一种含核酸适配体的HA/βTCP支架材料的制备方法及其应用专利检索-··生物活性物质例如治疗物质专利检索查询-专利查询网

一种含核酸适配体的HA/βTCP 支架材料的制备方法及其应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410686366.2	申请日	2024-05-30
公开(公告)号	CN118662692A	公开(公告)日	2024-09-20
申请人	中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院;	申请人类型	企业
发明人	侯天勇; 杨钱冬; 周江玲; 于博; 蔡娟; 唐贞珍; 艾秋池;	第一发明人	侯天勇
权利人	中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院	权利人类型	企业
当前权利人	中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：重庆市	城市	当前专利权人所在城市：重庆市沙坪坝区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号	邮编	当前专利权人邮编：400038
主IPC国际分类	A61L27/12	所有IPC国际分类	A61L27/12 ; A61L27/54
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	9	专利文献类型	A
专利代理机构	重庆志合专利事务所	专利代理人	胡荣珲;
摘要	本发明涉及一种含核酸适配体的HA/βTCP 支架材料的制备方法，以及用本发明所述方法制备的含核酸适配体的HA/βTCP支架材料在促进骨修复中的应用。根据本发明所述方法，核酸适配体稳定的连接在羟基磷灰石 /β 磷酸三钙上，并且能于材料表面特异性捕获MSC和EPC，实现选择性的富集，可应用于临床骨缺损修复过程，暨能在骨缺损原位捕获两种细胞，可以达到骨缺损修复的成骨成血管偶联作用，有效促进骨修复。
权利要求	1.一种含核酸适配体的HA/βTCP 支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)将无水乙醇、HA/βTCP、APTES、去离子水混合，震荡，洗涤沉淀，烘干，得到HA/βTCP‑APTES，所述无水乙醇：HA/βTCP：APTES：去离子水的摩尔比为1500‑2000：0.1‑0.15：10‑15： 25‑30； 2)将HA/βTCP‑APTES、PBS、Sulfo‑SMCC混合，震荡，洗涤沉淀，得到HA/βTCP‑APTES‑SMCC，所述HA/βTCP‑APTES：PBS：Sulfo‑SMCC的摩尔比为0.5‑1：0.5‑1：500‑800； 3)将HA/βTCP‑APTES‑SMCC与TBS、核酸适配体混合，震荡反应，得到HA/βTCP‑Apt，所述HA/βTCP‑APTES‑SMCC：TBS：核酸适配体的摩尔比为5000‑8000：8000‑10000：0.025‑0.03。 2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中震荡反应的时间为12h。 3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的洗涤沉淀包括先用去离子水清洗，再用甲醇清洗。 4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的洗涤沉淀为用PBS清洗。 5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的核酸适配体为单核酸或双核酸，所述核酸适配体为HM69和/或EPC1。 6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体为双核酸时，HM69： EPC1的摩尔比为1:1。 7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述HM69的序列为SEQ ID NO:2，所述EPC1的序列为SEQ ID NO:3。 8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)、步骤3)中震荡反应的时间为30min。 9.权利要求1所述方法制备的含核酸适配体的HA/βTCP支架材料在促进骨修复中的应用。
