一种ROS响应型的水凝胶及其制备方法和应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410411874.X | 申请日 | 2024-04-08 |
| 公开(公告)号 | CN118490889A | 公开(公告)日 | 2024-08-16 |
| 申请人 | 华南理工大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 赵海涛; 王均; 戴建武; 陈艳艳; | 第一发明人 | 赵海涛 |
| 权利人 | 华南理工大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 华南理工大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省广州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省广州市天河区五山路381号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：510641 |
| 主IPC国际分类 | A61L27/24 | 所有IPC国际分类 | A61L27/24 ; A61L27/52 ; A61L27/54 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 | 专利代理人 | 梅素丽; |
| 摘要 | 本 发明 属于 水 凝胶材料技术领域，特别涉及一种ROS响应型的水凝胶及其制备方法和应用。本发明ROS响应型的水凝胶包括生长因子、A组分；A组分包括功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，且高分子材料之间通过酰胺键连接的化合物；功能基团包括‑NH2、‑SH、‑OH、‑COOH、不饱和双键、不饱和三键中的至少一种；高分子材料含‑COOH和‑NH2。本发明水凝胶可延缓生长因子的释放并促进细胞的黏附，且可动态响应清除脊髓损伤微环境中的ROS，具有良好的ROS清除效果和脊髓损伤修复效果。 | ||
| 权利要求 | 1.一种水凝胶，其特征在于，包括生长因子、A组分；所述A组分包括功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，且高分子材料之间通过酰胺键连接的化合物； |
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| 说明书全文 | 一种ROS响应型的水凝胶及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于水凝胶技术领域，特别涉及一种ROS响应型的水凝胶及其制备方法和应用。 背景技术[0002] 脊髓损伤(SCI)发生后，由于损伤微环境的动态和复杂性，导致受损部位神经存活和组织再生困难。其中，氧化应激和炎症形成多个正反馈调节信号网络，在损伤后占主导地位，成为外在神经损伤环境的标志。SCI通过各种细胞和酶介导的信号通路产生活性氧(ROS)，高水平的ROS易引起氧化应激，通过多种机制导致炎症事件，重塑抗氧化损伤微环境以促进脊髓再生成为研究的重点。 [0003] 目前存在针对ROS响应型材料体系设计的相关研究，比如有研究将硫缩醛(酮)化合物接枝到纳米介孔硅，其载药后进一步偶联至环糊精聚合物以实现靶向递送。但是，这些研究对于硫醚键响应ROS后的后续功能转变没有进一步考虑和利用，很大程度上限制了药物递送效率及时效性，此外，这些材料体系对ROS清除能力较差，机械性能较差，且药物释放较快，不能满足缓释效果。 [0004] 因此，亟需提供一种ROS响应型的水凝胶，其具有良好的ROS清除能力、机械性能，且可有效延缓生长因子的释放，增强脊髓损伤修复效果。 发明内容[0005] 本发明旨在解决上述现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。具体而言，本发明提供一种ROS响应型的水凝胶，其良好的机械性能，ROS清除能力，且可有效延缓生长因子的释放，增强脊髓损伤修复效果。 [0006] 本发明的发明构思：本发明ROS响应型的水凝胶包括生长因子、A组分；所述A组分包括功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，且高分子材料之间通过酰胺键连接的化合物；所述功能基团包括‑NH2、‑SH、‑OH、‑COOH、不饱和双键、不饱和三键中的至少一种；所述高分子材料含‑COOH和‑NH2。功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，提高了硫醚类化合物在高分子材料中的连接稳定性，且高分子材料之间通过酰胺键连接使得高分子材料整体形成水凝胶，不易降解，并增强了材料的机械性能。本发明功能基团修饰的硫醚类化合物与ROS反应后产生游离‑SH或‑S‑S‑，其可以与水凝胶上的生长因子或细胞通过硫醇置换反应，或形成‑S‑S‑，或通过‑SH与‑NH2化学偶联反应，或氢键作用力等形式进一步动态结合，有效延缓水凝胶上生长因子的释放并促进细胞的黏附，增强功能支架的脊髓损伤修复效果。 [0007] 因此，本发明的第一方面提供一种ROS响应型的水凝胶。 [0008] 具体的，一种ROS响应型的水凝胶，包括包括生长因子、A组分；所述A组分包括功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，且高分子材料之间通过酰胺键连接的化合物； [0009] 所述功能基团包括‑NH2、‑SH、‑OH、‑COOH、不饱和双键、不饱和三键中的至少一种； [0010] 所述高分子材料含‑COOH和‑NH2。 [0011] 优选地，所述功能基团包括‑NH2、‑SH、‑OH、‑COOH、不饱和双键、不饱和三键中的至少两种不同或相同的基团。 [0012] 具体的，所述至少两种相同的基团指功能基团种类相同，但是数量至少为2个，如两个‑COOH。 [0013] 优选地，所述高分子材料包括胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)中的至少一种。 [0014] 优选地，所述化合物包括高分子材料结构单元和功能基团修饰的硫醚结构单元，所述高分子材料结构单元和功能基团修饰的硫醚结构单元的摩尔比为1‑1000：1‑1000；进一步优选地，所述高分子材料与功能基团修饰的硫醚的摩尔比为1000：1‑1000；更进一步优选地，所述高分子材料与功能基团修饰的硫醚的摩尔比为1000：1，100：1或10：1。 [0015] 优选地，所述硫醚类化合物包括双二硫醚、双苯磺酰硫醚、双(2‑巯乙基)二硫醚中的至少一种。 [0016] 优选地，所述功能基团修饰的硫醚类化合物包括缩硫酮、缩硫醛类化合物中的至少一种。 [0017] 优选地，所述生长因子包括含基团的因子、含基团的药物中的至少一种，所述基团包括‑SH、‑S‑S‑、‑NH2和‑COOH中的至少两种。 [0018] 本发明的第二方面提供一种本发明第一方面所述的ROS响应型的水凝胶的制备方法。 [0019] 具体的，所述ROS响应型的水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0020] (1)将功能基团修饰的硫醚类化合物、羧基活化剂混合，反应，得到混合物1； [0021] (2)将所述高分子材料和步骤(1)所得的混合物1混合，反应，得到混合物2； [0022] (3)将所述生长因子、步骤(2)所得的混合物2、羧基活化剂混合，固化，制得所述ROS响应型的水凝胶。 [0023] 优选地，步骤(1)中，所述羧基活化剂包括1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)；所述功能基团修饰的硫醚类化合物、EDC和NHS的质量比为1：(0.9‑11)：(0.9‑2.2)。 [0024] 进一步优选地，步骤(1)中，所述功能基团修饰的硫醚类化合物、EDC和NHS的质量比为1：(1‑10)：(1‑2)。 [0025] 优选地，步骤(1)中，先将功能基团修饰的硫醚类化合物溶解，得到硫醚类化合物溶液，然后与EDC、NHS混合。 [0026] 优选地，所述溶解在避光条件下进行。 [0027] 优选地，步骤(1)中，所述反应的温度为4‑37℃，所述反应的时间为25‑35min；进一步优选地，步骤(1)中，所述反应的温度为20‑37℃，所述反应的时间为27‑33min；更进一步优选地，步骤(1)中，所述反应的温度为37℃，所述反应的时间为30min。 [0028] 优选地，步骤(1)中，所述反应在避光条件下进行。 [0029] 具体的，步骤(1)中，所述反应为酰胺反应。 [0030] 优选地，步骤(1)中，EDC与NHS的质量比为0.9‑11：1；进一步优选地，步骤(1)中，EDC与NHS的质量比为1‑10：1。 [0031] 优选地，步骤(1)中，所述功能基团修饰的硫醚类化合物的制备方法，包括以下步骤：将含有所述功能基团的化合物和硫醚类化合物混合，反应，制得所述功能基团修饰的硫醚类化合物。 [0033] 优选地，所述功能基团修饰的硫醚类化合物包括3,3'‑(丙烷‑2,2‑二基双(硫烷二基))二丙酸、丙烷‑2,2‑二基双(磺胺二基)二乙胺、丙烷‑2,2‑二基双(硫基)二丙酸中的至少一种。 [0034] 优选地，所述反应为化学交联。 [0035] 优选地，所述化学交联包括酰胺化反应，酯化反应，加成反应，缩合反应，络合反应中的至少一种。 [0036] 具体的，通过化学交联将功能基团接枝到硫醚类化合物上。 [0037] 优选地，步骤(2)中，先将所述高分子材料溶解，得到高分子材料溶液，然后和步骤(1)所得的混合物1混合。 [0038] 优选地，步骤(2)中，所述高分子材料与所述混合物1中功能基团修饰的硫醚类化合物的摩尔比为1：0.8‑1.2；进一步优选地，步骤(2)中，所述高分子材料与所述混合物1中功能基团修饰的硫醚类化合物的摩尔比为1：0.9‑1.1；更进一步优选地，步骤(2)中，所述高分子材料与所述混合物1中功能基团修饰的硫醚类化合物的摩尔比为1：1。 [0039] 优选地，步骤(2)中，所述反应的温度为4‑37℃，所述反应的时间为4‑6h；进一步优选地，步骤(2)中，所述反应的温度为20‑37℃，所述反应的时间为4.5‑5.5h；更进一步优选地，步骤(2)中，所述反应的温度为37℃，所述反应的时间为5h。 [0040] 优选地，步骤(2)中，所述反应在避光条件下进行。 [0041] 优选地，步骤(2)中，所述反应后还包括透析的过程。 [0042] 优选地，所述透析在双蒸水中进行。 [0043] 优选地，所述透析的目的是除未反应的化合物杂质。 [0044] 优选地，步骤(3)中，先将步骤(2)所得的混合物2溶解，然后和生长因子、EDC、NHS混合。 [0045] 优选地，步骤(3)中，所述生长因子和所述混合物2的质量比为1：(1‑10000)；进一步优选地，步骤(3)中，所述生长因子和所述混合物2的质量比为1：1000‑8000；更进一步优选地，步骤(3)中，所述生长因子和所述混合物2的质量比为1：8000或1：1000。 [0046] 优选地，步骤(3)中，所述羧基活化剂包括EDC和NHS。 [0047] 优选地，步骤(3)中，EDC与NHS的质量比为0.9‑11：1；进一步优选地，步骤(3)中，EDC与NHS的质量比为1‑10：1。 [0048] 优选地，步骤(3)中，所述EDC、NHS为EDC和NHS的水溶液。 [0049] 优选地，所述EDC和NHS的水溶液的质量分数为40‑60％；进一步优选地，所述EDC和NHS的水溶液的质量分数为45‑55％；更进一步优选地，所述EDC和NHS的水溶液的质量分数为50％。 [0050] 优选地，步骤(3)中，所述固化的时间为25‑35min；进一步优选地，所述固化的时间为27‑33min；更进一步优选地，所述固化的时间为30min。 [0051] 本发明的第三方面提供一种支架。 [0052] 具体的，所述支架包括本发明第一方面所述的ROS响应型的水凝胶。 [0053] 相对于现有技术，本发明提供的技术方案的有益效果如下： [0054] (1)本发明ROS响应型的水凝胶包括生长因子、A组分；所述A组分包括功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，且高分子材料之间通过酰胺键连接的化合物；所述功能基团包括‑NH2、‑SH、‑OH、‑COOH、不饱和双键、不饱和三键中的至少一种；所述高分子材料含‑COOH和‑NH2。功能基团修饰的硫醚类化合物通过酰胺键与高分子材料偶联，提高了硫醚类化合物在高分子材料中的连接稳定性，且高分子材料之间通过酰胺键连接使得高分子材料整体形成水凝胶，不易降解，并增强了材料的机械性能。