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枸杞糖肽 纳米粒子及其制备方法及应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410745407.0	申请日	2024-06-11
公开(公告)号	CN118680887A	公开(公告)日	2024-09-24
申请人	湖北省产品质量监督检验研究院;	申请人类型	科研院所
发明人	徐阳粼; 赵寅; 倪悦琪; 刘佳; 皮向东; 鲁西亚; 于哲雄; 骆静; 杨奇志;	第一发明人	徐阳粼
权利人	湖北省产品质量监督检验研究院	权利人类型	科研院所
当前权利人	湖北省产品质量监督检验研究院	当前权利人类型	科研院所
省份	当前专利权人所在省份：湖北省	城市	当前专利权人所在城市：湖北省武汉市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：湖北省武汉市武昌区公平路6号	邮编	当前专利权人邮编：430000
主IPC国际分类	A61K9/19	所有IPC国际分类	A61K9/19 ; A61K38/14 ; A61P25/00 ; A61P27/02 ; A61P29/00 ; A61P39/06 ; A61L27/22 ; A61L27/54
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构		专利代理人
摘要	本申请涉及一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法及应用，在二氯甲烷中，用二羰基咪唑活化疏水性抗氧化分子得到活化‑疏水性抗氧化分子，再将活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽一起溶解于无水二甲亚砜中，并进行搅拌反应得到混合液；将混合液置于乙酸乙酯中反复沉淀，并纯化沉淀物，将纯化后的沉淀物真空干燥处理得到枸杞糖肽衍生物；将枸杞糖肽衍生物溶解于二甲基亚砜溶液中，然后在去离子水中透析处理，冻干干燥，得到的枸杞糖肽纳米粒子具有良好的稳定性、生物相容性和生物活性；通过调控疏水性抗氧化分子修饰的比例和种类调节枸杞糖肽纳米粒子的尺寸、形貌、功能和降解性等，在炎症性疾病、组织工程修复和药物递送等领域具有广泛的应用前景。
权利要求	1.一种枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：在二氯甲烷中，用二羰基咪唑活化疏水性抗氧化分子得到活化‑疏水性抗氧化分子，再将活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽一起溶解于无水二甲亚砜中，并进行搅拌反应得到混合液；步骤二：将混合液置于乙酸乙酯中反复沉淀，并纯化沉淀物，将纯化后的沉淀物真空干燥处理得到枸杞糖肽衍生物；步骤三：将枸杞糖肽衍生物溶解于二甲基亚砜溶液中，然后在去离子水中透析处理，再冻干干燥，得到枸杞糖肽纳米粒子。 2.根据权利要求1所述的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的质量比为(10～300)：(100～500)，不同的所述质量比用于调控最终枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，且所述活化‑疏水性抗氧化分子的反应量占比越少，最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸越大。 3.根据权利要求1所述的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的反应时间为6～48小时。 4.根据权利要求1所述的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述疏水性抗氧化分子为以下材料中的一种或者多种组合：4‑(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、鲁米诺、Tempol。 5.根据权利要求1所述的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，在步骤三中，所述二甲基亚砜溶液的浓度在1～10mg/mL之间。 6.根据权利要求5所述的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，在步骤三中，透析处理的时间在24～72小时之间，且透析处理所采用的透析袋的截留分子质量在3500‑ 14000Da之间。 7.根据权利要求6所述的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，在步骤三中，所述二甲基亚砜溶液的浓度为1mg/mL，透析处理的时间为48小时。 8.一种由1至7中任一项所述的制备方法制备得到的枸杞糖肽纳米粒子。 9.一种如权利要求8所述的枸杞糖肽纳米粒子在制备视觉保护、视神经修复、抗炎和抗氧化方面的药物和材料的应用。 10.一种如权利要求8所述的枸杞糖肽纳米粒子在制备抑制细胞铁死亡、调控Nrf2/HO‑ 1/NQO1通路、调控NF‑κB通路方面药物和材料的应用。
