[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架及其制备方法在修复大鼠脊髓损伤中的治疗效果及应用前景。

[0002] 脊髓作为中枢神经系统的组成部分，上端连接大脑，下端各节段向两侧发出成对的神经，延伸到四肢、体表、内脏等部位，因此脊髓对于神经信号的传递具有重要作用，也是我们能够完成一系列动作和生命活动的基础。脊髓损伤是一类脊髓功能暂时或永久性缺失的疾病，车祸、高处坠落以及运动损伤为主要病因。脊髓损伤造成的直接后果就是瘫痪，而患者多为年轻人，因此脊髓损伤不仅严重影响患者的生活质量，同时也会带来沉重的经济负担。

[0003] 脊髓损伤的病理机制主要分为两个阶段。首先急性损伤期指的是损伤发生瞬间到损伤两周以内，此阶段的主要病理特征为神经元以及神经细胞的大量死亡，神经纤维断裂，血管破裂导致局部组织缺血缺氧，为后续神经炎症的发展提供条件。随后病程向慢性损伤期进行发展，此阶段的主要病理特征为脊髓内部免疫细胞被大量激活，同时其他免疫细胞被大量招募到损伤部位，将损伤产生的细胞碎片进行清除，因此在损伤处产生无神经细胞的空腔组织，随后，脊髓内被激活的星形胶质细胞大量聚集在空腔周围，分泌胶质纤维酸性蛋白形成致密的蛋白质外壳，将空腔结构包裹起来，形成的囊状空腔将极大阻碍后续的神经修复。同时，神经炎症的组织微环境将长期持续，持续影响损伤周围残存的脊髓组织，形成一种萎缩性的组织微环境。

[0004] 目前，临床上对于脊髓损伤的治疗手段主要包括：手术清创及脊髓解压，同时伴随系统性施用甲基强的松龙以控制炎症。然而，甲基强的松龙作为一种糖皮质激素，在强烈抑制免疫反应的同时，也会产生严重的副作用。尽管如此，甲基强的松龙目前仍然是唯一获批的应用于临床控制脊髓损伤疾病发展的药物。由此可见，在医疗飞速发展的今天，对于脊髓损伤的治疗仍然存在极大的挑战。

[0005] 近年来对于脊髓损伤的临床前研究取得较大进展，以干细胞和生物材料为代表的组织工程技术取得众多突破。然而，大多数研究仍然集中在传统干细胞领域，纵使传统干细胞在分化潜能等方面具有很大优势，却难以兼顾免疫调节和神经属性这两方面的性质，并且其安全性及免疫排斥等问题也阻碍了进一步的临床转化应用。另外，受限于支架负载能力低，难以将更多的细胞递送至病灶区以发挥治疗作用。因此，亟待开发一种新型干细胞以及能够高负载细胞的递送支架，从而解决当前脊髓损伤治疗领域所面临的困难与挑战。

[0006] 胎盘作为胎儿与母体之间物质交换的重要器官，由羊膜、绒毛膜和蜕膜构成，羊膜位于胎儿绒毛膜的表面，与脐带和婴儿皮肤相连，包裹着羊水和胎儿，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物。从发育学角度上看，羊膜属于胎盘组织中的胎儿部分，其中可能包含部分分化程度低，具有潜在分化能力的细胞群。

[0007] 羊膜由羊膜上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层五层组成，处于羊膜最里面的一层面向羊膜腔包裹着羊水的细胞为羊膜上皮干细胞。从发生学上讲，羊膜上皮干细胞产生于受精卵起始发育时形成的内细胞团。受精卵发育早期，未植入子宫之前(受精后3‑4天)形成桑椹胚，大约由100多个细胞组成。外层的数十个细胞成为滋养层并最终形成绒毛膜，内层的数十个细胞就是内细胞群，未来发育为胚胎和羊膜。受精后大约8天，人类囊胚部分植入到子宫内膜基质。囊胚外层细胞(滋养层)分化成两层埋到基质内，内细胞团也分化成两层：上胚层和下胚层。上胚层是所有三个胚层的来源，最终形成发育的胚胎。同时，羊膜腔在上胚层内出现，相邻细胞滋养层的上胚层细胞被称为羊膜细胞。