本发明功能基团修饰的硫醚类化合物与ROS反应后产生游离‑SH或‑S‑S‑，其可以与水凝胶上的生长因子或细胞通过硫醇置换反应，或形成‑S‑S‑，或通过‑SH与‑NH2化学偶联反应，或氢键作用力等形式进一步动态结合，有效延缓水凝胶上生长因子的释放并促进细胞的黏附，增强功能支架的脊髓损伤修复效果。 [0055] (2)本发明制备方法步骤(2)所制备的混合物2还可以通过挤出、静电纺丝、湿法纺丝等成型方法在含有EDC/NHS的接收液中以化学交联方式快速固化成型，可制备成有序纤维、3D支架等形状，满足各种应用场景。 [0057] 图1为本发明实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶的ROS清除能力图； [0058] 图2为本发明实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶上细胞活力图； [0059] 图3为本发明实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶中生长因子释放效率图； [0060] 图4为本发明实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶的拉伸曲线图； [0061] 图5为本发明实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶的杨氏模量对比图； [0062] 图6为本发明实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶脊髓损伤修复结果图。 具体实施方式[0063] 为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。 [0064] 以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。 [0065] 实施例1 [0066] 一种ROS响应型的水凝胶，包括生长因子、A组分；A组分包括‑COOH修饰的硫醚类化合物3,3'‑(丙烷‑2,2‑二基双(硫烷二基))二丙酸(TK‑COOH)通过酰胺键与胶原偶联，且胶原之间通过酰胺键连接的化合物。 [0067] 一种ROS响应型的水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0068] (1)准确称取硫缩酮类化合物TK‑COOH 20mg，加入100mL的双蒸水，避光条件下充分溶解，得到TK‑COOH溶液；准确称取EDC 60mg，NHS15mg溶于TK‑COOH溶液中，在37℃避光搅拌反应30min，得到混合物1； [0069] (2)准确称取纯胶原10mg，溶于10mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴作用下完全溶解至透明凝胶状，得到胶原溶液；将胶原溶液加入步骤(1)所得的混合物1中，在37℃避光搅拌反应5h，反应完全后倒入透析袋中，并在双蒸水中透析3天以去除未反应的化合物杂质，冷冻干燥后避光保存于4℃，得到混合物2； [0070] (3)取40mg步骤(2)所得的混合物2溶解于1mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明凝胶状；然后加入将5μg生长因子bFGF，离心去除气泡，得到混合溶液； [0071] (4)将步骤(3)所得的混合溶液置入模具中并浸入预冷的含50wt％的EDC/NHS(EDC、NHS的质量比为4：1)的水溶液中，预冷温度为4℃，固化30min，得到交联的含ROS响应基团和生长因子bFGF的水凝胶，并将水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，冷冻干燥后保存于‑20℃备用。 [0072] 其中，硫缩酮类化合物TK‑COOH的制备方法，包括以下步骤： [0073] (1)称取乙二酸50mg溶解于双蒸水中，并向其中加入100mg的EDC和25mg的NHS，充分溶解后，调节PH至5.5，37℃反应30min，得到混合溶液1； [0074] (2)称取2,2'‑(丙烷‑2,2‑二基双(磺胺二基))二乙胺25mg溶解于双蒸水中，得到混合溶液2； [0075] (3)将步骤(1)所得的混合溶液1加入步骤(2)所得的混合溶液2中，在37℃下反应5h；将反应完全的产物转移到透析袋中，在双蒸水中透析3天后冷冻干燥，得到双‑COOH修饰的硫缩酮小分子化合物TK‑COOH，避光保存在‑20℃备用。 [0076] 实施例2 [0077] 一种ROS响应型的水凝胶，包括生长因子、A组分；A组分包括‑COOH修饰的硫醚类化合物(TK‑COOH)通过酰胺键与胶原偶联，且胶原之间通过酰胺键连接的化合物。 [0078] 一种ROS响应型的水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0079] (1)准确称取硫缩酮类化合物TK‑COOH 20mg，加入100mL的双蒸水，避光条件下充分溶解，得到TK‑COOH溶液；准确称取EDC 60mg，NHS15mg溶于TK‑COOH溶液中，在37℃避光搅拌反应30min，得到混合物1； [0080] (2)准确称取纯胶原20mg，溶于10mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴作用下完全溶解至透明凝胶状，得到胶原溶液；将胶原溶液加入步骤(1)所得的混合物1中，在37℃避光搅拌反应5h，反应完全后倒入透析袋中，并在双蒸水中透析3天以去除未反应的化合物杂质，冷冻干燥后避光保存于4℃，得到混合物2； [0081] (3)取40mg步骤(2)所得的混合物2溶解于1mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明凝胶状；然后加入将1mg生长因子bFGF，离心去除气泡，得到混合溶液； [0082] (4)将步骤(3)所得的混合溶液置入模具中并浸入预冷的含50％wt的EDC/NHS(EDC、NHS的质量比为4：1)的水溶液中，预冷温度为4℃，固化30min，得到交联的含ROS响应基团和生长因子bFGF的水凝胶，并将水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，冷冻干燥后保存于‑20℃备用。 [0083] 其中，硫缩酮类化合物TK‑COOH的制备方法同实施例1。 [0084] 实施例3 [0085] 一种ROS响应型的水凝胶，包括生长因子、A组分；A组分包括‑COOH修饰的硫醚类化合物(TK‑COOH)通过酰胺键与胶原偶联，且胶原之间通过酰胺键连接的化合物。 [0086] 一种ROS响应型的水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0087] (1)准确称取硫缩酮类化合物TK‑COOH 20mg，加入100mL的双蒸水，避光条件下充分溶解，得到TK‑COOH溶液；准确称取EDC 60mg，NHS15mg溶于TK‑COOH溶液中，在37℃避光搅拌反应30min，得到混合物1； [0088] (2)准确称取纯胶原30mg，溶于10mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴作用下完全溶解至透明凝胶状，得到胶原溶液；将胶原溶液加入步骤(1)所得的混合物1中，在37℃避光搅拌反应5h，反应完全后倒入透析袋中，并在双蒸水中透析3天以去除未反应的化合物杂质，冷冻干燥后避光保存于4℃，得到混合物2； [0089] (3)取40mg步骤(2)所得的混合物2溶解于1mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明凝胶状；然后加入将1μg生长因子bFGF，离心去除气泡，得到混合溶液； [0090] (4)将步骤(3)所得的混合溶液置入模具中并浸入预冷的含50％wt的EDC/NHS(EDC、NHS的质量比为4：1)的水溶液中，预冷温度为4℃，固化30min，得到交联的含ROS响应基团和生长因子bFGF的水凝胶，并将水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，冷冻干燥后保存于‑20℃备用。 [0091] 其中，硫缩酮类化合物TK‑COOH的制备方法同实施例1。 [0092] 对比例1 [0093] 对比例1和实施例1相比区别仅在于，对比例1的制备方法中不进行步骤(1)和(2)，其他同实施例1，具体为： [0094] 一种ROS响应型的水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0095] (1)取40mg胶原溶解于1mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明凝胶状；将5μg生长因子bFGF加入上述溶解的胶原材料溶液中，离心去除气泡，得到混合溶液； [0096] (2)将步骤(1)所得的混合溶液置入模具中并浸入预冷的含50％wt的EDC：NHS(4:1)的水溶液中固化30min，预冷温度为4℃，得到交联的含生长因子bFGF的水凝胶，并将水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，冷冻干燥后保存于‑20℃备用。 [0097] 对比例2 [0098] 对比例2和实施例1相比区别仅在于，对比例2的制备方法步骤(4)为，将步骤(3)所得的混合溶液置入模具中浸入预冷的水溶液中固化30min，得到含ROS响应基团和生长因子bFGF的胶原水凝胶，其他同实施例1，对比例2具体为： [0099] 一种ROS响应型的水凝胶的制备方法，包括以下步骤： [0100] (1)准确称取TK‑COOH 20mg，加入100mL的双蒸水，避光条件下充分溶解，得到TK‑COOH溶液；准确称取EDC 60mg，NHS15mg溶于TK‑COOH溶液中，在37℃避光搅拌反应30min，得到混合物1； [0101] (2)准确称取纯胶原10mg，溶于10mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴作用下完全溶解至透明凝胶状，得到胶原溶液；将胶原溶液加入步骤(1)所得的混合物1中，在37℃避光搅拌反应5h，反应完全后倒入透析袋中，并在双蒸水中透析3天以去除未反应的化合物杂质，冷冻干燥后避光保存于4℃，得到混合物2； [0102] (3)取40mg步骤(2)所得的混合物2溶解于1mL质量分数为1％的乙酸中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明凝胶状；然后加入将5μg生长因子bFGF，离心去除气泡，得到混合溶液； [0103] (4)将步骤(3)所得的混合溶液置入模具中并浸入预冷的水溶液中，预冷温度为4℃，固化30min，得到水凝胶，并将水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，冷冻干燥后保存于‑20℃备用。 [0104] 性能测试 [0105] 1.ROS清除能力测试 [0106] 对实施例1‑3和对比例1‑2所制备的水凝胶进行ROS清除能力测试，具体方法为： [0107] 称取实施例1‑3和对比例1‑2的冷冻干燥后的水凝胶材料各5mg，加入0.5mL的含250μM的H2O2水溶液中充分浸泡，5min后分别向其中加入2',7'‑二氯荧光黄双乙酸盐(DCHF‑DA)荧光探针(终浓度为10μM)，30min后在480nm激发光下检测其荧光强度。 [0108] 实施例1‑3和对比例1‑2所制备的水凝胶的ROS清除能力测试结果如图1所示，其中纵坐标ROS Clearance rate(％)表示ROS清除能力速率，*表示显著性(p≤0.05)。由图1可以看出，实施例1的ROS清除能力明显优于对比例1、2，尤其是优于对比例1，说明本发明水凝胶具有良好的ROS清除能力。由于对比例2含有的TK‑COOH比例高于实施例2和实施例3，所以在清除ROS方面效果优于实施例2和实施例3，但是由于其在固化液(预冷的水溶液)中没有发生化学交联，力学性能差，总体效果比实施例2和实施例3差。 [0109] 2.细胞活力测试 [0110] 对实施例1‑3和对比例1‑2所制备的水凝胶进行细胞活力测试，具体方法为： [0111] 称取实施例1‑3和对比1‑2冷冻干燥后的水凝胶材料各5mg，用PBS清洗后放入48孔板中；将神经干细胞用含250μM的H2O2的培养基分散，并以10万/孔的密度接种到实施例1‑3的水凝胶材料上，培养24h后采用细胞活力和细胞毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活力。 [0112] 实施例1‑3和对比例1‑2水凝胶上细胞活力测试结果如图2所示，其中纵坐标D450nm表示活细胞中生成的甲臜在450nm波长处的吸光度，*表示p≤0.05。