| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410689897.7 | 申请日 | 2024-05-30 |
| 公开(公告)号 | CN118652923A | 公开(公告)日 | 2024-09-17 |
| 申请人 | 江苏创健医疗科技股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 翟源心; 储筠; 李解; 凡孝菊; 付生伟; 钱晨明; 李丹璐; 钱松; | 第一发明人 | 翟源心 |
| 权利人 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省常州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省常州市金坛区双龙路28号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：213000 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/81 | 所有IPC国际分类 | C12N15/81 ; C12N15/12 ; C12N1/19 ; C07K14/78 ; A61K8/65 ; A61Q19/00 ; A61L27/24 ; A61L27/54 ; C12R1/84 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 9 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京东方盛凡知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 张凯; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 酵母 表达三螺旋结构Ⅰ型重组人 胶原蛋白 的制备方法及其应用，涉及 生物 技术领域。该制备方法包括利用工程菌 发酵 纯化得到该三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的步骤；该工程菌的构建方法包括将pMChZ‑α1(Ⅰ)、pMCrN‑α2(Ⅰ)、pPIC9K‑P4H(DP)‑1和pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)质粒转化宿主菌，构建得到该工程菌的步骤。利用该制备方法制备得到的具有三螺旋结构的Ⅰ型重组人胶原蛋白含有羟脯 氨 酸，羟脯氨酸达到总脯氨酸的30％以上。从而可以使得Ⅰ型重组人胶原蛋白能够广泛用于 化妆品 、医学美容、医疗器械、生物医学材料等领域，具有很好的实用性和重要的市场应用价值。 | ||
| 权利要求 | 1.一种表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的工程菌的构建方法，其特征在于，包括将pMChZ‑α1(Ⅰ)质粒、pMCrN‑α2(Ⅰ)质粒、pPIC9K‑P4H(DP)‑1质粒和pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)‑质粒转化宿主菌，构建得到所述工程菌的步骤； |
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| 说明书全文 | 一种酵母表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的制备方法及其应用 技术领域背景技术[0002] 胶原蛋白是生物体内一种非常重要的蛋白质，由三条左旋α肽链互相缠绕形成右手三螺旋结构，其中Ⅰ型胶原蛋白是是人体中含量最丰富的具有三螺旋结构的胶原蛋白之一，在维护皮肤健康和骨组织结构完整等方面发挥了重要作用。人体中Ⅰ型胶原蛋白多是由两条α1链和一条α2链组成的异源三聚体，这种三螺旋结构赋予了胶原蛋白良好的生物力学性能和生物相容性，使得它在维持皮肤弹性、骨骼强度以及肌腱韧性等方面发挥着关键作用。 [0003] 重组人I型胶原蛋白作为天然人胶原的替代物，被广泛应用于抑制和缓解皮炎、改善敏感性肌肤、护养术后创面等方面，在功能性生物材料、化妆品和食品等领域发挥巨大作用。目前市面上的重组人I型胶原蛋白产品多为重组人源胶原蛋白或重组类胶原蛋白，可在微生物中以较低成本获得大量表达，但这种胶原蛋白没有三螺旋结构。单链胶原的力学性能也远不及三螺旋胶原，在需要较高力学强度的应用场景难以胜任。因此亟需开发一种三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的制备方法。 发明内容[0004] 本发明的目的是提供一种酵母表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的制备方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。利用该制备方法制备得到的Ⅰ型重组人胶原蛋白具有三螺旋结构，从而可以使得Ⅰ型重组人胶原蛋白获得良好的生物力学性能和生物相容性。 [0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案： [0006] 本发明提供一种表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的工程菌的构建方法，包括将pMChZ‑α1(Ⅰ)质粒、pMCrN‑α2(Ⅰ)质粒、pPIC9K‑P4H(DP)‑1质粒和pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)质粒转化入宿主菌，构建得到所述工程菌的步骤； [0007] 所述pMChZ‑α1(Ⅰ)质粒是将α1(Ⅰ)克隆到pMChZ‑AOX载体得到； [0008] 所述pMCrN‑α2(Ⅰ)质粒是将α2(Ⅰ)克隆到pMCrN‑AOX载体得到； [0009] 