[0008] 人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial stem cells,hAESCs)与胚胎干细胞具有同一发育组织来源，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来，因此保留胚胎干细胞特性，具有多能干性，有较强的分化能力及可塑性，表达多潜能干细胞特异性转录因子OCT‑4、SOX‑2、NANOG。同时，人羊膜上皮干细胞还具有来源广泛，取材容易，无伦理性问题，免疫调节能力(分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白及抗炎因子)，低免疫原性(表达HLA‑E、HLA‑G，不表达β2微球蛋白，不表达共刺激因子)等特点。基于以上事实，人羊膜上皮干细胞是一种适合用于临床细胞治疗和再生医学的种子细胞。

[0009] GelMA(甲基丙烯酰化明胶)是一种以明胶分子为基础，经过甲基丙烯酸酐基团修饰的大分子化合物，这使得GelMA既具备天然材料的高生物相容性的特点，又具有合成材料的良好机械强度和可打印性等优势。借助高精度3D打印机，可以实现GelMA的光交联固化，从而制造个性化、批量化的水凝胶支架，为临床前以及临床应用奠定了技术基础。

[0010] 结合脊髓损伤的病理特征和人羊膜上皮干细胞的特有属性，本专利发明一方面探究发挥羊膜上皮干细胞在免疫调节以及类神经属性上的优势，从而控制脊髓损伤发生后的神经炎症，进而修复受损的神经回路。另一方面，为了将更多的人羊膜上皮干细胞递送到脊髓损伤病灶区以发挥作用，同时也为病灶区内的细胞贴附以及组织再生提供所需的物理支持，本发明进一步利用光固化3D打印技术以及GelMA水凝胶，开发能够用于高效递送人羊膜上皮干细胞的水凝胶支架。综上所述，为了解决脊髓损伤后严重的神经炎症环境以及神经回路受损等诸多问题，我们设计了能够高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架，构成一个既能调节组织微环境又能给予物理支撑的人工脊髓组织，探究其在修复大鼠脊髓损伤中的潜能以及作用。

[0011] 为了解决当前对于脊髓损伤疾病缺乏有效治疗手段的问题，本发明提供了一种高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架及其制备方法和用于治疗脊髓损伤的方法。

[0012] 发明人惊喜的发现，本发明所述的方法可以改善脊髓损伤大鼠损伤部位的炎症水平，同时明显提高了损伤大鼠的后肢运动功能，利用组织学方法分析发现，本发明所述的方法明显促进了模型大鼠损伤处的神经修复，可以作为脊髓损伤治疗的潜在方案之一，因此完成了本发明。

[0013] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种从羊膜组织中分离人羊膜上皮干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

[0014] 步骤1：人羊膜的获取；经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

[0015] 步骤2：人羊膜上皮干细胞的分离；将清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮干细胞。

[0016] 步骤3：人羊膜上皮干细胞的培养；以1×107个细胞/平板的密度将细胞接种于15cm培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待hAESCs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

[0017] 在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2中是利用含有双抗(P/S)的无菌PBS溶液清洗羊膜三遍。

[0018] 在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2中消化包括第一次预消化：加入10ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)消化30s，颠倒20次；第二次预消化：加入15ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)，37℃水浴消化10min；正式消化：加入25ml的0.25％胰酶，37℃水浴消化40min，每隔10分钟摇晃10次，结束后用力颠倒10次；终止消化：加等体积的消化终止液终止消化。

[0019] 在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2中离心收集细胞的条件为：转速500g，室温离心10min。

[0020] 本发明采取的技术方案之二为：3D打印具有三周期极小曲面结构且能够大量负载细胞的GelMA水凝胶支架，所述方法包括以下步骤：

[0021] 步骤1：液态GelMA材料的配置；将固体GelMA材料按照15％的质量体积比溶于PBS溶液中，加入0.02％的光引发剂，加热搅拌至完全溶解，将溶解的GelMA材料倒入3D打印机的料槽内。

