤源外泌体具有促血管生成的特点,通过搭载组织工程学心脏贴片的方式能够有效解决心肌梗死治疗中不完 全血 管化及微循环障碍而导致的顽固性心衰、心肌梗死复发等问题,降低缺血性心脏病的复发率和病死率。 | ||
权利要求 | 1.一种促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体在制备用于缺血性心脏病再血管化治疗的心脏贴片中的应用。 |
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说明书全文 | 促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体的制备方法及应用技术领域背景技术[0002] 缺血性心脏病发生过程中,梗死周围边界区的残余缺血会导致心肌细胞进一步受损,导致收缩功能进行性下降,因此心肌梗死后的促血管新生治疗具有重大的临床治疗意义。 [0003] 目前心梗治疗主要围绕及时恢复血供、改善缺血缺氧以减少心肌坏死,治疗手段主要包括药物溶栓、血管支架介入、冠脉旁路移植术和心脏移植等。然而,这些治疗手段均无法逆转心肌梗死和心功能的进一步恶化。此外,还存在心脏移植供体来源短缺、术后易出现免疫排斥等问题。近年来,利用组织工程原理构建的工程化心脏贴片具有重建心肌再生微环境和修复心肌梗死的潜力。 [0004] 作为搭载组织工程学心脏贴片的核心治疗部件,以外泌体为代表的无细胞疗法以其高效力,低免疫原性被广泛认可。使用不同类型细胞的外泌体均展现出不同程度的疗效,目前涉及治疗效力的外泌体如干细胞外泌体,内皮细胞外泌体,均存在治疗覆盖范围广,但对心肌梗死后促血管新生的疗效不确切不深入的问题,且现有外泌体所来源的细胞系培育难度大,提取效率低,无法应对应用转化的批量生产。 发明内容[0005] 为解决现有心脏贴片搭载的外泌体促血管新生疗效不确切,培育难度大无法应对批量生产的问题,本发明提供了促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体的制备方法及应用。 [0006] 本发明的技术方案: [0007] 一种促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体在制备用于缺血性心脏病再血管化治疗的心脏贴片中的应用。 [0008] 进一步的,所述心脏贴片中肿瘤源外泌体的质量百分含量为0.5%。 [0009] 进一步的,所述肿瘤源外泌体包括卵巢癌Caov‑3细胞系来源的外泌体和/或卵巢癌OV‑90细胞系来源的外泌体。 [0010] 一种促心梗后心肌再血管化的肿瘤源外泌体的制备方法,步骤如下: [0011] 步骤一、肿瘤细胞的复苏和传代: [0012] 将肿瘤细胞接种于复苏培养基中进行复苏培养,细胞融合度达到传代要求后,用胰蛋白酶消化所得肿瘤细胞后进行传代扩增; [0013] 步骤二、肿瘤细胞的无外泌体血清培养: [0014] 以去除外泌体的胎牛血清配置无外泌体血清专用培养基,将步骤一扩增所得肿瘤细胞接入所述无外泌体血清专用培养基进行72h无外泌体血清培养; [0015] 步骤三、收集肿瘤细胞: [0016] 收集步骤二已培养72h的肿瘤细胞培养液,通过两步离心去除死细胞、杂质及细胞碎片,收集细胞上清液; [0017] 步骤四、收集肿瘤源外泌体: [0018] 将步骤三收集的细胞上清液进行超速离心沉降外泌体,用缓冲液重悬所得外泌体并离心提纯,得到肿瘤源外泌体。 [0019] 进一步的,步骤一所述肿瘤细胞为卵巢癌Caov‑3细胞或卵巢癌OV‑90细胞。 [0020] 进一步的,步骤一所述复苏培养基为1640RIPM+10%v/v胎牛血清+1%v/v双抗;所述复苏培养是在37℃、CO2体积百分含量为5%的条件下培养。 [0021] 进一步的,步骤一所述细胞融合度为75~85%,所述胰酶为0.25%w/v胰蛋白酶溶液,消化时间为1min;所述传代扩增的传代比例为1:3。 [0022] 进一步的,步骤二所述去除外泌体的胎牛血清是将胎牛血清于4℃,120000G超速离心16h,去除血清中富含的外泌体获得的;所述无外泌体血清专用培养基为1640RIPM+5%v/v去除外泌体的胎牛血清+1%v/v双抗;所述无外泌体血清培养的传代比例为1:5,培养条件为CO2体积百分含量为5%的条件下,37℃温度下培养。 [0023] 进一步的,步骤三所述两步离心为先以300G离心10min去除死细胞及杂质,再以2000G离心10min去除细胞碎片。 [0024] 进一步的,步骤四所述超速离心为120000G离心90min,所述离心提纯为120000G离心90min。 [0025] 本发明的有益效果: [0026] 本发明创造性的将肿瘤细胞侵袭迁移的促血管生成的病理机制反向整合到促进梗死部位血管生成的治疗机制,将肿瘤细胞强大、刺激、持久刺激新生血管生成的能力进行有效利用。 [0027] 本发明通过试验证实,肿瘤源外泌体中sE‑cad蛋白(可溶性E‑钙黏蛋白)能与内皮细胞的VEGFR2位点结合发挥类VEGF的作用,此种外泌体还具有促进VEGFR2表达的能力,这两种能力使肿瘤源外泌体促内皮细胞成管能力大于已知促血管生成的最高效力经典因子VEGF,具有促血管生成的确切疗效。而且肿瘤细胞具有培育简单、扩增迅速、肿瘤源外泌体收集率突出的特点,能够满足转化应用和批量生产的要求。 [0028] 本发明利用肿瘤源外泌体具有促血管生成的特点,将其提取转化为治疗缺血性心脏病的关键治疗因子,通过搭载组织工程学心脏贴片的方式,能够有效解决心肌梗死治疗中不完全血管化及微循环障碍而导致的顽固性心衰、心肌梗死复发等问题,降低缺血性心脏病的复发率和病死率。附图说明 [0029] 图1为实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体的电镜摄片; [0030] 图2为实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体的浓度分布图; [0031] 图3为实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体的粒径分布图; [0032] 图4为实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取制备的OV‑90细胞源外泌体E‑cadherin蛋白、GADPH蛋白、HSP70蛋白和TSG101蛋白的表达情况对比图; [0033] 图5为Tube formation实验中各组内皮细胞生成血管的显微照片; [0034] 图6为Tube formation实验中各组内皮细胞生成血管的结点数、分支数和总分支长度对比图; [0035] 图7为划痕实验中各组内皮细胞0h和24h的划痕图像; [0036] 图8为划痕实验中各组内皮细胞的迁移面积对比图; [0037] 图9为Transwell实验中各组24孔板下室内皮细胞的染色显微照片; [0038] 图10为Transwell实验中各组24孔板下室内皮细胞的细胞数量对比图; [0039] 图11为分子对接中VEGFR2蛋白与E‑Cadherin蛋白的模拟互作图; [0040] 图12为CO‑IP免疫共沉淀试验中E‑cadherin蛋白和KDR蛋白的WB结果图; [0041] 图13为Rt‑qPCR实验中各组细胞KDR表达量的结果图; [0043] 图15为损伤模型对照MI组和Exo‑Patch心脏贴片治疗组大鼠心肌组织CD31和α‑SMA表达情况对比图; [0044] 图16为心脏超声检测中各组大鼠的心脏超声检查结果对比图; [0045] 图17从左至右依次为心脏超声检测中各组大鼠的左室射血分数LVEF、左室收缩末容量ESV和左室舒张末容量EDV的检测结果对比图; [0046] 图18为各组大鼠的心脏MASSON染色结果对比图。 具体实施方式[0047] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置,若未特别指明,本发明实施例中所用的原料等均可市售获得;若未具体指明,本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0048] 实施例1 [0049] 本实施例提供了一种卵巢癌细胞来源的肿瘤源外泌体的制备方法。 [0050] 本实施例中肿瘤细胞为卵巢癌Caov‑3细胞,肿瘤源外泌体的具体制备方法如下: [0051] 步骤一、肿瘤细胞的复苏和传代: [0052] 配制复苏培养基:1640RIPM+10%v/v胎牛血清+1%v/v双抗,双抗为青霉素‑链霉素混合液,青霉素‑链霉素溶液(100×)里青霉素的含量是10000u/mL,链霉素的含量为10mg/mL。 [0053] 将卵巢癌Caov‑3细胞接种于装有复苏培养基的T25瓶中,置于37℃、CO2体积百分含量为5%的细胞培养箱中培养,当Caov‑3细胞融合度达到80%时进行传代。 [0054] 用0.25%w/v胰蛋白酶溶液(含0.1%w/v EDTA)对复苏的Caov‑3细胞消化1min后加入同体积1640RIPM完全培养基进行中和,传代比例为1:3,置于37℃、CO2体积百分含量为5%的细胞培养箱中将细胞不断扩增培养,直到获得5‑6例左右150mm细胞培养皿的细胞数量。 [0055] 步骤二、肿瘤细胞的无外泌体血清培养: [0056] 将胎牛血清于4℃、120000G超速离心16h去除血清中富含的外泌体和其他营养物质,以所得无外泌体血清配制无外泌体血清专用培养:1640RIPM+5%v/v去除外泌体的胎牛血清+1%v/v双抗。 [0057] 将步骤一扩增所得5例150mm细胞培养皿的Caov‑3细胞接入无外泌体血清专用培养基,传代比例为1:5,置于37℃、CO2体积百分含量为5%的细胞培养箱中进行72h无外泌体血清培养。 [0058] 步骤三、收集肿瘤细胞: [0059] 收集步骤二已培养72h的Caov‑3细胞培养液,先以300G离心10min去除死细胞及杂质,再以2000G离心10min去除细胞碎片,收集细胞上清液。 [0060] 步骤四、收集肿瘤源外泌体: [0061] 将步骤三收集的细胞上清液先以10000G高速离心30min以去除微泡等杂质,再以120000G超速离心90min沉降外泌体,用PBS缓冲液重悬所得外泌体并再次以120000G超速离心90min以提高外泌体纯度,用PBS缓冲液对外泌体进行收集,得到浓度为1mg/ml的Caov‑3细胞源外泌体混悬液。 [0062] 实施例2 [0063] 本实施例提供了一种卵巢癌细胞来源的肿瘤源外泌体的制备方法。 [0064] 本实施例中肿瘤细胞为卵巢癌OV‑90细胞,肿瘤源外泌体的具体制备方法如下: [0065] 步骤一、肿瘤细胞的复苏和传代: [0066] 配制复苏培养基:1640RIPM+10%v/v胎牛血清+1%v/v双抗,双抗为青霉素‑链霉素混合液,青霉素‑链霉素溶液(100×)里青霉素的含量是10000u/mL,链霉素的含量为10mg/mL。 [0067] 将卵巢癌OV‑90细胞接种于装有复苏培养基的T25瓶中,置于37℃、CO2体积百分含量为5%的细胞培养箱中培养,当OV‑90细胞融合度达到80%时进行传代。 [0068] 用0.25%w/v胰蛋白酶溶液(含0.1%w/v EDTA)对复苏的OV‑90细胞消化1min后加入同体积完全培养液进行中和,传代比例为1:3,置于37℃、CO2体积百分含量为5%的细胞培养箱中将细胞不断扩增培养,直到获得5‑6例左右150mm细胞培养皿的细胞数量。 [0069] 步骤二、肿瘤细胞的无外泌体血清培养: [0070] 将胎牛血清于4℃、120000G超速离心16h去除血清中富含的外泌体和其他营养物质,以所得无外泌体血清配制无外泌体血清专用培养:1640RIPM+5%v/v去除外泌体的胎牛血清+1%v/v双抗。 [0071] 将步骤一扩增所得5例150mm细胞培养皿的OV‑90细胞接入无外泌体血清专用培养基,传代比例为1:5,置于37℃、CO2体积百分含量为5%的细胞培养箱中进行72h无外泌体血清培养。 [0072] 步骤三、收集肿瘤细胞: [0073] 收集步骤二已培养72h的OV‑90细胞培养液,先以300G离心10min去除死细胞及杂质,再以2000G离心10min去除细胞碎片,收集细胞上清液。 [0074] 步骤四、收集肿瘤源外泌体: [0075] 将步骤三收集的细胞上清液先以10000G高速离心30min以去除微泡等杂质,再以120000G超速离心90min沉降外泌体,用PBS缓冲液重悬所得外泌体并再次以120000G超速离心90min以提高外泌体纯度,用PBS缓冲液对外泌体进行收集,得到得到浓度为1mg/ml的OV‑ 90细胞源外泌体混悬液。 [0076] 实施例3 [0077] 本实施例提供了使用实施例1制备的Caov‑3细胞源外泌体制备的用于治疗缺血性心脏病的心脏贴片及其制备方法。 [0078] 本实施例心脏贴片的具体制备方法步骤如下: [0079] 步骤1、提取脂肪脱细胞基质: [0080] 将脂肪组织与无菌布上切成0.3cm厚脂肪组织块,将脂肪组织块置于50ml离心管中用PBS缓冲液充分冲洗去除血液杂质,加入刚没过脂肪组织块的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中,‑80℃冷冻后37℃水浴复温,反复冻融5次;本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,5mmol/L EDTA。 [0081] 配制含有0.25%w/v胰蛋白酶和0.1%w/vEDTA的胰蛋白酶处理液,将经过反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中,37℃水浴6h,用无菌PBS缓冲液冲洗30min×3次后置于异丙醇中,37℃水浴8h,用无菌PBS缓冲液冲洗30min×3次后再次置于胰蛋白酶处理液中,37℃水浴处理6h得到脂肪脱细胞基质。 [0082] 将所得脂肪脱细胞基质用去离子水配制成浓度为2wt%的脂肪脱细胞基质悬液,通过磁力搅拌器以1000rpm匀速搅拌12h获得乳白色匀浆; [0083] 步骤2、制备心脏贴片: [0084] 配制浓度为2.5wt%的明胶溶液,通过磁力搅拌器以1000rpm匀速搅拌状态下向步骤一所得乳白色匀浆中加入明胶溶液并搅拌均匀,乳白色匀浆、明胶溶液的体积比为1:1,将所得混合体系置于4℃冰箱中冷却1h;将所得凝胶体系浸没于1wt%的戊二醛溶液中,室温交联1h,取出后用PBS冲洗3次,将冲洗后的凝胶体系迅速移入低温冷冻‑80℃冷冻8h,然后将其置于真空冻干机中冻干处理48h得到冻干凝胶。 [0085] 配制浓度为1wt%的氢氧化钠溶液和2wt%的硼氢化钠溶液;将所得冻干凝胶浸泡于1wt%的氢氧化钠溶液中,浸泡时间为30min,用去离子水冲洗30min×3次后置于2wt%的硼氢化钠溶液中,浸泡时间为30min,用去离子水冲洗30min×3次得到凝胶贴片。 [0086] 将实施例1制备的外泌体混悬液配制成1mg/ml的Caov‑3细胞源外泌体的混悬液;按外泌体混悬液与凝胶贴片的体积质量比为0.1mL:20mg将Caov‑3细胞源外泌体的混悬液均匀渗透至凝胶贴片内部孔隙中,然后冻干处理12h后得到基于Caov‑3细胞源外泌体的心脏贴片,其中Caov‑3细胞源外泌体的质量百分含量为0.5%。 [0087] 实施例4 [0088] 本实施例提供了使用实施例2制备的OV‑90细胞源外泌体制备的用于治疗缺血性心脏病的心脏贴片及其制备方法。 [0089] 本实施例心脏贴片的具体制备步骤如下: [0090] 步骤1、提取脂肪脱细胞基质: [0091] 将脂肪组织与无菌布上切成0.3cm厚脂肪组织块,将脂肪组织块置于50ml离心管中用PBS缓冲液充分冲洗去除血液杂质,加入刚没过脂肪组织块的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中,‑80℃冷冻后37℃水浴复温,反复冻融5次;本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,5mmol/L EDTA。 [0092] 配制含有0.25%w/v胰蛋白酶和0.1%w/vEDTA的胰蛋白酶处理液,将经过反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中,37℃水浴6h,用无菌PBS缓冲液冲洗30min×3次后置于异丙醇中,37℃水浴8h,用无菌PBS缓冲液冲洗30min×3次后再次置于胰蛋白酶处理液中,37℃水浴处理6h得到脂肪脱细胞基质。 [0093] 将所得脂肪脱细胞基质用去离子水配制成浓度为2wt%的脂肪脱细胞基质悬液,通过磁力搅拌器以1000rpm匀速搅拌12h获得乳白色匀浆; [0094] 步骤2、制备心脏贴片: [0095] 配制浓度为2.5wt%的明胶溶液,通过磁力搅拌器以1000rpm匀速搅拌状态下向步骤一所得乳白色匀浆中加入明胶溶液并搅拌均匀,乳白色匀浆、明胶溶液的体积比为1:1;将所得混合体系置于4℃冰箱中冷却1h;将所得凝胶体系浸没于1wt%的戊二醛溶液中,室温交联1h,取出后用PBS冲洗3次,将冲洗后的凝胶体系迅速移入低温冷冻‑80℃冷冻8h,然后将其置于真空冻干机中冻干处理48h得到冻干凝胶。 [0096] 配制浓度为1wt%的氢氧化钠溶液和2wt%的硼氢化钠溶液;将所得冻干凝胶浸泡于1wt%的氢氧化钠溶液中,浸泡时间为30min,用去离子水冲洗30min×3次后置于2wt%的硼氢化钠溶液中,浸泡时间为30min,用去离子水冲洗30min×3次得到凝胶贴片。 [0097] 将实施例2制备的外泌体混悬液配制成1mg/ml的OV‑90细胞源外泌体的混悬液;按外泌体混悬液与凝胶贴片的体积质量比为0.1mL:20mg将OV‑90细胞源外泌体的混悬液均匀渗透至凝胶贴片内部孔隙中,然后冻干处理12h后得到基于OV‑90细胞源外泌体的心脏贴片,其中OV‑90细胞源外泌体的质量百分含量为0.5%。 [0098] 一、外泌体特征的鉴定 [0099] (1)外观、浓度及粒径 [0100] 图1为本实施例提取制备的Caov‑3细胞源外泌体的电镜摄片,图片显示Caov‑3细胞源外泌体呈囊泡状结构。 [0101] 图2为纳米流式检测所得本实施例提取制备的Caov‑3细胞源外泌体的浓度分布11 图,图中得出的外泌体浓度为2.30×10 Particles/ml。 [0102] 图3为本实施例提取制备的Caov‑3细胞源外泌体的粒径分布图;图片显示Caov‑3细胞源外泌体粒径绝大多数分布在40‑100nm之间。 [0103] 由外泌体的外观、浓度及粒径的鉴定结果证实实施例1所提取物符合外泌体特征。 [0104] (2)Westerblot(免疫印记)实验 [0105] 通过Westerblot实验考察实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取制备的OV‑90细胞源外泌体是否含有目的蛋白E‑cadherin蛋白、外泌体表征蛋白HSP70蛋白、TSG101蛋白和真核细胞内参蛋白GADPH蛋白,结果如图4所示。 [0106] 由图4可以证实,实施例1提取的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取的OV‑90细胞源外泌体中均含有80kDa的E‑cadherin蛋白、HSP70蛋白、TSG101蛋白和GADPH蛋白,这些蛋白的表达从分子生物学角度证实实施例1提取的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取的OV‑90细胞源外泌体都含有目的蛋白并符合外泌体特征。 [0107] 二、体外促血管生成能力的验证实验 [0108] 使用脐静脉内皮细胞(HUVEC)或与心脏微循环系统有关的主动脉内皮细胞(HAEC)进行实验论证,通过Tube formation实验(小管生成实验)、划痕实验和Transwell实验(细胞侵袭实验)考察了肿瘤源外泌体的促血管生成能力。 [0109] (1)Tube formation实验 [0110] 具体试验方法为: [0112] 具体步骤: [0113] 1.实验前一天将基质胶置于冰盒中,放入4℃冰箱,过夜缓融; [0114] 2.每孔中加入10μL基质胶; [0115] 3.将ibidi血管生成载玻片放入10cm培养皿中,同时放入浸水纸巾保持湿润; [0116] 4.将HUVEC(脐静脉内皮细胞)进行细胞悬液准备,密度为2×105; [0117] 5.每孔根据分组加入细胞悬液: [0118] NC组:40μL细胞悬液+10μL无血清培养基; [0119] IgG组:40μL细胞悬液+10μLIgG溶液; [0120] OV‑90exo组:40μL细胞悬液+10μLOV‑90exo悬液; [0121] Caov‑3exo组:40μL细胞悬液+10μLCaov‑3exo悬液; [0123] 图5为Tube formation实验中各组内皮细胞生成血管的显微照片;通过对比可以看出,OV‑90exo组和Caov‑3exo组生成血管数量更多,这说明内皮细胞的血管生成能力在外泌体刺激下得到增强。 [0124] 图6为Tube formation实验中各组内皮细胞生成血管的结点数、分支数和总分支长度对比图;通过对比可以看出,OV‑90exo组和Caov‑3exo组生成血管的结点数、分支数和总分支长度均显著高于NC组和IgG组;由此证实实施例1提取的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取的OV‑90细胞源外泌体都具有促进内皮细胞血管生成的功能。 [0125] (2)划痕实验 [0126] 具体试验方法为: [0127] 将HUVEC细胞系接种到细胞培养板中,并用1000μL无菌移液管吸头刮擦,PBS洗涤后添加等量无血清培养基,IgG组、Caov‑3exo组、OV‑90exo组和NC组依次分别内含IgG溶液、Caov‑3exo、OV‑90exo(终浓度50μg/mL)、PBS,在0h和24h拍摄图像,并测量划痕的面积。 [0128] 图7为划痕实验中各组内皮细胞0h和24h的划痕图像;图8为划痕实验中各组内皮细胞的迁移面积对比图;通过对比可以看出,Caov‑3exo组、OV‑90exo组内皮细胞的迁移面积显著优于NC组和IgG组;由此证实实施例1提取的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取的OV‑90细胞源外泌体都对内皮细胞的迁移能力有促进作用,且具有统计学意义。 [0129] (3)Transwell实验 [0130] 具体试验方法为: [0131] 将IgG组、Caov‑3exo组、OV‑90exo组和NC组的HUVEC细胞系分别用终浓度为50μg/mL的IgG溶液、Caov‑3exo、OV‑90exo或等量PBS处理并饥饿24h。取500μl完全内皮细胞培养基加入24孔板下室,用镊子将Transwell小室置于24孔板内,消化饥饿后的细胞,用无血清的培养基重悬,根据上室细胞接种数量调整细胞密度,将24孔板置于37℃,5%CO2,90%湿度条件下培养24~48小时。在24孔板中进行600uL4%多聚甲醛固定30min,将小室放入固定30分钟并洗涤,再加入600uL结晶紫染色液,将小室放入染色10分钟。取出小室,PBS洗涤小室内外3次。适当风干后,显微镜下观察定性研究;取3‑5个视野拍照后用ImageJ计数取平均值进行定量研究。 [0132] 图9为Transwell实验中各组24孔板下室内皮细胞的染色显微照片;图10为Transwell实验中各组24孔板下室内皮细胞的细胞数量对比图;通过对比可以看出,Caov‑3exo组、OV‑90exo组内皮细胞的迁移数量显著优于NC组和IgG组,由此证实实施例1提取的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取的OV‑90细胞源外泌体都对内皮细胞的迁移能力有促进作用,且具有统计学意义。 [0133] 三、肿瘤源中外泌体关键蛋白sE‑cad蛋白促内皮细胞成管能力验证实验[0134] (1)分子对接 [0135] 具体试验方法为: [0136] 蛋白结构由RCSB蛋白数据库(www.rcsb.org)提供,利用FFT(快速傅里叶变换)程序GRAMM对VEGFR2蛋白与E‑Cadherin蛋白进行自由对接,计算得到蛋白相互作用最稳定的构想,对接均使用软件默认参数。通过PDBePISA分析蛋白之间互相作用类型与结合能;最后通过PyMol软件进行可视化,绘制蛋白的相互作用图。 [0137] 图11为分子对接中VEGFR2蛋白与E‑Cadherin蛋白的模拟互作图;图片说明VEGFR2蛋白与E‑Cadherin蛋白存在多个模拟对接位点,模拟结果说明两种蛋白存在互作关系,可能互相结合。 [0138] (2)CO‑IP免疫共沉淀实验 [0139] 具体试验方法为: [0140] 将实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取制备的OV‑90细胞源外泌体和IgG分别加入含有主动脉内皮细胞(HAEC)的培养液中,同时设置不添加任何外泌体的HAEC细胞培养液作为对照组,24h后弃去各组培养液,用PBS清洗细胞表面两次去除残留培养液。 [0141] 用1mLPBS轻轻垂下贴壁细胞,用1.5mLEP管收集细胞,3000r/min离心5min,弃上清,向每个EP管中加入100μL细胞裂解液,吹匀细胞沉淀,冰上静置30min裂解细胞。