说明书全文	枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法及应用技术领域 [0001] 本申请涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法及应用。背景技术 [0002] 枸杞糖肽(LBP)是枸杞的主要活性成分，是一种安全且可食用的天然生物材料，具有抗氧化、免疫调节、神经保护和抗衰老等功能，尤其是枸杞口服可减轻大鼠高眼压引起的视网膜神经细胞(RGC)丢失。 [0003] 经检索，申请号：201811203049.1的中国专利公开了一种枸杞糖肽颗粒冲剂的制备方法，包括以下步骤：将枸杞干果粉碎处理后，得到的枸杞干果粉末；将所述枸杞干果粉末经超声微波辅助水提处理，得到枸杞糖肽初提液；将所述枸杞糖肽初提液经四级超滤和纳滤浓缩处理，得到枸杞糖肽提取液；将β‑环糊精配置成质量分数为30‑50％的，壁材溶液；将所述枸杞糖肽提取液和所述壁材溶液按照1：3～1：5的比例混合均匀，得到芯壁混合液；在所述壁芯混合液中加入单甘脂，搅拌均匀后，得到预混合液；将所述预混合液胶体磨均质处理得到固形物浓度为20％～40％的乳化液；将所述乳化液喷雾制粒处理，所述乳化液喷雾制粒处理的条件为：乳化液的吸入速度为250ml/h～350ml/h，雾化压力为0.1Mpa～ 0.3Mpa，进风口温度为150℃～170℃，喷雾制粒完成后，继续通热风使颗粒流化干燥；降温，待物料温度降至45℃以下时停机出料，得到糖肽颗粒半成品；半成品经整粒，得到所述枸杞糖肽颗粒冲剂。 [0004] 针对上述中的相关技术，发明人认为存在以下有待改进的技术缺陷： [0005] 常见枸杞糖肽颗粒的制备工艺复杂，喷雾制粒处理的反应条件苛刻，不易于合成，产率较低，而且需要特殊复杂仪器等，不适于推广使用。发明内容 [0006] 本申请提供一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法，以改善以下技术问题： [0007] 常见枸杞糖肽颗粒的制备工艺复杂，喷雾制粒处理的反应条件苛刻，不易于合成，产率较低，而且需要特殊复杂仪器等，不适于推广使用。 [0008] 第一方面，本申请提供一种枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，采用如下的技术方案： [0009] 一种枸杞糖肽纳米粒子的制备方法，包括以下步骤： [0010] 步骤一：在二氯甲烷中，用二羰基咪唑活化疏水性抗氧化分子得到活化‑疏水性抗氧化分子，再将活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽一起溶解于无水二甲亚砜中，并进行搅拌反应得到混合液； [0011] 步骤二：将混合液置于乙酸乙酯中反复沉淀，并纯化沉淀物，将纯化后的沉淀物真空干燥处理得到枸杞糖肽衍生物； [0012] 步骤三：将枸杞糖肽衍生物溶解于二甲基亚砜溶液中，然后在去离子水中透析处理，再冻干干燥，得到枸杞糖肽纳米粒子。 [0013] 在本申请的一种可实现的技术方案中，在步骤一中，所述活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的质量比为(10～300)：(100～500)，不同的所述质量比用于调控最终枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，且所述活化‑疏水性抗氧化分子的反应量占比越少，最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸越大。 [0014] 在本申请的一种可实现的技术方案中，在步骤一中，所述活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的反应时间为6～48小时。 [0015] 在本申请的一种可实现的技术方案中，所述疏水性抗氧化分子为以下材料中的一种或者多种组合：4‑(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、鲁米诺、Tempol。 [0016] 在本申请的一种可实现的技术方案中，在步骤三中，所述二甲基亚砜溶液的浓度在1～10mg/mL之间。 [0017] 在本申请的一种可实现的技术方案中，在步骤三中，透析处理的时间在24～72小时之间，且透析处理所采用的透析袋的截留分子质量在3500‑14000Da之间。 [0018] 在本申请的一种可实现的技术方案中，在步骤三中，所述二甲基亚砜溶液的浓度为1mg/mL，透析处理的时间为48小时。 [0019] 第二方面，本申请提供一种枸杞糖肽纳米粒子，采用如下的技术方案： [0020] 一种枸杞糖肽纳米粒子，由上述的制备方法制备得到。 [0021] 第三方面，本申请提供一种如上述的枸杞糖肽纳米粒子在制备视觉保护、视神经修复、抗炎和抗氧化方面的药物和材料的应用。 [0022] 第四方面，本申请提供一种如上述的枸杞糖肽纳米粒子在制备抑制细胞铁死亡、调控Nrf2/HO‑1/NQO1通路、调控NF‑κB通路方面药物和材料的应用。 [0023] 综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果： [0024] 整个制备工艺简单、反应条件温和、易于合成、产率高、不需要特殊复杂仪器等，适于推广使用，尤其是在炎症性疾病、组织工程修复和药物递送等领域具有广泛的应用前景； [0025] 制成的枸杞糖肽纳米粒子具有良好的稳定性、生物相容性和生物活性，还可以通过调控活化‑疏水性抗氧化分子和枸杞糖肽的反应量比例，来调节最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，甚至是枸杞糖肽纳米粒子的形貌、功能和降解性等。附图说明 [0026] 为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0027] 图1是本申请实施例的枸杞糖肽纳米粒子的制备方法的工艺流程图。 [0028] 图2是本申请实施例中枸杞糖肽衍生物的核磁氢谱图。 [0029] 图3是本申请实施例中枸杞糖肽衍生物的傅里叶变换红外光谱图； [0030] 图4是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子的透射电镜图。 [0031] 图5是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子的水合粒径分布图。 [0032] 图6是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子的的电势图。 [0033] 图7是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子的的细胞毒性图。 [0034] 图8是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子清除细胞内总活性氧的荧光图。 [0035] 图9是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子清除视网膜超氧阴离子的荧光图。 [0036] 图10是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子调控神经细胞NRF2/HO‑1/NQO‑1蛋白表达的免疫印记图。 [0037] 图11是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子调控小胶质细胞NF‑κB通路的免疫印记图。 [0038] 图12是本申请实施例中枸杞糖肽纳米粒子改善视网膜缺血再灌注小鼠中轴突肿胀的荧光图。具体实施方式 [0039] 为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。 [0040] 以下结合附图1‑12对本申请作进一步详细说明。 [0041] 本申请实施例公开一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法。参照图1，枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法包括以下步骤： [0042] 步骤一S1：在二氯甲烷中，用二羰基咪唑活化疏水性抗氧化分子得到活化‑疏水性抗氧化分子，再将活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽一起溶解于无水二甲亚砜中，并进行搅拌反应得到混合液，其中活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的质量比为(10～300)：(100～500)，不同的质量比用于调控最终枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，且活化‑疏水性抗氧化分子的反应量占比越少，最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸越大，活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的反应时间为6～48小时，其中疏水性抗氧化分子具体为4‑(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯； [0043] 步骤二S2：将混合液置于乙酸乙酯中反复沉淀，并纯化沉淀物，将纯化后的沉淀物真空干燥处理得到枸杞糖肽衍生物； [0044] 步骤三S3：将枸杞糖肽衍生物溶解于二甲基亚砜溶液中，然后在去离子水中透析处理，再冻干干燥，得到枸杞糖肽纳米粒子，其中二甲基亚砜溶液的浓度在1～10mg/mL之间，透析处理的时间在24～72小时之间，且透析处理所采用的透析袋的截留分子质量在3500‑14000Da之间。 [0045] 本申请实施例的枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法的有益技术效果大致如下： [0046] 整个制备工艺简单、反应条件温和、易于合成、产率高、不需要特殊复杂仪器等，适于推广使用，尤其是在炎症性疾病、组织工程修复和药物递送等领域具有广泛的应用前景； [0047] 制成的枸杞糖肽纳米粒子具有良好的稳定性、生物相容性和生物活性，还可以通过调控活化‑疏水性抗氧化分子和枸杞糖肽的反应量比例，来调节最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，甚至是枸杞糖肽纳米粒子的形貌、功能和降解性等。 [0048] 实施例一 [0049] 本申请实施例一公开一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法。枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法包括以下步骤： [0050] 步骤一：在二氯甲烷中，用二羰基咪唑活化疏水性抗氧化分子得到活化‑疏水性抗氧化分子，再将活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽一起溶解于无水二甲亚砜中，并进行室温搅拌24小时得到混合液，其中活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的质量比为80：200，其中活化‑疏水性抗氧化分子用量为80mg，枸杞糖肽的用量为200mg，无水二甲亚砜的用量为15mL； [0051] 不同的质量比用于调控最终枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，且活化‑疏水性抗氧化分子的反应量占比越少，最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸越大，活化‑疏水性抗氧化分子与枸杞糖肽的反应时间为24小时，其中疏水性抗氧化分子具体为4‑(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯(在其他实施例中还可以为鲁米诺或者Tempol)； [0052] 步骤二：将混合液置于乙酸乙酯中反复沉淀，并纯化沉淀物，将纯化后的沉淀物真空干燥处理得到枸杞糖肽衍生物； [0053] 步骤三：将枸杞糖肽衍生物溶解于二甲基亚砜溶液中，然后在去离子水中透析处理，再冻干干燥，得到枸杞糖肽纳米粒子，其中二甲基亚砜溶液的浓度为1mg/mL，透析处理的时间为48小时，且透析处理所采用的透析袋的截留分子质量在3500‑5000Da之间。 [0054] 通过核磁氢谱和傅里叶变换红外光谱表征，与枸杞糖肽(LBP)对比，核磁和红外光谱上出现了4‑(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯的特征峰，证明修饰成功(如附图2和图3)，其中枸杞糖肽纳米粒子(PLBP NPs，水合粒径294nm，如附图5)。 [0055] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽衍生物PLBP的透射电镜实验：分别取20～100微克枸杞糖肽衍生物PLBP分散在1毫升去离子水中，吸取10μL样品滴于铜网上，将铜网置于干燥箱中过夜干燥，制备透射电子显微镜(TEM)样品，由透射电子显微镜观察到的结果如附图4所示，枸杞糖肽衍生物PLBP NPs呈球形。 [0056] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs的水合粒径测定：取合成好的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs，用去离子水分散(0.1mg/mL)，取其中1mL用于测水合粒径，涡旋充分分散1min，每组样品平行测定三次，并监测整个过程的变化。其中枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs的水合粒径分布图如附图4所示，制备枸杞糖肽衍生物纳米粒子PLBP NPs分散良好，平均水合粒径为294nm，电势为‑19.2mV(如附图6)。 [0057] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs细胞毒性：采取CCK8法评3 价PLBP NPs对SH‑SY5Y、HMC3和ARPE‑19三种细胞的毒性。首先在96孔中每孔加入8×10 个细胞，培养24h使其贴壁生长，将枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs用培养基稀释，终浓度为0、10、 50、100、250、500μg/mL，每孔加200μl枸杞糖肽纳米粒子溶液共培养48h，弃去上层培养基，每孔加入100μl新鲜无血清培养基，之后每孔加10μl CCK8检测液，避光培养2h，用酶标仪测量450nm处吸光度值。如附图7所示，三种不同类型细胞与PLBP NPs共孵育24h之后，细胞活力均在95％以上，表明PLBP NPs的细胞毒性低，具有良好的细胞相容性。 [0058] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs清除细胞内活性氧测定：采用DCF法测定细胞内活性氧(ROS)，2,7‑二氯荧光素二乙酸酯(DCFH‑DA)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。因此检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 [0059] 首先在12孔板接种SH‑SY5Y细胞，接种细胞数为每孔10万个。