专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
申请号 | CN202310215919.1 | 申请日 | 2023-03-08 |
公开(公告)号 | CN116328045B | 公开(公告)日 | 2024-09-20 |
申请人 | 中国人民解放军总医院第三医学中心; | 申请人类型 | 其他 |
发明人 | 张加廷; 刘玉杰; 李春宝; 陈威; 孙莹; | 第一发明人 | 张加廷 |
权利人 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 权利人类型 | 其他 |
当前权利人 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 当前权利人类型 | 其他 |
省份 | 当前专利权人所在省份:北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市:北京市海淀区 |
具体地址 | 当前专利权人所在详细地址:北京市海淀区永定路69号 | 邮编 | 当前专利权人邮编:100039 |
主IPC国际分类 | A61L27/54 | 所有IPC国际分类 | A61L27/54 ; A61L27/36 |
专利引用数量 | 3 | 专利被引用数量 | 0 |
专利权利要求数量 | 4 | 专利文献类型 | B |
专利代理机构 | 北京鑫瑞森知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 刘晶; |
摘要 | 本 发明 公开了一种微孔隙 生物 羊膜的制备方法,所述生物羊膜制作的具体步骤为:S1:获得产妇剖腹产后胎盘;S2:将上述S1获取的羊膜进行验收;S3:将上述S2的羊膜进行紫外灯照射灭菌;S4:将上述S3清洗后的羊膜进行冻干处理;S5:将上述S4冻干后的羊膜进行打孔处理;S6:羊膜与BMP‑2进行复合生物活性因子处理;S7:将上述S6的羊膜进行复合生物活性因子处理后,将其进行冻干处理;S8:将上述S7处理后的羊膜进行裁剪;S9:将上述S8处理后的羊膜进行辐照灭菌入成品库;通过对羊膜进行 激光打孔 处理,使得羊膜 覆盖 组织以外的外源性干细胞、细胞因子等生物活动物质可自由通过,有助于减轻瘢痕修复的同时促进肌 腱 修复重塑和腱骨愈合。 | ||
权利要求 | 1.一种生物羊膜的制备方法,其特征在于,所述生物羊膜制作的具体步骤为: |
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说明书全文 | 一种生物羊膜的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及羊膜制备领域,尤其涉及一种生物羊膜的制备方法。 背景技术[0002] 羊膜具有5层结构,分别是上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层;研究表明羊膜具有以下特点:1、羊膜含有纤维粘连素、层粘连素、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖以及其它一些蛋白多糖大分子和一些细胞生长因子如EGF、BFGF,能促进细胞黏附、迁移、增殖、分化等重要功能,羊膜基底膜易使上皮细胞移行长入,增强上皮细胞的黏附性,促进上皮的分化、增殖,阻止上皮细胞凋亡;2、羊膜具有抑制炎症的作用,羊膜中含有多种蛋白酶抑制剂,通过抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用;3、羊膜具有抗粘连作用;4、羊膜富含IV、V型胶原,具有活跃的物质转运功能,具半透膜性质,可满足膜内细胞所需营养物质需要;5、因羊膜不表达HLA‑A、B、C及DR抗原或β2微球蛋白,同时有无血管的基质,抗原性较低;同时,羊膜来源广泛,易于取材,因而其已应用于组织工程研究和临床使用; [0003] 现有的技术中,生物羊膜都是直接采用对剥离下来的羊膜进行表面处理后干燥,且现有的生物羊膜中并不添加任何细胞因子,不能使用在膝关节的交叉韧带的肌腱愈合中,现有的羊膜是一个整体,不能使膝关节的骨髓血与肌腱之间流动交联,会造成肌腱愈合不良的情况,且愈合后不能减弱骨质与肌腱之间的雨刷效应和蹦极效应,也不会增加肌腱的强度。 