| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410617835.5 | 申请日 | 2024-05-17 |
| 公开(公告)号 | CN118703445A | 公开(公告)日 | 2024-09-27 |
| 申请人 | 华中科技大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 张胜民; 杜莹莹; 姜尚彤; 刘须龙; | 第一发明人 | 张胜民 |
| 权利人 | 华中科技大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 华中科技大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：湖北省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：湖北省武汉市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：430074 |
| 主IPC国际分类 | C12N5/16 | 所有IPC国际分类 | C12N5/16 ; C12N5/0775 ; C12N5/077 ; A61L27/38 ; A61L27/54 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京众达德权知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 洪丽; |
| 摘要 | 本 申请 涉及分子 生物 学技术领域，尤其涉及一种生物 能量 活性外泌体的制备方法及其应用；所述制备方法包括：采用 琥珀酸 刺激细胞至预设细胞融合度，得到融合细胞；以及，于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体；琥珀酸的浓度为50μM～2000μM；刺激的时间≥24h；采用三 羧酸 循环中间体琥珀酸刺激细胞并制备得到具有高生物能量活性的外泌体，与常规的外泌体相比，该高生物能量活性的外泌体可以刺激细胞内ATP含量显著提升，同时可以促进细胞内源性ATP合成，提高合成代谢 水 平。 | ||
| 权利要求 | 1.一种生物能量活性外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括： |
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| 说明书全文 | 一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用技术领域[0001] 本申请涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用。 背景技术[0002] 生物能量是维持细胞合成代谢、增殖和分化的主要驱动力，组织再生依赖于丰富和持续的能量供应(1)；而在哺乳动物细胞中特别是在组织再生过程中，ATP是细胞内的重 要能量来源，其分子结构中高能磷酸键的断裂伴随着能量的释放，维持细胞内各类反应的 进行。目前的研究表明，细胞的生物能量状态与组织再生密切相关，然而在病理性微环境 中，细胞合成代谢降低，细胞内能量供应不足导致组织再生困难，尤其是像骨关节炎这类退行性疾病和软骨缺损类疾病等，由于软骨的合成代谢是人类细胞外空间中进行的最耗能的 过程之一，软骨细胞能量供给不足、代谢速度缓慢，很难迅速到达缺损部位发挥修复的功 能，再加上软骨细胞数量较少，深层区BMSCs难以迅速分化，导致软骨组织一旦损伤很难自我愈合；同时目前在促进软骨相关细胞(骨髓间充质干细胞、软骨细胞)内源性ATP生成并影响下游相关基因的表达方面，鲜少有研究及应用。 [0003] 外泌体是由细胞分泌的一类细胞外囊泡，其粒径约60nm～150nm，通常携带包括DNA、RNA、脂质、代谢物以及细胞溶质和细胞表面蛋白质等多种生物活性分子，外泌体形成了一种全新的细胞‑细胞间信息传递网络，可参与细胞通讯、细胞迁移等，尤其是间充质干细胞外泌体，已在组织修复与再生领域获得广泛研究。而普通干细胞外泌体活性无法弥补 受损细胞能量匮乏的窘状，而且促进细胞能量代谢并提高细胞ATP合成水平一般采用外源 性添加活性物质，但是外源性添加活性物质不可避免的会发生活性物质易失活、时效短、需反复多次添加等问题，只能短暂的维持细胞活力，无法应对组织缺损再生中的能量需求。目前尚未有研究及应用报道关于具有能量效应的外泌体促进细胞内源性ATP生成案例。 发明内容 [0004] 本申请提供了一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用，以解决现有技术中采用外源性添加活性物质促进细胞能量代谢并提高细胞ATP合成水平存在的活性物质易失 活、时效短、需反复多次添加的技术问题。 [0005] 第一方面，本申请提供了一种生物能量活性外泌体的制备方法，所述制备方法包括： [0006] 采用琥珀酸刺激细胞至预设细胞融合度，得到融合细胞；以及， [0007] 于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体； [0008] 其中，所述琥珀酸的浓度为50μM～2000μM； [0009] 所述刺激的时间≥24h。 [0010] 可选的，所述琥珀酸的浓度为200μM～1000μM。 [0011] 可选的，所述细胞包括干细胞和/或软骨细胞。 [0012] 可选的，所述干细胞包括骨髓间充质干细胞。 [0013] 可选的，所述细胞的初始细胞融合度≤50％。 [0014] 可选的，所述预设细胞融合度≥80％。 [0015] 可选的，所述于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体，包括步骤： [0016] 于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，得到培养后的融合细胞； [0017] 对培养后的所述融合细胞进行梯度离心和过滤，后对滤渣进行高速离心，得到含外泌体的粗粒；以及， [0018] 对所述含外泌体的粗粒进行洗涤，得到具有生物能量活性的外泌体。 [0019] 可选的，所述梯度离心的离心力为300×g～2500×g；和/或， [0020] 所述高速离心的离心力≥100000×g。 [0021] 可选的，所述梯度离心的时间为15min～30min；和/或， [0022] 所述高速离心的时间为1.5h～2.5h。 [0023] 第二方面，本申请提供了一种生物能量活性外泌体的应用，所述应用包括将第一方面所述的制备方法所得的外泌体作为组织再生的活性物质。 [0024] 本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点： [0025] 本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法，由于三羧酸(TCA)循环是哺乳动物中最有效率的能量产生机制，因此通过三羧酸循环中间体的琥珀酸刺激细 胞，可以激活细胞内琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α‑酮戊二酸脱氢酶等TCA循环关键酶的表达，以此可以加速TCA循环效率，从而使得细胞内源性ATP水平上升，以此可以获得高能量状态的细胞，再对细胞进行纯化，可以得到具有生物能量活性的外泌体，由于外泌体是一种极易被细胞融合的细胞外囊泡，相比外源性添加活性物质，其不易失活，可以被细胞快速融合，且具有较长的作用时间的有点，因此无需反复添加。 附图说明 [0027] 为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而 言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0028] 图1为本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法流程示意图； [0029] 图2为本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法详细流程示意图； [0030] 图3为本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体的SEM图； [0031] 图4为本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体的电泳实验结果图； [0032] 图5为本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体的粒径分布结果图； [0033] 图6为本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体刺激BMSCs后的ATP含量结果图，其中，图6a为不同浓度琥珀酸所得的外泌体刺激BMSCs后的ATP含量统计结果图，图6b为不同浓度琥珀酸所得的外泌体刺激BMSCs后的ATP含量和琥珀酸浓度的标 准曲线示意图； [0034] 图7为本申请实施例2提供的制备方法中最佳浓度琥珀酸所得的外泌体分别刺激Chondrocytes和BMSCs后的ATP水平对比图； [0035] 图8为本申请实施例2提供的制备方法中最佳浓度琥珀酸所得的外泌体分别刺激Chondrocytes和BMSCs后的线粒体膜电位变化结果图； [0036] 图9为本申请实施例4提供的各个外泌体对Chondrocytes和BMSCs增殖影响的结果图。 