说明书全文	一种含核酸适配体的HA/βTCP 支架材料的制备方法及其应用技术领域 [0001] 本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种含核酸适配体的HA/βTCP支架材料的制备方法及其应用。背景技术 [0002] 现代社会中的四肢的骨创伤越来越高发，其中60％以上伴发骨缺损，而骨移植术是临床上治疗四肢骨缺损的重要技术手段，其核心是充足的、优良的植骨材料。优良的植骨材料需要具有骨诱导性、骨传导性和成骨活性。自体骨是骨移植材料的“金标准”，但是，其来源有限，切取自体骨是有创操作，伴发疼痛、感染等风险，严重限制了其在骨修复中的应用。因此，通过仿生自体骨结构和骨再生的原理制备异体或人工骨修复材料成为领域内的热点。骨髓富集材料作为一种仿生骨组织结构的、自体组织来源的高成骨活性材料，也被称为“自体人工骨”，越来越受到广泛的关注和应用。其具有应用简便、易保存和运输，可在基层广泛应用。 [0003] 通过构建软骨化中心和联用构建间充质干细胞(MSC)与内皮细胞(EC)的关系可以加快骨修复重建，但是这些策略都是应用在传统的骨组织工程技术领域，是以传统的种子细胞体外扩增、细胞接种打印和体外孵育为基础的。由于伦理的限制及组织工程技术需个性化的定制等原因限制，这种传统的技术向临床转化会有一个长期的过程，且成本高昂，技术复杂，短时间内根本无法满足临床需求。而细胞富集技术将有可能改变这一现状，核心是选择一种高效的骨髓中细胞的定向选择性富集技术(既往的富集技术利用了孔径效应及电荷效应，在一定程度上提升了富集的效率，但均为非选择性的富集)。发明内容 [0004] 本发明提供了一种含核酸适配体的HA/βTCP支架材料的制备方法及其应用。 [0005] 本发明的技术方案是： [0006] 1.一种含核酸适配体的HA/βTCP支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： [0007] 1)将无水乙醇、HA/βTCP、APTES、去离子水混合，震荡，洗涤沉淀，烘干，得到HA/βTCP‑APTES，所述无水乙醇：HA/βTCP：APTES：去离子水的摩尔比为1500‑2000：0.1‑0.15：10‑15：25‑30； [0008] 2)将HA/βTCP‑APTES、PBS、Sulfo‑SMCC混合，震荡，洗涤沉淀，得到HA/βTCP‑APTES‑SMCC，所述HA/βTCP‑APTES：PBS：Sulfo‑SMCC的摩尔比为0.5‑1：0.5‑1：500‑800； [0009] 3)将HA/βTCP‑APTES‑SMCC与TBS、核酸适配体混合，震荡反应，得到HA/βTCP‑Apt，所述HA/βTCP‑APTES‑SMCC：TBS：核酸适配体的摩尔比为5000‑8000：8000‑10000：0.025‑0.03。 [0010] 进一步地，所述步骤1)中震荡反应的时间为12h。 [0011] 进一步地，所述步骤1)中的洗涤沉淀包括先用去离子水清洗，再用甲醇清洗。 [0012] 进一步地，所述步骤1)中的洗涤沉淀为用PBS清洗。 [0013] 进一步地，所述步骤3)中的核酸适配体为单核酸或双核酸，所述核酸适配体为HM69和/或EPC1。 [0014] 更进一步地，所述核酸适配体为双核酸时，HM69：EPC1的摩尔比为1:1。 [0015] 更进一步地，所述HM69的序列为SEQ ID NO:2，所述EPC1的序列为SEQ ID NO:3。 [0016] 进一步地，所述步骤2)、步骤3)中震荡反应的时间为30min。 [0017] 所述方法制备的含核酸适配体的HA/βTCP支架材料在促进骨修复中的应用。 [0018] 根据本发明所述方法，核酸适配体稳定的连接在羟基磷灰石/β磷酸三钙上，并且能于材料表面特异性捕获MSC和EPC，实现选择性的富集，可应用于临床骨缺损修复过程，暨能在骨缺损原位捕获两种细胞，可以达到骨缺损修复的成骨成血管偶联作用，有效促进骨修复，所用的HA/β‑TCP为人工合成的骨修复材料，同样具有一定的骨修复能力。 [0019] 本发明所述方法中，核酸适配体与支架材料的连接方式为： [0020] 先用硅烷偶联剂APTES与支架中羟基磷灰石(HA)表面的羟基反应，让HA表面产生大量氨基(–NH2)，再与sulfo‑SMCC的羧基反应，在HA表面引入顺丁二烯的双键，再用3'端巯基化改性的核酸适配体与表面带双键的HA结合在一起，完成连接。 [0021] 本发明实现了同时将两种核酸适配体稳固的连接于HA/βTCP支架材料上，并通过实验，在体外及体内验证了对MSC和EPC细胞的特异性捕获，并且于体内模型中，证实了两种细胞可以协同发挥作用，进一步促进成骨的效果。 [0022] 核酸适配体(Aptamer)是一段脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)序列，核酸类似物(XNA)或肽，是利用体外指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中筛选得到的寡核苷酸片段，这个片段能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。虽然，传统的抗原‑抗体反应灵敏度和特异性均较好，也有较广泛的应用，但是，蛋白质作为连接成份，易受酸碱度(pH)、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵；而核酸适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经SELEX筛选后，可以拥有与抗原‑抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易、成本更低、稳定性更好。 [0023] 核酸适配体可以与蛋白质进行作用包括分子内或分子之间的相互作用力，包括共价键，氢键，范德华力，疏水作用和静电引力。从作用力来看，共价键最稳定，达到330‑380KJ/mol，其次是静电引力，达到42‑84KJ/mol，然后是氢键，8‑40KJ/mol，然后是疏水作用，4‑12KJ/mol，最弱的是范德华力1‑9KJ/mol。分子之间的相互作用力为：DNA与DNA，主要是氢键；DNA与蛋白，主要是静电引力，氢键，范德华力；蛋白与蛋白，主要是疏水作用力，静电引力，范德华力，氢键。可见，核酸适配体的DNA链和蛋白质的相互作用力种类和大小都是比较强的。 [0024] 基于上述原理，核酸适配体经过筛选后已经被用于同细胞表面特异蛋白质结合，进而达到对细胞进行选择性的捕获，包括可用于提高骨组织愈合的间充质干细胞MSC和促进血管再生的血管祖细胞EPC(可转化为EC)，MSC与EPC两种细胞联合促成骨成血管的作用，优于单个细胞作用的成骨成血管作用。附图说明 [0025] 图1为筛选核酸适配体过程中，对于核酸适配体的特异性结合力及亲和力的检测；其中，核酸适配体HM69和EPC1具有相对较高的亲和力(bar＝50um)。 [0026] 图2为核酸适配体与HA/βTCP支架材料连接的化学合成示意图，合成后的电镜表面形貌学分析及合成后的红外光谱检测，以及核酸适配体释放试验。 [0027] 图3为双核酸适配体支架材料的体外静态、动态捕获模拟实验；其中，MSC(购自Enova公司)为蓝色荧光标记，EPC(购自Enova公司)为红色荧光标记，动态捕获30min为峰值(bar＝100um)。 [0028] 图4为MSC细胞在空白及2组材料培养14天后的茜素红‑S染色情况(×40)以及使用碱性磷酸酶试剂盒检测的碱性磷酸酶定量结果；空白组细胞密度较小，仅有少量钙结节形成；HA/βTCP组细胞密度较大，可见数个钙结节形成；双核酸适配体组(TRSAWmx)可见大量橘红色钙结节着色(P<0.05)；(bar＝200um)。 [0029] 图5为mEPC细胞在空白及2组材料体外6h的基质胶成血管定性及定量结果；其中，空白组与HA/βTCP组无明显差异，含核酸适配体支架材料组成管能力更强(P<0.05)；(bar＝100um)。 [0030] 图6为双核酸适配体支架材料的体外CCK8细胞增殖实验；其中，支架材料对于细胞无细胞毒性。 [0031] 图7为4组材料(分组为单独的HA/βTCP、含EPC1的HA/βTCP、含HM69的HA/βTCP以及含双核酸适配体HA/βTCP)植入小鼠股骨半缺模型后4周取材的MicroCT、HE、Masson染色结果；其中，双核酸适配体组成骨效果更佳，进一步验证了成骨成血管的耦联作用(P<0.05)；(bar＝100um)。具体实施方式 [0032] 实施例1核酸适配体的设计及合成 [0033] Apt19S：AGGTCAGATGAGGAGGGGGACTTAGGACTGGGTTTATGACCTATGCGTG(SEQ ID NO:1)； [0034] HM69：TGCGTGTGTAGTGTGTCTGCATGCCCCTGTAATCGCCCATGGGTAGCCTCTT AGGGATTTGGGCGG(SEQ ID NO:2)； [0035] EPC1：CTTTAATGCGGGGTAATTTCTTTTCCATAATCGC(SEQ ID NO:3)； [0036] EPC2：UUCCUCUCUACUGUGAUAUUAAACAGAACGUAUACUAUUCUG(SEQ ID NO:4)； [0037] 上述核酸适配体基本序列及其相关巯基化修饰均由上海生工生物有限公司合成。 [0038] 实施例2核酸适配体与细胞结合率、亲和力检测 [0039] 核酸适配体末端分别标记红色荧光CY5(亲和MSC)和绿色荧光FAM(亲和EPC)。构建的核酸适配体分别进行结合率试验。结合率试验是将mMSC和mEPC分别制成单细胞悬液，通5 过Hoechst 33258(购自碧云天公司)染核，细胞和核酸适配体的数量比例为10：10nM，孵育 30分钟后，通过共聚焦显微镜观察细胞和核酸适配体的结合比例(绿色或红色荧光与蓝色共显影，提示二者结合)计算结合率； [0040] ImageJ定量分析荧光强度，计算相对亲和力，结果如图1所示，核酸适配体HM69和EPC1具有相对较高的亲和力。 [0041] 实施例3核酸适配体与支架材料的连接、体外捕获能力、体外成骨成血管能力验证[0042] 1.核酸适配体与支架材料的连接 [0043] 具体的合成方法为：100ml无水乙醇+100mgHA/βTCP(购自四川拜阿蒙公司)+2.5ml三乙氧基‑3‑氨基丙基硅烷(APTES，购自阿拉丁公司)+0.5ml去离子水(购自阿拉丁公司)，震荡反应12h，倒掉液体；去离子水洗2遍，甲醇(购自阿拉丁公司)洗5遍，于烘箱烘干，得到HA/βTCP‑APTES；10mg HA/βTCP‑APTES+340ul PBS+60ul 4.8mg/ml的磺基‑SMCC钠盐(Sulfo‑SMCC，购自阿拉丁公司)，震荡反应30min倒掉液体，用PBS洗3次，得到HA/βTCP‑APTES‑SMCC；最后，10mg HA/βTCP‑APTES–SMCC+400ul三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS，购自索莱宝公司)+25pmol核酸适配体(Apt‑SH，末端带有巯基，可与上述反应中的化学基团相连接，两种核酸适配体混合方式为直接等比例混合后加入TBS溶液与材料反应)，震荡反应30min，即得到HA/βTCP‑Apt；化学合成过程不会对材料本身形貌产生破坏如图2所示，连接成功与否的红外光谱检测如图2所示。 [0044] 2.核酸适配体支架材料体外捕获能力验证 [0045] 静态捕获：分别制备对应细胞数量的细胞悬液1000ul，滴加于核酸适配体支架材料表面静置5分钟后，PBS冲洗3遍后拍摄激光共聚焦层扫，观察材料表面粘附细胞数量； [0046] 动态捕获：制备mMSC的细胞悬液1000ul，设置摇床150转/分，于24孔板中放置核酸适配体支架材料(模拟体内血液流动过程)，分别于不同时间点拍摄激光共聚焦层扫，观察材料表面粘附细胞数量。 [0047] 3.