分为PBS对照组、OGD/R组、OGD/R+LBP组及OGD/R+PLBP组，PLBP NPs浓度为100μg/mL。细胞接种24小时后按照以上分组进行处理，24小时后用无菌PBS液洗两遍，并换上终浓度10μM DCFH‑DA培养箱孵育30min，染色后用荧光显微镜观察，结果如附图8所示，枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs可以有效清除细胞内活性氧。 [0060] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs清除视网膜内超氧阴离子测定： [0061] 采用二氢乙锭(DHE)作为超氧化物阴离子荧光探针，检测视网膜细胞内的超氧化物水平，评价PLBP NPs清除细胞内活性氧的能力。DHE进入细胞后与超氧化物阴离子反应，生成2‑hydroxyethidium，然后插入至核算中产生红色荧光。 [0062] 小鼠眼球新鲜取材，立即使用OCT包埋剂对眼球进行包裹并在液氮中速冻，随后进行10μm厚度的冰冻切片。使用无血清培养液稀释DHE获得终浓度为10μmol/L的工作液。将DHE工作液应用于冷冻切片上，37℃孵育30分钟进行染色。封片后用倒置荧光显微镜拍摄图像。结果如图9所示，枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs可以有效清除视网膜组织中的超氧阴离子，证明其在体内也具有良好的抗氧化作用。 [0063] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs调控神经细胞NRF2/HO‑1/NQO‑1表达的测定： [0064] 采用免疫印迹方法测定NRF2通路蛋白质含量。该方法通过利用PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)对蛋白质样品进行分离，随后通过电转移的方式将这些蛋白质转移到固相膜上。固相膜上的蛋白质充当抗原，与相应的抗体发生免疫反应，接着与酶标记的二抗发生反应。最终，通过底物显色或荧光成像等手段，检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。 [0065] 首先在6孔板接种SH‑SY5Y细胞，接种细胞数为每孔25万个。分为PBS对照组、OGD/R组、OGD/R+LBP组及OGD/R+PLBP组，PLBP NPs浓度为100μg/mL。细胞接种24小时后按照以上分组进行处理。24小时后弃去细胞培养基，预冷PBS液漂洗3遍后，每孔加入100μL RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂混合物，冰上静置5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集到1.5mL EP管中，使用高速离心机在4℃下以12000rpm的转速离心15分钟。离心后收集上清液，等比例加入5×蛋白上样缓冲液，在95℃下煮沸5分钟，分装后‑20℃保存。 [0066] 在进行免疫印迹实验时，首先制备合适浓度的凝胶，将蛋白样品按顺序加入到凝胶泳道内，使用电泳仪对蛋白质样品进行电泳分离，然后通过转膜仪将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。接着，使用5％脱脂牛奶对膜进行封闭，以防止非特异性结合。之后，在4℃下将膜分别与5％BSA稀释的NRF2、HO‑1、NQO1与内参蛋白β‑actin孵育过夜以特异性识别目标蛋白，次日洗涤去除未结合的一抗，再与标记辣根过氧化物酶的二抗孵育。洗涤去除未结合的二抗后，使用适当的底物触发二抗上的酶产生信号，最后通过成像系统记录信号。结果如图10所示，PLBP NPs显著升高了NRF2、HO‑1和NQO1的蛋白水平，说明其可以激活NRF2/HO‑1/NQO1通路，增强细胞的抗氧化能力。 [0067] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs调控小胶质细胞NF‑κB通路的测定： [0068] 采用免疫印迹方法测定NF‑κB通路蛋白含量与磷酸化水平。该方法通过利用PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)对蛋白质样品进行分离，随后通过电转移的方式将这些蛋白质转移到固相膜上。固相膜上的蛋白质充当抗原，与相应的抗体发生免疫反应，接着与酶标记的二抗发生反应。最终，通过底物显色或荧光成像等手段，检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。 [0069] 首先在6孔板接种HMC3细胞，接种细胞数为每孔25万个。分为PBS对照组、LPS组、LPS+LBP组及LPS+PLBP组，LPS浓度为1μg/mL，PLBP NPs浓度为100μg/mL。细胞接种24小时后按照以上分组进行处理。24小时后弃去细胞培养基，预冷PBS液漂洗3遍后，每孔加入100μL RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂混合物，冰上静置5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集到1.5mL EP管中，使用高速离心机在4℃下以12000rpm的转速离心15分钟。