| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202310076451.2 | 申请日 | 2023-02-02 |
| 公开(公告)号 | CN116159182B | 公开(公告)日 | 2024-09-24 |
| 申请人 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所; | 申请人类型 | 科研院所 |
| 发明人 | 戴建武; 沈贺; 黄世超; 裴钢; | 第一发明人 | 戴建武 |
| 权利人 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 权利人类型 | 科研院所 |
| 当前权利人 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 当前权利人类型 | 科研院所 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省苏州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省苏州市工业园区独墅湖高教区若水路398号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：215123 |
| 主IPC国际分类 | A61L27/36 | 所有IPC国际分类 | A61L27/36 ; A61L27/52 ; A61L27/54 ; A61K35/30 ; A61K9/06 ; A61K47/42 ; A61K47/36 ; A61P25/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 3 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 南京利丰知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 王锋; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种用于 治疗 脊髓损伤的神经类器官‑ 水 凝胶体系及制备方法。所述的制备方法包括：将一个或多个神经类器官与水凝胶的前驱体液均匀混合后进行交联反应，从而形成具有三维结构的神经类器官‑水凝胶体系。本发明通过体外构建多能性中枢神经系统类器官，并将其与水凝胶复合，可以在储藏和运输过程中更好的保障神经系统类器官所具有的模拟组织结构、形态和功能特性，并可以形成尺寸更大的具有三维空间结构的神经功能单元，以及能有效延长移植神经类器官在损伤区域的留存时间，提高其存活率，且支持细胞迁移和生长，同时改善损伤微环境，促进神再生和神经网络重建，改善运动功能，提高治疗效果。 | ||
| 权利要求 | 1.一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的用途，所述药物至少具有促进损伤后的神经再生和轴突生长以及促进脊髓损伤区域血管再生的功能； |
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| 说明书全文 | 用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系及制备方法技术领域[0001] 本发明具体涉及一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系、其制备方法及用途，属于医疗技术领域。 背景技术[0002] 脊髓是大脑和外周神经系统之间运动及感觉信息传递的中枢，损伤后严重致残。我国现有创伤性脊髓损伤患者超过200万，每年新增10‑14万人，给家庭和社会造成沉重负担。脊髓损伤修复是最具挑战性的再生医学难题，目前临床治疗方案仍停留在减少继发损伤及康复训练。 [0003] 大量临床前研究表明移植干细胞(如胚胎脊髓来源神经干细胞、胚胎脑来源神经前体细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞诱导分化的神经前体细胞、间充质干细胞等)可以促进脊髓损伤后神经再生和功能恢复(ACS Biomater.Sci.Eng.2020，6，1671)。脊髓形成是高度有序的过程，干细胞增殖、迁移、分化产生多种神经细胞并建立复杂的神经环路，然而，单一细胞治疗难以模拟组织中多种细胞类型和细胞间相互作用，导致传统干细胞移植治疗难以模拟体内脊髓组织内神经细胞三维组装特性。因此，如何实现脊髓组织损伤真正意义上的神经细胞替代和神经网络重建以及功能恢复是脊髓损伤细胞治疗的关键。 [0004] 类器官技术为再生医学带来巨大希望。近年来，国际上多个研究团队通过体外三维培养分化多能干细胞(pluripotent stem cells，PSC)获得了模拟皮层发育进程的类脑器官，以及类前脑、中脑和下丘脑样器官等脑区特异性类脑器官(Nature.2013，501：373；Cell Stem Cell.2016，19：248；Development.2019，146：dev166074)。