一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶及制备方法、应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410677232.4 | 申请日 | 2024-05-29 |
| 公开(公告)号 | CN118634370A | 公开(公告)日 | 2024-09-13 |
| 申请人 | 吉林大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 周延民; 王一涵; 吕慧欣; 张嘉萌; 陈升; 陈静霞; | 第一发明人 | 周延民 |
| 权利人 | 吉林大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 吉林大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：吉林省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：吉林省长春市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：吉林省长春市朝阳区红旗街道清华路1500号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：130012 |
| 主IPC国际分类 | A61L27/38 | 所有IPC国际分类 | A61L27/38 ; A61L27/22 ; A61L27/50 ; A61L27/52 ; A61L27/54 ; A61L27/58 ; A61L27/56 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 8 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京专赢专利代理有限公司 | 专利代理人 | 李斌; |
| 摘要 | 本 发明 适用于组织工程技术领域，提供了一种搭载双重外泌体的嵌套微球 水 凝胶的制备方法，包括：制备o‑exos和exos；制备白色多孔 泡沫 状的GelMA水凝胶前体；称取Fibrinogen溶于含o‑exos的PBS内，得到搭载外泌体的Fibrinogen水凝胶前体溶液，通过光交联聚合，得到Fibrinogeno‑exos微球水凝胶；称取GelMA水凝胶前体溶于含exos的PBS中，再与Fibrinogeno‑exos微球水凝胶充分混匀，再通过光交联聚合得到GelMAexos‑Fibrinogeno‑exos嵌套微球水凝胶。本发明还提供了一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶。本发明还提供一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶在制备上颌窦区骨成骨材料中的应用。本发明采用水油乳化法制备的双重缓释外泌体嵌套微球水凝胶，为 治疗 上颌窦缺损区域的原位 骨再生 提供了理论 基础 。 | ||
| 权利要求 | 1.一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶及制备方法、应用技术领域[0001] 本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶及制备方法、应用。 背景技术[0002] 上颌后牙缺失后，牙槽骨吸收和上颌窦气化所导致的剩余骨高度不足增加了种植手术的风险和难度，近年来，上颌窦底提升术逐渐成为解决上颌后牙区垂直骨高度不足的关键临床技术，并在全球范围内被接受和应用。有文献报道，不植入骨移植材料的上颌窦底提升术可以在窦底空间内观察到明显新骨的形成。研究发现，提升过后的窦底黏膜处能够发现向心性生长的新生编织骨和骨髓腔，由此认为上颌窦黏膜，即施耐德膜，除了具有维持成骨空间稳定的作用外，推测其中还含有成骨分化倾向的间充质干细胞，在随后的研究中成功分离并鉴定出施耐德膜内含有成骨分化潜力的间充质来源的干细胞。但目前关于上颌窦具体的成骨模式和机制仍存在争议，能够确定的是，开发基于间充质干细胞的高效原位上颌窦自体骨再生治疗策略来恢复上颌窦区剩余骨高度是十分重要的。 [0003] 外泌体是内体起源的直径约为40‑150nm的天然纳米囊泡，具有诸多优势，如来源广泛、可以人为修饰和改变内容物的数量和种类，还能规避干细胞过度增殖而导致的畸变，其在细胞间物质交换和信号通讯中发挥着重要作用，在应用中具有替代间充质干细胞的潜力。 [0004] 多种干细胞来源的外泌体在骨修复过程中的作用已被充分证实，包括调节免疫反应、抑制骨吸收、招募间充质干细胞并诱导其增殖、创造骨诱导环境促进干细胞成骨分化和诱导血管形成等。受此启发，提取施耐德膜间充质干细胞来源的外泌体，在应用过程中，既避免了细胞间直接接触导致的免疫原反应，又能够向靶细胞传递生物分子，实现上颌窦施细胞间的信号传递，但施耐德膜来源干细胞迁移和成骨能力均较为薄弱，且细胞数量相对较少。根据外泌体可随自然环境更改内容物含量的特点，通过改变细胞生存的组织微环境，提取两种工程化修饰的外泌体，根据不同基因谱的选择性表达，使其在成骨过程中分阶段发挥作用，可实现干细胞迁移和成骨的有序递进。 [0005] 外泌体直接在体内应用时容易被网状内皮系统捕获和单核细胞吞噬，导致靶向能力不足，局部有效作用浓度低。目前被广为接受和应用的是利用生物支架材料延长外泌体的储存和释放时间，水凝胶以其良好的生物相容性以及与组织微环境相似的优势被用作维持成骨空间的支架材料。目前大多是将天然外泌体直接加载到成骨支架中促进骨再生，但单一外泌体的功能有限，并且加载的方式和支架材料的选择仍有待考究。受上颌窦解剖条件和细胞培养困难等方面的限制，目前加载外泌体的水凝胶应用于上颌窦骨缺损区域的研究少见报道。为了发挥干细胞在成骨阶段的不同功效，亟需对支架进行改良。可注射水凝胶和微球水凝胶的流动性和可注射性符合上颌窦区骨移植材料所需要具备的特性。理论上，对微球的直径进行改良，构建嵌套的微球结构，并利用微球水凝胶的包裹性，可实现对不同功能外泌体的有效加载，另外，通过人为控制水凝胶降解过程中外泌体的逐级缓释，能够实现骨再生不同阶段干细胞功能的时空调控。 [0006] 搭载外泌体的嵌套微球水凝胶的应用在实现上颌窦骨缺损部位的原位骨再生具有充分的理论依据，并有望实现创新性突破。 发明内容[0007] 本发明实施例的目的在于提供一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶的制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。 [0008] 本发明实施例是这样实现的，一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0009] 步骤一、制备成骨诱导条件下的施耐德膜间充质干细胞来源外泌体o‑exos和非成骨诱导条件下的施耐德膜间充质干细胞来源外泌体exos； [0010] 步骤二、利用A型猪皮明胶制备白色多孔泡沫状的GelMA水凝胶前体； [0011] 步骤三、称取Fibrinogen并将其溶于含外泌体o‑exos浓缩液的无菌PBS内，得到搭载外泌体的Fibrinogen水凝胶前体溶液，加入光引发剂，在紫外光下进行光交联聚合，得到o‑exosFibrinogen 微球水凝胶； [0012] 步骤四、称取GelMA水凝胶前体并将其溶解于含外泌体exos浓缩液的无菌PBS中，o‑exos exos o‑exos再与Fibrinogen 微球水凝胶充分混匀，继而得到GelMA ‑Fibrinogen 水凝胶前exos o‑exos 体溶液，加入光引发剂，在紫外光下进行光交联聚合，得到GelMA ‑Fibrinogen 嵌套微球水凝胶。 [0013] 本发明实施例的另一目的在于提供一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶，其由上述制备方法制备得到。 [0014] 本发明实施例的又一目的在于提供一种上述搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶在制备上颌窦区骨成骨材料中的应用。 [0015] 本发明实施例提供的一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶的制备方法，采用甲基丙烯酰明胶(GelMA)和纤维蛋白原(Fibrinogen)两种天然低免疫原性的蛋白材料，将其应用在上颌窦区骨成骨材料中，作为骨组织工程的支架材料可以减轻支架植入后的免疫反应，同时，GelMA和Fibrinogen还是光响应水凝胶材料，光响应水凝胶的副产物少，生物相容性好，在骨组织工程的应用中具有很大的应用前景；GelMA为原料的光交联微球已商品化，但降解速度慢、对细胞的迁移、增殖和分化影响较弱，Fibrinogen具有良好的细胞粘附和招募功能，能够在一定程度上弥补GelMA微球水凝胶应用上的不足；在光交联剂的作用下，分别对Fibrinogen和GelMA前体溶液进行化学交联，通过调整转速改变微球直径，合成包裹有Fibrinogen的GelMA嵌套微球，为后续不同功能外泌体的逐级释放提供结构基础； [0016] 将两种培养条件下的施耐德膜干细胞超速离心，提取的两种外泌体分别加载到Fibrinogen和GelMA微球中，利用外泌体同样具备低免疫原性的优势，提高了微球水凝胶移入上颌窦骨缺损区域的生物安全性，外泌体与微球水凝胶之间的相互作用力，控制并延长了外泌体在微球内部的滞留时间，在嵌套微球分层降解过程中实现外泌体稳定而持续的逐级释放，行使对施耐德膜间充质干细胞的增殖、迁移和成骨诱导作用，完成上颌窦骨壁周围细胞迁移、增殖和成骨分化的生物整合，加速上颌窦区的原位骨再生； [0018] 图1为本发明实施例提供的Osteo‑SMMSCsexos的TEM图； [0019] 图2为本发明实施例提供的SMMSCsexos的TEM图； [0020] 图3为本发明实施例提供的Osteo‑SMMSCsexos的粒径分析结果； [0021] 图4为本发明实施例提供的SMMSCsexos的粒径分析结果； [0022] 图5为本发明实施例提供的Osteo‑SMMSCsexos和SMMSCsexos表面标记物的Westernblot分析检测结果； [0023] 图6为本发明实施例提供的嵌套微球水凝胶的OM图； [0024] 图7为本发明实施例提供的嵌套微球水凝胶的SEM图； [0025] 图8A‑图8E为本发明实施例提供的Transwell细胞迁移实验结果(图8A‑图8E分别exos o‑exos exos为空白组、GelMA‑Fibrinogen、GelMA ‑Fibrinogen、GelMA‑Fibrinogen 、GelMA ‑o‑exos Fibrinogen )； [0026] 图9A‑图9E为本发明实施例提供的碱性磷酸酶染色结果显示(图9A‑图9E分别为空exos o‑exos exos白组、GelMA‑Fibrinogen、GelMA ‑Fibrinogen、GelMA‑Fibrinogen 、GelMA ‑o‑exos Fibrinogen )； [0027] 图10A‑图10E为本发明实施例提供的苏木精和伊红(HE)染色结果(新骨New Bone，exos简称NB、原始骨Basal Bone)(图10A‑图10E分别为空白组、GelMA‑Fibrinogen、GelMA ‑o‑exos exos o‑exos Fibrinogen、GelMA‑Fibrinogen 、GelMA ‑Fibrinogen )； [0028] 图11A‑图11E为本发明实施例提供的Micro‑CT结果(图11A‑图11E分别为空白组、exos o‑exos exosGelMA‑Fibrinogen、GelMA ‑Fibrinogen、GelMA‑Fibrinogen 、GelMA ‑o‑exos Fibrinogen )； [0029] 图12为本发明实施例提供的外泌体提取的流程图； [0030] 图13为本发明实施例提供的合成多孔泡沫状的GelMA水凝胶前体的流程图； [0031] 图14为本发明实施例提供的合成GelMAexos‑Fibrinogeno‑exos嵌套微球水凝胶的流程图。 具体实施方式[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0033] 以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。 [0034] 实施例1 [0035] 一种搭载双重外泌体的嵌套微球水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0036] 提取外泌体，如图12所示，具体包括： [0037] (1)将第四代人来源施耐德膜间充质干细胞以1×106/mL的密度接种在含体积浓度10％胎牛血清的α‑MEM培养基中，37℃、5％CO2条件下培养至90％密度，更换为无外泌体血清培养基或添加有成骨诱导成分的无外泌体血清培养基，48h后收集细胞上清于50mL离心管，余下细胞根据细胞状态进行传代或弃去； [0038] (2)4℃条件下，300g离心10min，弃去沉淀中的残留细胞，将离心管中的上清转移至新的50mL离心管内； [0039] (3)4℃条件下，2000g离心10min，弃去沉淀中的坏死细胞，将离心管中的上清转移至新的50mL离心管内； [0040] (4)4℃条件下，6000g离心30min，弃去沉淀中的细胞碎片及细胞器，将离心管中的上清转移至新的50mL离心管内； [0041] (5)4℃条件下，16500g离心30min，近一步沉淀步骤(4)中的细胞碎片，将离心管中的上清转移至新的50mL离心管内； [0042] (6)将步骤(5)中的细胞上清转移至转移至超滤离心管内，4000g离心40min，用200ul加样枪轻轻混匀细胞浓缩槽中的上清浓缩液，将浓缩液通过0.22um针式过滤器后，用 1mL的注射针筒转移至新超滤离心管中； [0043] (7)4℃条件下，100000g离心70min，移液枪弃去上清，加200ul无菌PBS，缓慢重悬沉淀，使沉淀溶解； [0044] (8)将重悬溶液转移至新的超滤离心管内，缓慢添加无菌PBS至管颈部，4℃条件下，100000g离心70min，弃去上清，加入100ul无菌PBS重悬沉淀，最终的得到成骨诱导条件exos exos(Osteo‑SMMSCs ，以下缩写为o‑exos)和非成骨诱导条件下(SMMSCs ，以下缩写为exos)的施耐德膜间充质干细胞来源外泌体，放入4℃备用，‑80℃长久保存； [0045] 合成多孔泡沫状的GelMA水凝胶前体，如图13所示，具体包括： [0046] (1)取7.5gA型猪皮明胶和75mL无菌PBS，将7.5gA型猪皮明胶少量多次加入装有75mL无菌PBS的锥形瓶内，置于50℃水浴中连续搅拌1‑2h，直至锥形瓶内液体呈淡黄色澄清状，此时A型猪皮胶原完全溶解，由此得到浓度为10％w/v的GelMA水凝胶前体溶液； [0047] (2)将750ul甲基丙烯酸酐以1mL/min的速度缓慢滴加到持续搅拌的GelMA水凝胶前体溶液中，继续反应3h； [0048] (3)3h后将GelMA水凝胶前体溶液pH调整为中性或接近中性，将反应停止后的GelMA水凝胶前体溶液转移至截留率为8000‑14000的透析袋内，在50℃蒸馏水中将GelMA水凝胶前体溶液透析2周，第一周每隔4h更换一次蒸馏水，第2周每隔8h更换一次蒸馏水； [0049] (4)使用过滤膜对透析过后的GelMA水凝胶前体溶液在常温下以6000‑7000rmp的速度离心5min； [0051] (6)将预冻好的GelMA水凝胶前体溶液从‑80℃冰箱中取出置于冷冻干燥机内，冷冻干燥48h，得到白色多孔泡沫状的GelMA水凝胶前体； [0052] 合成GelMAexos‑Fibrinogeno‑exos嵌套微球水凝胶，如图14所示，具体包括： [0053] (1)称取50mg Fibrinogen并将其溶于含外泌体o‑exos浓缩液的1mL无菌PBS内，得到搭载外泌体的5％Fibrinogen水凝胶前体溶液，加入2mg光引发剂，在405nm紫外光下进行o‑exos5min光交联聚合，得到Fibrinogen 微球水凝胶； [0054] (2)称取100mg GelMA水凝胶前体并将其溶解于含外泌体exos浓缩液的1mL无菌o‑exos exos oPBS中，再与10mg Fibrinogen 微球水凝胶充分混匀，继而得到GelMA ‑Fibrinogen‑exos 水凝胶前体溶液，加入2mg光引发剂，在405nm紫外光下进行5min光交联聚合，得到exos o‑exos GelMA ‑Fibrinogen 嵌套微球水凝胶。 [0055] 鉴定、分析与结果： [0056] 1、人施耐德膜间充质干细胞来源外泌体的鉴定： [0057] 利用透射电子显微镜(TEM)对Osteo‑SMMSCsexo和SMMSCsexos进行观察，得到结果如exos exos图1‑4所示，可以看出Osteo‑SMMSCs 和SMMSCs 呈圆形杯托状结构(图1、图2)，有完整的exos exos 膜包被，散在分布，Osteo‑SMMSCs 和SMMSCs 两种外泌体的粒径范围主要介于30‑150nm范围内(图3、4)； [0058] 通过Osteo‑SMMSCsexos和SMMSCsexos表面标记物的Westernblot(WB)分析检测，结果如图5所示，特异性蛋白CD9(+)、CD81(+)、TSG101(+)，超速离心法所提取的沉淀确实为外泌体。 [0059] 2、嵌套微球的微观结构表征： [0061] 使用SEM对微球的外观形貌及粒径分布进行表征，将少量微球均匀分布于导电胶上，置于喷金仪中喷金15min增强微球的导电能力，将微球置于扫描电子显微镜中，在抽真空的条件下观察微球表面细微结构，并用软件对微球粒径大小及分布进行统计分析，得到结果如图7所示； [0062] 根据图示可以看出，微球呈规则球形，形态良好，无明显粘连，GelMA微球水凝胶粒径约为60‑150um，Fibrinogen微球水凝胶粒径约为5‑20um。 [0063] 3、搭载外泌体的嵌套微球水凝胶诱导施耐德膜间充质干细胞的迁移作用： [0064] 利用Transwell迁移实验衡量细胞的迁移能力，Transwell小室将孔板分隔为上室和下室，上室内为细胞，下室内为嵌套微球水凝胶，上下室之间由允许细胞通过的多孔膜分隔，根据通过多孔膜的细胞数量衡量不同材料间的迁移能力； [0065] 为检测GelMAexos‑Fibrinogeno‑exos嵌套微球水凝胶对施耐德膜来源间充质干细胞是否具有驱化作用，本实验通过6孔板的Transwell系统(8um孔径)进行细胞迁移实验，实验分为5组，以无微球组(仅在上室接种细胞)作为空白组，单纯GelMA‑Fibrinogen嵌套微球为exos o‑exos exos o对照组，实验组为GelMA ‑Fibrinogen，GelMA‑Fibrinogen ，GelMA ‑Fibrinogen‑exos ，具体实验步骤如下： [0066] 1)取对数生长期的施耐德膜间充质干细胞P4，去除旧培养基，PBS清洗3次； [0067] 2)加入0.25％胰酶消化，待细胞皱缩变圆后加入α‑MEM培养基终止消化反应； [0068] 3)转移细胞悬液于15mL离心管内，常温下1000rmp 5min； [0069] 4)培养基重悬细胞，并进行细胞计数，调整细胞浓度为5x105个/mL，将100ul细胞悬液加入Transwell上室中，下室中放入不同分组的微球水凝胶； [0070] 5)孔板于37℃5％CO2培养箱中培养24‑48h； [0071] 6)吸去培养基，4％多聚甲醛固定15min； [0072] 7)PBS清洗3次，棉签擦去上室内未迁移的细胞； [0073] 8)结晶紫染色20‑30min，PBS轻轻漂洗3次； [0074] 9)倒置光学显微镜下观察结果； [0075] Transwell细胞迁移实验结果如图8A‑图8E所示，与对照组相比，GelMAexos‑exos o‑exosFibrinogen和GelMA ‑Fibrinogen 两组能够显著促进上颌窦施耐德膜来源干细胞的o‑exos 迁移，且两者间无明显差异，GelMA‑Fibrinogen 组诱导细胞迁移的能力较弱，但优于对照组和空白组。 [0076] 4、搭载外泌体的嵌套微球水凝胶诱导施耐德膜间充质干细胞的成骨分化作用： [0077] 为检测GelMAexos‑Fibrinogeno‑exos微球水凝胶对施耐德膜来源间充质干细胞是否具有成骨诱导作用，本实验通过6孔板的Transwell系统(8um孔径)进行微球‑细胞非接触共培养，实验分为5组，以无微球组(仅在上室接种细胞)作为空白组，单纯GelMA‑Fibrinogenexos o‑exos exos组为对照组，实验组为GelMA ‑Fibrinogen，GelMA‑Fibrinogen ，GelMA ‑o‑exos Fibrinogen ，具体实验步骤如下： [0078] 1)取对数生长期的施耐德膜间充质干细胞P4，去除旧培养基，PBS清洗3次； [0079] 2)加入0.25％胰酶消化，待细胞皱缩变圆后加入α‑MEM培养基终止消化反应； [0080] 3)转移细胞悬液于15mL离心管内，常温下1000rmp 5min； [0081] 4)培养基重悬细胞，并进行细胞计数，调整细胞浓度为5x105个/mL，将100ul细胞悬液加入6孔Transwell板下室中，每孔加入2mLα‑MEM培养基，轻晃使细胞铺板均匀，放入37℃5％CO2培养箱中过夜； [0082] 5)24h后观察细胞贴壁情况，将培养基更换为成骨诱导培养基，上室中放入不同实验分组的微球水凝胶。