所述pPIC9K‑P4H(DP)‑1质粒是以核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的DNA分子替换P4H 9K DP质粒中的KanR得到； [0010] 所述pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)质粒是将[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)转录单元克隆到pMCeH‑AOX载体得到； [0011] 所述α1(Ⅰ)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； [0012] 所述α2(Ⅰ)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示； [0013] 所述[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)转录单元核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示； [0014] 所述pMChZ‑AOX载体是对pPIC9K质粒进行如下改造得到：以核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的DNA分子替代所述pPIC9K质粒的4648‑9221bp；将所述pPIC9K质粒中位于αMF上游的BamHⅠ删除；在所述pPIC9K质粒的1583‑1584bp间通过点突变引入BamHⅠ识别位点； [0015] 所述pMCrN‑AOX载体是以核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的DNA分子分别替代所述pMChZ‑AOX质粒上的PpHIS4和Zeocin筛选标记而构建得到； [0016] 所述pMCeH‑AOX载体是以核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的DNA分子分别替代所述pMChZ‑AOX质粒上的PpHIS4和PEM7‑BleoR‑CYC1 tt而构建得到。 [0017] 进一步地，所述构建方法具体包括以下步骤： [0018] 将所述pMChZ‑α1(Ⅰ)质粒转化入所述宿主菌，得到KM71H/pMChZ‑α1(Ⅰ)菌株； [0019] 将所述pMCrN‑α2(Ⅰ)质粒转化入所述KM71H/pMChZ‑α1(Ⅰ)菌株，得到KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)菌株； [0020] 将所述pPIC9K‑P4H(DP)‑1质粒转化入所述KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)菌株，得到KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)‑P4H菌株； [0021] 将所述pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)质粒转化入所述KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)‑P4H菌株，得到所述工程菌。 [0022] 进一步地，所述宿主菌为毕赤酵母X33或毕赤酵母KM71。 [0023] 进一步地，所述pPIC9K质粒中位于αMF上游的BamHⅠ通过点突变删除。 [0024] 本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的工程菌。 [0025] 本发明还提供上述的工程菌在制备三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白中的应用。 [0027] 本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白。 [0028] 本发明还提供上述的三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白在制备功能性生物材料、化妆品或医疗器械中的应用。 [0029] 本发明公开了以下技术效果： [0030] 本发明提供了一种酵母表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的制备方法，利用该制备方法制备得到的Ⅰ型重组人胶原蛋白具有三螺旋结构，从而可以使得Ⅰ型重组人胶原蛋白获得良好的生物力学性能和生物相容性。本发明制备得到的三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白可以广泛应用于化妆品、医学美容、医疗器械、生物医学材料等领域，具有重要的市场应用价值。附图说明 [0031] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0032] 图1为pPIC9K的质粒图谱； [0033] 图2为pMChZ‑AOX的质粒图谱； [0034] 图3为pMCrN‑AOX的质粒图谱； [0035] 图4为pMCeH‑AOX的质粒图谱； [0036] 图5为pPIC9K‑P4H(DP)‑1的质粒图谱； [0037] 图6为分别使用COL1A1和COL1A2抗体检测胶原蛋白的结果； [0038] 图7为分别使用P4HA1和P4HB抗体检测胶原蛋白的结果； [0039] 图8为圆二色谱检测结果； 具体实施方式[0041] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。 [0042] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。 [0043] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。 [0044] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。 [0045] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。 [0046] 以下实施例中使用的毕赤酵母KM71购自Invitrogen；pPIC9K载体购自Invitrogen。 [0047] 实施例1 [0048] 1、构建编码I型重组人胶原蛋白α1链α1(Ⅰ)的序列： [0049] 在序列(SEQ ID NO.1)的信号肽及N端肽间增加His Tag标签；N端肽与三螺旋区之间添加TEV酶切序列；三螺旋区与C端肽间添加TEV酶切序列，C末端添加His Tag标签，获得α1(Ⅰ)。α1(Ⅰ)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。α1(Ⅰ)的氨基酸按毕赤酵母表达偏好进行优化，获得编码基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。 [0050] 2、构建编码I型重组人胶原蛋白α2链α2(Ⅰ)的序列： [0051] 在序列(SEQ ID NO.4)的信号肽及N端肽间增加His Tag标签；N端肽与三螺旋区之间添加TEV酶切序列；三螺旋区与C端肽间添加TEV酶切序列，C末端添加His Tag标签，获得α2(Ⅰ)。α2(Ⅰ)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。α2(Ⅰ)的氨基酸按毕赤酵母表达偏好进行优化，获得编码基因，核酸序列如SEQ ID NO.6所示。 [0052] 3、构建质粒： [0053] 3.1构建质粒pMChZ‑AOX [0054] 合成核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的替代序列，替换pPIC9K载体序列的第4648‑9221bp，即以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子替换pPIC9K中的KanR抗性基因、Bom及AOX13’fragment元件；通过点突变删除pPIC9K中位于αMF前的BamHⅠ(938‑943bp)及αMF，在AOX1tt(也称为AOX1 transcription termination或AOX1termination)下游(1583‑ 1584bp间)通过点突变引入BamHⅠ识别位点，其他载体元件序列不变，构建获得质粒pMChZ‑AOX(其中的h代表重组位点为PpHIS4，Z代表筛选标记为BleoR)。该质粒在甲醇诱导时可表达Cre重组酶，催化lox71和lox66的重组，实现抗性基因的回收，位于AOX1tt后的BamHⅠ可用于同尾酶构建体外多拷贝质粒。原始质粒pPIC9K和本发明构建的pMChZ‑AOX的质粒图谱如图1和图2所示。 [0055] 其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的替代序列两端含lox71和lox66序列，lox71上游有ori，内部有Cre转录单元，Cre基因由SacⅠ酶切位点突变的AOX1启动子启动；BleoR上游有原核和真核启动子，可用于原核生物和真核生物筛选，AmpR上游有原核启动子，可用于原核生物筛选。 [0056] SEQ ID NO.7中各部分含义解释如下： [0057] 小写字母所示为ori，5’端 所示为lox71，3’端 所示为lox66；“_”所示为AmpR， 所示为pAmpR(AmpR启动子)， 所示为突变SacⅠ位点的pAOX1启动子，所示为Cre重组酶基因，“......”所示为AOX1tt， 所示为pTEF1(对应图中TEF1 promoter)， 同时小写字母部分为pEM7(对应图中EM7promoter)， 所示为 BleoR，“_”同时小写字母部分为CYC1tt(对应图中CYC1terminator)。 [0058] SEQ ID NO.7： [0059] [0060] [0061] [0062] 3.2构建质粒pMCrN‑AOX [0063] 合成SEQ ID NO.8序列(PpRGI2)和SEQ ID NO:9序列，分别替代步骤3.1中获得的pMChZ‑AOX上的PpHIS4和Zeocin筛选标记序列，获得质粒pMCrN‑AOX(其中r代表重组位点为PpRGI2，N代表筛选标记为NrsR)，图谱如图3所示。 [0064] 3.3构建质粒pMCeH‑AOX [0065] 合成SEQ ID NO.10序列(PpENO)和SEQ ID NO.11序列，分别替代pMChZ‑AOX上的PpHIS4和PEM7‑BleoR‑CYC1 tt，获得质粒pMCeH‑AOX(e代表重组位点为PpENO，H代表筛选标记为HygR)，图谱如图4所示。 [0066] SEQ ID NO.11： [0067] ATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTCCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTG，其中，下划线为HYGR，3’端为TEFTT。 [0068] 4、构建重组表达载体： [0069] 4.1将α1(Ⅰ)克隆至上述3.1中构建的pMChZ‑AOX载体，获得重组表达质粒pMChZ‑α1(Ⅰ)。 [0070] 4.2将α2(Ⅰ)克隆至上述3.2中构建的pMCrN‑AOX载体，获得重组表达质粒pMCrN‑α2(Ⅰ)。 [0071] 4.3分别以pMChZ‑α1(Ⅰ)和pMCrN‑α2(Ⅰ)为模板扩增得到目的基因α1(Ⅰ)和α2(Ⅰ)，构建得到[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)转录单元(SEQ ID NO.13)，利用BsaⅠ内切酶将[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)转录单元克隆至上述3.3中构建的pMCeH‑AOX载体中，获得pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)。 [0072] 4.4P4H表达载体pPIC9K‑P4H(DP)‑1的构建 [0073] 合成SEQ ID NO.12序列替换P4H 9K DP质粒(已在中国专利CN114480471A中公开)中的KanR，即在该筛选标记5’端(按pPIC9K质粒方向)添加PTEF和PEM7，3’端添加CYC1tt，获得P4H表达载体pPIC9K‑P4H(DP)‑1，其质粒谱图5所示。 [0074] SEQ ID NO.12： [0075] [0076] 其中， 所示为PTEF，“”所示为PEM7，“”所示为KANR，“”所示为CYC1TT。 [0077] 5、构建重组工程菌株、诱导表达和菌株筛选： [0078] 以毕赤酵母菌KM71(或X33)为出发菌株，参考Lin‑Cereghino描述的感受态制备方法(Lin‑Cereghino et a L，2005)制备毕赤酵母菌感受态；将上述4.1中获得的pMChZ‑α1(Ⅰ)使用SalⅠ线性化，得到pMChZ‑α1(Ⅰ)线性化质粒。参考Invitrogen的Pichia Expression Kit USER GUIDE的方法将pMChZ‑α1(Ⅰ)线性化质粒电转入毕赤酵母菌感受态中，然后涂布YPDZ(博来霉素，300μg/mL)平板，获得菌株KM71H/pMChZ‑α1(Ⅰ)。 [0079] 以KM71H/pMChZ‑α1(Ⅰ)出发菌株，将上述4.2中获得的pMCrN‑α2(Ⅰ)使用SalⅠ线性化并转化至出发菌株的感受态中，获得菌株KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)。 [0080] 以KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)为出发菌株，将上述4.4中获得的pPIC9K‑P4H(DP)‑1使用BspEⅠ线性化并转化至出发菌株的感受态中，获得菌株KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)‑P4H。 [0081] 以KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)‑P4H为出发菌株，将上述4.3中获得的pMCeH‑[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)使用SalⅠ线性化并转化至出发菌株的感受态中，获得菌株KM71H/[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)‑P4H。 [0082] 6、将上述获得的工程菌株接种于装有10mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，于28℃、220rpm培养至OD600为4(16h)。室温下3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为2左右，放置于28℃、220rpm的摇床上继续生长3天，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％。加甲醇诱导后每24h收取菌液样品，取样量为1mL，置于1.5mL EP管中，4℃下以12000g离心5min，分别收集上清和菌体。上清取80μL加20μL上样缓冲液，80℃加热5min制备成样品，取20μL进行SDS‑PAGE。菌体加200μL破壁液，40％液体体积的0.5mm玻璃珠；涡旋震荡1min，置冰上1min，循环6次；4℃下以12000g离心30min，上清取80μL加20μL上样缓冲液，99℃加热5min制备成样品，沉淀用8M尿素溶解后按上清操作步骤制备样品，取20μL进行SDS‑PAGE，后续进行Western Blot。胶原蛋白分别使用COL1A1和COL1A2抗体检测，检测结果如图6所示，结果显示，KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)和KM71H/[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)‑P4H可检测到全长COL1A1和COL1A2。P4H的α亚基用P4HA1抗体检测，P4H的β亚基用P4HB抗体检测，检测结果如图7所示，结果显示KM71H/α1(Ⅰ)‑α2(Ⅰ)和KM71H/[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)‑P4H可正常表达P4HA和P4HB亚基。 [0086] 使用5L发酵罐(保兴生物)，装液量2L发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min，温度30℃，用浓氨水配制好的碱液调pH，设置pH为6.0。先接入0.9mL PTM1，再将制备好的200mL种子液接入罐内(火焰圈接种)，然后点击溶氧电极校百，校百后开始发酵。待生长溶氧第一次掉至30％，采用溶氧串级转速功能，保持30％；等待甘油耗完，溶氧反弹、溶氧大于70％(OD600值约20)，取消溶氧串级转速，调高搅拌转速至650rpm，甘油采用30％联动补料，补料150mL。停止补甘油，溶氧反弹至70％以上后，以甲醇进行诱导培养，补料速度为 4mL/h恒速补料。诱导80h，OD600变化幅度不明显或下降即可放罐，得到发酵液。 [0087] 发酵结束后菌液经5000rpm离心30min收集菌体，菌体按1：10(W:V)重悬于纯化破壁液，均质机1000bar破碎，破碎结束后12000rpm、4℃离心30min分离上清和沉淀。将沉淀经洗涤、复性、胃蛋白酶(Pepsin)酶切，超滤脱盐后冻干，获得α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)冻干粉。 [0088] 纯化破壁液配方：10mM Tris‑HCl(pH 7.4)、100mM NaCl和100mM甘氨酸。 [0089] 8、α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)冻干粉的结构表征： |
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