具体实施方式[0037] 为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。 [0038] 除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。 [0039] 需要说明的是，目前促进细胞能量代谢并提高细胞ATP合成水平一般采用外源性添加活性物质，例如一种软骨保存液的配方，其配方中含有的腺苷(ATP的代谢产物)可以维持体外软骨的生物活性； [0040] 同时有相关研究表明，体外3D培养的牛软骨细胞中添加特定浓度(62.5μM～125μM)的ATP，促进了细胞外基质胶原和蛋白聚糖的合成。以上都属于外源性添加腺苷，为细胞能量合成提供原料，但是由于外源性ATP易分解、添加极不稳定。 [0041] 鉴于组织再生中生物能量的必要性，因此如何构建一种本身富含高浓度ATP的外泌体，且能够进一步激活细胞内源性ATP合成的外泌体，用来满足组织再生过程中能量需 求，是目前亟需解决的技术问题。 [0042] 图1示例性的示出了本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法流程示意图； [0043] 如图1所示，本申请实施例提供一种生物能量活性外泌体的制备方法，所述制备方法包括： [0044] S1.采用琥珀酸刺激细胞至预设细胞融合度，得到融合细胞；以及， [0045] S2.于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体； [0046] 其中，所述琥珀酸的浓度为50μM～2000μM； [0047] 所述刺激的时间≥24h。 [0048] 本申请实施例中，控制琥珀酸的具体浓度，以及刺激的具体时间，可以通过琥珀酸刺激的方式充分激活细胞内琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α‑酮戊二酸脱氢酶等TCA循环关键酶的表达，以此可以加速TCA循环效率，从而使得细胞内源性ATP水平上升，以此可以获得足够多高能量状态的细胞，方便后续对细胞的纯化，从而可以得到具有生物能量活性的外泌体。 [0049] 该琥珀酸的浓度可以是50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1000μM、1000μM、1100μM、1200μM、1300μM、1400μM、1500μM、1600μM、1700μM、1800μM、1900μM或2000μM。 [0050] 在一些可选的实施方式中，所述琥珀酸的浓度为200μM～1000μM。 [0051] 本申请实施例中，进一步控制琥珀酸的具体浓度，可以通过琥珀酸进一步充分激活细胞内琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α‑酮戊二酸脱氢酶等TCA循环关键酶的表达，以此进一步加速TCA循环效率，从而使得细胞内源性ATP水平上升，以此可以获得足够多的高 能量状态细胞，方便后续对细胞的纯化，从而可以得到具有生物能量活性的外泌体。 [0052] 该琥珀酸的浓度可以是200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、550μM、600μM、650μM、700μM、750μM、800μM、850μM、900μM、950μM或1000μM。 [0053] 在一些可选的实施方式中，所述细胞包括干细胞和/或软骨细胞。 [0054] 在一些可选的实施方式中，所述干细胞包括骨髓间充质干细胞。 [0055] 本申请实施例中，控制细胞的具体种类，再细化干细胞为骨髓间充质干细胞，由于骨髓间充质干细胞是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可分化为多种间质组织，因此采用骨髓间充质干细胞可以得到足够多的高能量状态细胞。 [0056] 在一些可选的实施方式中，所述细胞的初始细胞融合度≤50％。 [0057] 本申请实施例中，通过细化细胞的初始细胞融合度，由于初始细胞融合度在50％时，细胞处于对数期的最佳增殖速率状态，因此在该细胞融合度进行琥珀酸的刺激，从而可以分激活细胞内琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α‑酮戊二酸脱氢酶等TCA循环关键酶的表达，使得细胞内源性ATP水平上升，以此可以获得足够多的高能量状态细胞，方便后续对细胞的纯化，从而可以得到具有生物能量活性的外泌体。 [0058] 在一些可选的实施方式中，所述预设细胞融合度≥80％。 [0059] 本申请实施例中，控制预设细胞融合度的具体数值，可以明确刺激后的细胞所处的状态，从而可以方便后续培养得到大量的激活细胞，进而可以得到大量的具有生物能量 活性的外泌体。 [0060] 图2示例性的示出了本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法详细流程示意图； [0061] 如图2所示，在一些可选的实施方式中，所述于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体，包括步骤： [0062] S201.于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，得到培养后的融合细胞； [0063] S202.对培养后的所述融合细胞进行梯度离心和过滤，后对滤渣进行高速离心，得到含外泌体的粗粒；以及， [0064] S203.对所述含外泌体的粗粒进行洗涤，得到具有生物能量活性的外泌体。 [0065] 本申请实施例中，通过细化纯化的具体方式，利用梯度离心和过滤的方式可以初步纯化培养液，并去除培养液中残留的细胞和碎片，再通过高速离心方式实现细胞的破碎，可以得到含外泌体的粗粒，再通过洗涤的方式，可以对含外泌体的粗粒进行纯化，从而可以得到纯化的外泌体。 [0066] 需要说明的是，该培养可以采用无血清培养基。 [0068] 需要说明的是，该洗涤所用溶液可以是磷酸盐缓冲液。 [0069] 需要说明的是，该外泌体可以重悬于无菌磷酸盐缓冲液中或在‑80℃条件下直接保存。 [0070] 在一些可选的实施方式中，所述梯度离心的离心力为300×g～2500×g；和/或， [0071] 所述高速离心的离心力≥100000×g。 [0072] 本申请实施例中，控制梯度离心的具体离心力，可以有效的分离激活细胞个体和细胞碎片，方便后续过滤得到含外泌体的粗粒。 [0073] 该梯度离心的离心力可以是300×g、400×g、500×g、600×g、700×g、800×g、900×g、1000×g、1000×g、1100×g、1200×g、1300×g、1400×g、1500×g、1600×g、1700×g、 1800×g、1900×g、2000×g、2100×g、2200×g、2300×g、2400×g或2500×g。 [0074] 控制高速离心的具体离心力，可以使得激活细胞破碎，从而方便最终释放出具有生物能量活性的外泌体。 [0075] 在一些可选的实施方式中，所述梯度离心的时间为15min～30min；和/或， [0076] 所述高速离心的时间为1.5h～2.5h。 [0077] 本申请实施例中，控制梯度离心的具体时间，可以使得梯度离心更加充分，从而有效的分离激活细胞个体和细胞碎片，方便后续过滤得到含外泌体的粗粒。 [0078] 该梯度离心的时间可以是15min、20min、25min或30min。 [0079] 控制高速离心的具体时间，可以使得激活细胞的破碎更完全，从而可以足够多的外泌体。 [0080] 该高速离心的时间可以是1.5h、2h或2.5h。 [0081] 基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种生物能量活性外泌体的应用，所述应用包括将所述制备方法所得的外泌体作为组织再生的活性物质。 [0082] 该应用是基于上述制备方法来实现，该制备方法的具体步骤可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方 案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。 [0083] 需要说明的是，该活性物质可以是组织再生用生物活性剂，也可以是组织再生用小分子生物活性剂，还可以是组织再生用细胞激活剂。 [0084] 下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照行业标准测定。若没有相应的行业标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。 [0085] 实施例1 [0086] 如图2所示，一种生物能量活性外泌体的制备方法，包括： [0087] 将50μM～2000μM一系列浓度梯度琥珀酸刺激骨髓间充质干细胞(BMSCs)，并测试细胞中ATP水平和CCK‑8测试，判断最佳ATP产生含量的琥珀酸浓度： [0088] (1)复苏BMSCs细胞，当细胞细胞融合度达到50％时，使用不同浓度梯度的琥珀酸刺激细胞24h，其中，将250μM浓度的琥珀酸记为BAE‑0组、将500μM浓度的琥珀酸记为BAE‑1组、将1000μM浓度的琥珀酸记为BAE‑2组、将1500μM浓度的琥珀酸记为BAE‑3组、将2000μM浓度的琥珀酸记为BAE‑4组。 [0089] (2)当细胞达到80％的融合度，将其用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三遍，并且更换无血清培养基，再培养48h。 [0090] (3)收集培养基，梯度离心：于4℃下，采用300×g离心15min，再采用2500×g离心15min。 [0091] (4)取离心后上清液，使用0.22μm过滤器过滤上清液，以去除残留的细胞和碎片。 [0092] (5)在Optima L‑80XP超离心机(Beckman Coulter)的70Ti转子中，于4℃下，100000×g离心2h，得到含外泌体的粗粒。 [0093] (6)将含外泌体的粗粒用磷酸盐缓冲液洗，并重复离心3次； [0094] (7)将沉淀重悬于无菌PBS中进行进一步实验，或在‑80℃条件下保存，得到一种具有生物能量效应的外泌体(SUC‑EXO)。 [0095] 实施例2 [0096] 在实施例1所公开的制备方法基础上，进一步优选出具有最高生物能量活性的外泌体，具体包括以下步骤： [0097] (1)将不同浓度梯度琥珀酸刺激BMSCs后所得外泌体各取10μg/mL，加入20μL裂解液，裂解后置于4℃保存。 [0098] (2)ATP标准曲线绘制：将ATP标准浓度分别稀释为0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM这几个浓度。 [0099] (3)将裂解好的每组外泌体分别添加100μL的ATP检测工作液，同时标准系列浓度的ATP样本也添加同样体积的ATP检测工作液，分别在室温静置5min。 [0100] (4)使用多功能酶标仪进行化学发光检测，结果如图6所示。 [0101] 实施例3 [0102] 在实施例1所公开的制备方法基础上，进一步验证该外泌体能够促进细胞内源性ATP合成，具体包括以下步骤： [0103] (1)将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在黑色不透光的96孔板中进行铺板。设置分组为空白组、普通干细胞外泌体组、生物能量活性外泌体组。 [0104] (2)待BMSCs贴壁后，PBS洗涤后，更换含有20μg/mL的对应组别的外泌体培养基，分别培养6h、1d、3d；到时间后，取出培养板室温下平衡10min。 [0105] (3)每孔取100μL的CellTiter‑LumiTM Steady发光法检测试剂加入培养的细胞中，并于室温震荡2min，以促进细胞裂解。 [0107] (5)使用多功能酶标仪进行化学发光检测，每孔检测时间为1000ms，如图7所示，根据化学发光的读数可以直接反应细胞的活力和ATP水平。 [0108] 实施例4 [0109] 在实施例1所公开的制备方法基础上，进一步验证生物能量活性外泌体加速细胞增殖，具体步骤如下： [0110] (1)在96孔板中分别接软骨细胞(Chondrocytes)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)的细胞悬液，每孔100μL，大约含2000个细胞，各设置组别为空白组、普通干细胞外泌体组、生物能量活性外泌体组。 [0111] (2)待BMSCs贴壁后，PBS洗涤两遍，更换含有20μg/mL的对应组别的普通外泌体和生物能量活性外泌体培养基，BMSCs培养12h、1d、2d、3d，软骨细胞培养1d、3d。 [0112] (4)到时间后，每个孔加入10μL的CCK8溶液，并继续在培养箱中孵育1h。 [0113] (5)用酶标仪测定在450nm处的吸光值，结果如图9所示。 [0114] 相关实验及效果数据： [0115] 图3示例性的示出了本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体的SEM图； [0116] 图4示例性的示出了本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体的电泳实验结果图； [0117] 图5示例性的示出了本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体的粒径分布结果图； [0118] 图6示例性的示出了本申请实施例1提供的制备方法中不同浓度琥珀酸所得的外泌体刺激BMSCs后的ATP含量结果图； [0119] 图7示例性的示出了本申请实施例2提供的制备方法中最佳浓度琥珀酸所得的外泌体分别刺激Chondrocytes和BMSCs后的ATP水平对比图； [0120] 图8示例性的示出了本申请实施例2提供的制备方法中最佳浓度琥珀酸所得的外泌体分别刺激Chondrocytes和BMSCs后的线粒体膜电位变化结果图； [0121] 图9示例性的示出了本申请实施例4提供的各个外泌体对Chondrocytes和BMSCs增殖影响的结果图； [0122] 1.