[0001] 本发明属于生物材料的技术领域，更具体地，涉及一种用于骨关节炎治疗的壳聚糖/明胶复合膏体材料及其制备方法和应用。

[0002] 关节软骨是厚度为2～4mm的透明软骨，其主要功能是为骨组织之间提供一个光滑表面，并以低摩擦系数促进载荷的传递，发挥着重要的载荷转移功能。关节软骨对关节健康至关重要，关节软骨的损伤是导致肌肉骨骼疾病的一个重要原因。然而，由于关节软骨内没有血管、淋巴管和神经，细胞密度较低，且内部生物力学环境较为复杂，关节软骨损伤后的内在愈合和修复能力有限，给患者、外科医生和理疗师带来了治疗的挑战。

[0003] 关节滑液是关节腔内的一种粘性液体，具有润滑和减少关节摩擦的功能，作为关节的生物力学润滑剂而存在。滑液主要由透明质酸和表面活性蛋白等组成。透明质酸是一种线性非支链多糖，是滑液中最丰富的聚合物成分之一，负责填补所有组织中细胞之间的缝隙，增强了滑液的粘度和弹性，从而保证了关节接触处的有利润滑条件。目前对关节滑液的模拟已有许多进展，如Seror等人模拟了不同组分的混合润滑剂，结果显示透明质酸通过润滑剂分子锚定在关节软骨的外表面，与关节磷脂酰胆碱复合物通过水合‑润滑机制提供滑膜关节的极端润滑。Wang等人制备了基于透明质酸和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)的模拟滑液，结果显示模拟滑液具有低摩擦系数、高承载能力和良好的润滑能力。Wathier等人通过开环移位聚合制备了一种高分子聚合物(7‑oxanoe‑bornene‑2‑carboxylic)，当它溶解在水溶液中并涂抹在人软骨表面时，可以减少界面上的摩擦并起到润滑剂的作用，其性能与滑液相似。仿生聚合物刷具有较低摩擦系数，可以通过水化作用起到减少磨损的作用，如Liu等人开发了一种刷状微凝胶(PSPMK)，该微凝胶具有水合润滑能力和影响药物释放的温敏性，为设计智能滑液提供了可能性，并且其润滑和药物负载能力的结合使其作为关节润滑剂在骨关节炎治疗具有临床潜力。尽管已有许多模拟关节滑液的研究，但仍缺少对关节滑液生物力学特征的构建，因此相关仿生材料也常因力学性能与生物功能的不匹配而导致应用受限。

[0004] 目前，关节软骨疾病的常用治疗方法主要有自体软骨细胞植入(ACI)，但ACI手术时间长，后续护理非常复杂。而随着体外扩增代数的增加，软骨细胞很难保持其表型，去分化现象很容易发生。此外，关节内注射透明质酸可以显著缓解早中期膝骨性关节炎患者的疼痛，透明质酸可以作为关节内机械粘度的补充剂，起到润滑、减震、减摩等关节保护作用，也可以通过促进内源性透明质酸的分泌，重建关节的内稳态。但由于透明质酸容易被酶促降解并且在关节内停留时间短，因此透明质酸的临床疗效有限，注射透明质酸治疗骨关节炎的方法存在较大争议。

[0005] 针对上述现有的技术问题，本发明的首要目的在于提供一种用于骨关节炎治疗的壳聚糖/明胶复合膏体材料，制备获得的壳聚糖/明胶复合膏体材料在模拟体液环境中能保持稳定的力学性质，具有优异的粘弹性质；此外，所述壳聚糖/明胶复合膏体材料还具有良好的可注射性，生物相容性，以及较好的抗炎效果，能够促进关节软骨损伤修复。

[0006] 本发明的第二个目的在于提供上述用于骨关节炎治疗的壳聚糖/明胶复合膏体材料在制备促进关节软骨损伤修复和/或治疗炎症的产品中的应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