[0022] 步骤2：计算机软件中输入三周期极小曲面结构的模型参数。

[0023] 步骤3：开始3D光固化生物打印。

[0024] 步骤4：将打印完成的支架材料从打印平台上取下，浸泡于75％的酒精溶液中过夜，随后更换PBS溶液进行浸泡以除去残留的酒精，随后更换细胞培养基进行浸泡，以备后续细胞接种使用。

[0025] 本发明采取的技术方案之三为：将hAESCs接种于GelMA水凝胶上，构建高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架，所述方法包括以下步骤：

[0026] 步骤1：hAESCs的复苏；将液氮中保存的hAESCs于37℃水浴中快速化冻，离心后收集细胞沉淀。

[0027] 步骤2：hAESCs细胞悬液的制备；将hAESC按照100万细胞/100μl的密度，在培养基中进行配制。

[0028] 步骤3：hAESCs细胞的接种；将GelMA水凝胶支架放在皿底，每个材料块滴加100μl细胞悬液，于37℃培养箱中放置2小时后，轻轻加入培养基。

[0029] 在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤1中离心收集细胞的条件为：转速500g，室温离心3min。

[0030] 本发明采取的技术方案之四为：构建脊髓损伤大鼠模型，所述方法包括以下步骤：

[0031] 步骤1：实验动物的购买；实验动物为SD大鼠，SPF级，220‑250g，雌性，由上海南方模式动物中心提供。

[0032] 步骤2：实验动物的饲养；分笼饲养，每笼3‑4只。

[0033] 步骤3：实验动物分组；一次试验共24只大鼠，分别为细胞材料治疗组6只(Scaffold+hAESCs组)，材料治疗组6只(Scaffold组)，空白模型组6只(FT组)，正常对照组6只(Normal组)。

[0034] 步骤4：脊髓损伤模型手术：将大鼠称重后，按照1ml/100g剂量腹腔注射兽用丙泊酚麻醉剂，待大鼠完全麻醉后，将背侧胸椎周围毛发清除，局部涂抹碘伏消毒，以T10胸椎为中心，用手术刀沿头尾端方向切口1cm左右，将皮肤、脂肪和肌肉逐层切开，暴露T10胸椎。随后，对T10胸椎行椎板切除术，暴露T10胸椎脊髓，在体式镜下利用显微眼科剪将T10段胸椎完全横切，形成约2‑3mm的脊髓缺口。明胶海绵进行局部止血，生理盐水冲洗。

[0035] 步骤5：移植手术：对于Scaffold+hAESCs组大鼠，将高负载hAESCs的脊髓支架移植到损伤缺口处，完成移植；对于Scaffold组大鼠，将空的GelMA支架移植到损伤缺口处，完成移植；对于空白模型组大鼠，不做任何移植。

[0036] 步骤6：缝合：待移植手术完成后，逐层缝合肌肉层，脂肪层和皮肤层，局部涂抹碘伏进行消毒。

[0037] 步骤7：预后处理：在各组大鼠手术完成后的7天内，每天对大鼠后肢腓肠肌进行青霉素钠溶液注射；另外，每天对各组大鼠进行膀胱按压，帮助其排尿，直至其恢复自主排尿能力。

[0038] 在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤2及7中的饲养条件为：室温23‑26摄氏度之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。

[0039] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0040] 本发明高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架，在具有主动吸附细胞能力的脊髓支架的基础上，引入了具有免疫调节和神经营养属性的人羊膜上皮干细胞，从而共同构建了用于修复脊髓损伤的脊髓支架，使得本发明高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架同时具有为损伤病灶区提供力学支撑和生物修复功能的多种需求。