统计各个外泌体的表面形貌、生物鉴定及外泌体中的ATP含量。 [0123] 采用0μM的琥珀酸刺激细胞所得的外泌体作为空白对照，并分别收集实施例1所得的BAE‑1和BAE‑2的外泌体，进行扫描电镜检测，结果如图3所示， [0124] 根据扫描电镜检测的结果，统计各个外泌体的粒径分布，结果如图5所示，结果表明：高浓度琥珀酸(1000μM)刺激细胞得来的BAE‑2具有和空白对照相似的粒径大小,，分布在40nm～110nm，特定浓度的琥珀酸(500μM)刺激细胞得来的BAE‑1的粒径相对较大，粒径范围较广，大致为80nm～300nm。 [0125] 同时对这些外泌体进行电泳实验，结果如图4所示，结果表明：与空白对照相同，BAE‑1具有经典的外泌体表面标志物，其形态与对照组一致，即琥珀酸刺激不影响外泌体的表面形貌，但是增加了其内的ATP水平。 [0126] 同时根据实施例1所得的各个外泌体，采用实施例2所公开的方法进行检测，结果如图6a所示，不同浓度琥珀酸刺激细胞所得的ATP含量不同，其含量随浓度呈正态分布，其中0～500μM琥珀酸刺激细胞所得的外泌体中ATP水平最佳，大于1000μM的琥珀酸刺激细胞所得外泌体中的ATP含量随浓度的增加而减少。另外，根据图6b的ATP标准曲线所示，这说明外泌体中的ATP水平可以根据琥珀酸的浓度进行调节，可以根据需要定制具有不同ATP水平 的外泌体。 [0127] 2.统计各个外泌体融合后的受体细胞内ATP水平和线粒体膜电位变化，结果如图7和图8所示。 [0128] 基于实施例4所公开的组别，分别对软骨细胞和不同培养时间的骨髓间充质干细胞进行ATP水平的测量，具体测量方法根据实施例2的方法进行检测，结果如图7所示，同时检测其线粒体膜电位，具体的线粒体膜电位检测步骤为： [0129] (1)将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在6孔板中进行铺板，其中每孔约1*105个细胞。 [0130] 设置分组为空白组、普通干细胞外泌体组、生物能量活性外泌体组、阳性对照组。 [0131] (2)待BMSCs贴壁后，PBS洗涤两遍，更换含有20μg/mL的对应组别的普通外泌体和生物能量活性外泌体培养基，阳性对照组使用CCCP(10mM)按照1:1000的比例加入到细胞培 养液中，稀释至10μM，处理细胞20分钟。 [0132] (3)1d后，吸除培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。 [0133] (4)加入1mL的JC‑1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。 [0134] (5)37℃孵育结束后，吸除上清，用JC‑1染色缓冲液洗涤2次。 [0135] (6)加入2mL细胞培养液。 [0136] (7)激光共聚焦显微镜下观察。 [0137] 结果如图8所示，500μM琥珀酸刺激细胞后所得到的外泌体不仅本身具有较高的ATP水平，且能够显著提高受体细胞内ATP水平和线粒体膜电位，是一种具有生物能量活性 的外泌体。 [0138] 3.统计生物能量活性外泌体对细胞增殖的加速影响，结果如图9所示，这表明细胞数量与吸光值的大小呈正比。 [0139] 综上所述，本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法，采用三羧酸循环中间体琥珀酸刺激细胞并制备得到具有高生物能量活性的外泌体，与常规的外泌体 相比，该高生物能量活性的外泌体可以刺激细胞内ATP含量显著提升，同时可以促进细胞内源性ATP合成，提高合成代谢水平。 [0140] 同时该制备方法是一种新的有效的方法，能够调节细胞代谢来满足组织再生(例如软骨再生)过程中的能量需求，在利用生物能量进行组织再生方面取得了重大突破，拓展了生物材料促进组织再生的功能，对未来的临床应用具有重要意义。 [0141] 本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6 的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。 [0142] 在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a‑b(即a和b),a‑c,b‑c,或a‑b‑c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。 [0143] 以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。 |
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