12000r/min离心15min收集上清脂0.5mLEP管中,并用NanoDrop2000分光光度计测量浓度。 [0142] 根据蛋白质量加入对应一抗,封口后置于垂直混合仪上,置于4℃过夜。次日向各组样品中加入40μL琼脂糖磁珠,封口后置于垂直混合仪上,置4℃过夜。第三天弃上清,每管中加入400μLPBST,上下颠倒10次,冲洗磁珠以去除非特异性结合,共清洗3次。每次清洗后1500r/min离心5min,弃上清,最后向每管中加入100μL1×loading buffer,100℃金属浴 10min,待样品冷却后分别行Western Blot。 [0143] 图12为CO‑IP免疫共沉淀试验中E‑cadherin蛋白和KDR蛋白的WB结果图;结果显示,在HAEC细胞系加入外泌体后显示出sE‑cad段的条带,并具有KDR的条带,证明在外泌体加入后进行CO‑IP及蛋白提取的过程中存在了KDR‑sE‑cad蛋白复合体,证明两种蛋白具有互相结合互相作用的关系,两种蛋白的相互作用可以启动下游蛋白的表达增高或磷酸化水平增高,进而实现对应的功能。 [0144] (3)Rt‑qPCR实验 [0145] 具体试验方法为: [0146] 将主动脉内皮细胞(HAEC)进行细胞悬液准备,密度为2×105;每孔根据分组加入细胞悬液:NC组:40μL细胞悬液+10μL无血清培养基;OV‑90exo组:40μL细胞悬液+10μLOV‑90exo悬液;Caov‑3exo组:40μL细胞悬液+10μLCaov‑3exo悬液;培养24h后弃去培养液,PBS清洗两次后,每孔加入1mLTrizol,用细胞刮刀收集细胞至1.5mLEP管。每管中加入200μL氯仿,上下颠倒10次,12000r/min离心15min,将上清液转移至新的1.5mLEP管,加入500μL异丙醇,上下颠倒10次,静置10~15min,12000r/minlixin 15min,弃上清,加入75%乙醇,摇晃至沉淀溶解,12000r/min离心5min,弃上清,用滤纸条吸干液体,每管中加入10μLDEPC水溶解RNA沉淀。最后,用NanoDrop2000分光光度计测量浓度。 [0147] 按逆转录酶(Enzyme Mix)1μL,5×缓冲液(5×RT Buffer)4μL,引物(Primer Mix)1μL,RNA样品200ng/RNA样品浓度(μg/mL),DEPC水14μL‑2000ng/RNA样品浓度(μg/mL)配制逆转录体系,选择对应的逆转录程序(37℃,15min,98℃,5min)进行逆转录,待样品冷却至4℃取回,逆转录样本保存在‑20℃。 [0148] 按SYB Green(染料)10μL,DEPC水7μL,cDNA模板1μL,上游引物(Forward)1μL,下游引物(Reverse)1μL进行PCR体系配比,按95℃10min1循环,95℃13s40循环,60℃30s40循环,72℃30s40循环进行PCR反应。 [0149] 图13为Rt‑qPCR实验中各组细胞KDR表达量的结果图;结果显示,在外泌体加入后,HAEC细胞内KDR的表达高于对照组,说明外泌体的加入引起了HAEC细胞内KDR的表达上调,即外泌体的加入促进了VEGFR2的表达。 [0150] (4)蛋白磷酸化实验 [0151] 具体试验方法为: [0152] 将实施例1提取制备的Caov‑3细胞源外泌体和实施例2提取制备的OV‑90细胞源外泌体和IgG分别加入含有主动脉内皮细胞(HAEC)的培养液中,同时设置不添加任何外泌体的HAEC细胞培养液作为对照组,24h后弃去各组培养液,用PBS清洗细胞表面两次去除残留培养液。吸干培养瓶中PBS后,加入80μL细胞裂解液(裂解液:蛋白酶抑制剂=100:1,磷酸酶抑制剂=1:50),用刮刀将细胞刮下收集在1.5mlEP管中。冰上裂解30min后,12000r/min离心15min。收集上清液并用NanoDrop2000分光光度计测量浓度。 [0153] 根据浓度计算上样体积,并用5×loading buffer混匀,100℃金属浴10min,待样品冷却转移至‑80℃冰箱保存。按照不同浓度分离胶的配方制分离胶,用无水乙醇液封。待下层胶凝固后,倒扣弃掉无水乙醇,加入积层胶并快速插入梳子。待上层胶凝固后,转移至4℃冰箱保存或拔掉梳子进行下一步实验。