[0041] 本发明高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架的制备方法，该方便高效的细胞接种方法与传统细胞接种方法不同，避免了细胞分布不均以及支架表面利用率低下的问题，利用该脊髓支架的主动吸附细胞能力，实现细胞接种过程易于实施和控制，具有广阔的应用前景。

[0042] 本发明首次构建了一种高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架应用于大鼠脊髓损伤的治疗中，并且具有良好的效果，为当前中枢神经系统损伤类疾病提供了一种治疗方案。本发明通过构建高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架用于大鼠脊髓损伤的治疗，一定程度上弥补了现有方法的不足，其中人羊膜上皮干细胞主要具有以下几个方面的优势：①具有多能干性，有较强的分化能力及可塑性，在体外具有较强的分化能力，可以分化为三个胚层；②具有调节体内和体外免疫反应的能力，在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白；③具有低免疫原性，可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生；④不表达端粒酶逆转录酶，没有致瘤性；⑤来源广泛，取材容易，没有应用限制，不存在伦理问题。因此，本发明构建的高负载细胞的脊髓支架能够将大量的人羊膜上皮干细胞递送至脊髓损伤部位，为最大化发挥人羊膜上皮干细胞的治疗作用提供了手段和工具，对于未来细胞递送以及细胞治疗具有重要意义。
附图说明

[0043] 图1为具有三周期极小曲面结构且能够高负载细胞的GelMA水凝胶支架模型展示[0044] 图2为3D打印具有三周期极小曲面结构且能够高负载细胞的GelMA水凝胶支架的工艺流程；

[0045] 图3为高负载hAESCs的脊髓支架表面的细胞骨架染色；

[0046] 图4为Scaffold+hAESCs组与hAESCs组大鼠体内细胞活性成像；

[0047] 图5为hAESCs大鼠体内短期KI67表达情况；

[0048] 图6为各组大鼠脊髓损伤周围炎症标志物IBA1表达；

[0049] 图7为各组大鼠脊髓损伤周围炎症标志物CD68表达；

[0050] 图8为各组大鼠自由爬行后肢运动表征；

[0051] 图9为各组大鼠后肢肌肉电生理表征；

[0052] 图10为各组大鼠病灶区内神经纤维生长情况；

[0053] 图11为各组大鼠病灶区内不同亚型神经纤维的生长情况；

[0054] 图12为各组大鼠病灶区周围组织学表征；

[0055] 图13为各组大鼠病灶区内髓鞘保留情况；

[0056] 图14为Scaffold+hAESCs组大鼠病灶区内髓鞘结构的代表性图片。

[0057] 以下通过具体实施例对本发明作进一步阐释。

[0058] 实施例中的磷酸盐缓冲液简写为PBS，上皮细胞生长因子简写为EGF，人羊膜上皮干细胞简写为hAESCs，甲基丙烯酰化明胶简写为GelMA，血清替代物简写为KSR，胎牛血清简写为FBS，细胞核染料简写为DAPI。实施例1人羊膜上皮干细胞的分离

[0059] 1、人羊膜的来源

[0060] 经产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

[0061] 2、人羊膜上皮干细胞的分离

[0062] 用加过双抗(P/S)的无菌PBS溶液清洗羊膜三遍，洗去血液及其他杂质，将羊膜转入50ml离心管。

[0063] 加入10ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)消化30s，颠倒20次，将羊膜移入另一个50ml离心管中。

[0064] 向离心管中加入15ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)，37℃水浴消化10min后，将羊膜移入另一个50ml离心管。

[0065] 向离心管中加入25ml的0.25％胰酶，37℃水浴消化40min，每隔10分钟摇晃10次，结束后用力颠倒10次，加等体积的消化终止液终止消化，转速500g，室温离心10min后收集细胞，用1ml培液重悬。

[0066] 将羊膜转移至另一个50ml离心管中，加入25ml的0.25％胰酶，37℃消化40min，每隔10分钟混匀10次，结束后用力颠倒10次，加等体积的消化终止液终止消化，转速500g，室温离心10min后收集细胞，用1ml培液重悬。