[0008] 一种用于骨关节炎治疗的壳聚糖/明胶复合膏体材料，所述壳聚糖/明胶复合膏体材料的制备方法包括以下步骤：

[0009] S1.将环糊精修饰的壳聚糖衍生物溶于醋酸水溶液中，获得混合溶液；

[0010] S2.将三聚磷酸钠溶液与步骤S1中混合溶液混合，搅拌离心，获得壳聚糖纳米粒子；

[0011] S3.在水浴加热条件下，将5～8％(w/v)的明胶溶液与所述壳聚糖纳米粒子混合，使所述壳聚糖纳米粒子均匀分散于明胶溶液，获得所述壳聚糖/明胶复合膏体材料。

[0012] 发明人团队通过对模拟关节滑液的生物力学特征进行长期的研究，以壳聚糖衍生物为原料，通过三聚磷酸钠离子交联，组装制备了壳聚糖纳米粒子，随后将壳聚糖纳米粒子与明胶混合，壳聚糖衍生物上修饰的特定的羧甲基‑β‑环糊精基团能与明胶之间形成主客体相互作用，进而制备获得了一种具有良好力学性能的壳聚糖/明胶复合膏体材料；发明人在研发过程中进一步发现明胶的浓度也会影响膏体材料的力学性能(粘弹性质)，当壳聚糖纳米粒子与特定质量体积比(5～8％(w/v))的明胶结合时，能够构建一种性能优异，且极其适合作为关节滑液的壳聚糖/明胶复合膏体材料。所述壳聚糖/明胶复合膏体材料在模拟体液环境中能保持稳定的力学性质，不易被酶降解；且所述壳聚糖/明胶复合膏体材料还具有优异的粘弹性质，以及具有典型的剪切稀化性质，反映其良好的可注射性。此外，所述壳聚糖/明胶复合膏体材料可有效抑制脂多糖(LPS)导致的炎症，能够促进大量软骨细胞和特异性基质的产生，修复软骨组织；表明所述壳聚糖/明胶复合膏体材料具有良好的生物相容性，良好的抗炎效果以及促进关节软骨损伤修复的作用。

[0013] 优选地，所述环糊精选自羧甲基‑β‑环糊精。

[0014] 优选地，所述环糊精修饰的壳聚糖衍生物的分子量为(0.5～3)×106，所述环糊精修饰的壳聚糖衍生物的取代度为10～30％。发明人通过研究发现，壳聚糖衍生物的取代度会影响壳聚糖纳米粒子与明胶的结合程度，取代度越大，壳聚糖纳米粒子与明胶结合的越紧密，进而影响壳聚糖/明胶复合膏体材料力学性能以及粘弹性能，高取代度的壳聚糖衍生物制备获得的壳聚糖/明胶复合膏体材料难以作为关节滑液用于关节软骨损伤修复。

[0015] 进一步优选地，所述步骤S1中，所述环糊精修饰的壳聚糖衍生物的分子量为(1～6
1.5)×10，所述环糊精修饰的壳聚糖衍生物的取代度为15～20％。

[0016] 优选地，所述步骤S1中，所述醋酸溶液为0.5～2％(v/v)的醋酸水溶液。

[0017] 优选地，所述步骤S2中，所述三聚磷酸钠溶液和混合溶液的体积比为1～1.5：1。

[0018] 进一步优选地，所述步骤S2中，所述三聚磷酸钠溶液和混合溶液的体积比为1：1。

[0019] 优选地，所述壳聚糖纳米粒子和所述明胶溶液的质量体积比为0.01～4mg/mL。

[0020] 优选地，所述壳聚糖纳米粒子和所述明胶溶液的质量体积比为2～4mg/mL。

[0021] 优选地，所述三聚磷酸钠溶液为0.2～0.8％(w/v)的三聚磷酸钠溶液。发明人通过研究发现，对于本体系制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料而言，三聚磷酸钠溶液的浓度过低，体系的交联作用太弱，不能够形成稳定的壳聚糖纳米粒子；而三聚磷酸钠溶液的浓度过高，体系中易形成沉淀，难以得到分散性的纳米粒子。