离心后收集上清液，等比例加入5×蛋白上样缓冲液，在95℃下煮沸5分钟，分装后‑20℃保存。 [0070] 在进行免疫印迹实验时，首先制备合适浓度的凝胶，将蛋白样品按顺序加入到凝胶泳道内，使用电泳仪对蛋白质样品进行电泳分离，然后通过转膜仪将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。接着，使用5％BSA对膜进行封闭，以防止非特异性结合以及脱脂奶粉中的磷酸酶干扰。之后，在4℃下将膜与5％BSA稀释的磷酸化‑IκB‑α、IκB‑α、磷酸化‑NF‑κB‑p65、NF‑κB‑p65与内参蛋白β‑actin孵育过夜以特异性识别目标蛋白，次日洗涤去除未结合的一抗，再与标记辣根过氧化物酶的二抗孵育。洗涤去除未结合的二抗后，使用适当的底物触发二抗上的酶产生信号，最后通过成像系统记录信号。结果如图11所示，枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs显著抑制了IκB和NF‑κB‑p65蛋白的磷酸化，说明其可以有效抑制NF‑κB信号通路的激活，从而抑制炎症。 [0071] 关于实施例一中制备得到的枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs改善视网膜缺血再灌注小鼠中轴突肿胀的测定： [0072] 采用免疫荧光方法检测小鼠视网膜神经节细胞的轴突肿胀。视网膜神经节细胞的轴突于视网膜后部汇成视神经盘后穿过巩膜，构成视神经。使用微管蛋白TUJ1标记视神经纤维。正常情况下，视神经的神经纤维光滑且平直，轴突功能受损时，神经纤维会肿胀、卷曲，TUJ1会在肿胀部位堆积，卷曲为球状。 [0073] 首先使用微量注射器对小鼠玻璃体腔内分别注射2μL PBS、LBP或PLBP，24小时后进行视网膜缺血再灌注模型，即麻醉小鼠并进行扩瞳后，将连接生理盐水的30G针头插入小鼠前房中并固定针头，维持1米高的灌注压以模拟视网膜缺血；1小时后取出针头，以模拟再灌注情况。造模7天后，对小鼠进行断颈处死并完整取出视神经，使用4％多聚甲醛固定24小时，随后30％蔗糖溶液脱水过夜，次日使用OCT包埋剂包裹视神经，进行冰冻切片。 [0074] 在进行组织冰冻切片的免疫荧光染色时，首先用PBS清洗切片以去除OCT包埋剂，然后在驴血清中封闭1小时以减少非特异性结合。接着在4℃下将组织与5％BSA稀释的TUJ1孵育过夜，随后在室温下与标记Alexa Fluor 488的二抗孵育2小时。孵育完成后使用抗荧光淬灭封片剂进行封片，最后使用倒置荧光显微镜对组织进行成像，以观察目标蛋白的荧光信号。结果如图12所示，视网膜缺血再灌注小鼠的神经纤维显著发生肿胀和卷曲，枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs明显改善了缺血再灌注引起的神经纤维肿胀和卷曲，说明其可以有效的在体内保护视神经。 [0075] 实施例二 [0076] 本申请实施例二公开一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法，与实施例一的区别之处在于：枸杞糖肽200mg的用量不变，活化‑疏水性抗氧化分子的用量减小至70mg。 [0077] 实施例三 [0078] 本申请实施例三公开一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法，与实施例一的区别之处在于：枸杞糖肽200mg的用量不变，活化‑疏水性抗氧化分子的用量减小至60mg。 [0079] 实施例四 [0080] 本申请实施例四公开一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法，与实施例一的区别之处在于：枸杞糖肽200mg的用量不变，活化‑疏水性抗氧化分子的用量减小至50mg。 [0081] 实施例五 [0082] 本申请实施例五公开一种枸杞糖肽纳米粒子及其制备方法，与实施例一的区别之处在于：枸杞糖肽200mg的用量不变，活化‑疏水性抗氧化分子的用量减小至40mg。 [0083] 参照上述的“枸杞糖肽纳米粒子PLBP NPs的水合粒径测定”实验，分别对实施例一至实施例五中得到的枸杞糖肽纳米粒子，分别进行水合粒径测定处理，最终得出结论：枸杞糖肽纳米粒子的水合粒径，由294nm逐步增加到390nm。 [0084] 由此可以得到的推论如下：不同的质量比用于调控最终枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸，且活化‑疏水性抗氧化分子的反应量占比越少，最终得到枸杞糖肽纳米粒子的粒径尺寸越大。当使用其他疏水性分子(如鲁米诺、Tempol等)替代4‑(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯，修饰枸杞糖肽得到的两亲性衍生物，也可以在水溶液中自组装获得纳米粒子。 [0085] 以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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