在各孔道内加入处理好的蛋白样品及适合的marker,恒压80V电泳至样品进入分离胶改为恒压120V继续电泳,直至样品条带到达凝胶底部,终止电泳。 [0154] 按照“滤纸‑凝胶‑NC膜‑滤纸”的顺序组装转膜夹板,置于转膜液中。按照分子量转膜1min确定转膜时间,转膜结束后用脱脂牛奶封闭2h。孵育对应一抗4℃摇床过夜。第二天用PBST清洗NC膜3次,每次8min。避光孵育对应二抗1h,PBST清洗NC膜3次,每次8min。最后使用Odyssey进行荧光扫描。 [0155] 图14为蛋白磷酸化实验中各组细胞KDR下游蛋白Akt、Smad2/3和Src的磷酸化水平WB结果图;结果显示,加入外泌体后促进了KDR下游蛋白Smad2/3、Akt和Src的磷酸化水平升高,他们分别对应内皮细胞的存活,血管通透和迁移能力,其共同磷酸化上调的表达代表了内皮细胞血管生成能力的提高,即外泌体的加入通过上调KDR下游蛋白磷酸化水平增加血管生成能力。 [0156] 四、含有肿瘤源外泌体的心脏贴片促心梗后心肌再血管化功能的验证实验。 [0157] 构建大鼠MI(心肌梗死)模型的方法如下: [0158] 将2月龄左右雄性SD大鼠吸入麻醉后,以16号套管针进行气管插管,小动物呼吸机以氧气(流量1L/min)和空气混合气体及2%异氟醚进行正压通气,呼吸频率80次/min,潮气量3ml。大鼠取平卧位,消毒后,左侧第4肋间开胸,撕开心包,于左心耳下方约2mm处以6‑0Prolene线结扎左冠状动脉前降支,局部心肌的苍白紫绀提示结扎成功,心电图表现为S‑T段进行性抬高和/或T波高耸和/或QRS高大增宽。表明心肌梗死造模成功。 [0159] 将建模成功的大鼠分为三组: [0160] 1、损伤模型对照MI组; [0161] 2、使用实施例3制备的含有肿瘤源外泌体的心脏贴片进行治疗的Exo‑Patch组,具体治疗方法是:大鼠冠状动脉结扎后,梗死区(左室前壁)敷贴Exo‑Patch心脏贴片; [0162] 3、使用实施例3制备的不含肿瘤原外泌体的凝胶贴片进行治疗的Patch组,具体治疗方法是:大鼠冠状动脉结扎后,梗死区(左室前壁)敷贴Patch心脏贴片。 [0163] (1)体内免疫组化实验 [0164] 治疗28天后,取MI组和Exo‑Patch组大鼠的心肌组织,通过免疫组化试验观察大鼠心肌组织新生血管标志物CD31和α‑SMA的表达情况。 [0165] 将获得的大鼠心脏经OCT包埋后制作冰冻切片(5μm厚)。将获得的冰冻切片分别使用抗CD31及抗α‑SMA一抗对切片进行免疫组织化学染色,后与生物素标记的二抗孵育。于显微镜下对切片进行观察。 [0166] 图15为损伤模型对照MI组和Exo‑Patch心脏贴片治疗组大鼠心肌组织CD31和α‑SMA表达情况对比图;由图中对比可以看出,经过含有肿瘤源外泌体的心脏贴片治疗的大鼠心肌组织中CD31和α‑SMA表达增多,表明含有肿瘤源外泌体的心脏贴片具有良好的促血管生成作用。 [0167] (2)心脏功能检测 [0168] 治疗28天后,分别对健康大鼠、MI组大鼠、Exo‑Patch组大鼠和Patch组大鼠进行心脏超声检测,图16为心脏超声检测中各组大鼠的心脏超声检查结果对比图,图17从左至右依次为心脏超声检测中各组大鼠的左室射血分数LVEF、左室收缩末容量ESV和左室舒张末容量EDV的检测结果对比图;由图中对比可以看出,含有肿瘤源外泌体的心脏贴片对于大鼠心脏功能具有保护作用。 [0169] (3)MASSON染色 [0170] 治疗28天后,分别取健康大鼠、MI组大鼠、Exo‑Patch组大鼠和Patch组大鼠的心脏经OCT包埋后制作冰冻切片(5μm厚)并行Masson三色染色,光学显微镜下观察,通过Image J软件对图像进行分析,测量纤维化厚度与左室厚度的比值以及纤维化面积与左室横截面积的比值;并观察心肌细胞形态及排列。 [0171] 图18为各组大鼠的心脏MASSON染色结果对比图,由图中对比可以看出,MI组大鼠心肌细胞排列紊乱,扭曲肥大,细胞与细胞之间的间隙增加,胶原纤维的数量显著增多,并呈现紊乱的排列。Patch组大鼠心肌某些区域,坏死的肌纤维被蓝色的胶原纤维所取代。而Exo‑Patch组大鼠心肌细胞排列整齐,结构清晰,胶原纤维数量相对较少。由此证明含有肿瘤源外泌体的心脏贴片对于心脏的梗死面积具有减轻的作用。 |