培养期间，每隔2‑3天更换一次成骨诱导培养基； [0083] 6)共培养7天后，弃去培养基，加入1‑2mLPBS润洗3次； [0084] 7)每孔加入2mL4％多聚甲醛固定15min，PBS轻轻漂洗3次； [0085] 8)按照说明，每孔加入1mLBCIP/NBT碱性磷酸酶显色工作液，充分覆盖孔板底壁细胞，室温条件下避光孵育30min，吸除染色液后PBS洗涤，于倒置光学显微镜下观察并采集图像； [0086] 培养7天，碱性磷酸酶染色结果如图9A‑图9E所示，与空白组相比，GelMAexos‑o‑exos o‑exos exosFibrinogen 组、GelMA‑Fibrinogen 组、GelMA ‑Fibrinogen和GelMA‑Fibrinogen组颜色依次减弱，结果表明，搭载外泌体的嵌套微球水凝胶能够诱导施耐德膜来源间充质干细胞的成骨分化。 [0087] 5、搭载外泌体的嵌套微球水凝胶对兔上颌窦缺损模型骨组织再生修复的影响： [0088] 对10只新西兰大白兔建立4周兔上颌窦骨缺损模型，给予空白组、GelMA‑exos o‑exos exos o‑exosFibrinogen、GelMA ‑Fibrinogen、GelMA‑Fibrinogen 、GelMA ‑Fibrinogen 五组微球水凝胶，每组各设4复孔，具体操作步骤如下： [0089] 1)术前准备：材料消毒，器械的准备及消毒，动物术前12小时禁食水； [0090] 2)制备上颌窦底提升模型：新西兰大白兔称重后，使用安泰(0.2mL/Kg)臀大肌注射麻醉，鼻背部备皮，碘伏消毒，75％酒精脱碘后铺巾，并在鼻背部注射0.5‑1mL必兰作局部浸润麻醉，鼻面部沿中线做长度约为2‑3cm的垂直切口，切开皮肤直至骨膜，剥离子完全剥离骨膜，充分暴露鼻骨及双侧鼻骨结合处，在预冷的无菌生理盐水冲洗下，使用环钻在鼻额缝前2cm，中线外0.5cm处，左右各制备一个直径为5mm的骨窗，使用无菌镊小心取出骨片，可观察到随呼吸上下起伏的完整兔施耐德膜，用剥离子随着呼吸节律紧贴骨壁将上颌窦黏膜向后上方轻轻推开，将术前消毒好的材料填充至此空间，拉拢缝合骨膜及黏膜，严密缝合切口，术后注意保暖，每日检测动物状态，术后3天每日注射60万单位青霉素，分别于术后4周、8周、12周3个时间点对兔进行安乐死，收集兔上颌窦模型进行影像及组织学分析； [0091] 3)切片：将包埋好的组织事先预冷，标本夹调整组织的位置和角度，按照3‑5um的厚度进行切片，将石蜡切片于45℃水浴锅内进行展片，载玻片倾斜进入水面轻轻捞起展开的切片，去除多余水分，铅笔标记组别，60℃恒温烤片2h至石蜡全部消失； [0092] 4)HE染色：切片依次浸入二甲苯I15min、二甲苯II 15min进行脱蜡处理，脱蜡完成后分别浸入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、95％乙醇5min、90％乙醇5min、80％乙醇5min，最后蒸馏水冲洗10min，苏木精染色5min取出，大量自来水冲洗，盐酸酒精10s取出，大量自来水冲洗，镜下观察细胞核染色效果，伊红染色2min取出，大量自来水冲洗后，镜下观察细胞质染色效果。最后进行脱水透明封片，切片依次浸入75％乙醇5min、80％乙醇5min、 95％乙醇I 5min、95％乙醇II 5min、无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、二甲苯I 5min、二甲苯II 5min，彻底风干后中性树胶封片，晾干； [0093] 5)Micro CT检测骨组织：收集的骨组织标本浸泡于4％多聚甲醛中固定48h，流动水冲洗2小时，利用Micro‑CT对骨组织扫描并进行三维重建，观察骨体积(Bone Volume，BV)并进行分析和数据统计比较； [0094] 利用苏木精和伊红(HE)染色结果如图10A‑图10E所示，Micro‑CT结果如图11A‑图11E所述，评估兔上颌窦提升术后4周的骨缺损愈合情况，HE染色和Micro‑CT结果均显示，空exos o‑exos 白组和对照组的新骨形成几乎可以忽略不计，而GelMA ‑Fibrinogen 组在缺损区域有大量基质形成，且骨缺损愈合速度快且新骨形成多。 |
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