由图2可以看出，实施例1中细胞活力明显优于对比例1、2，尤其是优于对比例1，说明本发明水凝胶上氧化损伤的细胞的生存活力强。由于对比例2含有的TK‑COOH比例高于实施例2和实施例3，所以在改善氧化损伤细胞存活方面效果优于实施例2和实施例3，但是由于其在固化液中没有发生化学交联，力学性能差，总体效果比实施例2和实施例3差。 [0113] 3.生长因子bFGF的释放效率 [0114] 对实施例1‑3、对比例1‑2水凝胶中生长因子bFGF的释放效率进行测试，具体方法为： [0115] 称取实施例1‑3和对比例1‑2冷冻干燥后的水凝胶材料各5mg，用PBS清洗后放入1mL PBS中，在80rpm，25℃条件下进行生长因子释放测试，在第0d，1d，3d，5d，7d，14d，28d时分别收集上清液，并补充新的PBS至1mL，利用紫外分光光度计在260nm处检测上清液中bFGF的含量。 [0116] 实施例1‑3和对比例1‑2水凝胶中生长因子bFGF的释放效率图如图3所示，其中纵坐标Retained bFGF(％)表示bFGF的剩余量。由图3可以看出，实施例1‑3水凝胶中bFGF的释放速率较慢，可实现缓释效果，而对比例1和2水凝胶中bFGF的释放速率较快，尤其是对比例2。这是由于实施例1‑3中bFGF通过在水凝胶网络中参与硫醇置换，‑S‑S‑，‑SH与‑NH2化学偶联反应等实现缓慢释放。对比例1由于未引入TK‑COOH，bFGF以自由扩散的方式释放，释放速率快。对比例2步骤(4)由于未加入EDC/NHS，导致水凝胶网络未形成，在释放过程中凝胶解体，bFGF释放较快。 [0117] 4.拉伸性能测试 [0118] 对实施例1‑3、对比例1、对比例2水凝胶进行拉伸性能测试，具体方法为： [0119] 通过万能材料试验机对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2所制备的水凝胶的拉伸强度进行测试，拉伸夹具之间的初始高度设置为1cm，拉伸速度为5mm/min，记录样品参数和拉伸曲线数据。 [0120] 实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2水凝胶的拉伸强度曲线如图4所示，其中横坐标Tensile strain(％)表示拉伸应变，纵坐标Tensile stress表示拉伸应力。由图4可以看出，相比于对比例1，实施例1‑3所制备的水凝胶材料由于具有更多的内部交联作用力表现出更高的拉伸强度，对比例2由于未发生凝胶化，拉伸强度较低。 [0121] 此外，由图4中拉伸曲线在1～10％应变区间内的斜率计算得到杨氏模量，实施例1‑3、对比例1、对比例2水凝胶的杨氏模量如图5所示，其中纵坐标Young’s modulus(KPa)表示杨氏模量(千帕)，***表示p≤0.001。由图5可以看出，相比于对比例1和对比例2，实施例 1‑3制备的水凝胶材料具有更高的杨氏模量。 [0122] 5.脊髓损伤修复研究 [0123] 对实施例1‑3，对比例1‑2水凝胶进行体内脊髓损伤修复研究，具体方法为：将2mm×4mm规格的水凝胶植入脊髓损伤大鼠模型脊髓T9段体内2个月后，取材进行免疫组化染色分析，脊髓损伤修复结果如图6所示。图6为脊髓组织尼氏染色，蓝色着色区域表示神经元阳性信号，可以看出实施例1中神经元数量最多，神经元数量明显优于对比例1和2，此外，实施例2和3中神经元数量也多于对比例1和2，表明本发明水凝胶具有良好的修复脊髓损伤的效果。 [0124] 综上所述，本发明功能基团修饰的硫醚类化合物与ROS反应后产生游离‑SH或‑S‑S‑，其可以与水凝胶上的生长因子或细胞通过硫醇置换反应，或形成‑S‑S‑，或通过‑SH与‑NH2化学偶联反应，或氢键作用力等形式进一步动态结合，有效延缓水凝胶上生长因子的释放并促进细胞的黏附，且可动态响应清除脊髓损伤微环境中的ROS，减轻脊髓损伤部位的神经炎症和胶质瘢痕沉积，促进神经回路重建，增强功能支架的脊髓损伤修复效果。 [0125] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 |
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