[0067] 将两次重悬细胞混合，加入18ml培液(培养液中提前加入双抗及EGF)混匀过200目筛后过400目筛。

[0068] 实施例2人羊膜上皮干细胞的接种培养及冻存

[0069] 细胞计数培养： 一个平板接种1×7
10个细胞。待hAESCs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

[0070] 待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm dish加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，300g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进‑80℃冰箱，12小时后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。

[0071] 实施例3具有三周期极小曲面结构且能够大量负载细胞的GelMA水凝胶支架的打印

[0072] 将固体GelMA材料按照15％的质量体积比溶于PBS溶液中，加入0.02％的光引发剂，加热搅拌至完全溶解，将溶解的GelMA材料倒入3D打印机的料槽内。计算机软件中输入三周期极小曲面结构的模型参数。随后开始3D光固化生物打印。将打印完成的支架材料从打印平台上取下，浸泡于75％的酒精溶液中过夜，随后更换PBS溶液进行浸泡以除去残留的酒精，随后更换细胞培养基进行浸泡，以备后续细胞接种使用。

[0073] 实施例4构建大鼠脊髓损伤模型

[0074] 1、实验动物的购买和饲养

[0075] SD大鼠，SPF级，220‑250g，雌性，动物由上海南方模式动物中心提供。分笼饲养，每笼3‑4只在浙江大学实验动物中心饲养，空调控制室温23‑26摄氏度之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。

[0076] 2、实验药品

[0077] (1)兽用丙泊酚注射液广东嘉博制药有限公司

[0078] (2)注射用青霉素钠山东聖旺药业股份有限公司

[0079] 3、实验动物分组

[0080] (1)体内炎症水平检测

[0081] 一次试验共24只大鼠，分别为细胞材料治疗组6只(Scaffold+hAESCs组)，材料治疗组6只(Scaffold组)，空白模型组6只(FT组)，正常对照组6只(Normal组)。

[0082] (2)体内神经修复水平检测

[0083] 一次试验共24只大鼠，分别为细胞材料治疗组6只(Scaffold+hAESCs组)，材料治疗组6只(Scaffold组)，空白模型组6只(FT组)，正常对照组6只(Normal组)。

[0084] 4、脊髓损伤模型手术

[0085] 将大鼠称重后，按照1ml/100g剂量腹腔注射兽用丙泊酚麻醉剂，待大鼠完全麻醉后，将背侧胸椎周围毛发清除，局部涂抹碘伏消毒，以T10胸椎为中心，用手术刀沿头尾端方向切口1cm左右，将皮肤、脂肪和肌肉逐层切开，暴露T10胸椎。随后，对T10胸椎行椎板切除术，暴露T10胸椎脊髓，在体式镜下利用显微眼科剪将T10段胸椎完全横切，形成约2‑3mm的脊髓缺口。明胶海绵进行局部止血，生理盐水冲洗。

[0086] 5、移植手术

[0087] 对于Scaffold+hAESCs组大鼠，将高负载hAESCs的脊髓支架移植到损伤缺口处，完成移植；对于Scaffold组大鼠，将空的GelMA支架移植到损伤缺口处，完成移植；对于空白模型组大鼠，不做任何移植。

[0088] 6、缝合

[0089] 待移植手术完成后，逐层缝合肌肉层，脂肪层和皮肤层，局部涂抹碘伏进行消毒。

[0090] 7、预后处理

[0091] 在各组大鼠手术完成后的7天内，每天对大鼠后肢腓肠肌进行青霉素钠溶液注射；另外，每天对各组大鼠进行膀胱按压，帮助其排尿，直至其恢复自主排尿能力[0092] 实施例5人羊膜细胞实验溶液的配制

[0093] 1、人羊膜上皮干细胞培液的配制：

[0094] 500ml的DMEM/F12里加入56ml KSR；6ml L‑谷氨酰胺；6ml丙酮酸钠；6ml非必需氨基酸；10ng/ml的EGF与P/S使用前添加；