[0022] 优选地，所述步骤S2中，所述搅拌的转速为2500～3500rpm。

[0023] 优选地，所述步骤S2中，将三聚磷酸钠溶液以5～10mL/h的速率缓慢加入到混合溶液中。

[0024] 优选地，所述步骤S3中，所述水浴加热的温度为38～42℃。

[0025] 优选地，采用超声波清洗仪使所述壳聚糖纳米粒子均匀分散于明胶溶液，采用超声波清洗仪的处理时间为5～15min。

[0026] 进一步地，本发明还请求保护所述壳聚糖/明胶复合膏体材料在制备促进关节软骨损伤修复和/或治疗炎症的产品中的应用。优选地，所述产品包括但不限于仿生关节滑液、关节腔注射剂等。

[0027] 进一步地，所述炎症为白细胞介素‑6(IL‑6)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)或肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)导致的炎症。

[0028] 优选地，所述炎症为骨关节炎。

[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种壳聚糖/明胶复合膏体材料，所述壳聚糖/明胶复合膏体材料在模拟体液环境中能保持稳定的力学性质，且具有优异的粘弹性质；此外，所述壳聚糖/明胶复合膏体材料还具有良好的可注射性，生物相容性，在人体中不易被酶降解，以及较好的抗炎效果，能够促进关节软骨损伤修复。附图说明

[0030] 图1为壳聚糖纳米粒子和壳聚糖/明胶复合膏体材料的表征，其中，图1A为壳聚糖纳米粒子的TEM图；图1B为壳聚糖/明胶复合膏体材料的TEM图；图1C为壳聚糖纳米粒子的DLS粒径分析。

[0031] 图2为不同浓度的壳聚糖纳米粒子对壳聚糖/明胶复合膏体材料弹性模量的影响。

[0032] 图3为不同浓度的壳聚糖纳米粒子对壳聚糖/明胶复合膏体材料粘性模量的影响。

[0033] 图4为不同浓度的壳聚糖纳米粒子对壳聚糖/明胶复合膏体材料剪切粘度的影响。

[0034] 图5为在模拟体液环境中，壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量和粘性模量随时间的变化图。

[0035] 图6为在模拟体液环境中，壳聚糖/明胶复合膏体材料的剪切粘度随时间的变化图。

[0036] 图7为壳聚糖纳米粒子和壳聚糖/明胶复合膏体材料对不同细胞的细胞毒性图。

[0037] 图8为不同脂多糖浓度下，不同实验组和空白对照组中，IL‑6、IL‑1β和TNF‑α在mRNA水平的相对表达情况。

[0038] 图9为加入不同壳聚糖/明胶复合膏体材料量的实验组中，IL‑6、IL‑1β和TNF‑α在mRNA水平的相对表达情况。

[0039] 图10为关节软骨损伤修复4周后，对照组、手术组和治疗组中，H&E、番红固绿和甲苯胺蓝的染色图。

[0040] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0041] 实施例1壳聚糖/明胶复合膏体材料的制备

[0042] (1)以羧甲基‑β‑环糊精修饰的壳聚糖(mCS，分子量为1.02×106，羧甲基‑β‑环糊精取代度为17.3％)为原料，采用三聚磷酸钠离子交联组装方法制备壳聚糖纳米粒子(NP)，具体操作如下：制备1％(v/v)醋酸水溶液，将mCS充分溶解于其中，得到1％(w/v)mCS溶液；利用微量注射泵将0.4％(w/v)的三聚磷酸钠溶液以10mL/h的速率缓慢加入到mCS溶液中，三聚磷酸钠溶液和mCS溶液的体积比为1：1，反应液在3000rpm转速下离心10min以收集壳聚糖纳米粒子(NP)。

[0043] (2)在8％(w/v)明胶溶液，40℃水浴条件下加入壳聚糖纳米粒子NP，使壳聚糖纳米粒子NP的含量为4.0mg/mL，利用超声波清洗仪将壳聚糖纳米粒子NP均匀分散在明胶溶液中，得到壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)。

[0044] 实施例2

[0045] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中，壳聚糖纳米粒子NP的含量为2.0mg/mL。

[0046] 实施例3

[0047] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中，壳聚糖纳米粒子NP的含量为1.0mg/mL。

[0048] 实施例4

[0049] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中，壳聚糖纳米粒子NP的含量为0.5mg/mL。

[0050] 实施例5

[0051] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中，壳聚糖纳米粒子NP的含量为0.1mg/mL。