类脑器官为研究大脑发育和疾病过程以及组织再生提供了新的研究平台，并且神经类器官包含多种神经细胞类型和细胞间生物通信，提供更合适神经再生的微环境，能更好地用于模拟脊髓发生过程促进损伤修复。 [0005] 另一方面，单纯移植干细胞到脊髓损伤部位的治疗效果有限，这主要是由于移植的干细胞在损伤区域留存时间短，且易受损伤微环境影响，从而影响再生修复效果。移植干细胞和支架复合物有望改善治疗结果。然而，中枢神经类器官在治疗脊髓损伤和病变导致运动障碍的疾病的优越性，即是否可以促进损伤后神经再生和功能恢复尚未见报道；同时，现有的研究均是将干细胞及生物支架复合后移植，考虑到中枢神经类器官与干细胞在一些方面存在显著差异，例如模拟人中枢神经组织的三维多细胞组成和提供合适微环境，所以将中枢神经类器官按照怎样的方式与何种生物支架复合后移植才能达到较为理想的治疗效果，仍是业界重点研究的对象，且其也成为了本领域亟待解决的难题。 发明内容[0006] 本发明的主要目的在于提供一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系、其制备方法及用途，以克服现有技术中的不足。 [0007] 为实现前述发明目的，本发明采用的以下技术方案实现： [0008] 本发明的一个方面提供了一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系的制备方法，其包括：将一个或多个神经类器官与水凝胶的前驱体液均匀混合后进行交联反应，从而形成具有三维结构的神经类器官‑水凝胶体系。 [0009] 本发明的另一个方面提供了一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系，它是由所述方法制得。 [0010] 本发明的再一个方面提供了所述用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系的用途。 [0011] 相较于现有技术，本发明至少具有如下优点： [0012] (1)通过体外构建多能性中枢神经系统类器官，并将其与水凝胶复合，一方面可以更好的保持神经系统类器官所具有的模拟组织结构、形态和功能特性，相比细胞移植可以更好地实现神经再生和神经网络重建，促进与宿主组织融合和血管化，另一方面可以形成尺寸更大，满足移植条件和填补缺损区域的，具有三维空间结构的神经功能单元。 [0013] (2)通过将神经类器官与水凝胶复合形成神经类器官‑水凝胶体系，可以有效延长移植神经类器官在损伤区域的留存时间，提高其存活率，并支持细胞迁移和生长，同时改善损伤微环境，促进神经再生和神经网络重建，改善运动功能，提高治疗效果。附图说明 [0014] 图1示出了本发明一实施例中将神经类器官培养不同后移植，移植细胞在损伤区域的存活和迁移水平。 [0015] 图2a示出了本发明一实施例中不同比例明胶/透明质酸水凝胶促进神经再生的水平，其中神经元标志物：NeuN和MAP2，细胞核：DAPI。 [0017] 图2c示出了本发明一实施例中不同比例明胶/透明质酸水凝胶提高NeuN阳性神经元再生水平。 [0018] 图2d示出了本发明一实施例中不同比例明胶/透明质酸水凝胶提高Map2阳性神经元再生水平。 [0019] 图2e示出了本发明一实施例中不同比例明胶/透明质酸水凝胶提高NeuN和Map2双阳性神经元数目情况。 [0020] 图2f示出了本发明一实施例中不同比例明胶/透明质酸水凝胶增强NF+神经纤维生长情况。 [0021] 图3示出了本发明一实施例中治疗10天和60天后，对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)中GFP标记的神经干细胞和GFP标记的神经类器官在损伤区的存活情况及与宿主脊髓组织整合情况。 [0022] 图4示出了本发明一实施例中治疗60天后，对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)中，损伤区再生的Tuj1阳性神经元。 [0023] 图5示出了本发明一实施例中治疗60天后，对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)中，脊髓损伤区再生的NF阳性神经纤维。 [0024] 图6a‑图6b分别示出了本发明一实施例中治疗60天后，对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)中，脊髓损伤区再生的五羟色胺阳性神经元和胆碱能神经元。 [0025] 图7示出了本发明一实施例中治疗60天后，对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)中，血管再生情况。 [0026] 图8a‑图8b分别示出了本发明一实施例中治疗60天后，对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组中大鼠运动功能恢复情况，图8a为BBB评分情况，图8b为斜板实验。 具体实施方式[0027] 本发明的一些实施例提供的一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系的制备方法包括：将一个或多个神经类器官与水凝胶的前驱体液均匀混合后进行交联反应，从而形成具有三维结构的神经类器官‑水凝胶体系。 [0028] 在一个实施例中，所述的制备方法包括：至少通过培养胚胎干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞中的一种或多种获得所述神经类器官。 [0029] 在一个实施例中，所述的制备方法具体包括：将诱导多能干细胞培养7～10天形成神经类器官后，与所述水凝胶的前驱体液均匀混合并进行所述的交联反应。 [0030] 在一个实施例中，所述水凝胶包括明胶水凝胶、胶原水凝胶、透明质酸水凝胶、壳聚糖水凝胶、聚乳酸水凝胶中的任一种或多种的组合，且不限于此。 [0031] 在一个实施例中，所述水凝胶包括质量比为9∶1～19∶1的明胶水凝胶和透明质酸水凝胶。 [0032] 在一个实施例中，所述水凝胶的前驱体液包含甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸。 [0033] 在一个实施例中，所述水凝胶的前驱体液的浓度为5‑10w/v％，该浓度范围有助于细胞生长和迁移以及物质交换。 [0034] 在一个实施例中，所述水凝胶的前驱体液还包含0.01‑0.2w/v％引发剂，该浓度范围的引发剂有助于水凝胶在损伤原位快速交联并具有较高的生物安全性。所述引发剂可以是本领域常见的光引发剂、热引发剂等，优选为可见光引发剂，例如苯基‑2，4，6‑三甲基苯甲酰基‑次膦酸锂(LAP)等，且不限于此。 [0035] 在一个实施例中，所述制备方法具体包括：通过光照激发所述交联反应。 [0036] 在一个实施例中，所述神经类器官于水凝胶的前驱体液内的密度为1*106‑1*107个/mL，该密度范围更有利于中枢神经类器官在损伤区存活和分化并参与神经网络重建。 [0037] 在一个实施例中，所述神经类器官‑水凝胶体系的尺寸为毫米至厘米级，以更好的满足急性期和慢性期脊髓损伤临床治疗移植需求。 [0038] 本发明的一些实施例还提供了一种用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系，其由本发明所述的方法制得。 [0039] 本发明的一些实施例还提供了所述用于治疗脊髓损伤的神经类器官‑水凝胶体系在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的用途。 [0040] 在一个实施例中，所述药物还可以包括药学上接受的载体、其他生物活性因子或药用化合物等，且不限于此。 [0041] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得；而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。 [0042] 如下实施例中，神经类器官的培养过程包括：将人诱导多能干细胞的单细胞悬液以密度为9000细胞/孔接种至96孔超低粘附培养板中，加入含10μMY‑27632 EB形成培养基。每隔2天更换为不含Y‑27632的EB形成培养基。5天之后，将EBs转移到含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板中进行分化。分化2天后的类器官，即可用于移植。 [0043] 如下实施例中，水凝胶的前驱体液的制备过程具体包括：按照文献记载的方法，分别在明胶(GL)和透明质酸(HA)分子链上引入甲基丙烯酰基团制备得到甲基丙烯酰化明胶(mGL)和甲基丙烯酰化透明质酸(mHA)。分别将不同质量比的mGL和mHA溶解在PBS中，并分别添加少量LAP，配制成浓度为6％w/v(mGL和mHA的总浓度)的明胶/透明质酸前体溶液(含有0.02％w/v引发剂)，即水凝胶的前驱体液。在光引发条件下，mGL和mHA可通过甲基丙烯酰基团交联形成生物材料支架，具有良好的生物相容性和成胶性能，且交联度和力学性能可根据甲基丙烯酸酐接枝率进行调控。 [0044] 如下实施例中，神经类器官‑水凝胶体系的制备过程包括：将制得的多个神经类器官与水凝胶前体溶液均匀混合，超低粘附培养板中，加入含10μMY‑27632 EB形成培养基。每隔2天更换为不含Y‑27632的EB形成培养基。5天之后，将EBs转移到含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板中进行分化。分化2天后的类器官，然后以发射波长为395nm的5W LED灯室温光照90秒激发交联，形成尺寸从毫米到厘米级的三维神经类器官‑水凝胶体系，这些神经类器官‑水凝胶体系可以用于移植填补大段损伤。 [0045] 实施例1本实施例中，在培养神经类器官时，在超低粘附培养板中在含10μM Y‑27632 EB培养基内培养2天，之后在不含Y‑27632的EB形成培养基培养3天，然后将EBs转移到含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板中继续培养2天、9天。采用水凝胶的前驱体液所含mGL和mHA的质量比为9∶1。以及，神经类器官与水凝胶的前驱体液是按照细胞浓度达2× 6 10个/mL的比例混合，之后进行所述的光照，制得了两种神经类器官‑水凝胶体系。 [0046] 之后，利用这些神经类器官‑水凝胶体系进行脊髓损伤的治疗，具体过程包括：在大鼠的背部进行中线切口以暴露T8‑T10椎骨。使用#11手术刀片在T8‑T9椎骨水平进行椎板切除术。切断并切除T8‑T9脊髓，形成3mm的完全性缺损，并用明胶海绵控制脊髓损伤部位的出血。在治疗10天后，观察脊髓损伤部位的恢复情况，结果如图1所示。其中绿色荧光GFP对应移植类器官；白色GFAP对应宿主脊髓组织细胞。 [0047] 可以看到，将神经类器官培养7天后移植，相比于长期培养神经类器官后移植，移植细胞在损伤区域的存活和迁移水平更好，有助于功能恢复。 [0048] 事实上，通过类似实验发现，将神经类器官培养6‑8天后移植，相较于将神经类器官培养10～30天后移植，其治疗效果均有明显提升。 [0049] 实施例2本实施例中，所采用水凝胶的前驱体液所含mGL和mHA的质量比分别为10/0、9/1、8/2和7/3。神经类器官是参照实施例1的方式培养共7天。神经类器官‑水凝胶体系的制备方法也与实施例1相似。利用这些水凝胶体系进行脊髓损伤的治疗，具体过程与实施例 1相同。 [0050] 在治疗60天后，观察脊髓损伤部位的恢复情况，结果如图2a‑图2f所示。可以看到，当mGL和mHA的质量比为9/1时，可以更好地促进神经分化，从而更有效地改善脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。 [0051] 实施例3 [0052] 本实施例中，在培养神经类器官时，是将嵌入的类器官在扩张培养基中维持培养4天，并在第5天时，分别将类器官转换到分化培养基中继续培养到第7天。采用的水凝胶的前6 驱体液所含mGL和mHA的质量比为9/1。以及，神经类器官与水凝胶的前驱体液是按照2*10个细胞/mL的比例混合，之后进行所述的光照，制得了神经类器官‑水凝胶体系。 [0053] 之后，参照实施例1的方式制造脊髓损伤大鼠。并将所有脊髓损伤大鼠随机分成四组：对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)和水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)。对照组：脊髓损伤区域加入PBS；水凝胶移植组：脊髓损伤区域移植明胶/透明质酸复合水凝胶；水凝胶包载神经干细胞移植组：脊髓损伤区域移植负载了神经干细胞的明胶/透明质酸复合水凝胶；水凝胶包载神经类器官移植组：脊髓损伤区域移植包载了神经类器官的明胶/透明质酸复合水凝胶。最后，缝合肌肉和皮肤层。术后每天注射他克莫司和辅助排尿。 [0054] 神经类器官‑水凝胶体系移植治疗脊髓损伤10天和60天后，相比于移植神经干细胞‑水凝胶体系移植，神经类器官‑水凝胶体系移植后有更多的细胞在损伤区存活并与宿主脊髓组织整合(图3)。神经类器官‑水凝胶体系中更多存活细胞将有效提高细胞治疗的疗效。 [0055] 移植神经类器官‑水凝胶体系治疗脊髓损伤大鼠60天后，与对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)、水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)相比，水凝胶包载神经类器官移植组(hi‑NSC‑organoid/GL)可以观察到更多的Tuj阳性的神经细胞再生和NF+神经纤维生长(图4和图5)。这表明移植神经类器官‑水凝胶体系可以更有效地促进损伤后的神经再生和轴突生长。更重要的是，移植神经类器官‑水凝胶体系可以更好地促进脊髓功能神经元如五羟色胺能神经元(5‑HT，参阅图6a)和乙酰胆碱能神经元(Chat，参阅图6b)。 [0056] 此外，移植神经类器官‑水凝胶体系可以更好地促进脊髓损伤区域血管再生。水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)的脊髓损伤病灶中心特异性标记物RECA免疫染色的内皮细胞和血管明细增多(图7)，表明其促进血管再生作用。损伤区域的血管再生增多将更有利于神经再生。 [0057] 通过测量Basso‑Beattie‑Bresnahan(BBB)评分和斜板实验评估移植神经类器官‑水凝胶体系促进脊髓全横断损伤后运动功能恢复效果(图8a‑图8b)。与对照组(SCI)、水凝胶移植组(GL)和水凝胶包载神经干细胞移植组(hi‑NSC‑sc/GL)相比，移植了水凝胶包载神经类器官的大鼠(hi‑NSC‑organoid/GL)的BBB评分和斜板角度都大幅提高，其中BBB平均得分增加到约9.5，说明部分大鼠偶见步行，斜板平均角度增加到33°，表明肌力增加。移植神经类器官‑水凝胶体系可以更好地促进脊髓损伤后功能恢复。 [0058] 本发明以上实施例通过体外构建多能性中枢神经系统类器官，并将其与水凝胶复合，可以在储藏和运输过程中更好的保障神经系统类器官所具有的模拟组织结构、形态和功能特性，并可以形成尺寸更大的具有三维空间结构的神经功能单元，以及能有效延长移植神经类器官在损伤区域的留存时间，提高其存活率，并支持细胞迁移和生长，同时改善损伤微环境，促进神再生和神经网络重建，改善运动功能，提高治疗效果。 |
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