[0095] 2、2000×EGF(20μg/ml EGF母液)的配制：

[0096] 向EGF包装管中加入1ml无菌ddH2O，静置5‑10min使其溶解，再加入4ml稀释液(5％ Trehalose PBS)，混匀然后分装至1.5ml EP管中，每管分装100μl；

[0097] 3、消化终止液配制：DMEM/F12+10％FBS；

[0098] 4、冻存液配制：40％FBS+50％培液+10％DMSO。

[0099] 实施例6移植人羊膜上皮干细胞至大鼠体内存活情况的检测

[0100] 利用过表达Luciferase的慢病毒感染人羊膜上皮干细胞，待感染72小时后将细胞消化下来，接种到GelMA水凝胶上，体外培养2天后进行移植手术。过程如实施例1中所述。

[0101] 分别在移植后的第2、3、5、7天对植入大鼠体内的人羊膜上皮干细胞的存活情况进行检测，检测前按照15mg/ml的浓度配制底物溶液，按照1ml/100g的剂量对大鼠进行腹腔注射，注射后15分钟将大鼠放入气体麻醉诱导笼中，待大鼠完全麻醉后放入生物成像仪中，进行生物成像。

[0102] 实施例7大鼠后肢运动学功能评分

[0103] 将各组大鼠放置于开放场中，采用双人双盲评分，评分依据BBB运动评分准则进行打分，观察时间为每只大鼠3分钟，观察并记录大鼠在规定时间内后肢各关节的运动情况，结束后取平均分进行记录。

[0104] 实施例8大鼠后肢肌肉电生理检测

[0105] 按照1ml/100g的剂量对大鼠进行丙泊酚腹腔注射，待大鼠完全麻醉后，将其颅骨暴露，利用脑立体定位仪确定运动皮层所在位置，利用颅钻将对应位置的颅骨穿孔，利用无菌注射器将硬脑膜刺破，将电极插入运动皮层合适深度。暴露后肢胫前肌和腓肠肌，将记录电极绑在两块肌肉上，连接在Plexon一起电脑上，准备记录肌肉电信号。

[0106] 将恒流电刺激器连接到刺激电极，调整合适的刺激参数，对大鼠大脑运动皮层区域进行恒定间隔的电刺激，并且记录电刺激后大鼠后肢肌肉电信号。

[0107] 记录结束后，将各个伤口逐层缝合，局部涂抹碘伏进行消毒，放置于热垫上直至大鼠苏醒。

[0108] 实施例9大鼠脊髓损伤部位神经修复情况检测

[0109] 1、收集大鼠受损脊髓组织

[0110] 利用腹腔注射过量麻醉剂使大鼠深度麻醉，随后脱颈处死大鼠，利用组织剪等器械暴露大鼠胸腔，对大鼠进行心脏灌注，灌注150ml PBS溶液和150ml福尔马林溶液，随后暴露损伤脊髓，以损伤处为中心，收集长度约2cm的脊髓组织，福尔马林溶液浸泡过夜。

[0111] 2、溶液配制：

[0112] 4％多聚甲醛：180ml ddH2O加热至65℃，加入20μl 5M氢氧化钠后加入8g多聚甲醛持续加热至溶解(用转子搅拌)，冷却至室温后加入10ml的20×PBS，定容至200ml。

[0113] 盐酸乙醇溶液：7ml盐酸溶液(37％)+252ml 70％乙醇溶液。

[0114] 稀氨水：200ml H2O加8滴氨水，即为0.05％稀氨水。

[0115] 3、脊髓组织病理学检查

[0116] 3.1脱水及透蜡：

[0117] 将脊髓组织放入包埋盒中依次通过装有下列溶液的脱水缸：

[0118] 脱水：装有甲状腺组织的包埋盒依次通过70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇中各15min，然后在两个95％乙醇脱水缸中放置30min，两个100％乙醇脱水缸中放置30min；