[0052] 实施例6

[0053] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中，采用5％(w/v)的明胶溶液；采用0.2％(w/v)的三聚磷酸钠溶液。

[0054] 实施例7

[0055] 本实施例与实施例1的区别在于：以羧甲基‑β‑环糊精修饰的壳聚糖(mCS，分子量6
为0.5×10，羧甲基‑β‑环糊精取代度为10％)为原料。

[0056] 实施例8

[0057] 本实施例与实施例1的区别在于：以羧甲基‑β‑环糊精修饰的壳聚糖(mCS，分子量6
为3×10，羧甲基‑β‑环糊精取代度为30％)为原料；采用0.8％(w/v)的三聚磷酸钠溶液。

[0058] 对比例1

[0059] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中，不加入壳聚糖纳米粒子NP，将8％(w/v)明胶溶液在40℃下水浴加热，得到明胶材料。

[0060] 试验例1壳聚糖纳米粒子(NP)和壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)的表征

[0061] 采用TEM表征实施例1中制备的壳聚糖纳米粒子悬浮液(0.5mg/mL)中壳聚糖纳米粒子的形貌，加速电压为100kV，转速为200rpm。进一步利用动态光散射粒度分析仪(DLS)探究壳聚糖纳米粒子的粒径和分布，其中应用了4mW氦氖激光源，λ＝633nm，散射角为90°。利用TEM表征实施例1制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料的形貌，加速电压为100kV。

[0062] 如图1中图1A所示，壳聚糖纳米粒子为球形，且直径约为120nm，尺寸较为均匀。

[0063] 如图1中图1B所示，壳聚糖/明胶复合膏体材料内可观察到清晰的、大小均匀的球形壳聚糖纳米粒子存在，直径仍约为120nm，且壳聚糖纳米粒子分布较为均匀。此外，还可观察到壳聚糖/明胶复合膏体材料内的壳聚糖纳米粒子周围有阴影存在，可以推测这些阴影反映了明胶与壳聚糖纳米粒子的结合。

[0064] 如图1中图1C所示，在水动力直径124nm处出现了一个强而尖锐的单峰，PDI为0.12，这个结果与上述TEM观察到的结果相对应。

[0065] 试验例2壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)的流变学性质分析

[0066] 利用马尔文Kinexus Pro+旋转流变仪对实施例1～4制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料以及对比例1中制备的明胶材料进行了流变学测试，分析了不同壳聚糖纳米粒子含量对壳聚糖/明胶复合膏体材料的流变性能影响。为了测试壳聚糖/明胶复合膏体材料的力学性能，将其置于平板上(直径20mm和1mm的间隔距离)，样品使用量约为1mL，37℃下平衡后开始测量，施加的频率从0.1Hz增加到10Hz，剪切应力为1.0Pa。

[0067] 如图2和图3所示，分别为壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量(G’)和粘性模量(G”)随剪切频率的变化图。由图2和图3可知，壳聚糖纳米粒子浓度的增加可显著提高壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量和粘性模量，这说明壳聚糖纳米粒子含量的提高，可显著增强壳聚糖/明胶复合膏体材料的力学性能，当壳聚糖纳米粒子的含量分别为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL时，壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量和粘性模量相较于对比例1中的明胶分别提高了144.8％、150.8％、188.6％、250.9％和172.3％、190.6％、223.2％、266.3％。

[0068] 此外，通过剪切速率扫描分析研究壳聚糖/明胶复合膏体材料的粘度随剪切速率‑1 ‑1的变化，保持温度为37℃，剪切应力为1.0Pa不变，施加的频率从0.1s 增加到10s 。如图4所示，壳聚糖/明胶复合膏体材料的粘度随壳聚糖纳米粒子浓度升高而增加，且随着剪切速‑1
率的增加，壳聚糖/明胶复合膏体材料的粘度急剧下降，当剪切速率增加至10s 时，其粘度均接近0。这说明壳聚糖/明胶复合膏体材料具有典型的剪切稀化性质，具有作为一种有效的关节腔注射材料的能力。试验例3壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)的力学稳定性分析[0069] 为了探究实施例1制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料在模拟体液中的稳定性，利用旋转流变仪对置于pH＝7.4的PBS缓冲液中的壳聚糖/明胶复合膏体材料进行频扫测试(测试的天数分别为第0、1、2、4、6、8、10、15、20、25、30d)(直径20mm和1mm的间隔距离)，37℃下平衡后开始测量，施加的频率从0.1Hz增加到10Hz，剪切应力为1.0Pa，分别取稳定后的弹性模量和粘性模量作为每个时间点NCP的弹性模量值和粘性模量值。