核酸适配体支架材料体外成骨能力和成管能力验证(细胞茜素红S染色+碱性磷酸酶定量+基质胶成血管实验) [0048] 茜素红S(购自索莱宝公司)染色：在空白、HA/βTCP、核酸适配体支架材料上接种4 1mL m细胞悬液(密度：5×10/mL)。而后培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中，每隔换液，成骨诱导培养基诱导(购自索莱宝公司)培养14d后，吸净孔内的培养基，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定20min后，PBS清洗3次，加入茜素红‑S染液室温下染色10min,PBS清洗残留染液，随机取视野拍照；通过14天诱导培养后茜素红‑S染色观察钙结节的生成情况，结果如图4所示，核酸适配体支架材料组成骨能力更强； [0049] 碱性磷酸酶定量：在空白、HA/βTCP、核酸适配体支架材料上接种1mL m细胞悬液4 (密度：5×10/mL)。而后培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中，每隔天换液，诱导培养14d后，吸净孔内的培养基，PBS清洗2次，Trizol裂解后加入碱性磷酸酶定量检测试剂盒测定液(购自碧云天公司)，绘制标准曲线后定量计算相对碱性磷酸酶含量，结果如图4所示，核酸适配体支架材料组成骨能力更强； [0050] 基质胶(购自Corning公司)成血管实验：在冰上，将基质凝胶基质加入24孔板(289μl/孔)中，将HA/βTCP或核酸适配体支架材料置于0.4‑微米Transwell(康宁)的上室中，然5 后在37℃下孵育1小时。将mEPC(300μl/孔中1。2×10个细胞接种到聚合物基质凝胶上(与材料充分接触)。在血管生成测试板上于37℃孵育6小时后，将Transwell装置移除，并在显微镜下观察管的形成，ImageJ测量累积管长度、连接和网孔的数量，结果如图5所示，核酸适配体支架材料组成管能力更强。 [0051] 实施例4核酸适配体支架材料的细胞毒性实验及体内成骨能力验证 [0052] 1.增殖活力测定 [0053] 在24孔板内，将5×104/ml的mMSC细胞悬液50ul分别种植于空白、HA/βTCP，核酸适配体支架材料组。每天换液，在培养的1、3、7天，吸去孔中培养基，按每10：1的比例混合成骨培养液(购自索莱宝公司)和CCK‑8试剂(购自MCE公司)，每孔加入100μL CCK‑8混合液，培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中孵育1h后，以酶标仪在450nm测OD(450)值。CCK‑8检测细胞增殖结果如图6所示，各组无显著差异。 [0054] 2.体内成骨能力验证 [0055] 小鼠股骨半缺模型造模：术前1d拟手术部位清洁和备皮处理，术前禁食8h，禁水2h。七氟烷气体(中心实验室统一发放)麻醉小鼠，75％乙醇(天信牌，四川华天科技实业有限公司)消毒术部皮肤；用眼科剪于股骨中段横向切开皮肤，长度约10mm左右，钝性分离皮下软组织和肌肉，暴露股骨中段，破坏打孔处骨膜，用执笔式牙科磨钻制备一直径为1mm左右圆形单侧皮质骨缺损孔，并在缺损处塞入对应分组材料，术毕逐层缝合切口，碘伏(中心实验室统一发放)消毒。 [0056] 术后4周取材，4％甲醇组织固定液(购自碧云天公司)固定1天后行MicroCT拍摄，行定性定量分析，结果如图7所示，双核酸适配体支架材料组成骨效果更好；拍摄完毕后使用脱钙液(购自索莱宝公司)脱钙1周后行石蜡切片及HE、Masson染色，结果如图7所示，核酸适配体支架材料组成骨效果更好。 [0057] 本发明通过将核酸适配体与HA/βTCP材料相连接，构建的新型人工骨修复材料，能够兼顾细胞黏附和促成骨相关性能，其创新性在于，能在骨缺损的原位捕获到可以促进成骨的MSC和促进成血管的EPC，并发生相互偶联的作用，进一步的促进骨缺损的修复。 [0058] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

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