[0119] 透明：依次通过装有50％二甲苯和50％酒精的脱水缸中60min，两个二甲苯脱水缸中60min；

[0120] 透腊：通过两个装有纯蜡的脱水缸中60min。

[0121] 3.2包埋：

[0122] 用镊子将包埋盒取出，与石蜡模子一起置于蜡缸中，用镊子夹取石蜡模子放在滴蜡处，滴一滴蜡后放在4℃处，将组织放在蜡上(切面朝下)，然后将模具放在滴蜡处，盖上包埋盒加石蜡，放在4℃处凝固后再补充石蜡。

[0123] 3.3切片：

[0124] 先将蜡块按组织部位修整，切除多余蜡块。调整切片机使刀片与蜡块的距离和角度合适。先将切片厚度调到50μm，切到样品后将切片厚度调到4μm，镜下检查是否切到想要的组织，之后按4μm的厚度切片。

[0125] 3.4展片、贴片、烘片：

[0126] 打开展片仪使水温维持在42℃，用小镊子夹取蜡带放在水面上，切片在水中展开。取洁净的载玻片，小心捞起展开的切片，另一端磨面上标记日期与样品编号。将烘片机的温度调到37℃，切片放在烘片机上烘干，使切片贴服在玻璃片上。烘片4h后收起，切片可长期保存。

[0127] 3.5脊髓切片HE染色：

[0128] 将切好的脊髓病理切片依次经过以下容器：

[0129] 3.5.1脱蜡：二甲苯10min×3；

[0130] 3.5.2水化：100％乙醇5min×2—95％乙醇2min；自来水缓慢水流冲洗5min；

[0131] 3.5.3染细胞核：苏木精(45秒至数分钟，根据染色情况决定，细胞核染成蓝色)；自来水缓慢水流冲洗5min；

[0132] 3.5.4分化：盐酸乙醇溶液2s；自来水缓慢水流冲洗5min；

[0133] 3.5.5返蓝：放入稀氨水中8次；自来水缓慢水流冲洗6min；95％乙醇4min；

[0134] 3.5.6染细胞质：伊红(45秒，细胞质染成红色)；

[0135] 3.5.7脱水：95％乙醇2min×2—100％乙醇4min×2；

[0136] 3.5.8透明：二甲苯5min×3，完成染色之后将切片至于通风厨中风干残留的二甲苯，用中性树脂封片。

[0137] 3.6脊髓切片Luxol Fast Blue染色：

[0138] 将切好的脊髓病理切片依次经过以下容器：

[0139] 3.6.1脱蜡：二甲苯10min×3；

[0140] 3.6.2水化：100％乙醇5min×2—95％乙醇2min；自来水缓慢水流冲洗5min；

[0141] 3.6.3染色：浸泡于Luxol Fast Blue染色液中染色过夜；

[0142] 3.6.4分化：浸泡于0.5％的碳酸锂溶液中15秒；

[0143] 3.6.5分色：浸泡于70％的酒精溶液中30秒至灰白质界限清晰；

[0144] 3.6.6蒸馏水冲洗；

[0145] 3.6.7脱水：95％乙醇2min×2—100％乙醇4min×2；

[0146] 3.6.8透明：二甲苯5min×3，完成染色之后将切片至于通风厨中风干残留的二甲苯，用中性树脂封片。

[0147] 4、脊髓组织冰冻切片

[0148] 4.1脱水：固定后的脊髓样品浸泡于梯度蔗糖溶液中进行脱水，10％蔗糖溶液2小时，20％蔗糖溶液2小时，30％蔗糖溶液4度72小时；

[0149] 4.2包埋：取适当大小组织，包埋于包埋剂中，‑80度条件保存；

[0150] 4.3冰冻切片：与上述3.3所述一致，切片保存于‑80度环境中。

[0151] 5、神经修复相关荧光染色

[0152] 5.1溶液配制(所有溶液现配现用)