[0070] 如图5所示，为壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量(G’)和粘性模量(G”)随时间的变化图。结果显示在10d内，壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量减少量在初始弹性模量的10％内，在30d内，壳聚糖/明胶复合膏体材料的弹性模量减少量在初始弹性模量的50％内；在10d内，壳聚糖/明胶复合膏体材料的粘性模量减少量在初始粘性模量的20％内，且在30d内，壳聚糖/明胶复合膏体材料的粘性模量的变化量不大。

[0071] 壳聚糖/明胶复合膏体材料置于pH＝7.4的PBS缓冲液中，在第0、1、2、4、6、8、10、15、20、25、30d时，通过剪切速率扫描分析测量了壳聚糖/明胶复合膏体材料的剪切粘度。温‑1
度为37℃，剪切应力为1.0Pa，剪切速率为0.1s 。

[0072] 如图6所示，在10d内，壳聚糖/明胶复合膏体材料的剪切粘度减少量在初始剪切粘度的15％内；在30d内，壳聚糖/明胶复合膏体材料的剪切粘度减少量在初始剪切浓度的50％内。这说明，在模拟体液的环境下，壳聚糖/明胶复合膏体材料具有良好维持力学性能的能力。

[0073] 试验例4壳聚糖纳米粒子(NP)和壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)的细胞相容性分析

[0074] 采用CCK‑8试剂盒测试实施例1中壳聚糖纳米粒子和壳聚糖/明胶复合膏体材料对骨髓间充质干细胞(BMSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞相容性。将壳聚糖纳米粒子和壳聚糖/明胶复合膏体材料加入到基础培养基中，使其浓度分别为1、5、10、50、100μg/mL。体外培养BMSCs和HUVEC，将细胞传代接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，更换为含有各浓度样品的培养基继续培养2d。加入CCK‑8试剂孵育30min后，利用酶标仪测试各孔在450nm处的吸光值。设置空白对照组和阴性对照组。按如下公式计算细胞的存活率(Cell 
viability)，其中ODS、ODB和ODN分别为样品、空白对照组和阴性对照组的OD值。

[0075]

[0076] 细胞存活情况如图7所示。在浓度为1、5、10、50、100μg/mL的壳聚糖纳米粒子和壳聚糖/明胶复合膏体材料处理2d后，BMSCs细胞和HUVEC细胞系的存活率都在80％以上，表明壳聚糖纳米粒子和壳聚糖/明胶复合膏体材料对细胞没有明显的毒性，具有良好的细胞相容性。此外，与壳聚糖纳米粒子处理的实验组相比，经壳聚糖/明胶复合膏体材料处理的细胞存活率更高，其原因可能是明胶具有促进细胞粘附和生长的功能。

[0077] 试验例5壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)的抗炎效果试验

[0078] (1)不同脂多糖浓度下NCP的抗炎效果

[0079] 将小鼠骨髓瘤细胞(ATDC5)传代接种于6孔板培养，分别加入含有0、5、10、15μg/mL的LPS培养液，为非材料处理组。按照以上步骤再培养4组，每组加入0.5mL实施例1制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料为材料处理组。非材料处理组和材料处理组培养24h和48h后，利用RT‑qPCR分别检测白细胞介素‑6(IL‑6)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)在mRNA水平上的相对表达量。0μg/mL脂多糖浓度未处理组24h为对照组，其目的基因相对表达量设为1。