发明内容[0004] 本发明目的是提供一种生物羊膜的制备方法,可以解决上述问题。 [0005] 本发明解决技术问题采用如下技术方案:一种生物羊膜的制备方法,所述生物羊膜制作的具体步骤为: [0007] S2:将上述S1获取的羊膜进行验收,用PCR法检测乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒,合格后进入后续工序; [0008] S3:将上述S2的羊膜进行紫外灯照射灭菌,灭菌后在洁净环境下将新鲜羊膜用工艺用水清洗除去血渍; [0010] S5:将上述S4冻干后的羊膜进行打孔处理; [0011] S6:将上述S5打孔后的羊膜与BMP‑2进行复合生物活性因子处理; [0013] S8:将上述S7处理后的羊膜进行裁剪,裁剪成所需尺寸,裁剪后进行包装; [0014] S9:将上述S8处理后的羊膜进行辐照灭菌,辐照灭菌后,每批产品均需要做产品的无菌、内毒素、胶原蛋白含量等项目,均合格后入成品库。 [0015] 可选的,所述S2与S3之间还可以将羊膜进行脱细胞处理,具体步骤为: [0016] 将经过S2处理后的羊膜浸泡在1%浓度的TritonX‑100中振荡,然后加入0.25%胰酶或乙二胺四乙酸溶液中振荡孵育除去上皮细胞,处理后制得脱细胞羊膜。 [0017] 可选的,所述S3的具体步骤为:将羊膜在紫外灯照射的环境下照射20min以上,再将其用工艺用水清洗3‑5次,每次清洗用水量为300‑500ml,每次清洗时间为3‑5min。 [0018] 可选的,所述S4/S7的具体步骤为:将羊膜置于;冷冻干燥机工作室内进行预冻0.2‑10h,冷冻干燥机工作室温度为0‑56℃,再将其置于冷凝式内,冷凝式温度为‑10‑56℃,开启真空泵,控制真空度为1‑40Pa,真空冷冻干燥2‑10h。 [0019] 可选的,所述S5中的羊膜打孔处理采用激光打孔处理,所述激光打孔的具体步骤为: [0020] 二维步进电机由控制器控制一维延水平方向移动,另一维延垂直方向移动;样品固定在两块相同的样品架中间,样品架固定在步进电机上;程序设置:水平、垂直方向上每步长均为1mm,首先激光通过定位在样品最边缘的第一列上启动程序;水平方向以每步长1mm,停留0.9s速度移动;激光打完第一列后,垂直方向向内侧移动一个步长,水平方向再以上述同样步长、速度,沿水平方向移动;二维步进电机按照上述方式循环反复运行,完成整片样品的打。 [0021] 可选的,所述S6的具体步骤为:将1.0mg BMP‑2粉末溶于10mL无菌蒸馏水中,制备100μg/mL BMP‑2溶液;将其无菌储存在EP管中,温度为‑20℃,浸入BMP‑2溶液中1小时。 [0022] 可选的,所述S6的具体步骤为:将重组人骨形态发生蛋白‑2冻干粉溶于PBS中,所述PBS的PH值为3.8;用0.22μm注射器过滤器对蛋白质溶液进行灭菌,并在连续搅拌下将其作为水溶液湿化冻干羊膜,制成10mL反应混合物;采用戊二醛介导的交联将BMP‑2与羊膜结合。 [0023] 可选的,所述S8中的裁剪尺寸为10cm×10cm,所述S8中的包装采用双层无菌包装。 [0024] 可选的,所述S9中的辐照灭菌采用钴60辐照灭菌,辐照强度选择是25KGy‑30KGy。 [0025] 本发明具有如下有益效果: [0026] 1.通过对羊膜进行激光打孔处理,羊膜覆盖组织以外的外源性干细胞、细胞因子等生物活动物质可自由通过,有助于减轻瘢痕修复的同时促进肌腱修复重塑和腱骨愈合; [0027] 2.对羊膜进行复合生物活性因子处理,可以使得细胞因子更加丰富,有助于肌腱和骨之间的愈合; [0029] 图1为激光打孔的光路图; [0030] 图2为打孔完的羊膜样品; [0031] 图3为图2中的单孔图像。 具体实施方式[0032] 下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。 [0033] 实施例1 [0034] 本实施例提供了一种生物羊膜的制备方法,所述生物羊膜制作的具体步骤为: [0035] S1:通过符合伦理要求的志愿捐献获得产妇剖腹产后胎盘,胎盘供体应符合年龄25‑35岁之间,且产妇无基础、妊娠期及围生期疾病,所述胎盘应获取产后1小时之内的新鲜胎盘组织,将羊膜剥离; [0036] S2:将上述S1获取的羊膜进行验收,用PCR法检测乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒,合格后进入后续工序; [0037] S3:将上述S2的羊膜进行紫外灯照射灭菌,灭菌后在洁净环境下将新鲜羊膜用工艺用水清洗除去血渍; [0038] S4:将上述S3清洗后的羊膜置于冷冻干燥机工作室内预冻,再将其置于冷凝室内,打开真空泵将羊膜进行冻干处理; [0039] S5:将上述S4冻干后的羊膜进行打孔处理; [0040] S6:将上述S5打孔后的羊膜与BMP‑2进行复合生物活性因子处理; [0041] S7:将上述S6的羊膜进行复合生物活性因子处理后,将其置于冷冻干燥机工作室内预冻,再将其置于冷凝室内,打开真空泵将羊膜进行冻干处理; [0042] S8:将上述S7处理后的羊膜进行裁剪,裁剪成所需尺寸,裁剪后进行包装; [0043] S9:将上述S8处理后的羊膜进行辐照灭菌,辐照灭菌后,每批产品均需要做产品的无菌、内毒素、胶原蛋白含量等项目,均合格后入成品库。 [0044] 通过对羊膜进行激光打孔处理,使得骨髓血可以与肌腱之间进行流通,有助于肌腱愈合;对羊膜进行复合生物活性因子处理,可以使得细胞因子更加丰富,有助于肌腱和骨之间的愈合;本羊膜可以增加抗炎作用,增加肌腱的强度,减弱雨刷反应和蹦极反应。 [0045] 本实施例的进一步实施方式,所述S2与S3之间还可以将羊膜进行脱细胞处理,具体步骤为: [0046] 将经过S2处理后的羊膜浸泡在1%浓度的TritonX‑100中振荡,然后加入0.25%胰酶或乙二胺四乙酸溶液中振荡孵育除去上皮细胞,处理后制得脱细胞羊膜。 [0047] 本实施例的进一步实施方式,所述S3的具体步骤为:将羊膜在紫外灯照射的环境下照射20min以上,再将其用工艺用水清洗3‑5次,每次清洗用水量为300‑500ml,每次清洗时间为3‑5min。 [0048] 本实施例的进一步实施方式,所述S4/S7的具体步骤为:将羊膜置于;冷冻干燥机工作室内进行预冻0.2‑10h,冷冻干燥机工作室温度为0‑56℃,再将其置于冷凝式内,冷凝式温度为‑10‑56℃,开启真空泵,控制真空度为1‑40Pa,真空冷冻干燥2‑10h。 [0049] 本实施例的进一步实施方式,所述S5中的羊膜打孔处理采用激光打孔处理,所述激光打孔的具体步骤为: [0050] 二维步进电机由控制器控制一维延水平方向移动,另一维延垂直方向移动;样品固定在两块相同的样品架中间,样品架固定在步进电机上;程序设置:水平、垂直方向上每步长均为1mm,首先激光通过定位在样品最边缘的第一列上启动程序;水平方向以每步长1mm,停留0.9s速度移动;激光打完第一列后,垂直方向向内侧移动一个步长,水平方向再以上述同样步长、速度,沿水平方向移动;二维步进电机按照上述方式循环反复运行,完成整片样品的打。 [0051] 本实施例的进一步实施方式,所述S6的具体步骤为:将1.0mg BMP‑2粉末溶于10mL无菌蒸馏水中,制备100μg/mL BMP‑2溶液;将其无菌储存在EP管中,温度为‑20℃,浸入BMP‑2溶液中1小时。 [0052] 本实施例的进一步实施方式,所述S6的具体步骤为:将重组人骨形态发生蛋白‑2冻干粉溶于PBS中,所述PBS的PH值为3.8;用0.22μm注射器过滤器对蛋白质溶液进行灭菌,并在连续搅拌下将其作为水溶液湿化冻干羊膜,制成10mL反应混合物;采用戊二醛介导的交联将BMP‑2与羊膜结合。 [0053] 本实施例的进一步实施方式,所述S8中的裁剪尺寸为10cm×10cm,所述S8中的包装采用双层无菌包装。 [0054] 本实施例的进一步实施方式,所述S9中的辐照灭菌采用钴60辐照灭菌,辐照强度选择是25KGy‑30KGy。 [0055] 产品技术要求规定如下表的检测项目及接受标准: [0056]以上实施例的先后顺序仅为便于描述,不代表实施例的优劣。 [0057] 最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。 |