[0153] 5.1.1封闭液：1％BSA+5％山羊血清(PBS溶液)。

[0154] 5.2切片从‑80度环境中取出后，室温放置1小时，37度放置2小时。

[0155] 5.3切片浸入PBS溶液浸洗3次，每次5min。

[0156] 5.4透化：0.5％triton X‑100溶液浸泡切片2小时。

[0157] 5.5封闭：封闭液室温浸泡1小时。

[0158] 5.6一抗孵育：一抗用封闭液按照1：200比例进行配制，浸泡组织，4度过夜。

[0159] 5.7二抗孵育：PBS清洗组织3次，每次5min，随后二抗按照1：200比例配制，室温孵育组织1小时。

[0160] 5.8清洗二抗3次，每次5min。

[0161] 5.9染细胞核：按照1：1000比例配制DAPI，浸泡组织5min.

[0162] 5.10清洗组织，封片液封片，镜下观察。

[0163] 如图1所示，本研究设计的具有TPMS结构的大鼠脊髓支架具有大比表面积的特点，为细胞的贴附和生长提供了充足的表面空间。

[0164] 如图2所示，本研究基于光固化3D打印技术构建了上述脊髓支架。

[0165] 如图3所示，对接种在脊髓支架上的hAESCs进行细胞骨架染色，显示细胞长满整个支架表面，显示其优异的载细胞能力以及良好的生物相容性。

[0166] 如图4所示，活体成像结果显示脊髓支架的保护作用能够明显延长hAESCs在大鼠脊髓损伤模型体内的存活时间以及细胞活力。

[0167] 如图5所示，对预标记的hAESCs(红色荧光)进行Ki67荧光染色(绿色荧光)，结果显示移植后10天仍有部分hAESCs能够存活并发生增殖现象。

[0168] 如图6所示，对各组大鼠脊髓损伤病灶区进行微小胶质细胞染色(红色荧光)，结果显示Scaffold+hAESCs能够明显抑制微小胶质细胞的招募以及激活。

[0169] 如图7所示，对各组大鼠脊髓损伤病灶区进行巨噬细胞染色(绿色荧光)，结果显示Scaffold+hAESCs能够明显抑制巨噬细胞的招募以及激活。

[0170] 如图8所示，对各组的大鼠进行后肢运动能力的检测，结果显示Scaffold+hAESCs组大鼠在自由爬行过程中后肢运动能力明显提高，出现后肢明显的步态动作。

[0171] 如图9所示，对各组的大鼠后肢肌肉电生理信号进行检测，结果显示Scaffold+hAESCs组大鼠后肢肌肉电信号振幅明显提高，信号延时缩短，显示损失部位上下行神经回路发生重建，后肢肌肉受到大脑的神经支配。

[0172] 如图10所示，对各组大鼠病灶区内部神经纤维生长情况，结果显示Scaffold+hAESCs组大鼠病灶区出现明显的神经纤维线性排列生长，两个神经纤维标志物的表达明显提高。

[0173] 如图11所示，Scaffold+hAESCs组大鼠病灶区内部的神经纤维特化为不同亚型的神经纤维，又助于后肢运动能力的恢复。

[0174] 如图12所示，Scaffold+hAESCs组大鼠病灶区周围及内部组织结构更加完整，病灶区组织的空腔化以及纤维化程度明显降低。

[0175] 如图13所示，Scaffold+hAESCs组大鼠病灶区周围及内部髓鞘化程度明显提高。

[0176] 如图14所示，扫描电镜结果显示Scaffold+hAESCs组大鼠病灶区出现经典的髓鞘结构。

[0177] 本发明研究高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架在大鼠脊髓损伤治疗中的潜在能力并挖掘其治疗机理。结果表明，移植高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架能够明显抑制大鼠脊髓损伤处的炎症反应，大鼠后肢运动学功能评价显示，后肢运动能力大幅提高，组织学评价显示接受该脊髓支架治疗的大鼠脊髓损伤处存在大量神经纤维修复情况，说明本发明提出的高负载人羊膜上皮干细胞的脊髓支架在大鼠脊髓损伤模型中取得较好的效果。