[0080] 结果如图8所示(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，显著性差异均为相对于24h空白对照组而言)，随着脂多糖浓度的增加，未用壳聚糖/明胶复合膏体材料处理的非材料处理组24h和48h后IL‑6、IL‑1β和TNF‑α表达量有增加的趋势。加入壳聚糖/明胶复合膏体材料处理的材料处理组24h后IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的表达量较非材料处理组24h相比有明显的降低，表明壳聚糖/明胶复合膏体材料材料有抗炎作用，并且可推测壳聚糖纳米粒子的加入提高了纳米复合膏体材料的抗炎效果。材料处理组24h后IL‑6的表达量与非材料处理组24h相比有明显的降低，并且在48h后IL‑6的表达量更进一步降低，加入壳聚糖/明胶复合膏体材料处理48h后0μg/mL和5μg/mL脂多糖浓度组TNF‑α、IL‑1β表达量有所降低，但10μg/mL和15μg/mL脂多糖浓度组TNF‑α的表达量相差不大且相对于24h时有升高，猜测可能为壳聚糖/明胶复合膏体材料加入的量不足，无法抵抗更高浓度脂多糖的影响。

[0081] (2)不同NCP的量对抗炎效果的影响

[0082] 将ATDC5细胞传代接种于6孔板培养，加入含有5μg/mL的LPS培养液5ml，分别加入一定量的壳聚糖/明胶复合膏体材料(分别为0ml、0.5ml、1ml、1.5ml)，使得壳聚糖/明胶复合膏体材料的浓度分别为0％、10％、20％、30％，处理细胞，培养24h后，利用RT‑qPCR分别检测IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的mRNA表达水平。0mL NCP处理组为对照组，其目的基因相对表达量设为1。

[0083] 结果如图9所示(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，显著性差异均为相对于对照组而言)，随着壳聚糖/明胶复合膏体材料的浓度在培养液中的增加，IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的表达量减少，并具有显著性差异，说明加入壳聚糖/明胶复合膏体材料的相对量越多，抗炎的效果越显著。

[0084] 试验例6壳聚糖/明胶复合膏体材料(NCP)对骨关节炎的体内治疗实验及作用评价[0085] 采用雄性SD大鼠研究实施例1制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料对骨关节炎的体内治疗作用，将27只SD大鼠随机分为三组：空白对照组，手术组和治疗组。

[0086] 其中，空白对照组：不对大鼠进行任何处理。配制10％水合氯醛溶液，腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，用剃毛器对其腿部去毛，75％酒精消毒。切开膝关节皮肤暴露髌骨韧带，沿髌骨韧带内源打开关节囊，横切大鼠内测半月板副韧带(MMTL)，建立大鼠半月板失稳术(DMM)模型，成功后将韧带和皮肤进行缝合。其中，手术组：不对大鼠关节处做任何治疗处理。治疗组：将实施例1制备的壳聚糖/明胶复合膏体材料注射到大鼠内测半月板副韧带缺损处。

[0087] 空白对照组、手术组和治疗组处理4w(4周)后，颈椎脱臼处死大鼠，无菌条件下去除其他组织，取其关节软骨组织，于4％多聚甲醛溶液中48h，置于入脱钙液中浸泡，每1d更换新鲜脱钙液一次，直至组织脱钙完全。制作组织切片，并通过H&E、番红固绿(Safranin Fast Green)和甲苯胺蓝(TB)染色探究壳聚糖/明胶复合膏体材料对骨关节炎的体内治疗作用。其中，H&E染色可以使细胞核呈现蓝色，细胞质呈现红色；番红固绿染色可以使软骨组织呈现红色，骨组织呈现绿色；甲苯胺蓝染色可以使软骨细胞呈蓝紫色。

[0088] 如图10所示，手术组与对照组相比存在小面积空洞及凹陷；治疗组空洞面积明显减小，表面较为平滑，与对照组情况较为接近。番红固绿染色显示，治疗组中软骨着色明显，说明有大量软骨特异性基质产生，软骨组织修复情况较好。甲苯胺蓝染色结果显示，与手术组相比，治疗组中软骨组织含有较多软骨细胞，并且治疗组与对照组染色情况相似。以上染色结果证明了壳聚糖/明胶复合膏体材料能有效促进关节软骨组织损伤的修复，具有良好的骨关节炎治疗能力。

[0089] 前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例为申请人真实试验结果加以论证。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。